Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové katedra biologických a lékařských věd

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové katedra biologických a lékařských věd Význam stanovení aktivovaného parciálního tromboplastinového času a porovnání citlivosti parciálních tromboplastinů k lupus antikoagulans, deficitu koagulačních faktorů a heparinu Bakalářská práce Praha, 2011 Dagmar Drábková

Prohlašuji, ţe tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichţ jsem při zpracování čerpal(a), jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla vyuţita k získání jiného nebo stejného titulu. datum: podpis:

Poděkování Ráda bych touto cestou poděkovala svým vedoucím bakalářské práce Prof. MUDr. Janu Kvasničkovi, DrSc. a Mgr. Iloně Fátorové za pomoc při zpracování této práce. Mgr. Ivaně Malíkové za její vysoce profesionální a odborný přístup, protoţe bez její pomoci bych tuto práci nemohla realizovat. Dále svému kolegovi Bc. Jaroslavu Andělovi za pomoc při výběru a laboratorním zpracování vzorků. V neposlední řadě mé velké díky patří mojí rodině, která mi vycházela vstříc po celou dobu mého studia.

Obsah: Abstrakt... 6 1. Úvod... 7 2. Cíl práce... 8 3. Teoretická část... 9 3.1. Aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aptt)... 9 3.1.1. Historie objevu... 9 3.1.2. Princip metody... 9 3.1.3. aptt reagencie... 9 3.1.4. Odběr krve pro vyšetření aptt... 10 3.1.5. Vyjadřování výsledku aptt... 10 3.1.6. Význam stanovení aptt... 10 3.2. Fyziologie krevního sráţení... 11 3.2.1. Krevní sráţení... 11 3.2.2. Primární hemostáza... 11 3.2.3. Systém plazmatických koagulačních faktorů... 12 3.2.4. Koagulační faktory... 13 3.2.5. Přirozené inhibitory krevního sráţení... 15 3.2.6. Fibrinolytický systém... 15 3.3. Patofyziologie hemostázy... 16 3.3.1. Poruchy cévní stěny... 16 3.3.2. Poruchy krevních destiček... 16 3.3.2. Poruchy koagulačních faktorů... 17 3.4. Trombotické stavy... 18 3.4.1. Zvýšení faktoru VIII... 18 3.4.2. Defekt faktoru XII... 18 3.4.3. Získané inhibitory krevního sráţení... 19 3.4.4. Antifosfolipidový syndrom... 19 3.5. Moţnosti léčby krvácivých stavů... 19 3.6. Moţnosti léčby trombotických stavů... 20 3.6.1. Heparin... 20 3.6.2. Standardní heparin (UHF)... 20 3.6.3. Nízkomolekulární heparin (LMWH)... 20 3.6.4. Monitorování léčby heparinem... 21 3.6.5. Reptilázový čas... 21 4. Praktická část... 22 4.1. Definice souboru... 22 4.1.1. Kontrolní soubor... 22 4.1.2. Soubor lupus anikoagulans... 22 4.1.3. Soubor vysoký faktor VIII... 23 4.1.4. Soubor nízký faktor VIII... 23 4.1.5. Soubor heparin... 24 4.2. Odběr a zpracování vzorků... 24 4.3. Metodika pro koagulační stanovení... 24 4.3.1. Stanovení aptt... 25 4.4. Analyzátory... 26 4.4.1. Koagulometr BCS XP... 26

4.4.2. Koagulometr AMAX Destiny... 26 4.5. Kontrola kvality... 26 4.5.1. Vnitřní kontrola kvality... 26 4.5.2. Vnější (externí) kontrola kvality... 27 4.5.3. Nejistota měření... 27 4.6. Zpracování naměřených dat... 27 4.6.1. Data kontrolního souboru... 27 4.6.2. Data souboru lupus antikoagulans... 28 4.6.3. Data souboru vysoký faktor VIII... 30 4.6.4. Data souboru nízký faktor VIII... 31 4.6.5. Data souboru heparin... 32 4.6.6. Vyhodnocení citlivostí jednotlivých reagencií... 33 5. Diskuze... 34 6. Závěr... 36 7. Pouţitá literatura... 37 8. Přílohy... 39

