UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE 3. lékařská fakulta Autoreferát disertační práce Rizikové faktory rakoviny plic Modulace hladiny protilátek proti polycyklickým uhlovodíkům (PAU) ve vztahu ke kouření, nádorovému a nenádorovému onemocnění plic a výzkum možnosti zvyšování odolnosti organismu vůči působení PAU imunizací MUDr. Šárka Klimešová 2013 1

Doktorské studijní programy v biomedicíně Univerzita Karlova v Praze a Akademie věd České republiky Obor: preventivní medicína Předseda oborové rady: doc. MUDr. Alexander M. Čelko, CSc. Školící pracoviště: Dizertační práce byla vypracována v rámci postgraduálního doktorského studia biomedicíny, oborová rada Preventivní medicína. Práce vznikla na pracovišti FN Na Bulovce Klinika pneumologie a hrudní chirurgie, dále v laboratořích Vidia spol. s r. o. a v Oddělení genetické ekotoxikologie Ústavu experimentální medicíny Akademie věd České republiky. Předkladatel: MUDr. Šárka Klimešová Nemocnice Na Bulovce, Klinika pneumologie a hrudní chirurgie Budínova 2 180 81 Praha 8 Tel: sekretariát kliniky 266082080 E-mail: sarka.klimes@atlas.cz Školitel: MUDr. Norbert Pauk, Ph.D. Klinika pneumologie a hrudní chirurgie, Nemocnice Na Bulovce Oponenti: Prof. MUDr. Miloslav Marel CsC. Pneumologická klinika, FN V Motole Prof. MUDr. Miloš Pešek CsC. Klinika TRN, FN Plzeň Autoreferát byl rozeslán dne Obhajoba se koná dne..v hod. před komisí pro obhajoby dizertačních prací v oborové radě Preventivní medicína, 3. LF UK, Ruská 87, 100 00 Praha 10. 2

S dizertační prací je možné se seznámit na Oddělení pro vědu a výzkum 3. LF UK. Abstrakt Disertační práce je věnována výzkumnému projektu Modulace hladiny protilátek proti polycyklickým uhlovodíkům (PAU) ve vztahu ke kouření, nádorovému a nenádorovému onemocnění plic a výzkum možnosti zvyšování odolnosti organismu vůči působení PAU imunizací. Hlavním cílem projektu bylo ověření přítomnosti, změny hladin a ochranného účinku protilátek proti PAU a PAU-DNA aduktům v séru organismů po působení čistých PAU a cigaretového kouře a epidemiologickou studií zjištění vlivu hladiny anti-pau protilátek a dalších testovaných parametrů na riziko onemocnění plic. Mimo samotných výsledků potvrzujících nárůst genotoxického rizika expozice polycyklickým aromatickým uhlovodíkům s pobytem v zakouřeném a jinak PAU znečištěném prostředí byla prokázána nejen relevantnost dosud běžně užívaných markerů (DNA adukty), ale i vhodnost markerů nových, z ekonomického a praktického hlediska výhodnějších (anti-bpde- DNA, anti-b(a)p IgA protilátky). 3

Abstract The thesis is focused on the research project Modulation of the level of antidotes to polycyclic hydrocarbons (PAH) in relation to smoking, tumorous and non-tumorous lung disease, and research of a possible strengthening of the immune system against PAH by immunization. The main objective of the project was to verify the presence, change of levels and protective effect of the antibodies against the PAH and PAH-DNA adducts in the serum after impact of the pure PAH and cigarette smoke and the application of an epidemiologic study to discover the influence of the level of the anti- PAH antibodies and other tested parameters on the risk of developing a lung disease. In addition to the results proper, which confirm the increase of genotoxic exposure risk to PAH in smoke-polluted places of residence and other PAH polluted environments, there has also been proved the relevance of still commonly used markers (DNA adducts), as well as the suitability of new markers, more favourable from the economic and practical viewpoints (antibenzo(a)pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide-dna [anti-bpde- DNA], anti-benzo(a)pyrene antibodies of the IgA class). 4

OBSAH 1. Úvod.......5 1.2. Polycyklické aromatické uhlovodíky.....5 2. Představení projektu....5 3. Stručné zhodnocení celého projektu..7 4. Dílčí cíle.... 7 5. Stručný popis celého projektu.... 7 6. Skutečné indikátory dosažení cíle... 11 7. Srovnání dosažených výsledků s cíli projektu.....12 8. Co všechno musí být uskutečněno, aby výsledky projektu byly uplatněny........18 9. Diskuze...15 10. Závěr...17 11. Prezentace výsledků...18 12. Prameny.. 19 5

1. Úvod Termínem rakovina plic se v odborné terminologii rozumí bronchogenní karcinomy, tedy jak primární nádory průdušek, tak rovněž i nádory, které primárně vznikají v plicním parenchymu. Příčin původu vzniku zhoubného nádorového onemocnění plic je v současné době popsána obrovská heterogenní skupina, v autoreferátu se budu věnovat pouze účinkům skupiny polycyklických aromatických uhlovodíků jako jedné z hlavních kancerogenů tabákového kouře. Konkrétně se pokusím o seznámení s průběhem a výsledky studie s názvem Modulace hladiny protilátek proti polycyklickým uhlovodíkům (PAU) ve vztahu ke kouření, nádorovému a nenádorovému onemocnění plic a výzkum možnosti zvyšování odolnosti organismu vůči působení PAU imunizací řešeného v rámci projektu Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy, Národní program výzkumu II č.2b06150. Tento projekt byl řešen ve spolupráci tří institucí: Vidia spol. s r. o. (koordinátor projetu), Klinika pneumologie a hrudní chirurgie Fakultní nemocnice na Bulovce a Oddělení genetické ekotoxikologie Ústavu experimentální medicíny Akademie věd České republiky v letech 2006 2010. 1.2.Polycyklické aromatické uhlovodíky Mezi tzv. polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU) patří více než 100 chemicky jednoduchých látek s dvěma a více aromatickými cykly, dodávajícím jim velkou stabilitu. Jedná se o zapáchající, krystalické látky bílé či žlutavé barvy nerozpustné ve vodě, avšak dobře rozpustné v organických rozpouštědlech. Při zahřívání sublimují při různě vysokých teplotách. PAU vznikají zejména při nedokonalém spalování organických uhlíkatých látek včetně hoření tabáku. Mohou vznikat také při tepelné úpravě pokrmů (pečení, uzení). Jsou též důležitými surovinami v chemickém průmyslu, pro který se vyrábějí z kamenouhelného dehtu. Mají velký význam při znečišťování 6

