MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO ROMAN WALOSZEK 1

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie Sledování interakce kademnatých iontů s fytochelatiny Diplomová práce Vedoucí práce: doc. Ing. René Kizek, PhD. Vypracoval: Bc. Roman Waloszek Brno 2012 2

Mendelova univerzita Ústav chemie a biochemie v Brně Agronomická 2010/2011 fakulta ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE Autor práce: Studijní program: Obor: Konzultant: Bc. Roman Waloszek Fytotechnika Biotechnologie rostlin Ing. Dalibor Húska Název tématu: Sledování interakce kademnatých iontů s fytochelatiny Rozsah práce: 40-50 stran Zásady pro vypracování: 1. Anotace práce: díky antropogennímu působení dochází v životním prostředí k nárůstu celé řady škodlivých sloučenin, jako jsou pesticidy, ale také těžké kovy. V mnoha zemích je koncentrace těžkých kovů v životním prostředí závažným problémem v ochraně zdraví a produkci potravin. Je známo, že pokud jsou rostliny vystaveny účinkům těžkých kovů, zahájí rostlinné buňky syntézu thiolových sloučenin, jako jsou glutathion a fytochelatiny (PC). 2. Metodický přístup: pro charakterizaci thiolových sloučenin lze využít elektrochemických metod (diferenční pulzní voltametrie, chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza), kde nachází své uplatnění kromě visící rtuťové kapkové elektrody také pevné elektrody. 3. Cíle práce: Vypracovat literární přehled zabývající se souvislostmi mezi rostlinnou buňkou, fytochelatiny a ionty těžkých kovů (především kademnatých iontů). Listopad 2010 prosinec 2011. 4. Studium elektrochemického chování fytochelatinu s kademnatými ionty za využití elektrochemických technik. Leden 2011 únor 2011. 5. Matematické a statistické vyhodnocení výsledků, sepsání diplomové práce. Únor 2011 březen 2011. Seznam odborné literatury: 1. 2. KLEJDUS, B. -- HAVEL, L. Analýza cysteinu, glutathionu a fytochelatinů pomocí HPLC. CHEMagazin. 2003. sv. 13, č. leden, s. 01--04. ISSN 1210-7409. PETŘEK, J. -- VÍTEČEK, J. -- HAVEL, L. -- PETRLOVÁ, J. -- ADAM, V. -- KÍZEK, R. Vliv těžkých kovůů (Cd-EDTA, Pb-EDTA) na raná somatická embrya smrku (Picea spp.). In 3

3. 4. 5. 6. 7. 8. BLÁHA, L. Vliv abiotických a biotických stresorů na vlastnosti rostlin 2005. Praha: Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně, 2005, s. 218--227. ISBN 80-86555-63-1. ZEHNÁLEK, J. -- ADAM, V. -- KÍZEK, R. Vliv těžkých kovů na produkci obranných sloučenin u zemědělských kulturních rostlin. Listy cukrovarnické a řepařské : odborný časopis pro obor cukrovka-cukr-líh. 2004. sv. 120, č. 7-8, s. 222--224. ISSN 1210-3306. BALOUN, J. -- STEJSKAL, K. -- DIOPAN, V. -- SHESTIVSKA, V. -- ADAM, V. -- MIKELOVÁ, R. -- ZEHNÁLEK, J. -- HAVEL, L. -- TRNKOVÁ, L. -- BARTŮŠEK, K. -- KIZEK, R. Vyuziti analyzy obrazu, nuklearni magneticke rezonance a Brdickovy reakce pro studium vlivu tezkych kovu na embryonalni smrkove kultury. In Chemické zvesti. Slovenská republika: Institute of Chemistry Slovak Acedemy of Science, Bratislava, Slovak Chemical Society, Bratislava, 2007, s. 167--169. ISSN 1336-7242. DIOPAN, V. -- SHESTIVSKA, V. -- BALOUN, J. -- STEJSKAL, K. -- VLAŠÍNOVÁ, H. -- ADAM, V. -- HAVEL, L. -- KIZEK, R. Změny hladiny fytochelatinů lnu setého vystaveného vlivu iontů těžkých kovů. In Vliv abiotických a biotických stresorů na vlastnosti rostlin. 1. vyd. Praha: Česká zemědělská univerzita v Praze, 2008, s. 137--141. ISBN 978-80-87011-18-8. ŠUPÁLKOVÁ, V. -- HÚSKA, D. -- DIOPAN, V. -- HANUŠTIAK, P. -- ZÍTKA, O. -- STEJSKAL, K. -- BALOUN, J. -- PIKULA, J. -- HAVEL, L. -- ZEHNÁLEK, J. -- ADAM, V. -- TRNKOVÁ, L. -- BEKLOVÁ, M. -- KIZEK, R. Electroanalysis of plant thiols. Sensors. 2007. sv. 7, č. 6, s. 932--952. ISSN 1424-8220. BALOUN, J. -- HÚSKA, D. -- DIOPAN, V. -- ADAM, V. -- BABULA, P. -- HAVEL, L. - - KIZEK, R. Analysis of phytochelatin and phytochelatin synthase using liquid chromatography with electrochemical detection. In 7th Workshop on Sulfur in Plants. 1. vyd. Warsaw, Poland: Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, 2008, s. 67. ISBN 83-917432-8-4. KÍZEK, R. -- KLEJDUS, B. -- VACEK, J. -- VÍTEČEK, J. -- VOJTĚCH, A. -- TRNKOVÁ, L. -- HAVEL, L. -- KUBÁŇ, V. Elektrochemické stanovení metalothioneinu a fytochelatinu. In 3. metodické dny. 1. vyd. Praha: Česká společnost experimentální biologie rostlin a Ústav experimentální botaniky AV ČR, 2003, s. 74. Datum zadání diplomové práce: listopad 2010 Termín odevzdání diplomové práce: duben 2011 Bc. Roman Waloszek Autor práce doc. Ing. René Kizek, Ph.D. Vedoucí práce doc. RNDr. Petr Hrdlička, CSc. Vedoucí ústavu prof. Ing. Ladislav Zeman, CSc. Děkan AF MENDELU 4

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci Sledování interakce kademnatých iontů s fytochelatiny vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MENDELU v Brně. V Brně, dne 29. dubna 2012 Roman Waloszek 5

Poděkování Děkuji vedoucímu diplomové práce doc. Ing. Renému Kizekovi, Ph.D. za účinnou metodickou a pedagogickou pomoc. Dále děkuji odbornému konzultantantovi Ing. Daliboru Húskovi a celému kolektivu v laboratořích na Ústavu chemie biochemie. 6

Abstrakt Problematika toxicity těžkých kovů jako kadmium a olovo v životním prostředí je stále aktuální téma. K hlavním zdrojům znečištění patří průmyslová výroba, antropogenní a zemědělská činnost. Tyto kovy se dostávají do potravního řetězce rostlinami a ovlivňují tím vyšší organizmy. V současnosti se věda zaměřuje na využití nových materiálu, především velké naděje se vkládá do uhlíkových nanotechnologií. Tyto materiály budoucnosti se vyznačují vysokou pevností, odolností a zároveň lehkostí, dále díky svému obrovskému aktivnímu povrchu mají vysokou vodivost, což je cenná vlastnost v elektrotechnice. Tato práce se zabývá vlastnostmi a využitím uhlíkových nanotrubic v elektrochemii, hlavně při tvorbě senzoru pro detekci iontů těžkých kovů. Při využití uhlíkové pastové elektrody modifikované nanotrubicemi a chitosanem a jejich interakce s fytochelatiny. Právě fytochelatiny hrají klíčovou roli v detoxikaci těžkých kovů v rostlinných pletivech. Této schopnosti rostlin se využívá i ve fytoremediacích. Pro komplexní využití fytoremediačních technik je zapotřebí znát principy a chování rostlin vystavených těžkým kovům in vitro. Klíčová slova: těžké kovy, elektrochemie, uhlíková pastová elektroda, nanotrubice 7