Abstrakt Aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aptt) je koagulační test pro odhalování poruch hemostázy a nejpouţívanější test pro monitorování léčby nefrakcionovaným heparinem. V parciálním tromboplastinu jsou přítomny kontaktní aktivátory a fosfolipidy, které mohou významně ovlivnit citlivost reagencie ke koagulačním faktorům, lupus antikoagulans a heparinu. Cílem práce bylo porovnat citlivost parciálních tromboplastinů (s odlišným původem fosfolipidů a různými aktivátory) k lupus antikoagulans, ke sníţeným a zvýšeným hladinám koagulačního plazmatického faktoru VIII a citlivost ke standardnímu heparinu. Dále na základě naměřených dat zjistit, zda některá z vybraných reagencií umoţňuje odhalit současně deficit koagulačního faktoru, přítomnost inhibitoru a zároveň je vhodný k monitorování heparinu. Stanovení aptt bylo provedeno s pěti reagenciemi s různým původem fosfolipidů a s rozdílnými aktivátory. Měření byla provedena na plně automatickém koagulometru BCS XP. Z naměřených dat jsme zjistili, ţe ţádný z testovaných tromboplastinů neměl 100% citlivost ke všem zmíněným faktorům. Pathromtin SL je vyuţíván hlavně pro rutinní stanovení a kontrolu léčby heparinem. Pathromtin SL a APTT LS se jeví jako nejlepší pro záchyt sníţených hladin faktoru VIII. Na vysoké hladiny faktoru VIII nejcitlivěji reaguje APTT LS a na screeningový záchyt Lupus antikoagulans je citlivý APTT SP, APTT LS a Pathromtin SL. Abstract Activated partial thromboplastin time (aptt) is coagulation test which detect the disturbances of hemostasis and it is the most common test for monitoring unfractioned heparin therapy. In parcial tromboplastin are present activators of contact phase and phospholipids which can significantly affect the sensitivity of reagents to coagulation factors, lupus anticoagulans and heparin. The objective of this study was firstly to compare the sensitivity of parcial tromboplastins with different origins of fosfolipids and various activators to lupus anticoagulans, to decreased and increased levels of coagulation plasmatic factor VIII and sensitivity to standard heparin. Secondly, according to measured data to determine whether any of the selected reagents is suitable for monitoring heparin while being able to detect deficit of coagulation factors and presence of inhibitor. Determination of aptt was performed with five different reagents which had various phospholipids and activators. The measurements of appt were performed on automatic analyzer BCS XP. From the measured data we have found that none of the tested tromboplastins had 100% sensitivity to all referred factors. Pathromtin SL is mainly used for coagulation screening and monitoring heparin therapy. Pathromtin SL a APTT LS appear to be the most sensitive for decreasing the level of factor VIII. The best for high levels of factor VIII is APTT LS and for screening of Lupus anticoagulans the most sensitive are APTT SP, APTT LS a Pathromtin SL. 6

1. Úvod Krevní sráţení je proces, který probíhá v organismu fyziologicky při porušení cévní stěny. Jde o souhru koagulačních plazmatických, cévních i buněčných faktorů, které musí být v rovnováze, jinak můţe docházet ke stavům se sklonem ke krvácení nebo naopak k nadměrnému sráţení krve. Oba tyto stavy jsou ţivot ohroţující, proto je nutné celý proces sráţení kontrolovat. Významnou úlohu zde má hematologická laboratoř, kde je pomocí komplexních vyšetření moţné tyto stavy odhalovat a následně kontrolovat jejich léčbu. Mezi rutinně prováděná vyšetření v rámci poruch hemostázy patří hodnocení krevního obrazu zejména počtu krevních destiček a koagulační vyšetření protrombinový čas, aktivovaný parciální tromboplastinový čas, trombinový čas, fibrinogen, antitrombin, D-dimery. Ke speciálním vyšetřením patří např. vyšetření primární hemostázy - agregace trombocytů prováděná na optickém a impedančním agregometru nebo na speciálním přístroji PFA 100, vyšetření hladin koagulačních faktorů, stanovení lupus antikoagulans a antifosfolipidových protilátek a dále i molekulárně genetická vyšetření mutace faktoru V Leiden, mutace faktoru II protrombin, mutace v genu pro metylentetrahydrofolátreduktázu 677 a současně s tím i vyšetření hladiny homocysteinu. Léčba jak krvácivých, tak trombotických stavů musí být kontrolována, aby nedošlo k závaţným komplikacím, které by nemocného poškodily. Při akutních stavech můţe dojít u pacienta ke zvýšení hladiny fibrinogenu a faktoru VIII a tím narůstá trombofilní riziko, při léčbě trombotických stavů můţe naopak dojít k nadměrnému krvácení. Aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aptt) je základní koagulační test, který nám pomáhá vyhledávat deficit koagulačních faktorů VIII, IX a faktorů fáze kontaktu, které jsou provázeny krvácivými stavy. S prodlouţenými časy aptt se můţeme setkávat v přítomnosti získaných inhibitorů krevního sráţení. A v neposlední řadě je to nejpouţívanější test k monitorování léčby nefrakcionovaným heparinem. 7