ovzduší, neboť jsou obsaženy v emisích vznikajících při spalování ropných produktů, dřeva, uhlí, dehtu. Nacházejí se také ve výfukových plynech. PAU mají fotosenzibilizační a kancerogenní účinky, jsou toxické pro buňky parenchymatozních orgánů (ledviny, játra). Kancerogenní účinek byl zatím laboratorně prokázán celkem u 15 těchto sloučenin. Ve formě drobných částic pronikají až do plicních alveolů. Inhalované PAU jsou hlavní příčinou karcinomů plic. PAU přijaté cestou alimentární se podílejí na vzniku karcinomů trávicí soustavy (včetně dutiny ústní), při kožní expozici vyvolávají karcinomy kůže.(3) 2. Představení projektu PAU, podobně jako mnohé jiné chemické karcinogeny, nejsou karcinogenní per se, ale musí být metabolizované pomocí enzymů z rodiny cytochromu P450 (1A1, 1A2) na elektrofilní sloučeniny schopné reagovat s nukleofilními centry molekul DNA. Jde o vícestupňový proces aktivace a zároveň probíhá i detoxikace těchto látek. Enzymy podílející se na metabolických přeměnách jsou geneticky kontrolované, a proto celkový poměr aktivace a detoxikace dané chemické látky závisí na genotypu buňky. PAU se po aktivaci navazují na nukleotidy DNA za tvorby DNA aduktů, které mohou být v průběhu replikace DNA fixovány jako mutace (3, 4). Kromě DNA aduktů jsou PAU schopné indukovat oxidační poškození DNA, chromozomální aberace a podílejí se na molekulárních změnách onkogenů a tumor supresorových genů (5). Nejrozšířenější a nejcitlivější metodou detekce DNA aduktů indukovaných PAU je 32P-postlabelling (6), jehož použití však přináší řadu problémů jednak je časově náročné a použití radioaktivního izotopu fosforu je možné jen v laboratořích s příslušným bezpečnostním rizikem. Člověk je během života exponován PAU, u lidí s vyšší expozicí bylo prokázano, že dochází k tvorbě protilátek proti PAU (7). Jestliže zvýšená expozice PAU způsobuje tvorbu DNA aduktů v buňkách, vznikají též protilátky proti PAU-DNA aduktům (7). 7

Metoda detekce a kvantifikace hladiny těchto protilátek v lidské krvi (séru) by v klinické praxi mohla sloužit jako biomarker expozice PAU a mohla by také pomoci v předpovědi rizika vzniku nádorů indukovaných PAU. Předpokládá se, že přítomnost protilátek proti PAU v séru, především neutralizačních protilátek, má ochranný charakter.na základě imunochemickych reakcí dochází k vyvázaní PAU protilátkami, a tím je zabráněn jejich vstup do buněk, kde by se PAU mohly aktivovat na genotoxické metabolity. Jestliže už došlo k vytvoření těchto metabolitů, které jsou hydrofilnější než nemetabolizované PAU, jsou tyto lehko vylučované z buňky do extracelulárního prostoru, kde mohou být opět vyvázané specifickými protilátkami a zabrání se tím jejich další aktivaci na reaktivnější formy (biologicky relevantní druhá šance zabránění tvorby genotoxických metabolitů) (8). Při dlouhodobé chronické expozici PAU (kouření) dochází ke snižování obranyschopnosti organismu a předpokládáme i snižování hladiny anti-pau protilátek; organismus je tak ve zvýšené míře vystaven negativnímu působení PAU z vnějšího prostředí. V rámci projektu jsme na experimentálních zvířatech sledovali změnu hladin protilátek v krvi a indukci DNA aduktů v jaterních a krevních buňkách v závislosti na dávce (akutně anebo chronicky) PAU podávaných v čisté formě jednotlivě anebo směsi PAU aplikovaných v podobě cigaretového kouře. Metodami detekce protilátek a DNA aduktů byly metody ELISA respektive 32Ppostlabelling. Za účelem zjištění protektivních účinků anti-pau, projevující se zabráněním vzniku DNA aduktů, bude hladina anti- PAU protilátek v séru modulována vakcinací. Biologický monitoring patří mezi nejvýznamnější metody používané pro studium vlivu prostředí na zdraví člověka. Výsledky z těchto studií poskytují informace o expozici znečišťujícím složkám životního prostředí na základě měření přítomnosti kontaminantů anebo jejich metabolitů v tělesných tekutinách (krev, moč) a v tkáních. Významným přínosem 8

biologického monitorování je zpřesnění odhadu expozice a detekce časných účinků na organismus a umožnění zahájit preventivní opatření ještě ve fázi časných reverzibilních změn v organismu. Doposud nejsou známy séro-epidemiologické studie ověřující vztah karcinogen-specifických protilátek na riziko rozvoje nádorů v exponované populaci (8). V tomto projektu jsme se mimo jiné pokusili o provedení studie, která by byla základem pro další retrospektivní a prospektivní environmentální epidemiologické studie zabývající se expozicí PAU. Ve studii jsme sledovali přítomnost protilátek proti PAU v séru ve vztahu ke kouření, místu pobytu a prevalenci plicních onemocnění a nádorů plic. 3. Stručné zhodnocení celého projektu Hlavním cílem projektu bylo ověření přítomnosti, změny hladin a ochranního účinku protilátek proti PAU a PAU-DNA aduktům v séru organismů po působení čistých PAU a cigaretového kouře a epidemiologickou studií zjištění vlivu hladiny anti-pau protilátek a dalších testovaných parametrů na riziko onemocnění plic. Celkové řešení projektu bylo rozděleno do pěti dílčích cílů. Všechny dílčí úkoly probíhaly podle plánu projektu a ke dni uzavření řešení projektu, 31. 7. 2010, byly ukončeny. V následující části je uvedeno shrnutí průběhu řešení celého projektu. 4. Dílčí cíle 4.1. monitorování sérové hladiny protilátek proti polycyklickým aromatickým uhlovodíkům (PAU) a proti DNA aduktům indukovaným PAU 4.2. provedení studie vlivu kouření na změny v hladině anti-pau protilátek a na indukci DNA aduktů v játrech a plicích exponovaných zvířat 4.3. určení ochranného efektu protilátek proti účinkům PAU, jednak samotných PAU a poté ve směsi s ostatními složkami cigaretového kouře 9

4.4. vakcinací experimentálních zvířat proteinovými konjugáty PAU sledování vlivu zvýšené hladiny anti-pau protilátek na rezistenci organismu vůči genotoxickým účinkům PAU se záměrem zjištění možnosti zvýšení odolnosti organismu proti nádorovým onemocněním 4.5. v epidemiologické studii ověřování vztahu protilátek proti PAU, kouření a incidence plicních onemocnění, včetně nádorového onemocnění plic 5. Stručný popis celého projektu V úvodu projektu byly připraveny jednotlivé PAU deriváty za účelem experimentální imunizace laboratorních zvířat a ELISA soupravy pro detekci protilátek proti jednotlivým PAU v sérech (funkčnost a stabilita ELISA soupravy byla stanovena pomocí komerční protilátky). V důsledku komerční nedostupnosti některých PAU derivátů a jejich náročné chemické syntézy byla dokončena příprava pouze u 9 z 18 plánovaných konjugátů PAU-protein (KLH - Keyhole Limpet Hemocyanin a BSA Bovinní sérový albumin). Všechny imunizace zvířat pomoci PAU-KLH konjugátů v projektu probíhaly podle imunizačního schématu vybraného na základě imunizací s použitím pyren-klh konjugátu a to tak, že myši byly imunizovány dávkou 100µl/zvíře s 500µg/ml a to v pěti dávkách, vždy 1x týdně, přičemž mezi 4. a 5. imunizací byla týdenní prodleva. Imunizacemi dochází k produkci anti-pau protilátek třídy IgG. Následně probíhaly imunizace myší pomocí všech připravených PAU-KLH konjugátů. Zaznamenali jsme postupnou tvorbu měřitelných hladin specifických protilátek proti jednotlivým PAU a cross-reaktivních protilátek proti benzo(a)pyrenu (B(a)P). Nejvyšší cross-reaktivita indukovaných protilátek s B(a)P byla zaznamenaná v sérech izolovaných z myší imunizovaných pyren- KLH, antracen-klh, fluoren-klh a chryzen-klh konjugáty. Séra, která obsahovala příslušné anti-pau protilátky byla testována v in vitro experimentech, ve kterých se sledovala tvorba DNA aduktů v jaterních buňkách HepG2 po inkubaci buněk s jednotlivými séry a stanovoval se jejich neutralizační účinek proti B(a)P. Na základě 10