Abstract The issue of toxicity of heavy metals as cadmium and lead in the environment is still a current topic. The principal sources of pollution include manufacturing, anthropogenic and agricultural activities. These metals enter into the food chain by through plants and affect higher organisms. At present, science focuses on the use of new materials, high hopes are most notably associated with carbon nanotechnologies. These materials of future are characterized by high strength, resistibility and also lightness, further, thanks to their great active surface they have a high conductivity, which is a valuable feature in electrical engineering. This thesis deals with the features and use of carbon nanotubes in electrochemistry, especially in developing sensors for the detection of heavy metal ions while using carbon paste electrode modified nanotubes and chitosan and their interaction with phytochelatins. It is the phytochelatins which play a key role in the detoxification of heavy metals in plant tissues. This ability of plants is used in phytoremediation. For the comprehensive use of phytoremediation techniques it is necessary to understand the principles and behavior of plants exposed to heavy metals in vitro. Keywords: heavy metals, electrochemistry, carbon paste electrode, nanotubes 8

Obsah SEZNAM ZKRATEK..11 I. ÚVOD..12 II. CÍLE PRÁCE.13 III. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY...14 1. TĚŽKÉ KOVY - KADMIUM.14 1.1 KADMIUM..14 1.2 Mechanizmy příjmu kadmia rostlinou..15 1.3 Toxické působení kadmia na rostlinu..15 1.4 Obranné mechanizmy rostlin proti těžkým kovům..16 1.4.1 Hlavní obranné mechanizmy.. 17 1.4.1.1 IMOBILIZACE.. 17 1.4.1.2 EXKLUZE...17 1.4.1.3 STRESOVÉ PROTEIN....17 1.4.2 OBRANA ROSTLIN PROTI PŮSOBENÍ VOLNÝCH RADIKÁLU.....17 1.4.3 FYTOCHELATINY.19 1.4.3.1 SYNTÉZA FYTOCHELATINU.. 19 1.4.3.2 INTERAKCE FYTOCHELATINU Z TĚŽKÝMI KOVY.. 20 2. ELEKTROCHEMIE.22 2.1 ELEKTROANALÝZA... 22 2.2 VOLTAMETRIE... 22 2.3 PRACOVNÍ ELEKTRODY... 23 2.3.1 Rtuťové elektrody... 23 2.3.2 Kovové elektrody........ 24 2.3.3 Uhlíkové elektrody...........24 2.3.3.1 Uhlíkové nanotrubice... 25 2.4 Referentní elektrody... 26 2.5 Pomocné elektrody... 26 IV. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... 27 3.MATERIÁL A METODY... 27 3.1 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE....27 3.2 PŘÍPRAVA UHLÍKOVÉ PASTOVÉ ELEKTRODY. 27 3.3 ELEKTROCHEMICKÁ ANALÝZA.. 28 3.4 ROSTLINNÝ MATERIÁL....28 9

4. VÝSLEDKY A DISKUSE... 29 4.1 OPTIMALIZACE STANOVENÍ KADEMNATÝCH IONTŮ POMOCÍ ELEKTROCHEMICKÝCH METOD... 29 4.1.1 Vliv doby akumulace iontů Cd a Pb na odezvu signálu... 29 4.1.2 Vliv koncentrace Cd2+ a Pb2+ na odezvu signálu... 31 4.1.2.1 MikroCPE... 31 4.1.2.2 NanoCPE1... 31 4.1.2.3 NanoCPE2... 32 4.2 MODIFIKACE UHLÍKOVÝCH PASTOVÝCH ELEKTROD CHITOSANEM... 33 4.2.1 MikroCPE modifikovaná chitosanem... 33 4.2.2 NanoCPE1 a nanocpe2 modifikovaná chitosanem... 34 5. POROVNÁNÍ VÝSLEDKU Z LITERATUROU.. 36 5.1 Výsledky uhlíkových pastových elektrod, které jsem používal při svých měřeních.. 37 5.2 Porovnávané elektrody.......37 5.2.1 Tlustovrstvá uhlíková elektroda modifikovaná bizmutem.....37 5.2.2 Uhlíková elektroda modifikovaná nanotrubicemi a chitosanem.....37 5.2.3 Uhlíková elektroda modifikovaná nanotrubicemi a cysteinem... 37 5.2.4 Pracovní tlustovrstvá zlata elektroda....38 5.2.5 Nano CPE2 a nano CPE2 modifikovaná chitosanem....38 5.3 Hygienické limity pro vodu podle MŽP ČR..... 39 5.4 Metody zlepšeni vysledku... 40 6. SLEDOVÁNÍ VLIVU KADEMANTÝCH IONTŮ NA ZEA MAYS L... 41 6.1 Vliv kademnatých iontů na růst Zea mays L.... 41 6.1.1 Růstové závislosti... 42 6.2 Vliv Cd 2+ na aktivitu γ-glutamyltransferázy GMT (µcat l -1 ) v Zea mays.... 43 6.3 Vliv Cd 2+ na množství fytochelatinů v Zea mays.... 44 VII. ZÁVĚR....46 VIII. LITERATURA... 47 IX. SEZNAM OBRÁZKŮ... 52 10

SEZNAM ZKRATEK CPE uhlíková pastová elektroda (carbon paste electrode) ROS reaktivní kyslíkové látky (reactive oxygen species) Cys cystein Glu kyselina glutamová Gly glycin GSH redukovaný glutathion SH sulfhydrylová skupina ATP adenosintrifosfát Cys cystein GRX glutathionredoxin DPV diferenční pulzní voltametrie GTS γ-glutamylcysteinylsyntetasa Glu kyselina glutamová PCs fytochelatiny GMT glutathion-s-transferasa HMC vysokomolekulární komplex s těžkým kovem LMC nízkomolekulární komplex s těžkým kovem GSH redukovaný glutathion GR glutathion reduktasa Gly glycin GPX glutathion peroxidasa GS glutathionsyntetasa 11

I. ÚVOD Těžké kovy se nacházejí v zemské kůře ve stopových množstvích, ale i v těchto malých koncentracích ovlivňují živé organizmy, včetně rostlin. Do prostředí vod, půdy a atmosféry se dostávají skrze přírodní aktivity, jako jsou sopečné výbuchy nebo antropogenní činnosti spojené s těžbou a zpracováním surovin. Takto uvolněné těžké kovy se mohou dostávat do životního prostředí a akumulovat v rostlinách, které tvoří první stupeň potravinového řetězce, a začínají tím negativně ovlivňovat vyšší organismy. Jedním z environmentálně nejvíce sledovaným neesenciálním těžkým kovem je kadmium. V dnešním globalizovaném světě nikdy nevíme přesně odkud pochází to, co jíme, a kolik to obsahuje nežádoucích látek. Proto je nutné vyvíjet nové účinnější a kompaktnější přístroje na detekci škodlivých látek. Stejně důležitá jako je detekce je i prevence a aktivní sanace vzniklých znečištěných ploch. Perspektivní se jeví metoda fytoremediace. Výběrem vhodného rostlinného hyperakumulátoru a dále jeho šlechtění nebo genetickou modifikací je možné dosáhnout kvalitních sanačních výsledků. Nejdůležitější proces ovlivňující vazbu těžkých kovů je tvorba na cystein bohatých polypeptidů fytochelatinů. Díky zkoumaní procesu jejich tvorby můžeme vytvořit organismy, které nám ulehčí práci se stále vzrůstající kontaminací. 12

II. CÍLE PRÁCE Diplomová práce byla zaměřena na vývoj zcela nových a originálních postupů detekce těžkých kovů a jejich interakce s fytochelatiny za využití pastové uhlíkové elektrody modifikované laboratorně připravenými uhlíkovými nanotrubicemi a chitosanem ve spojení s elektrochemickými technikami. Pro řešení byly vytýčeny následující dílčí cíle: Vypracovat literární přehled zabývající se souvislostmi mezi rostlinnou buňkou, fytochelatiny a ionty těžkých kovů a možnosti elektrochemické detekce Navrhnout a optimalizovat postup detekce iontů těžkých kovů (Cd 2+, Pb 2+ ) za využití elektrochemických technik a modifikovaných uhlíkových pastových elektrod Studium elektrochemického chování fytochelatinu s kademnatými ionty u rostlin kukuřice Zea mays L. za využití elektrochemických technik. 13

III. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 1. TĚŽKÉ KOVY 1.1 Kadmium Kadmium je stříbřitý, měkký, kujný a tažný kov s teplotou tání (767 C). Svými vlastnostmi se podobá zinku. Vzhledem k podobnosti se vyskytuje i v rudách společně se zinkem v poměru 1:100 až 1:1000. Je také získáváno jako vedlejší produkt při tavení zinku. Při zpracování jedné tuny zinkové rudy se uvolní okolo tří kilogramů kadmia a jiných kovů, zejména olova a mědi. Pro svoji vlastnost chránit železo před korozí je používáno při výrobě plechů, dále se především používá v automobilovém průmyslu k výrobě katalyzátorů. Do životního prostředí se dostává zejména jako atmosférická depozice. Dalším zdrojem je zemědělská činnost, konkrétně používání minerálních superfosfátů. Ty obsahují především kadmium, ale i chróm a arsen. Rozhodující pro obsah těchto prvků je použitá surovina, například apatity obsahují okolo 0,15 ppm Cd, zatímco fosfority zejména z afrických nalezišť kolem 50 ppm (Adriano D. C. Springer Verlag, (2001), Tlustoš, 2006). Dále se kadmium může do prostředí dostávat hnojením čistírenskými kaly, nebo popelem ze spaloven biomasy. Kadmium se efektivně akumuluje v rostlinných pletivech, čímž se dostává do potravního řetězce člověka. Mobilita kadmia v půdě závisí na rozpustnosti, která se zvedá se snižujícím se ph (způsobené např. kyselými dešti). Může tak dojít k uvolnění kadmia ze sedimentů, čímž se následně může zvýšit koncentrace ve vodě a v půdě, a tím se zvyšuje i jejich dostupnost pro rostliny (Bertin et Averbeck, 2006, Kafka et Puncocharova, 2002, Wolterbeek, 1987, Wolterbeek et al., 1987). 14

1.2 Mechanismy příjmu kadmia rostlinou Kadmium je rostlinami přijímáno převážně kořeny, ale i povrchem listů při suché depozici. Transport kadmia ke kořenům se děje difúzí a hromadným tokem. Množství kadmia, které rostlina přijme, je přímo závislé na jeho koncentraci v živném roztoku. V blízkosti kořenů dochází k chelataci kovů organickými kyselinami vylučovanými rostlinou čímž se zvyšuje difuzní gradient a urychluje příjem prvku. Příjem kadmia kořeny se děje výměnnou absorpcí, při níž je kadmium zaměněno s jinými esenciálními kovy, jako je zinek a měď. Při výměnné absorpci kationty reagují se záporně nabitými částmi střední lamely buněčných stěn (Wolterbeek, 1987, Wolterbeek et al., 1987). Další způsob, kterým přijímají rostliny kadmium, je ireverzibilní nemetabolická fixace v buněčné stěně. Tento mechanizmus příjmu kadmia lze chápat jako určitou obranu rostlinné buňky před vstupem kadmia do cytoplazmy buněk, čímž je redukováno jeho toxické působení. Jak již bylo dříve řečeno, procesy příjmu kadmia závisí na jeho koncentraci v daném prostředí, jeho formě a době působení, obsahu organických a dalších komplexotvorných látek, ale i na teplotě půdy, obsahu vody, hodnotě oxido-redukčního potenciálu a samozřejmě nelze opomenout druh rostliny (Ahmad et al., 2008, Almendras et al., 2009, Florijn et Vanbeusichem, 1993, Florijn et Vanbeusichem, 1993). 1.3 Toxické působení kadmia na rostlinu Kadmium toxicky působí na rostlinu už ve velmi malých dávkách. Hlavním místem negativního ovlivňováni jsou buněčně membrány a enzymy. Snížení jejich aktivity a následná ztráta jejich funkce je příčinou dalších poškození rostliny. Těžké kovy způsobují změny v obsahu ostatních prvků v rostlině. Vyvolávají nadměrné hromadění nebo výdej prvku. Hlavně kadmium může reagovat s nezbytnými základními živinami, které jsou přijímaný, a tím narušovat výživu rostlin (Brune et Dietz, 1995). Například bylo prokázáno, že kadmium v buňkách se váže na fosfor a tím tvoří fosforečnany kovu, které jsou nerozpustné, tím dochází 15

k úbytku anorganického fosforu v buňce, který je potřebný pro syntézu ATP (Husaini et Rai, 1991). Příjem kademnatých iontů rostlinou muže být také ovlivněn přítomností iontů zinku. To potvrzuje experiment, při kterém se v živném médiu obohaceném zinkem snižoval příjem kadmia rostlinou (Hart et al., 2005). Dalším důležitým vlivem kadmia v rostlině je tvorba volných kyslíkových radikálů, jako jsou hydroxylové radikály, peroxid vodíku, singletový kyslík, anion superoxidu s čímž souvisí i interakce s nukleovými kyselinami, následkem čehož vznikají mutace a narušení proteosyntetického aparátu. Dále kyslíkové radikály způsobují oxidativní stres, změny v proteinových řetězcích a oxidaci lipidů v membránách, čímž narušují celý membránový systém buňky (Jabeen et al., 2009, Kafka et Puncocharova, 2002, Piterkova, et al., 2005, Tlustoš, 2006). 1.4 Obranné mechanismy rostlin proti těžkým kovům Rostliny, které rostly na přírodním podloží bohatém na kovy, si časem vybudovaly různé mechanizmy odolnosti proti nadměrné koncentraci těchto látek. Tyto rostliny se vyznačují výrazným růstem oproti svým druhovým příbuzným, které nemají schopnost tolerance koncentrace kovu vyvinutou do takové míry. Pro tyto vysoce tolerantní rostliny to představuje stanovištní výhodu a netrpí tak velkým selekčním tlakem jako na normálních půdách. Rostliny reagují na stres vyvolaný kadmiem obrannými mechanismy, které jsou společné i pro jiné kovy. Tvorba fytochelatinů a vakuolární kompartmentace představují hlavní mechanismy působící proti Cd stresu. V další řadě je to tvorba a syntéza stresových proteinů, produkce etylenu a peroxidáz (Sanita di Toppi et Gabbrielli, 1999). 16

1.4.1 Hlavní obranné mechanizmy 1.4.1.1 Imobilizace Imobilizace je proces kdy se kovy vážou do buněčných stěn a extracelulárních látek, již v kořenech rostliny, tím se snižuje poškození buněčných membrán. Například u fazolu obecného jsou kademnaté ionty vázané na pektiny a histidinové skupiny buněčné stěny (Sanita di Toppi et Gabbrielli, 1999). 1.4.1.2 Exkluze Exkluze je vyloučení kovu z buňky pomocí transmembránových přenašečů. Je to mechanismus, který zabraňuje hromadění toxických kovů v rostlině. Je využíván především jednobuněčnými organizmy u rostlin je studován. 1.4.1.3 Stresové proteiny Přítomnost kovů v rostlinné buňce iniciuje tvorbu stresových proteinů (heat shock proteins). Tyto proteiny chrání membrány před stresem způsobeným ionty kovů s cílem udržet integritu plasmatické membrány a zvýšit efektivitu reparačních mechanismů (Hall, 2002). Experimentálně bylo dokázáno, že DNA rostlin stresovaných kadmiem tvoří odpověď v podobě specifických mrna transkriptů, které regulují syntézu stresových proteinů. Tyto proteiny mohou opravovat proteiny poškozené kadmiem a mají také ochranný vliv na membrány buňky (Sanita di Toppi et Gabrielli, 1999). 1.4.2 Obrana rostlin proti působení volných radikálů Ochranu před oxidačním poškozením organismu aktivními formami kyslíku zajišťuje řada antioxidačních obranných systémů lokalizovaných v různých buněčných strukturách. Antioxidační obranné mechanismy zahrnují neenzymové a enzymové systémy. K velmi účinným antioxidantům řadíme askorbát, β-karoten, redukovaný glutathion a α-tokoferol. Specializované enzymy jako superoxiddismutasa (EC 1.15.1.1), peroxidasa (EC 1.11.1.7), katalasa(ec 1.11.1.6), které zabezpečují univerzální obranu rostlin (Piterkova et al., 2005). 17