2. Cíl práce (zadání) Cílem práce je porovnat citlivost parciálních tromboplastinů s odlišným původem fosfolipidů a různými aktivátory k lupus antikoagulans, sníţené a zvýšené hladině koagulačního plazmatického faktoru VIII a citlivost ke standardnímu heparinu. Na základě naměřených dat zjistit, zda některá z vybraných reagencií umoţňuje v rutinním provozu koagulační laboratoře odhalit současně deficit koagulačního faktoru, přítomnost inhibitoru a zároveň je vhodný k monitorování heparinu. 8

3. Teoretická část 3.1. Aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aptt) 3.1.1. Historie objevu Aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aptt aktivated parcial tromboplastine time) zavedl do klinické praxe Samuel I. Rapaport a R. R. Proctor1 v roce 1961 přidáním kaolinu jako aktivátoru. Dříve se prováděl tento test bez přídavku aktivátoru, jako parciální tromboplastinový čas, vyšetření však bylo méně specifické s delšími fyziologickými hodnotami neţ u aptt. 1 3.1.2. Princip metody Aktivovaný parciální tromboplastinový čas je základní koagulační test 2, který sleduje koagulační děje od vnitřní cesty aktivace přeměny protrombinu na trombin aţ po tvorbu fibrinového vlákna. 1 Přidáním parciálního tromboplastinu (např. kefalin, jako náhrada za destičkový fosfolipid) a vápenatých iontů k vyšetřované citrátové plazmě dochází k aktivaci tzv. vnitřní cesty koagulace. Rychlost tvorby fibrinu je závislá zejména na koncentraci koagulačních faktorů XII, XI, IX a VIII. K urychlení aktivace je přidáván aktivátor, kterým můţe být kaolin, křemičitany nebo kyselina elagová. Kontaktní fáze vyţaduje aktivaci některých sloţek 1 z tohoto důvodu se citrátová plazma společně s aptt reagencií inkubuje při teplotě 37 C nejčastěji 180 s. Po této době jsou přidány kalciové ionty a sleduje se čas potřebný k utvoření fibrinu. 3.1.3. aptt reagencie K vyšetření aktivovaného parciálního tromboplastinového času jsou dnes pouţívány komerčně vyráběné reagencie, které se ve svém sloţení mohou lišit. Jako aktivátor se pouţívají látky s negativně nabitými povrchy kaolin, kyselina elagová, křemičitany, polyfenoly nebo sulfamidy kombinované s kaolinem 1. Důleţitou součástí reagencie jsou fosfolipidy, které mohou vykazovat zvýšenou citlivost k heparinu, lupus antikoagulans nebo koagulačním plasmatickým faktorům. Fosfolipidy mohou být rostlinného, zvířecího nebo syntetického původu. 9

Kalciové ionty jsou přítomny v 0,025 M 4 roztoku chloridu vápenatého, který je dodáván v setu s reagencií aptt nebo ho pro laboratoř připravuje nemocniční lékárna. 3.1.4. Odběr krve pro vyšetření aptt Všechny odběry ţilní krve pro hematologická vyšetřeni musí být provedeny za standardních podmínek. Nejčastěji se provádí odběr venózní krve z loketní ţíly a staţení paţe by mělo být co nejkratší. 5 Pořadí odběrových zkumavek z jednoho vpichu je následující: odběr na hemokulturu (pokud se provádí) vţdy jako první 6, pak následuje odběr do zkumavky bez přísad a teprve poté můţe být odebrána zkumavka na hemokoagulační vyšetření. Pro hemokoagulační vyšetření se odebírá ţilní krev do protisráţlivého činidla citrátu sodného o koncentraci 0,109 mol/l nebo 0,129 mol/l v poměru mnoţství citrátu ku mnoţství krve 1:9. 1 Nedodrţením poměru odebrané krve k protisráţlivému činidlu pro vyšetření aptt dochází ke zkreslení výsledku a to směrem k hodnotám patologickým. 7 Bezprostředně po odběru musí být krev s činidlem promíchána pomalým opakovaným otáčením minimálně 5x. 6 Odběr krve pro všechna koagulační vyšetření se nesmí provádět z centrálních ţilních katetrů ani kanyl, protoţe i po odstranění prvních deseti mililitrů krve získáváme zkreslené výsledky aptt a trombinového času. 8 3.1.5. Vyjadřování výsledku aptt Zároveň s vyšetřovanou plazmou vyšetřujeme i tzv. denní normál. Denní normál je směsná (poolovaná) plazma od minimálně deseti zdravých dárců. Výsledky mohou být vyjadřovány: 1. V sekundách s udáním času denního normálu 2. Jako poměr časů R = čas vyšetřované plazmy/čas denního normálu Normální hodnoty aptt se liší podle typu pouţité reagencie od 25 do 45 sekund, poměr časů R se pohybuje v rozmezí od 0,8 do 1,2 je stejný pro všechny reagencie. 2 3.1.6. Význam stanovení aptt Hlavním významem sledování aptt je prodlouţení jeho času a to zejména z důvodu sníţené hladiny jednoho z faktorů vnitřní cesty koagulace zejména faktoru 10