experimentálních výsledků byly pro další testování vybrány PAU konjugáty: pyren-klh/bsa, antracen-klh/bsa a chryzen- KLH/BSA. Tyto konjugáty indukovaly významnou tvorbu křížových neutralizačních protilátek v sérech imunizovaných myší a přitom neindukovaly hladiny DNA aduktů v in vitro a in vivo experimentech (játra). Pro porovnání efektu jednotlivých PAU byl v testech použit kontrolní konjugát B(a)P-KLH/BSA. Jak již bylo uvedeno, imunizačními procesy dochází postupné tvorbě specifických i cross-reaktivních anti-pau protilátek, které se po ukončení imunizací určitou dobu tvoří, avšak bez opakované imunizace dochází k jejich poklesu. Přídavkem další imunizační dávky po určitém období klidu experimentálních zvířat dochází k reindukci anti-pau protilátek. Odpověď na opakovanou jednu imunizační dávku je výrazně vyšší v porovnání s hladinou anti-pau protilátek po ukončení imunizací, přičemž vysoké hladiny byly udržovány až 5 měsíců od reimunizace. Na udržení vyšší hladiny protilátek je proto nutné experimentální zvířata reimunizovat jednou imunizační dávkou alespoň jednou za šest měsíců. Zjistili jsme, že imunizacemi myší nedochází jenom k indukci specifických protilátek proti PAU, ale i k tvorbě protilátek proti BPDE-DNA aduktům, a to po imunizacích myší s B(a)P-KLH anebo pyren-klh konjugáty. Stanovení probíhala pomocí experimentální ELISA soupravy, která specificky rozeznává protilátky proti BPDE-DNA aduktům (funkčnost a stabilita ELISA soupravy byla stanovena pomocí komerční protilátky). Ačkoli jsme nedokázali po imunizacích zvířat, ani v in vitro experimentech po inkubaci buněk s PAH-KLH konjugáty, přítomnost DNA aduktů, domníváme se, že indukce anti-bpde-dna probíhá jako důsledek tvorby B(a)P-DNA aduktů námi nezachycených, anebo organizmem rychle reparovaných. Pro indukci anti-bpde-dna protilátek jsou potřebné opakované expozice PAU, protože po jednorázovém intraperitoneálním (i.p.) vlivu B(a)P tvorba anti-bpde-dna neprobíhá, i když samotné hladiny DNA aduktů detekovány jsou. Jedním z cílů projektu bylo sledování ochranných účinků indukovaných anti-pau protilátek v séru myší imunizovaných vybranými PAU-KLH konjugáty, které byly následně ovlivněny i.p. čistými PAU. Po 48 hodinové expozici myší byla odebrána játra na 11

stanovení DNA aduktů a z krve izolováno sérum pro stanovení přítomnosti specifických, crossreaktivních a neutralizačních anti- PAU protilátek. Zjištěné parametry byly hodnoceny v závislosti na imunizaci PAU- KLH konjugáty a expozici čistými PAU. Z použitých tří modelových karcinogenů jenom B(a)P působil in vivo na jaterní buňky genotoxicky a vyvolal v nich tak tvorbu DNA aduktů, v důsledku čehož jsme zaznamenali ochranný účinek jen u specifických a crossreaktivních protilátek proti B(a)P indukovaných imunizací zvířat pomocí B(a)P-KLH a pyren-klh konjugáty. Imunizace pomocí chrysen-klh a antracen-klh neměly vliv na snížení počtu DNA aduktů indukovaných B(a)P v játrech. V souladu s uvedenými výsledky jsme pozorovali i signifikantní pokles hladiny protilátek proti B(a)P u myší imunizovaných B(a)P-KLH a pyren- KLH konjugáty a následně exponovaných B(a)P v porovnání s kontrolními neimunizovanými myšmi. Pokles byl pravděpodobně způsoben uplatněním protilátek v neutralizaci exogenního B(a)P. Hladina specifických i crossreaktivních protilátek u myší imunizovaných chrysen-klh a antracen-klh konjugáty byla stejná u exponovaných i u neexponovaných myší. Sledoval se i vliv neutralizačních anti-pau protilátek indukovaných imunizacemi na redukci DNA aduktů vyvolaných B(a)P in vitro v buňkách HepG2. Pravděpodobně v důsledku nízkého obsahu těchto protilátek v sérech imunizovaných zvířat nebyl zaznamenán jejich signifikantní účinek. Dalším cílem projektu bylo sledování hladiny protilátek proti PAU v séru myší při akutní a chronické expozici cigaretového kouře a pozorování zvýšené odolnosti organismu vůči vlivu cigaretového kouře po imunizaci zvířat. Postupně se sledovala indukce protilátek v průběhu i po imunizacích experimentálních zvířat, chronických a akutních expozicích cigaretovým kouřem a následném vlivu PAU-KLH konjugátů anebo imunizacemi myší, které nebyly před expozicemi imunizovány. Sledovala se také indukce protilátek proti BPDE-DNA aduktům v sérech, jakož i DNA adukty v játrech a v plicích experimentálních zvířat ve všech testovaných skupin. Imunizacemi bylo dosaženo indukce specifických i crossreaktivních anti-pau protilátek, které se po ukončení imunizací určitou dobu tvoří, avšak bez opakované imunizace dochází k jejich poklesu (vysvětlení viz výše). 12