Obr. 1 Obecné schéma biologických důsledku intoxikace buňky kadmiem. Kadmium zasahuje do různých důležitých mechanismů v rostlině, jako jsou genová exprese, buněčný cyklus, diferenciace a proliferace buňky. Kadmium zvyšuje oxidační poškození DNA, proteinů a membránových lipidů. Indukce oxidačního poškození je spojeno s narušením mitochondrií. Oxidační stres vyvolává tvorbu HSPs (heat shock protein), spojené s přizpůsobením na stres, zahájení opravy bílkovin nebo degradaci pomocí ubiqitin - proteasomu. Oxidační poškození DNA vede k mutacím a vyvolání rakoviny. Inhibice některých opravných mechanizmů DNA přispívá k nárůstu mutací a rakoviny (Bertin et Averbeck, 2006). 18

1.4.3 Fytochelatiny Pro zvýšení ochrany proti toxickým těžkým kovům si musely rostlinné buňky vyvinout mechanismy, pomocí nichž jsou ionty kovů, které se dostanou do cytosolu buňky, ihned komplexovány a inaktivovány. Sloučeniny, které se účastní komplexace kovů, zahrnují organické kyseliny, volné aminokyseliny, glutathion, fytochelatiny, metalothioneiny, metalochaperony a heat shock proteiny. Metalothioneiny jsou polypeptidy bohaté na cystein, které jsou kódovány skupinou genů. Na druhou stranu fytochelatiny jsou skupinou enzymaticky syntetizovaných peptidů bohatých na cystein, které jsou syntetizovány pouze za přítomnosti těžkého kovu (Soudek et al, 2008). Fytochelatiny jsou všeobecně známy jako peptidy, jichž základní stavební jednotkou je tripeptid glutathion. Jejich funkce v rostlinách spočívá v schopnosti izolovat těžký kov a následně jej transportovat do rostlinné vakuoly, kde je ukládán ve formě komplexu (Babula et al, 2010). Základní složkou fytochelatinů (PCs) je tripeptid glutathion. PCs pak mají základní strukturu (γ-glu-cys)n-gly, kde se dipeptidická repetice glutamové kyseliny a cysteinu (γ-glu-cys) může opakovat dvakrát až 11krát, ale nejčastěji 2 5krát (Supalkova et al., 2007, Zehnalek et al, 2004,) 1.4.3.1 Syntéza fytochelatinů Fytochelatiny jsou syntetizovány v cytosolu z glutathionu a γ -glutamylcysteinu pomocí enzymu fytochelatinsyntetázy (PCS) (Obr.2). Tento enzym podléhá pozitivní alosterické regulaci prostřednictvím iontů kovů. Syntéza fytochelatinu probíhá přímo z jednotlivých aminokyselin. Nejprve vzniká glutathion za účasti dvou sekvenčních ATP dependentních reakcí katalyzovaných enzymy gama-glutamyl-cys syntetázou (gama-ecs) a následně glutathion syntetázou (GS). Poslední krok reakce zahrnuje prodlužování řetězce (gama-glu-cys) připojováním jednotek gama-glu-cys pomocí transpeptidačního enzymu fytochelatin syntázou (PCS). Vzorec uvedený na konci schématu představuje základní strukturní jednotku fytochelatinů opakujících se jednotek glutamyl-cysteinyl s C-terminální části cysteinem (Ahmad et al., 2008, Cobbett, 2000, Gill et Tuteja, 2010, Supalkova et al., 2007). 19

Obr. 2 Schéma syntézy fytochelatinů. 1.4.3.2 Interakce fytochelatinů s těžkými kovy Kadmium stimuluje tvorbu fytochelatinů v cytosolu a vytváří s ním komplexy s vyšší polymerizační hladinou, které jsou transportovaný do vakuoly a napomáhají tím ke snižovaní hladiny kadmia v cytoplazmě. Kadmium se váže do struktury fytochelatinu pomocí SH skupin. Molekuly kadmia se váží k doméně-c přičemž vzniká nízkomolekulární komplex (LMC). Tento komplex je transportován proti koncentračnímu spádu pomocí transportérů přes tonoplast do vakuoly. To bylo prokázáno na experimentu s Cd-senzitivními mutanty htm1 u kvasnic. Ve vakuole nízkomolekulární komplex podléhá změnám za vzniku vysokomolekulárního komplexu (HMC), který znemožňuje opětovnou refundaci zpět do cytosolu. Fytochelatiny následně mohou být degradovány hydrolasami ve vakuole nebo se mohou vracet do cytosolu a pokračovat ve své funkci. Schéma detoxifikace Cd iontů ukazuje Obr. 3 (Arthur et al., 2005, Cobbett, 2000, Gill a Tuteja, 2010, Supalkova, et al., 2007). 20

Obr. 3 Schéma detoxifikaci kadmia pomocí fytochelatinů ů v rostlinné buňce. Kademnaté ionty jsou přepravovány přes protonové pumpy do vakuoly. Tady tyto ionty aktivují tvorbu fytochelatinu, která tvoří s ionty kovů M-PC komplex (LMW Cd). Tento komplex je následně přepravován pře es tonoplast do vakuol,je to aktivní proces spotřebovává se při tom ATP. Zde je nízkomolekulární komplex transformován na komplex s vysokou molekulovou hmotností M-PC (HMW M-PC), přes- S-S-skupiny (Supalkova et al., 2007) 21

2. ELEKTROCHEMIE Elektrochemie vznikla na přelomu 18. a 19. století. Jedna z prvních definic byla zaznamenána v Ottově slovníku naučném. Elektrochemie je tedy odvětví fyzikální chemie, u níž dochází ke kombinaci chemie s elektřinou. Další významná definice pochází od Rudolfa Brdičky, který elektrochemii popisuje jako odvětví fyzikální chemie, zabývající se elektrickými a energetickými stránkami chemických dějů pozorovaných na stykové ploše mezi elektrodou a kapalným vodičem a to jak při průchodu proudu, tak za rovnovážného stavu. Elektrochemie má mnoho různých odvětví. Patří mezi ně elektroanalýza, elektrokapilarita, elektromigrace, elektroforéza, elektrochemická metalurgie (Palecek, 2002). 2.1 Elektroanalýza Elektroanalýza je skupina technik v analytické chemii, která studuje změny analytu na základě měření potenciálu nebo proudu. Elektroanalýza se rozděluje do tří základních skupin podle zkoumaných aspektů a typu jejich měření. Tyto hlavní kategorie jsou potenciometrie, coulometrie a volumetrie. (Adam et al., 2007, Huska et al., 2009). 2.2 Voltametrie Voltametrie je skupina elektroanalytických metod. Informace o analytu se získávají měřením proudu při různém potenciálu. K správnému fungování jsou zapotřebí 2 elektrody pracovní (polarizovatelná) a referentní (nepolarizovatelná), tomuto zapojení se říká dvouelektrodové. V dnešní době se používá kromě pracovní a referentní elektrody i třetí pomocná elektroda (tzv. tříelektrodové zapojení), a to z důvodu eliminace rušivých vlivů, které plynou z dvouelektrodového zapojení. Při dvouelektrodovém zapojení je velmi obtížné udržovat konstantní potenciál na elektrodách, docházelo například k proudovému zatížení referentní elektrody. U tříelektrodového zapojení se zvyšuje i citlivost detekce v celém systému (Mikelova, et al., 2007, Palecek, 2002). 22