VIII, IX, XI, XII, prekalikreinu a vysokomolekulárního kininogenu. Je-li sočasně prodlouţený protrombinový čas můţeme uvaţovat o nedostatku faktoru X, ale i FV, protrombinu a fibrinogenu. V současné době patří tento test k nejpouţívanějším pro monitorování léčby nefrakcionovaným heparinem. 9 S prodlouţenými časy se můţeme setkávat i v přítomnosti získáných inhibitorů krevního sráţení lupus antikoagulans, protilátka proti faktoru VIII ad. Se zkrácenými časy se setkáváme u trombofilních stavů, hlavně u vysoké hladiny faktoru VIII. 3.2. Fyziologie krevního srážení 3.2.1. Krevní srážení Fyziologicky probíhá krevní sráţení v organismu při porušení cévní stěny a podílí se na něm všechny buněčné i plazmatické sloţky koagulačního systému přítomného v krvi. K základním mechanismům hemostázy patří - primární hemostáza, systém koagulačních plazmatických faktorů, fibrinolytický systém a inhibitory krevního sráţení a fibrinolýzy. 3 3.2.2. Primární hemostáza Krevní sráţení je zahájeno v okamţiku narušení integrity cévní stěny. Po poškození endotelu a obnaţení subendotelových struktur kolagenních vláken, která jsou vysoce trombogenní, je zahájena tvorba primární krevní zátky. Prvním krokem je adheze krevních destiček pomocí glykoproteinových receptorů k obnaţeným kolagenním vláknům, které zprostředkovává von Willebrandův faktor nebo fibronectin. 10 Po kontaktu s kolagenem začne trombocyt měnit svůj tvar na kulatý a začnou se tvořit tzv. pseudopodia dochází k uvolňovací reakci, při které jsou z granulí destiček uvolňovány látky v nich obsaţené. Následuje agregace, při které dochází ke vzájemnému spojování destiček za účelem vytvoření trombu. Nejprve vzniká nepevný reverzibilní agregát, v druhé agregační vlně vzniká pevný ireverzibilní agregát. Aby agregace probíhala je zapotřebí přítomnost induktorů kolagen, epinefrin, trombin, ADP, Ca 2+. Posledním krokem je smrštění primární zátky retrakce. Retrakce je funkce destiček, která odpovídá kontrakci svalů, a in vivo slouţí k podpoře uzavření rány. 9 11