Vliv akutní krátkodobé expozice cigaretovým kouřem na změny v hladinách anti-pau protilátek (specifických, crossreaktivních) v závislosti na jednotlivých expozičních skupinách experimentálních zvířat nebyl pozorován. Také nebyl zaznamenán zvýšený počet DNA aduktů v jaterních a plicních homogenátech myší. Hodnoty se pohybovaly na úrovni spontánních hladin DNA aduktů všech testovaných experimentálních zvířat. Dalším parametrem, který se sledoval, jsou protilátky proti BPDE-DNA aduktům. Akutní expozicí cigaretovým kouřem byl zaznamenán nárůst anti-bpde-dna u všech myší, imunizovaných i neimunizovaných, v porovnání se všemi myšmi, které exponované nebyly. Ačkoli nárůst není statisticky potvrzen, naznačuje pravděpodobně tvorbu reparujících se BPDE-DNA aduktů po nekolikadenní expozici cigaretovým kouřem. V případě chronické expozice cigaretovým kouřem, se nám nepodařilo potvrdit vliv imunizací, a to jak před, tak po chronické expozici, na indukci změn hladin anti-pau protilátek v závislosti na různě exponovaných skupinách experimentálních zvířat. Určitá část anti-pau protilátek se spotřebuje při neutralizaci expozice PAU z vnějšího prostředí, což však v případě celotělové expozice cigaretovým kouřem pozorováno nebylo. Stejně jako v případě akutní expozice, ani u chronické expozice nebyla zaznamenána indukce DNA aduktů v jaterních a plicních homogenátech myší. Hodnoty se pohybovaly na úrovni spontánních hladin DNA aduktů všech testovaných experimentálních zvířat. Co se týče protilátek proti BPDE-DNA aduktům, nekolikatýdenní expozice myší cigaretovým kouřem způsobila nárůst hladin anti-bpde-dna v porovnání s neexponovanými zvířaty.také u myší, které byly po dlouhodobých expozicích cigaretovým kouřem následně imunizovány imunizačním procesem, anebo i.p. ovlivněny B(a)P-KLH konjugátem, byla pozorována změna v hladině anti-bpde-dna protilátek projevující se v nárůstu koncentrací v porovnání s myšmi bez chronické expozice cigaretovým kouřem. Nárůst anti-bpde-dna protilátek naznačuje pravděpodobně tvorbu BPDE-DNA aduktů vlivem nekolikatýdenní chronické expozice cigaretovým kouřem. Významné je, že tento nárůst se projevil jen u myší před expozicí neimunizovaných, což 13

podporuje hypotézu ochranného účinku imunizace vůči dlouhodobému vlivu genotoxických látek. Poslední část projektu, která probíhala v průběhu celého řešení grantu, byla epidemiologická studie zaměřena na sledování hladiny anti-pau protilátek a protilátek proti PAU-DNA aduktům v séru jednak pacientů s nenádorovým a nádorovým onemocněním plic a v kontrolní populaci, představující skupinu zdravých lidí žijících jednak v Praze (řidiči autobusů, dělníci) a v Ostravě a okolí (policisté, administrativní pracovníci). Všichni účastníci studie vyplnili informovaný souhlas a dotazníky pro biostatistické zpracování dat. Celkově bylo ve studii použito 210 kontrolních a 190 pacientských vzorků. Získané vzorky biologického materiálu byly použity pro stanovení protilátek proti benzo(a)pyrenu třídy IgG a IgA, protilátek proti BPDE-DNA aduktům v sérech a stanovení celkových DNA aduktů v lymfocytech izolovaných z krve respondentů. Získané hodnoty naměřených parametrů byly statisticky zpracovány a jednotlivé skupiny populace vzájemně porovnávány. Na základě výsledků statistického zpracování naměřených parametrů a získaných dat, jsme nepozorovali rozdíly v testovaných parametrech (IgG, IgA, anti-dna adukty a DNA adukty) u pacientů, kteří byli hospitalizováni v nemocnici na Bulovce, Klinika pneumologie a hrudní chirurgie s diagnózou nenádorového onemocnění plic (Chronická obstrukční plicní nemoc (CHOPN)) v porovnání s pacienty s diagnózou nádorového onemocnění plic. V obou případech jde o závažná onemocnění, v jejichž terminálních stádiích již nebyly zjištěny změny v hladinách testovaných parametrů. Projev nádorového onemocnění plic je spojen s mnoha příčinami, ke kterým jen z určitého procenta patří i kouření, či expozice karcinogenům z vnějšího prostředí, na rozdíl od CHOPN, která vzniká především v důsledku dlouhodobého kouření a jiných expozic dýchacích cest chemickým látkám. Proto, po rozdělení pacientů z hlediska diagnózy a zároveň z hlediska expozice cigaretového kouře, bylo u nenádorových pacientů (s CHOPN) kuřáků zjištěny zvýšené hodnoty DNA aduktů v 14

porovnání s pacienty nekuřáky a s pacienty s nádorovým onemocněním plic. Po biostatistickém zpracování kontrolní skupiny se překvapivě zjistil signifikantní nárůst v hladinách hodnocených parametrů DNA aduktů, protilátek proti DNA aduktům, a slizničních anti-b(a)p protilátek třídy IgA v porovnání s pacienty. Zvýšené hodnoty jednotlivých parametrů přičítáme pravděpodobně zvýšené expozici genotoxickým PAU z vnějšího prostředí, protože šlo o skupinu lidí jednak profesionálně exponovaných emisemi z dopravy (řidiči autobusů a pracovníci garáží MHD v Praze), v automobilech a jednak o obyvatele Ostravsko-Karvinského regionu, tedy oblasti s dlouhodobě největšími koncentracemi PAU, především B(a)P, v ovzduší. Významným přínosem epidemiologické studie je zpřesnění detekce účinků expozice PAU ze životního prostředí na organismus, což by mohlo umožnit preventivní opatření ještě ve fázi časných reverzibilních změn v organismu. Vedle stanovení DNA aduktů v periferních lymfocytech, což je parametr, který se v těchto typech molekulárně epidemiologických studií často stanovuje, se zdá být velmi dobrým parametrem i stanovení protilátek proti BPDE- DNA aduktů v sérech. Protilátky vznikají na základě imunitní odpovědi organismu na přítomnost nového antigenu. Po opakované expozici tvorba protilátek roste a v organizmu tyto protilátky zůstávají přítomné i po vymizení antigenů. Proto stanovení protilátek proti BPDE-DNA aduktům by mohl být doplňujícím markerem stanovení expozice PAU, kdy hodnoty DNA aduktů, v důsledku rychlých reparačních procesů, nejsou detekovatelné (viz. experimenty na myších). Kromě anti-bpde-dna protilátek byla prokázána významná korelace mezi hodnotami celkových DNA aduktů (na skupinové úrovni) a protilátkami proti B(a)P třídy IgA. IgA protilátky představují typ slizničních protilátek, které se indukují po expozicích látkami z prostředí prostřednictvím sliznice. Jsou významnějším markerem expozice tkání (ústní sliznice, gastrointestinální trakt) než protilátky třídy IgG, které představují sérové protilátky indukující se například po subkutánní imunizaci organismu. I biostatistické výsledky ukázali na nevhodnost použití protilátek proti B(a)P třídy IgG jako markérů expozice organismu 15