2.3 Pracovní elektrody Pracovní elektrody, tedy polarizovatelné elektrody, se obecně dělí do dvou základních skupin, a to na rtuťové a pevné elektrody. Další dělení elektrod může být podle jejich velikosti a to na makroelektrody (velikost jejich plochy se pohybuje v cm 2 ), dále pak na minielektrody (DME a některé velké HMDE), semimikroelektrody (patří mezi ně některé HMDE), dalšími jsou mikroelektrody (těmi jsou meniskové elektrody) a posledními jsou ultramikroelektrody (UME). Se zmenšením elektrody dochází i ke zmenšení povrchu pracovní elektrody. Je tedy potřebné zajištění vyšší citlivosti na stanovování analytu (Adam et al., 2007, Hubalek et al., 2007, Huska et al., 2009, Huska et al., 2008),Kizek et al., 2003). 2.3.1. Rtuťové elektrody Kvůli dobrým elektrickým vlastnostem se nejčastěji využívají kovové elektrody, hlavní pozici mezi nimi má rtuťová elektroda, která má dokonale obnovitelný povrch kapky, díky tomu je její využití velice výhodné u elektroanalytického stanovení. Tento typ elektrody je díky vysokému přepětí vodíku na rtuti lépe polarizovatelný ve větším rozsahu negativních potenciálů (v porovnání s jinými kovovými elektrodami). Díky nasycené kalomelové elektrodě (saturated calomel electrode; SCE) také umožňuje pozorování dějů, které probíhají i ve značně negativních oblastech potenciálů. Rtuťové elektrody se dělí do dvou hlavních skupin a to na kapající rtuťovou elektrodu (dropping mercury electrode; DME) a visící rtuťovou kapkovou elektrodu (hanging mercury drop electrode; HMDE). DME je využívána především v polarografii, jejími výhodami je dobře definovatelný a snadno obnovitelný povrch kapky. Hlavní nevýhodou je velký nárok na objem analytu, který se pohybuje v mililitrech. HMDE se využívá především ve voltametrii. Hlavní předností této elektrody je, že celý průběh experimentu probíhá na jedné kapce, kde se studovaný analyt akumuluje a poté analyzuje (Huska, et al., 2010, Vacek, et al., 2004), (Almendras, et al., 2009, Li, et al., 2010). 23

2.3.2 Kovové elektrody U kovových elektrod je možné dále modifikovat pracovní povrch, díky tomu se zvyšuje citlivost a selektivita dané elektrody. Povrch pevné kovové elektrody je možné pokrýt různými vrstvami. Nejznámější je pokrytí povrchu rtutí (vzniká filmová elektroda), dále pak může být pokryt lipidy apod. Dalším typem elektrody je elektroda, označována jako amalgámová, na níž vzniká amalgám po interakci kovu v elektrodě se rtutí. (Adam, et al., 2007,Kizek, et al., 2003,Palecek, 2002) 2.3.3 Uhlíkové elektrody Uhlíkové elektrody se hojně využívají při studiu biologických látek jako doplnění rtuťových elektrod, protože je možné je polarizovat do oblasti kladných potenciálů, na rozdíl od rtuťových (HMDE), které lze polarizovat do nízkých oblastí kladných potenciálů (jen asi 0,2 V). Síťovaný sklovitý uhlík (reticulated vitreous carbon; RVC) se využívá v průtokové analýze, kde uplatňuje své vlastnosti (vysoká pórovitost, která klade nízký odpor tekoucí kapalině). Hojně využívanou pevnou uhlíkovou pracovní elektrodou je elektroda, vyrobená ze skelného uhlíku (glassy carbon electrode; GCE), které je vyrobena z polymerních fenolformaldehydových živic, které se kontrolovaně zahřívají v inertní atmosféře. Další elektrodou je uhlíková elektroda z pyrolitického grafitu (pyrolitic graphite electrode; PGE), důležitou funkci má pastová uhlíková elektroda (carbon paste electrode; CPE), která se skládá ze směsi práškového uhlíku (85%) a oleje (15%). Přidáním příměsi do CPE nám vznikne modifikovaná pastová uhlíková elektroda. Příměsí může být nízko i vysoko molekulární látka. Pokud jako příměs do CPE bude místo oleje vosk, vznikne vosková uhlíková elektroda (WISGE) nebo parafínem impregnovaná grafitová elektroda (paraffin impregnated graphite electrode; PIGE)(Fojta, et al., 2003, Masarik, et al., 2003, Supalkova, et al., 2006). 24

2.3.3.1 Uhlíkové nanotrubice Uhlíkové nanotrubice jsou podlouhlé částice složené z atomů uhlíku. Jejich struktura je podobná fullerenům, na rozdíl od nich však mají válcovitý tvar (fullereny jsou kulovité). V přírodě se nanotrubice nevyskytují, v laboratoři byly poprvé připraveny v roce 1991. Průměr nanotrubic je 1 až 100 nm a jejich délka může být až 100 µm. Uhlíkové nanotrubice mohou být jednostěnné SWCNTs (Single Walled CNTs), které mají jednu stěnu o půměru 1-2nm či více stěnné MWCNTs (Multi Walled CNTs), které mají více stěn o souhrnnétloušťce 2-25 nm. Pole výzkumu uhlíkových nanotrubic je velmi aktivní a přitahuje velkou pozornost, protože nanotrubice mají zajímavé vlastnosti využitelné v elektrotechnice hlavně pro jejich velmi malý elektrický odpor a velký aktivní povrch. A dále pak termodynamice a mechanice(hubalek, et al., 2009, Huska, et al., 2010, Ivanov, et al., 2003). 25

2.4 Referentní elektrody Referentní elektroda je elektroda přesně definovaným vlastním potenciálem. Tato elektroda funguje jako porovnávací bod pro nastavení potenciálu pracovní elektrody. Mezi nejvíce využívané eferentní elektrody patří elektrody tzv. druhého druhu. Tyto elektrody jsou tvořeny kovem, na němž je tenká vrstva nerozpustné (případně málo rozpustné) soli a celá tato elektroda je následně ponořena do roztoku jejich anionů. Referentní elektrody se tedy uchovávají v roztocích a nesmí se nechat vysušit (Adam, et al., 2007, Ivanov, et al., 2003,Palecek, 2002). 2.5 Pomocné elektrody Tyto elektrody jsou tvořeny z kvalitních, chemicky nereaktivních vodičů. Využívá se platina (plíšek či drátek) nebo uhlíková tyčinka. Referentní elektroda musí mít větší plochu než pracovní elektroda, aby se zajistilo, že na pracovní elektrodě bude vždy správný potenciál. Její hlavní funkcí je tedy zbavení se proudového zatížení, které je na referentní elektrodě, čímž se sníží její šum a možná chyba ve stanovení (Adam, et al., 2007, Ivanov, et al., 2003, Palecek, 2002). 26

IV. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3. MATERIÁL A METODY Všechny použité chemikálie byly A.C.S. čistoty. Pufry a roztoky byly vždy před započetím experimentu připravovány ze zásobních roztoků, které byly uchovávány při teplotě 4 C ve tmě. 3.1 Použité chemikálie Cd(NO 3 ) 2 a Pb(NO 3 ) 2 zakoupeny firmou Sigma Aldrich (St. Louis, USA) byly rozpuštěny v H 2 0 A.C.S. čistoty jako zásobní roztoky o koncentraci 1 M. Acetátový pufr o ph 5,6 se skládal z 0,2 M CH 3 COOH + 0,2 M CH 3 COONa. Fosfátový pufr se skládal z 0,1 M NaCl + 50 mm Na 2 HPO 4 + NaH 2 PO 4 a 0,2 M NaCl + 100 mm Na 2 HPO 4 + NaH 2 PO 4 Chitosan byl zakoupen od firmy Fluka. Minerální olej byl zakoupen od firmy Sigma Aldrich (St. Louis, USA).Nanotrubice byly vyrobeny na VUT Brno. 3.2 Příprava uhlíkové pastové elektrody Mikro CPE: naváženo 0,02g Carbon, glassy, spherical powder 2-12um + 20 ul minerálního oleje, vše smícháno na achátové třecí misce Nano CPE1: naváženo 0,02g Carbon, glassy, spherical powder 2-12µm + 0,006g NANOcarbon VUT, vnější průměr OD 30-50 nm; vnitřní průměr ID = 5-15 nm; délka L = 0,5 200 µm + 30 µl minerálního oleje, vše smícháno na achátové třecí misce. Nano CPE2: naváženo 0,02g Carbon, glassy, spherical powder 2 12 µm + 0,006 g NANOcarbon VUT, vnější průměr OD=7-15nm; vnitřní průměr ID=5-6nm; délka L=0,5-200µm; MWCNTS + 30 µl minerálního oleje, vše smícháno na achátové třecí misce. 27