prostřednictvím dýchacího a trávicího ústrojí (běžná expozice PAU z ovzduší a diety). Touto studií jsme prokázali vhodnost stanovení jednotlivých stávajících markerů genotoxicity při expozici PAU (DNA adukty), jakož i vhodnost stanovení nových markerů (anti- BPDE-DNA, anti-b(a)p IgA protilátky), které poskytují další zpřesňující informace o expozicích znečisťujícími složkami životního prostředí a jejich vlivu na organismus. Pro řešení projektu byly použity experimentální ELISA soupravy na detekci jednotlivých protilátek proti PAU a stanovení protilátek proti BPDE-DNA aduktům. V průběhu řešení projektu byly tyto soupravy vyvinuty postupně tak, jak byly připraveny jednotlivé PAU-BSA konjugáty potřebné pro imobilizaci mikrotitračních destiček. Bylo vyvinuto 9 ELISA souprav pro detekci specifických protilátek proti B(a)P, pyrenu, antracenu, chryzenu, acenaftenu, fluorantenu, fluoren, fenantrenu a naftalenu a ELISA souprava pro detekci anti-bpde-dna. Funkčnost těchto výzkumných ELISA souprav byly stanoveny pomocí komerčních protilátek. 6. Skutečné indikátory dosažení cíle V průběhu řešení projektu byly dosaženy následující cíle. Podařilo se nám připravit 9 PAU-KLH konjugátů pro imunizaci myší a PAU-BSA konjugátů pro přípravu ELISA souprav na detekci anti-pau protilátek. Procesy optimálních imunizací myší jsme docílili indukce specifických a cross-reaktivních protilátek třídy IgG. V in vitro experimentech jsme nezjistili genotoxický účinek PAU-KLH konjugátů, ani sér z imunizovaných myší, nebyla zaznamenaná ani tvorba DNA aduktů v játrech myší imunizovaných jednotlivými PAU-KLH konjugáty. Významný pokles DNA aduktů v buňkách HepG2 inkubovaných v médiu, které obsahovalo B(a)P a sérum z imunizovaných myší, v porovnaní s inkubací buněk jenom s B(a)P, nebyl zaznamenán (výsledky na hranici signifikance). Intraperitoneální expozice samotnými PAU, konkrétně B(a)P, 16

indukuje tvorbu DNA aduktů v játrech, jejichž hladiny jsou u před expozicí imunizovaných myší nižší než u myší neimunizovaných. Nezaznamenali jsme změnu hladin anti-pau protilátek v séru a zvýšený počet DNA aduktů v plicních a jaterních homogenátech myší imunizovaných PAU-KLH konjugáty a následně exponovaných akutně anebo chronicky cigaretovému kouři. Zaznamenali jsme ale mírný nárůst anti-bpde-dna u všech myší exponovaných cigaretovým kouřem akutně i chronicky. Preventivní imunizace dlouhodobě exponovaných zvířat měla za následek stagnaci vzrůstu anti-bpde-dna protilátek v porovnání s neimunizovanými myšmi, u kterých hodnoty anti- BPDE-DNA protilátek vlivem dlouhodobé expozice vzrostly. Samotná imunizace B(a)P-KLH a pyren-klh zvyšují tvorbu anti-bpde-dna protilátek, pravděpodobně jako důsledek tvorby rychle reparujících se DNA aduktů. Jednorázový i.p. vliv B(a)P tvorbu anti-bpde-dna a anti-b(a)p nevyvolává. V epidemiologické studii jsme stanovili hladiny protilátek proti B(a)P tříd IgG a IgA, protilátek proti BPDE-DNA aduktům v sérech a DNA aduktů v periferních lymfocytech. Biostatistickým zpracováním dat dotazníků a jednotlivých parametrů, kromě anti-b(a)p IgG protilátek, jsme zjistili vhodnost stanovení těchto parametrů, které vzájemně korelují na skupinové úrovni a včas odrážejí důsledky expozice genotoxickým látkám v životním prostředí, což je důležité pro prevenci zejména nádorových onemocnění. Genotoxické riziko expozice PAU vzrůstá pobytem v zakouřeném a jinak PAU znečištěném prostředí. Pacienti s onemocněním významně souvisejícím s kouřením (CHOPN pacienti - kuřáci), vykazovali zvýšené hodnoty DNA aduktů v porovnání s pacienty nekuřáky. Všeobecně nebyl prokázán rozdíl u pacientů ve vztahu s onemocněním nádorového nebo nenádorového charakteru. 17

7. Srovnání dosažených výsledků s cíli projektu V aplikaci projektu bylo uvedených sedm očekávaných výsledků, ke kterým jsme se pokoušeli v průběhu projektu dopracovat. Na tomto místě budou postupně získané výsledky konfrontovány s očekávanými cíli a doplněny o další výsledky, které vznikly v průběhu řešení projektu. Očekávaný výsledek 1: Budou zjištěny hladiny protilátek proti PAU a hladiny protilátek proti PAU-DNA aduktům v séru myší po expozici PAU nebo cigaretovému kouři. Protilátky proti PAU byly indukovány optimálním imunizačním procesem, který byl v projektu vyprofilován tak, že dochází k indukci protilátek třídy IgG. Tvorba protilátek postupnou imunizací vzrůstá, po ukončení imunizace několik týdnů stagnuje a potom začíná klesat. Pro udržení stabilních hladin anti-pau protilátek je nutná reimunizace alespoň jednou v průběhu šesti měsíců. Zjistili jsme, že dochází i k tvorbě protilátek proti BPDE- DNA aduktům po imunizacích B(a)P-KLH a pyren-klh konjugátů, i když přítomnost DNA aduktů v in vitro a in vivo experimentech nebyla detekována. Samotná expozice PAU (jednorázový i.p. vliv) nevyvolává indukci anti-pau a anti-bpde-dna protilátek. Také nebyla zaznamenána tvorba anti-pau protilátek v sérech myší po akutní a chronické expozici cigaretovému kouři, zatímco u této několikadenní a několikatýdenní expozici cigaretovým kouřem indukce anti-bpde-dna dekována byla. Očekávaný výsledek 2: Budou zjištěny hladiny DNA aduktů v krevních a jaterních buňkách myší a v buněčné linii HepG2 po působení PAU a po akutní expozici cigaretovému kouři. 18

Po působení B(a)P z testovaných PAU byly stanoveny DNA adukty jednak v buňkách HepG2 (inkubace buněk s B(a)P) i v jaterním homogenátu (po i.p. aplikaci B(a)P). DNA adukty po inkubaci HepG2 buněk s PAU-KLH konjugáty, ani v játrech izolovaných z myší imunizovaných PAU-KLH konjugáty nebyly detekovány. Akutní ani chronická expozice cigaretovým kouřem nezpůsobila tvorbu detekovatelných DNA aduktů v plicích a játrech exponovaných myší. Očekávaný výsledek 3, 5 a 6: Budou zjištěny změny hladiny anti-pau protilátek a protilátek proti PAU-DNA aduktům po chronickém působení cigaretového kouře. Bude zjištěna změna hladiny anti-pau protilátek v séru indukovaných experimentální vakcinací vlivem krátkodobé expozice cigaretovému kouři a dopad této změny na rezistenci organismu vůči genotoxickému působení PAU. Bude zjištěna změna hladiny anti-pau protilátek v séru myší vlivem chronické expozice cigaretovému kouři. Vliv zvolených způsobů akutní i chronické expozici cigaretovým kouřem na změny v hladinách anti-pau protilátek (specifických, crossreaktivních) v závislosti na jednotlivých expozičních skupinách experimentálních zvířat nebyl pozorován. Vliv expozice cigaretového kouře na změny v produkci anti-pau protilátek imunizacemi zvířat, které následovali po expozici, nebyl též pozorován. Jak bylo uvedeno v předcházejícím bodu, ani tvorba DNA aduktů v plicích a játrech exponovaných zvířat nebyla zjištěna. Avšak ELISA stanovením protilátek proti BPDE-DNA aduktům jsme zjistili nesignifikantní indukci těchto protilátek v séru myší exponovaných akutně anebo chronicky cigaretovému kouři v porovnání s neexponovanými zvířaty. Nárůst anti-bpde-dna protilátek naznačuje pravděpodobně tvorbu námi nezaznamenaných anebo rychle se reparujících BPDE-DNA aduktů vlivem nekolikadenní anebo nekolikatýdenní expozice cigaretovým kouřem. V případě chronické expozice jsme zaznamenali výraznější nárůst 19

anti-bpde-dna protilátek u myší před expozicí neimunizovaných, než u myší imunizovaných, kde se hladiny těchto protilátek téměř neměnily. Proto se domníváme, že imunizace pravděpodobně napomáhají zvyšovat obranyschopnost organizmu vůči dlouhodobému působení genotoxických látek z vnějšího prostředí a to i na základě výsledků z experimentů, ve kterých jsme zjistili snížené hladiny DNA aduktů v játrech myší imunizovaných B(a)P- KLH konjugáty a následně i.p. exponovaných B(a)P v porovnaní s hladinami DNA aduktů z jater myší jen i.p. exponovaných B(a)P. Nezaznamenané změny v samotných hladinách anti-pau protilátek v sérech a DNA aduktů v testovaných orgánech po expozicích myší cigaretovým kouřem by mohly být i důsledkem nedostatečné expozice, která byla celotělová a pasivní, takže pravděpodobně nedošlo k dostatečné vnitřní expozici. To, že k určité expozici došlo, jsme zaznamenali vzrůstem protilátek proti BPDE-DNA, jejichž stanovení by tak mohlo být vhodnou alternativou pro stanovení vnitřní expozice organismu PAU. Očekávaný výsledek 4: Bude zjištěna ochranná (neutralizační) funkce anti-pau protilátek indukovaných experimentální vakcinací zvířat proti genotoxickému působení PAU v testech in vitro na buněčné linii HepG2. Séra izolované po imunizacích myší, která obsahovala příslušné anti-pau protilátky byla testována v in vitro experimentech, ve kterých se sledovala tvorba DNA aduktů v buňkách HepG2 po inkubaci buněk s jednotlivými séry a následně po inkubacích s B(a)P indukující DNA adukty v buňkách. Nebyl (na hranici signifikance) zaznamenán pokles DNA aduktů v buňkách HepG2 inkubovaných v médiu, které obsahovalo B(a)P a sérum. Negativní výsledek by mohl být způsoben nízkým obsahem protilátek proti PAU v sérech, čímž nenastalo efektivní vyvázání relativně vysoké koncentrace B(a)P. 20

Očekávaný výsledek 7: Epidemiologickou studií se zjistí hladina protilátek proti PAU a protilátek proti PAU-DNA aduktům v lidském séru pacientů postižených nádorovými a nenádorovými onemocnění plic, kuřáků a nekuřáků. Na základě těchto zjištění se určí vliv hladiny anti-pau protilátek na rizika výskytu plicních onemocnění spojených s kouřením a expozicí PAU v životním prostředí. Na základě výsledků statistického zpracování naměřených parametrů a získaných dat, jsme nepozorovali rozdíly v testovaných parametrech (IgG, IgA, anti-dna adukty a DNA adukty) u pacientů, kteří byli hospitalizováni v Nemocnici na Bulovce, Klinika pneumologie a hrudní chirurgie, s diagnózou nenádorového onemocnění plic (Chronická obstrukční plicní nemoc (CHOPN)) v porovnání s pacienty s diagnózou nádorového onemocnění plic. V obou případech jde o závažná onemocnění, v jejichž terminálních stádiích již nebyly zjištěny změny v hladinách testovaných parametrů. Proto, po rozdělení pacientů z hlediska diagnózy a zároveň z hlediska expozice cigaretového kouře, bylo u nenádorových pacientů (s CHOPN) kuřáků zjištěny zvýšené hodnoty DNA aduktů v porovnání s pacienty nekuřáky a s pacienty s nádorovým onemocněním plic. Po biostatistickém zpracování kontrolní skupiny byl zjištěn signifikantní nárůst v hladinách hodnocených parametrů DNA aduktů, protilátek proti DNA aduktům, a slizničních anti-b(a)p protilátek třídy IgA způsobený zvýšenou dlouhodobou expozicí PAU z vnějšího prostředí. Hodnoty protilátek proti B(a)P třídy IgG se neměnily a zdají se být u tohoto typu expozice PAU nepodstatné. 8. Co všechno musí být uskutečněno, aby výsledky projektu byly uplatněny V aplikaci projektu byly uvedeny následující kritické předpoklady a rizikové momenty řešení projektu. 21

Jestliže po dlouhodobé expozici cigaretovému kouři nedojde k poklesu hladiny protilátek proti PAU v séru myší v důsledku snížení imunity, nebude následující vakcinace pro znovunavrácení obranyschopnosti organismu zvýšením hladin anti-pau protilátek relevantní. Pokles anti-pau protilátek v průběhu dlouhodobé expozice cigaretovému kouři nastal, avšak i u myší, které exponovány nebyly. Pokles tedy nebyl pravděpodobně způsoben snížením imunity vlivem expozice. Následnou imunizací zvířat došlo k indukci anti-pau protilátek, přičemž indukce byla shodná u všech zvířat nezávisle na době expozice cigaretovému kouři. Změny vlivem chronické expozice jsme zaznamenali v případě detekce anti- BPDE-DNA protilátek, kde u neimunizovaných myší hladiny těchto protilátek rostly v porovnání s imunizovanými myšmi. Protože imunizace po expozici cigaretovým kouřem neměly žádný vliv na změny anti-bpde-dna protilátek, domníváme se, že se imunizace zdají být relevantní, když probíhají před samotnou expozicí cigaretovým kouřem a hladiny anti-pau protilátek se udržují na určité účinné úrovni i v průběhu samotné expozice cigaretovým kouřem. Experimentální vakcinací by mohlo dojít k indukci vedlejších nežádoucích projevů, které nejsme v celkové šíři schopni předpovědět. Proto v pilotních pokusech projektu budou probíhat experimenty zaměřené na určení nejoptimálnějšího způsobu vakcinace vhodným netoxickým konjugátem PAU-protein, s důrazem na získání nejvyšší imunitní odpovědi a zároveň nejnižšího pozorovaného negativního projevu. In vitro jako i in vivo experimenty jsme dokázali, že PAU-KLH konjugáty nejsou při imunizaci zvířat za účelem indukce specifických i cross-reaktivních protilátek proti PAU genotoxické. Imunizacemi však dochází k tvorbě anti-bpde-dna protilátek, které by mohly indikovat přítomnost nízkých hladin DNA aduktů, jejichž hladina je regulována reparačními procesy na přijatelné úrovni. 22