3.3 Elektrochemická analýza Elektrochemická analýza byla prováděna na přístroji CHI 440A Electrochemical Workstation (CH Instruments, Inc., U.S.A.), řízeném programem CHI Version 7.12. v tříelektrodovém zapojení. Jako referenční elektroda byla použita (Ag/AgCl, 3M KCl) a uhlíková tyčinka jako pomocná elektroda. Pracovní elektrodou byla CPE modifikovaná nanotrubicemi. Parametry metody: rozsah potenciálu : -1.2V do 0V,potenciálový krok = 4mV; Amplituda = 5mV; Frekvence (Hz) = 100(Hz); Doba akumulace(s) = 0-500;(s) Citlivost = 1.e -0,04 (A/V) 3.4 Rostlinný materiál V experimentech byly použity rostliny kukuřice seté (Zea mays, L.) F1 hybrid Gila. Zrna kukuřice byla naklíčena na vlhkém filtračním papíru ve speciálních nádobách ve tmě při teplotě 23,0 ± 2,0 C. Po 7 dnech po naklíčení byly rostliny umístěny do nádob obsahující vodovodní vodu a kultivovány v MLR-350 H (Sanyo, Japan) po dobu 8 dnů se 14 hod světelnou periodou (maximální intenzita světla byla kolem 100 µe.m-2s-1) při teplotě 23,5 25,0 C a vlhkosti 71 78 %. Rostliny rostoucí bez CdCl 2 byly použity jako kontroly. Další rostliny byly umístěny do nádob s vodovodní vodou, do které byl přidán CdCl 2 o koncentraci 0, 5, 10, 25, 50 a 100 µmol/l. 28

4. VÝSLEDKY A DISKUSE 4.1 Optimalizace stanovení kademnatých iontů pomocí elektrochemických metod Elektrochemie je pro svou vysokou citlivost, metodou velmi vhodnou pro stanovení těžkých kovů. Tato technologie umožňuje zmenšení měřicí instrumentace do takových rozměrů, které by byly snadno přenosné a schopné mimo-laboratorních měření. V neposlední řadě nesmíme opomenout možnosti kombinovat fyzikálněchemický převodník v podobě elektrody s biologickou složkou, kdy získáme biosenzor, který oproti výše zmíněným výhodám elektrochemie přináší do analytického systému prvek zvýšené selektivity (Krystofova, et al., 2010, Majzlik, et al., 2010). V současnosti roste stále větší zájem o uhlíkové pastové elektrody, které jsou modifikovány uhlíkovými nanotrubicemi. Předpokládá se, že přinesou výrazné zlepšení senzitivity, ale i selektivity. Těmito nanotrubicemi byla modifikována uhlíková pastová elektroda, která byla dále použita pro stanovení kademnatých a olovnatých iontů. Jelikož se jedná o zcela originální nanotrubice, byla nejdříve nutná optimalizace stanovení iontů kadmia. Z důvodu posouzení funkčnosti modifikované CPE byla optimalizace provedena ne jen na Cd 2+ ale i Pb 2+. 4.1.1 Vliv doby akumulace iontů Cd a Pb na odezvu signálu Prvním parametr, jenž byl studován, byla doba, po kterou je CPE vystavena iontům Cd 2+ a Pb 2+. Zaznamenávala se proudová odezva v jednotkách na (nano ampéry), která byla následně vyjádřena v procentech. Na obrázku 4 můžeme vidět výsledný graf pro jednotlivé připravené mikro CPE, nano CPE1 a nano CPE2. Všechny elektrody byly vystaveny Cd 2+ a Pb 2+ iontům po dobu 20, 40, 60, 80, 100, 120,140,160,180 a 200 sekund a následně bylo provedeno měření. Nejdříve byla studována mikro CPE jako kontrolní elektroda (Obrázek 4A). Vidíme, že s rostoucí dobou akumulace obou zkoumaných kovů se odezva signálu do doby 100 s výrazně neměnila. Nárůst signálu o 12 % jsme zaznamenali u doby akumulace 120s a také u doby 160s u iontů Cd 2+. Ionty Pb 2+ vykazovaly celkově nižší odezvu oproti iontů Cd 2+ Po té byl zaznamenán výrazný pokles obou signálů a to o 60 70 %. I zde ale bylo detekováno mírné zvýšení signálu o 9 % u 120 s a u doby akumulace 140 s bylo zvýšení o 13 %.Další měření bylo provedeno na nano 29

CPE1 a nano CPE2 (Obr. 4B a 4C). Obě nanouhlíkové elektrody se výrazně svým průběhem lišily od mikro CPE. Oba studované kovy poskytovali podobné signály u nano CPE2 dokonce olovnaté měli lepší odezvu než ionty kademnaté. U nano CPE1 jsme získali nejlepší odezvu signálu při době akumulace 100 s pro Cd 2+ a pro Pb 2+ 120 s. Nano CPE2 poskytovala nejvyšší signály při 120 s pro Cd 2+ a 100 s pro Pb 2+. A) 120 mikro CPE 100 Cd Pb Signal (%) 80 60 40 20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 120 B) nano CPE1 Doba akumulace (s) 120 nano CPE2 C) 100 Cd Pb 100 Cd Pb Signal (%) 80 60 40 Signal (%) 80 60 40 20 20 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Doba akumulace (s) 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Doba akumulace (s) Obr. 4 Závislosti doby akumulace kademnatých a olovnatých iontů na CPE elektrodách. A) mikro CPE, B) nano CPE, C) nano CPE2. 30

4.1.2 Vliv koncentrace Cd 2+ a Pb 2+ na odezvu signálu Optimalizací doby akumulace pro jednotlivé CPE jsme mohli přistoupit ke sledování vlivu koncentrace Cd 2+ a Pb 2+ na odezvu signálu. 4.1.2.1 Mikro CPE Opět jsem nejdříve začali s mikro CPE (Obr. 5). Mikro CPE vykazovala symetrické dobře charakteristické signály. Z obrázku je patrné, že olovnaté ionty měly výrazně nižší odezvu o proti iontům kademnatým. Podíváme-li se ale na rozsah linearit dosáhli jsme u obou kovů stejného limitu detekce 10 mm. Dále pro Cd inoty byl rozsah linearity od 100 0,1 mm s faktorem spolehlivosti R 2 = 0,97 naproti tomu pro Pb ionty byl rozsah linearity od 25 0,1 mm s faktorem spolehlivosti R 2 = 0,99. Signal (na) 400000 300000 200000 Cd 2+ y = 3075,x + 13159 R² = 0,971 Mikro CPE Signal (na) 100000 75000 50000 Pb2+ y = 2599,x + 3566, R² = 0,992 100000 25000 0 0 50 100 Koncentrace Cd 2+ mm 0 0 10 20 30 Koncentrace Pb 2+ mm Obr. 5 Závislosti koncentrací (mm) Cd 2+ a Pb 2+ na odezvu signálu pro mikro CPE. 4.1.2.2. Nano CPE1 Závislosti koncentrace na odezvě signálu pro nano CPE1 ukazuje Obr 6. Nano CPE1 elektroda poskytovala charakterističtější signály. Pokud se ale podíváme na graf pro olovnaté ionty vidíme, že limitu detekce jsme dosáhli při 6 mm koncentraci, ale lineární rozsah byl od 100 6 mm, R 2 = 0,99. U kademnatých iontů byl dosáhnut limit detekce 0,04 mm a linearita byla mezi 100 0,04 mm, R 2 = 0,97. 31