Riziko nepotvrzení hypotézy ochranného účinku anti-pau protilátek vůči působení PAU, případně vůči cigaretovému kouři. Vzhledem ke komplexnímu složení cigaretového kouře a přítomnosti dalších karcinogenních látek v cigaretovém kouři nemusí být ochrana před vznikem karcinogenního působení úplná. Projekt si neklade za cíl navodit kompletní ochranu, ale dokázat princip a položit základ dalším studiím, které v konečném cíli povedou ke zvýšení obranyschopnosti organismu před karcinogeny přítomnými v životním prostředí. Ochranný účinek anti-pau protilátek vytvořených imunizacemi byl dokázán v případě sledování hladin DNA aduktů indukovaných i.p. B(a)P v játrech imunizovaných myší. Dále byl dokázán ochranný účinek imunizace u myší po chronické expozici cigaretovému kouři na základě měření hladin anti-bpde-dna protilátek. Pravděpodobně v důsledku nízkých koncentrací indukovaných anti-pau v séru imunizovaných myší a vysoké použité koncentraci B(a)P pro indukce DNA aduktů buněk HepG2, v in vitro experimentech neutralizační efekt anti-pau protilátek, na hranici signifikance, zjištěn nebyl. 9. Diskuze Snaha vědců detekovat biologicky účinnou dávku potencionálního karcinogenu v tkáni živého organismu množstvím DNA aduktů posouvá poznatky v oblastimetodiky neustále kupředu. Když jsme v roce 2007 zahajovali výše popsaný výzkumný projekt, byl metodou volby 32 P-postlabelling, což se výrazně nezměnilo ani v roce 2010, kdy byl projekt ukončen. V září 2012 uveřejnil Georgiadis a kol.z Ústavu biologického výzkumu a biotechnologie v Athénách výsledky svého výzkumu 9, v kterých popisují vývoj a validaci imunologické sendvičové chemiluminecsence (SCIA) pro měření DNA aduktů benzo(a)pyrenu a ostatních polycyklických aromatických uhlovodíků. Prakticky se jedná o využití extrakčního postupu a techniky přímého sendvičového ELISA testu s detekcí pomocí 23

chemiluminiscenčního činidla. Chemiuminiscenční signál je pak připojen k neaditivovanému nukleotidu, nikoli k DNA aduktu. Techniku ověřili in vitro i in vivo a srovnali výsledky s detekcí pomocí 32 P-postlabelling. Hladiny aduktů in vitro měřených SCIA technikou byly o 30-60% nižší než objem aduktů DNA naměřených ve shodných vzorcích pomocí 32 P-postlabelling. Významnou korelaci zjistili testováním párů mateřské a dětské krve BPDE-DNA SCIA, nicméně nezaznamenali korealci mezi technikou SCIA a 32Ppostlabelling pro shodné vzorky. Zlepšováním a validací uvedených technologií se zabývá jedna ze spoluautorek výše uvedené studie i ve svojí disertační práci. Katalin Kovács z Medical School University of Pécs 10 se zaměřuje na zlepšení metody 32P-postlabelling s cílem snížit množství užívaného radioizotopu při zachování účinnosti značení aduktu. Prakticky se jedná o snížení reakčního objemu vzorku odpařováním o jednu třetinu. To umožňuje snížení γ-32p o 50% ve vzorcích izolovaných Quiagen technologií a o 80% při izolaci DNA vzorku klasickou fenolovou metodou. Autorka se ve svojí práci rovněž pokouší validizovat získané výsledky srovnáním s metodou BPDE-DNA SCIA. DNA vzorky byly získány z buněk MCF 7 (Michigan Cancer Foundation 7, buněčné linie rakoviny prsu izolované v roce 1970) ošetřených buňky B [a] P a z jater myší, kterým bylo podáno in vivo několik dávek B [a] P, B [b] F, a DB. Dále pak z lidské periferní krve matky a novorozeneckých vzorků pupečníkové krve. Pro B [a] P- hladiny DNA aduktů naměřené SCIA a 32 P- postlabelling z buněk MCF 7 byl poměr mezi hodnotami aduktů 0,5. U zvířecích vzorků byly hodoty aduktů měřené imunologickýcm testem několikanásobně nižší než pomocí 32 P-postlabelling (poměry byly 01:05 pro B [a] P, 01:30 pro B [b] F a 01:05 pro DB [a, h] A). U všech vzorků byla velmi významná pozitivní korelace mezi křivkou dávka-reakce v metodě SCIA a toutéž křivkou metodou 32 P-postlabelling. U lidských vzorků byl poměr mezi SCIA a 32 P-postlabelling zhruba 01:10. Absenci korelace mezi výsledky obou metod autorka vysvětluje různou účinností detekce odlišných strukturálních typů aduktů DNA danou expozicí člověka okolnímu prostředí. 24

SCIA je ve srovnání s našimi testovacími soupravami ELISA rychlejší metoda, kterou lze plně automatizovat. Rovněž je ale možné i stanovení po jednom vzorku a díky možnosti reprodukovatelnosti lze zajistit i vyšší přesnost. Na druhou stranu se jedná o metodu finančně náročnější. Výhody ELISA ve srovnání s 32 P-postlabelling jsem již uváděla výše. Domnívám se, že i při existenci nové metody SCIA mohou námi vyvinuté experimentální soupravy najít uplatnění ve výzkumných projektech při stanovení jednotlivých protilátek proti PAU třídy IgG, IgA, IgM, jako i cross-reaktivních protilátek proti B(a)P v myších anebo lidských sérech. ELISA souprava pro detekci anti-bpde-dna by potenciálně mohla sloužit pro identifikaci protilátek proti PAU-DNA aduktům v lidských a myších sérech, které by odrážely aktuální stav expozice PAU a přítomnost DNA aduktů. Stanovení těchto protilátek by se vzhledem k jednoduchosti, rychlosti a nízké finanční náročnosti mohlo uplatnit zejména při screeningu velkých exponovaných populací, kde je všestranně náročnější stanovení DNA aduktů metodou 32P-postlabelling neproveditelné. V případě zjištění hodnot protilátek odchylných od normálu, by bylo možné výsledky uplatnit při prevenci ve fázi časných reverzibilních změn v organismu. Ve světle novějších studií bude nutné i některé další závěry přehodnotit se znalostí novějších poznatků. Např. Chavan a Krishnamurthy v University of Kansas Medical Centre 11 prokázali, že díky působení PAU dochází k expresi myšího i lidského genu ABCB6. Transkripce membránového proteinu kódovaného tímto genem vede k jeho zapojení nejen do prezentace antigenu, ale svojí nemalou roli má i v lékové rezistenci. Jelikož se nám nepodařilo detekovat DNA adukty po inkubaci HepG2 buněk s PAU-KLH konjugáty, ani v játrech izolovaných z myší imunizovaných PAU- KLH, nabízí se na podkladě závěrů výše uvedené studie otázka, nakolik je na vině právě přímá transkripce mitochondriálního proteinu kódovaného ABCB6 díky působení PAU. Řada studií se zabývá funkcí aryl uhlovodíkového receptoru (AhR) v aktivaci cytochromu P450, který je u lidí kódován genem CYP1A1 a CYP1B1. Jak ukazuje přehledový článek Tsay JJ a kol.z plicní kliniky New York University School of Medicine 12, 25