Signal (na) 400000 300000 200000 y = 3218,x + 7651, R² = 0,983 Nano CPE1 Cd 2+ Pb 2+ Signal (na) 80000 60000 40000 y = 605,4x + 715,7 R² = 0,983 100000 20000 0 0 50 100 Koncentrace Cd 2+ mm 0 0 Koncentrace 50 Pb 2+ mm 100 Obr. 6 Závislosti koncentrací (mm) Cd 2+ a Pb 2+ na odezvu signálu pro nano CPE1. 4.1.2.3 Nano CPE2 Poslední testovaná elektroda nano CPE2 poskytovala nejlepší elektrochemický signál. Limity detekce byly pro Cd 2+ ionty 0,02 mm a pro Pb 2+ ionty 0,08 mm (Obrázek 7). Lineární oblast pro Cd 2+ byla mezi 100 0,02 mm s R 2 = 0,98 a pro Pb 2+ byla linearita mezi 25 0,08 mm s faktorem spolehlivosti R 2 = 0,98. Signal (na) 400000 300000 200000 100000 y = 3269,x + 6920, R² = 0,983 Nano CPE2 Cd 2+ Pb 2+ Signal (na) 60000 40000 20000 y = 1942,x + 3236, R² = 0,962 0 0 50 100 150 Koncentrace Cd 2+ mm 0 0 10 20 30 Koncentrace Pb 2+ mm Obr. 7 Závislosti koncentrací (mm) Cd 2+ a Pb 2+ na odezvě signálu pro nano CPE2. 32

4.2 Modifikace uhlíkových pastových elektrod chitosanem Optimalizací detekce kademnatých a olovnatých iontů na vybraných CPE elektrodách jsme získali základní představu o jejich funkčnosti. Přesto, že nanotrubicemi modifikované CPE dosáhly celkově lepších výsledů než mikro CPE, limity detekce přesto zůstávají vysoké (µm). Dalším cílem tedy bylo, limity detekce snížit na koncentraci (nm). Pro tento cíl jsme zvolili další modifikaci CPE elektrod látkou chitosan. Chitosan je polysacharid výraběný deacetylací chitinu, který je obsažen v kostrách korýšů. Má schopnost na sebe vázat těžké kovy i některé jiné látky, a proto se také používá v čistírnách vod. Přidáním do uhlíkové pasty výrazně zvyšuje citlivost a detekční limit (Huang, et al., 2002, Xiang, et al., 2007). 4.2.1 Mikro CPE modifikovaná chitosanem Modifikovaná mikro CPE chitosanem vykazovala zvýšenou citlivost ke zkoumaným těžkým kovům a výraznou stabilitu elektrochemického signálu. Signály jsou lineárně závislé na koncentraci a mají stabilnější pozici oproti nemodifikovaným elektrodám. Limit detekce jsme naměřili 180 nm (Cd 2+ ) a 400 nm (Pb 2+ ). Jednotlivé kalibrační křivky jsou znázorněny na Obr. 8. 300 225 y = 0,182x + 75,02 R² = 0,984 chitosan mikro CPE Cd 2+ Pb 2+ 1600 1200 y = 1,247x - 16,66 R² = 0,964 Signal (na) 150 Signal (na) 800 75 400 0 0 0 500 1000 1500 Koncentrace Cd 2+ nm 0 500 1000 1500 Koncentrace Pb 2+ nm Obr. 8 Závislosti koncentrací (nm) Cd 2+ a Pb 2+ na odezvu signálu pro chitosan mikro CPE. 33

4.2.2 Nano CPE1 a nano CPE2 modifikovaná chitosanem Modifikací nano uhlíkových pastových elektrod, jsme dosáhli limitu detekce kademnatých iontů 100 nm u nano CPE1 a 10 nm u nano CPE2. Odezva signálu se vzrůstající koncentrací lineárně rostla od 100 500 nm, podle rovnice y = 0.393x + 24.3 s faktorem spolehlivosti R 2 = 0.9934 (Obrázek 9). Olovnaté ionty měly i zde horší odezvu. Lineární křivka byla v rozsahu hodnot 200 400 nm podle rovnice y = 0.722x - 46.8 s faktorem spolehlivosti R² = 0.9949(Obr. 10). 250 200 y = 0,393x + 24,3 R² = 0,993 Chitosan nano CPE1 Cd 2+ Pb 2+ 500 400 y = 0,722x - 46,8 R² = 0,994 150 300 Signal (na) 100 50 Signal (na) 200 100 0 0 200 400 600 Koncentrace Cd 2+ nm 0 0 500 1000 Koncentrace Pb 2+ nm Obr. 9 Závislosti koncentrací (nm) Cd 2+ a Pb 2+ na odezvu signálu pro chitosan nano CPE1. 34

200 160 Cd 2+ y = 0,530x + 14,05 R² = 0,968 Chitosan nano CPE2 200 160 Pb 2+ y = 0,378x + 13,61 R² = 0,981 Signal (na) 120 80 Signal (na) 120 80 40 40 0 0 200 400 Koncentrace Cd 2+ nm 0 0 200 400 600 Koncentrace Pb 2+ nm Obr. 10 Závislosti koncentrací (nm) Cd 2+ a Pb 2+ na odezvu signálu pro chitosan nano CPE2. 35

5. Porovnáni výsledků s literaturou 5.1 Výsledky uhlíkových pastových elektrod, které jsme používali při svých měřeních Použitá pasta Limit detekce pro Cd 2+ koncentrace mm/l Limit detekce pro Pb 2+ koncentrace mm/l mikro CPE 10 10 nano CPE 1 0,04 6 nano CPE 2 0,02 0,08 mikrocpe+ chitosan 0,000180 0,000400 nano CPE1+ chitosan 0,000100 0,000200 nano CPE2+ chitosan 0,000010 0,000400 Pro porovnání s literaturou jsem vybral dvě uhlíkové pasty, které dosahovaly nejlepších výsledku a zobrazovaly elektrochemickou odezvu v dobře vyvinutých pících. A to CPE 2 a CPE 2 obohacené chitosanem. Porovnával jsem se čtyřmi elektrodami z publikovaných vědeckých článků uvedených v tabulce, a to konkrétně s uhlíkovou elektrodou modifikovanou nanočásticemi bizmutu, tištěnou elektrodou obohacenou uhlíkovými nanotrubicemi a chitosanem, uhlíkovou elektrodou modifikovanou cysteinem a zlatou elektrodou. 36

5.2 Porovnávané elektrody 5.2.1 Pracovní tlustovrstvá uhlíková elektroda modifikovaná nanočásticemi bizmutu. Metoda : Square-wave voltametrie. Syntetizované bizmutové nanočástice přimíchané do vodného roztoku, který byl umístěn na pracovní elektrodu. Nastavení : rozsah potenciálu od -1.4 do 0.6 V, potenciálový krok 5mV, frekvence 20Hz, amplituda 25mV, akumulační čas 120 s, měřeno v acetátovém pufru ph 4.5 Pracovní elektrody o průměru 4mm (Rico, et al. 2009) 5.2.2 Tištěna elektroda obohacena nanotrubicemi a chitosanem Metoda :Diferenční pulzní voltametrie Nastavení: rozsah potenciálu -1.0 do -0.4V potenciálový krok 4mV, frekvence 50Hz, amplituda 50mV, akumulační čas 10s-20 s, měřeno v 0.1M KCl (Erborsy et al.2010) 5.2.3 Elektroda s uhlíkovými nanotrubicemi, chemicky modifikovanými cysteinem. Metoda : Square-wave voltametrie Nastavení : rozsah potenciálu -0,8 do 1V, potenciálový krok 4mV 0,1M acetátový pufr, ph 5,5 (Morton et al.2009) 5.2.4 Pracovní tlustovrstvá zlatá elektroda. Metoda : Square-wave voltametrie Nastavení: rozsah potenciálu -0.7V do 0.4V, doba akumulace 30s při akumulačním potenciálu 0,5V, potenciálový krok 3mV, frekvence 15 Hz, měřeno v 0.1M HCl, průměr pracovní plochy 3mm (Laschi, et al. 2005) 37

5.2.5 Nano CPE 2 a nano CPE 2 modifikovaná chitosanem Uhlíková pastová elektroda s nanotrubicemi MWCNTS (OD=7-15nm; vnitřní průměr ID=5-6nm; délka L=0,5-200µm) tyto nano trubice dosahovaly nejlepších hodnot a proto se s nimi dále pracovalo. Metoda : Diferenční pulzní voltametriemetrie Nastavení: rozsah potenciálu : -1.2V do 0V, potenciálový krok 4mV, frekvence 100Hz, doba akumulace 0-500 s Pro lepší porovnáni výsledku byly přepočítaný na molární hodnoty mm/l.. Použitá pasta/elektroda Limit detekce pro kadmium Limit detekce pro olovo Koncentrace mm/l Koncentrace mm/l CPE 2 0,02 0,08 CPE 2 + Chitosan 0,00001 0,0004 Uhlíková mod. Bizmutem 0,00071 0,00038 Uhlikova elektroda mod 0.0000044 0,0000016 chiosanem Uhlíková mod. cysteinem 0.000015 0.000001 Zlatá 0,000124 0,000445 Výše uvedené elektrody používají odlišnou měřicí metodu a mají různou pracovní plochu, což má velký vliv na výsledný limit detekce. Porovnávám jednotlivé elektrody jako výsledek celého systému. 38

5.3 Hygienické limity pro vodu podle MŽP ČR : µg/l Cd mm/l Cd Hygienické limity dané MŽP ČR µg/ l Pb mm/l Pb Podle Pitná voda 5.0 4.45x10-5 10 4.82x10-5 Vyhláška č. 252/2004 Balená kojenecká voda Balená přírodní a minerální voda 2.0 1.78x10-5 5 2.41x10-5 Vyhláška č. 275/2004 3.0 2.67x10-5 10 4.82x10-5 Vyhláška č. 275/2004 Podzemní Metodické pokyny MŽP ČR voda A 1.5 1.33x10-5 2 0.96x10-5 Věstník 3/1996 B 5.0 4.45x10-5 100 48.2x10-5 C 2.0 1.78x10-5 200 96.5x10-5 Odpadní voda A 50.0 44.5x10-5 D 1500 724x10-5 Příloha č. 1 k nařízení vlády č. B 100.0 89 x10-5 E 200 96.5x10-5 61/2003 Sb. C 200.0 178x10-5 F 500 24.1x10-5 Emisní limity pro kadmium v odpadních vodách vznikajících při: A- spalování odpadů B- povrchové úpravě kovů a plastů C- smaltování, lakování, obrábění a elektrotechnické výrobě. Emisní limity pro olovo v odpadních vodách vznikajících při: D-výrobě a zpracování skla E-spalování odpadů F-strojírenství, barevné metalurgii a elektrotechnickém průmyslu 39

Vysvětlivky k limitům kadmia a olova v podzemních vodách podle Metodického pokynu MŽP ČR 3/1996. Překročení limitů kategorie A v zeminách (a podzemních vodách) se podle Metodického pokynu MŽP ze dne 3. 7. 1996 posuzuje jako znečištění příslušné složky životního prostředí vyjma oblastí s přirozeným vyšším obsahem sledovaných látek. Překročení limitů B se posuzuje jako znečištění, které může mít negativní vliv na zdraví člověka a jednotlivé složky životního prostředí a které vyžaduje další opatření. Překročení limitů C představuje znečištění, které může znamenat významné riziko ohrožení zdraví člověka a složek životního prostředí. Překročení limitu C zároveň vyžaduje dekontaminaci území pro daný účel(věstník 3/1996). Z této tabulky hygienických limitů MŽP ČR vyplývá, že uhlíkovými pastovými elektrodami obohacenými chitosanem lze měřit koncentraci kadmia ve všech typech vod. 5.4 Metody zlepšení výsledku V této části bych se chtěl zaměřit na možnosti zlepšení měření a zvýšení limitu detekce iontu těžkých kovů. 1. Chitosan, který se používal, byl ve formě šupinek, a nešlo jej v achátové misce dokonale rozdrtit. Dokonale rozemletý by měl větší adsorbční plochu pro ionty těžkých kovů. Dalo by se ho přimísit do uhlíkové pasty daleko větší množství aniž by se výrazně snižovala její vodivost. Velké šupinky bobtnaly v uhlíkové pastě a způsobovaly její rozpad do pufru. Tím se musela snížit doba akumulace na dobu, po kterou to uhlíkova pasta bezpečně vydrží. 2. Specifické nastavenícitlivosti potenciostatu pro detekci nízkých limitů detekce. 3. U psaty nano CPE 2 obohacene chitosanem, která dávala nejlepší limit detekce a stabilni elektrochemickou odezvu, vyzkoušet ruzne poměry uhliku, nanotrubic a chitosanu. 40

6. Sledování vlivu kademantých iontů na Zea mays, L. Po optimalizaci a charkterizaci elektrochemické detekce kademnatých a olovnatých iontů jsme mohli přistoupit k biologické části experimentu, a to ke sledování vlivu Cd 2+ na růst a morfologické změny Zea mays, L., a na syntézu fytochelatinů. Rostliny vystavené abiotickému stresu jsou nuceny zvýšit syntézu různých biologicky aktivních molekul, jako jsou sloučeniny obsahující volné SH skupiny (glutathion, fytochelatiny, metalothioneinu a podobné proteiny) (Babula, et al., 2010, Zehnalek, et al., 2004,). Nejčastěji se využívá k detekci těchto látek vysoce účinná kapalinová chromatografie ve spojení s různými typy detektorů. K charakterizaci tiolových sloučenin lze také využít elektrochemických metod, jako jsou diferenční pulsní voltametrie.(zitka, et al., 2009,, Zitka, et al., 2007). 6.1 Vliv kademnatých iontů na růst Zea mays, L. Rostliny byly vystaveny abiotickému stresu způsobeným kademnatými ionty o koncentraci 0, 5, 10, 25, 50 a 100 µm/l. Rostliny rostly po dobu 10 dnů se 14 hod světelnou periodou (maximální intenzita světla byla kolem 100 µe.m -2 s -1 ) při teplotě 23.0 25.0 C a vlhkosti 75 80 %. Vzorky byly odebrány po 10 dnech růstu. Na Obr. 11 můžeme vidět fotografie testovaných rostlin při zvolených koncentracích Cd 2+. Vidíme, že rostliny bez vlivu Cd 2+ (0 µm/l Cd 2+ ) vykazovaly zcela normální růst bez žádné inhibice, tyto rostliny sloužily po celou dobu experimentu jako kontrolní vzorky. U koncentrace 5 µm/l Cd 2+ byl zaznamenán výraznější přírůst a rostliny nevykazovaly žádné morfologické změny, naopak zde došlo k mírné stimulaci růstu. Od koncentrace 10 µm/l Cd 2+ byly vidět morfologické změny a postupná inhibice růstu, které se projevovaly se vzrůstající koncentraci Cd 2+. Největší deformace rostlinných orgánů a inhibice růstu byla zaznamenána při koncentraci 100 µm/l Cd 2+. 41

0 mol/l 5 mol/l 10 mol/l 25 mol/l 50 mol/l 100 mol/l Obr.11 Rostliny kukuřice (Zea mays, L.)kultivované za přítomnosti kademnatých iontů o konentraci ( 0, 5, 10, 25, 50 a 100 µm/l). 6.1.1 Růstové závislosti Růstové závislosti rostlin kukuřice délka (mm) podzemní i nadzemní části v závislosti na množství Cd 2+ jsou ukázány na Obr. 12. Hnědé sloupečky ukazují podzemní část a zelené nadzemní část rostliny. Vzorky byly odebrány 10 dne růstu. Výsledky ukazují, že se zvyšující se koncentrací Cd 2+ v roztoku rostla i inhibice růstu. U podzemní části byla pozorována inhibice, tedy kořeny rostly pomaleji oproti kontrole. Nadzemní část rostliny vykazovala u koncentrace 5 µm/l Cd 2+ mírný nárůst a aktivnější růst oproti kontrole. Je obecně známo, že nízké koncentrace kovů v prostředí mohou stimulovat růst kořenů (Arduini et al.,2004) Ale se vzrůstající koncentrací kovu v prostředí se růst nadzemní i podzemní časti snižuje. Jak ale ukazuje Obr. 12, vidíme, že od koncentrace 10 µm/l Cd 2+ dochází už k výrazné inhibici růstu. 42