míra vlivu AhR na biotransformaci PAU ještě není zcela ujasněná. Již dříve se prokázalo, že přítomnost genu pro aryl uhlovodíkový receptor u myší zvyšuje vlivem zvýšené exprese CYP1A1 a 1B1 množství reaktivních částic BaP i jeho aduktů s DNA. Přestože se u myší bez genů pro AhR při expozici BaP neexprimoval žádný z cytochromů, i zde v menší míře probíhala bioaktivace BaP. 13 Vycházeli jsme z předpokladu, že působením PAU obsaženým v cigaretovém kouři, dojde k indukci enzymu CYP1A1 a 1B1, čímž budou aktivovány prokarcinogeny na ultimátní karcinogeny. Jak ale ukazují výsledky Bernauera a kol. ze Spolkového ústavu pro hodnocení rizik v Berlíně 14, lidské plíce mají díky veliké variabilitě enzymů CYP individuální citlivost vůči nepříznivým účinkům toxických látek. Chang TJ a kol., rovněž ze Spolkového instituci pro hodnocení rizik v Berlíně 15 popisuje zvýšenou expresi AhR a CYP1A1 u pacientů kuřáků s adenokarcinomem plic, zatímco exprese AhR a CYP1B1 je u pacientů zvýšena bez ohledu na kouření. Autoři poukazují na vysokou úroveň CYP1B1 u premaligních nádorů a vyslovují hypotézu, že nadměrná exprese AhR se vyskytuje v časných stádiích adenokarcinomu plic, což pak opět vede ke zvýšené expresi CYP1B1. To zvyšuje nitrobuněčný oxidační stres, čímž i podporuje růst buněk. Narušení exprese AhR by tedy mělo u časných forem adenokarcinomů dokázat zabránit jeho růstu. V našich výsledcích jsme nepozorovali rozdíly v testovaných parametrech (IgG, IgA, anti-dna adukty a DNA adukty) u pacientů s diagnózou CHOPN v porovnání s pacienty s diagnózou rakoviny plic. V souladu s výsledky výše uvedené studie si odvážím navrhnout hypotézu, že v pozdních stádiích obou nemocí již nemuselo docházet k expresi AhR a CYP1B1. Zvýšené hodnoty DNA aduktů u kuřáků s CHOPN v porovnání s pacienty nekuřáky a s pacienty s nádorovým onemocněním plic by pak mohlo odpovídat expresi CYP1A1, což je v souladu s výsledky studie Antilla a kol. z Finského ústavu pro ochranu zdraví při práci 16. Ta se zabývá plicní EROD činností (Ethoxyresorufin-O-deethylase : EROD, katalytické měření indukce cytochromu P4501A jako biomarker expozice chemické látce) v závislosti na methylaci promotoru CYP1A1 v důsledku kouření. Promotorová oblast CYP1A1 (nukleotidy 1411-1295) byla kompletně methylována u 94% nekuřáku, ale pouze u 26

46% kuřáků. Nedostatek methylace byl pak spojen s mírně vyšší EROD činností. Shodná studie pak ovšem nenalezla v periferních leukocytech žádný vztah mezi kouřením a methylací promotoru CYP1A1, zatímco nám jednotlivé parametry, s výjimkou anti-b(a)p IgG protilátek, vzájemně korelovaly. Ve shodě s našimi výsledky o rostoucím genotoxickém riziku expozice PAU v zakouřeném a jinak PAU znečištěném prostředí je rumunská studie od Cioroiu a kol. z Univerzity lékařství a farmacie v Iasi 17. Studie zahrnovala 31 histologicky potvrzených případů rakoviny plic. U pacientů žijících v městských oblastech byla zjištěna významně vyšší hladina PAU (p<0,05)ve vlhké tkáni než u pacientů žijících na venkově. Shodný výsledek zaznamenali i pro některé nekarcinogenní PAU (acenaften, fluorantren, antracen). Navíc ještě popisují zvýšené koncentrace karcinogenních PAU ve vzorcích plicní tkáně od pacientů s krevními skupinami A a 0. 10. Závěr Domníváme se, že imunizacemi PAU-KLH konjugáty navozuje zvýšení obranyschopnosti organismu vůči vlivu PAU ze životního prostředí za podmínky přetrvávání určité účinné hladiny anti-pau protilátek v organizmu. Získané výsledky by mohly být základem pro další studie principů imunizací vedoucích ke zvýšení obranyschopnosti organismu před karcinogeny přítomnými v životním prostředí. 27

11. Prezentace výsledků Postery: Černohorská, H., Lábaj, J., Jinoch, J., Lepša, L., Krocová, Š., Topinka, J.: Determination of environmental contamination caused by polycyclic aromatic hydrocarbons and their influence on the level of antibodies against benzo(a)pyren in serum of exposed persons. 38 th Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society (EEMS 2008), Environmental mutagens and human health, Cavtat, Croatia, 21. 25. 9. 2008. Jesenné pracovné dni Českej a Slovenskej spoločnosti pre mutagenézu vonkajším prostredím a Sekcie pracovníkov s tkanivovými kultúrami Genetická toxikológia a prevencia rakoviny, Bratislava, Slovenská Republika, 13. - 15. 10. 2008. Lábaj, J., Černohorská, H., Jinoch, J., Lepša, L., Klimešová, Š., Milicová, A., Topinka, J.: Do protein conjugates of polycyclic aromatic hydrocarbons induce genotoxic effects in vitro or in vivo? 10 th International Conference on Environmental Mutagens (ICEM 2009), 38 th Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society (EEMS 2009), 18th Annual Meeting of the Italian Environmental Mutagen Society (SIMA), The Renaissance of Environmental Mutagenesis, Florence, Italy, 20. 25. 8 2009. Přednášky: Lábaj, J., Černohorská, H., Jinoch, P., Lepša, L., Krocová, Š., Topinka, J.: Modulace hladiny protilátek proti polycyklickým aromatickým uhlovodíkům a možnosti zvyšování odolnosti organismu imunizací. 31. pracovní dny České a Slovenské společnosti pro mutagenezi zevním prostředím a Československé biologické společnosti Aktuální problematika genetické toxikologie, Brno, Česká Republika, 12. - 14. 5. 2008. 28

Lábaj, J., Černohorská, H., Jinoch, J., Lepša, L., Klimešová, Š., Milicová, A., Topinka, J.: Monitoring of antibody response to polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) and the possibility of increasing the resistance in organism to PAH by immunization. Jesenné pracovné dni Českej a Slovenskej spoločnosti pre mutagenézu vonkajším prostredím a Sekcie pracovníkov s tkanivovými kultúrami Genetická toxikológia a prevencia rakoviny, Bratislava, Sovenská Republika, 12. - 14. 10. 2009. Články: Article title: Influence of immunization with non-genotoxic PAH- KLH conjugates on the resistance of organisms exposed to benzo(a)pyrene Reference: MUTGEN402088 Journal title: Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis First author: Dr. Heda Cernohorska, Dr. Sarka Klimesova (Both are the first authors and they contributed to this paper equally) Online publication complete: 15-DEC-2011 DOI information: 10.1016/j.mrgentox.2011.10.016 The article is now published online at: http://dx.doi.org/10.1016/j.mrgentox.2011.10.016 Article title: The relevance of monitoring of antibodies against the Polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) and PAH-DNA adducts in serum in relation to lung cancer and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) Journal title: Neoplasma Page From: 182, Page To: 187 Year: 2013, Volume: 60, Issue: 2 Author: N. Pauk, S. Klimesova, J. Kara, J. Topinka, J. Labaj Online publication complete: 26-Nov-2012 DOI information: 10.4149/neo_2013_024 The article is now published online at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23176278 29