Hlavní úlohu v primární hemostáze hraje cévní stěna, krevní destičky a adhezivní proteiny (von Willebrandův faktor, fibronektin, vitronektin), které jsou produkovány cévním endotelem a leukocyty při aktivaci krevních destiček. 3.2.3. Systém plazmatických koagulačních faktorů Cílem krevního sráţení je utvoření nerozpustného fibrinu, který vznikne postupnou a hlavně regulovanou kaskádovitou enzymatickou reakcí. Na začátku 20. století byla známa závěrečná fáze krevního sráţení. V roce 1905 navrhl Morawitz základní koagulační schéma 9, ve kterém popisuje aktivaci protrombinu na trombin a trombinem katalyzovanou tvorbu fibrinu z fibrinogenu. 11 Postupně se podařilo dokázat existenci dvou cest aktivace protrombinu cesta zevní, při které dochází k vazbě tkáňového faktoru na faktor VIIa. Tento komplex spolu s Ca 2+ a fosfolipidy aktivují faktor X, který společně s faktorem Va, Ca 2+ a fosfolipidy tvoří komplex protrombinázu. Protrombináza štěpí protrombin na trombin a ten katalyzuje přeměnu fibrinogenu na fibrin. Trombin vzniklý touto cestou aktivuje trombocyty. Vnitřní cesta koagulace cesta fáze kontaktu, není dodnes zcela objasněna a pravděpodobně funguje na aktivních površích in vitro. 11 V přítomnosti kalikreinu a HMWK dojde k navázání faktoru XII na negativně nabitý povrch, následně je aktivován faktor XI, který aktivuje faktor IX a společně s Ca 2+, fosfolipidy a faktorem VIII, který byl aktivován trombinem utvoří komplex vnitřní tenázu, která aktivuje faktor X a utvoří se komplex protrombináza (obr. 1). Všechny dosavadní poznatky o sráţení krve byly pouţity do nového modelu, který má tři fáze, podle zvyšujícího se mnoţství trombinu: 1. Fáze iniciace zahajovací, začíná utvořením komplexu TF-FVIIa, probíhá na povrchu buněk a v této fázi je utvořeno jen malé mnoţství trombinu. 2. Fáze amplifikace probíhá na adherovaných destičkách, které byly aktivovány vytvořeným trombinem, účastní se jí faktory Va, VIIIa a IXa. 12 3. Fáze propagace dochází k uvolnění trombinu v mnoţství schopném přeměnit fibrinogen na fibrin, děj probíhá na buněčných površích např. monocytů a aktivovaných destiček, na kterých jsou navázané koagulačně aktivní komplexy protrombináza a tenáza. 3 12

Obr. č. 1: Schéma koagulační kaskády Klíčovým enzymem celé koagulační kaskády je trombin, který působí nejen koagulačně, ale i antikoagulačně a uplatňuje se v procesu hojení. K jeho nejdůleţitější funkci patří štěpení fibrinogenu na fibrin 24, dále limitovanou proteolýzou aktivuje faktory V a VIII (pozitivní zpětná vazba), při větším mnoţstvím jsou tyto faktory trombinem degradovány. 9 Z dalších koagulačních faktorů aktivuje faktor XIII a faktor IX. Je významným induktorem krevních destiček. Po navázání na trombomodulin aktivuje protein C a TAFI. Posiluje sekreci a tvorbu t-pa na endotelu. 3.2.4. Koagulační faktory Koagulační faktory jsou označovány římskými číslicemi tak, aby byly odlišeny od komplementu, kde se pouţívají číslice arabské. Aktivované formy koagulačních faktorů označujeme indexem a. I dnes však dáváme u některých faktorů přednost původnímu názvu. Např. fibrinogen faktor I, protrombin faktor II, jejich aktivované formy fibrin faktor Ia, trombin faktor IIa, tkáňový faktor nebo tromboplastin pro faktor III a kalciové ionty pro faktor IV. 13

Z biochemického hlediska jsou koagulační faktory proenzymy převáţně tvořené v játrech. Faktory II, VII, IX, X, XII, prekalikrein jsou serinové protézy, jejich aktivní místo obsahuje serin. Faktor VIII, V a vysokomolekulární kininogen (HMWK) jsou kofaktory, které se po rozštěpení účastní tvorby koagulačně aktivních komplexů. Faktor XIII - faktor stabilizující fibrin je transglutamináza. Faktory II, VII, IX a X potřebují ke své syntéze vitamin K 25. Důleţitou úlohu v krevním sráţení hrají kalciové ionty, které připojují γ- karboxylovou skupinu kyseliny glutamové koagulačních faktorů závislých na K vitaminu (FII, VII, IX, X) na fosfolipidy. Jsou součástí koagulačních komplexů tenázy - [FVIIIa.IXa], [TF.FVIIa], protrombinázy [FVa.Xa.PL.Ca 2+ ] a inhibičního komplexu [TFPI.Xa.VIIa.TF]. 1 Faktor VIII (antihemofilický faktor) Faktor VIII je glykoprotein, který je v cirkuluje v plazmě v komplexu s vwf, v tomto komplexu je FVIII chráněn před štěpením aktivovaným proteinem C a FXa. Faktor VIIIa v komplexu s faktorem IXa, fosfolipidy a Ca 2+ tzv. tenáza, štěpí faktor X na Xa. Faktor IX (Christmas faktor) Faktor IX je K-dependenní glykoprotein syntetizovaný v játrech. Spolu s kofaktorem VIIIa, fosfolipidy a Ca 2+ tvoří tzv. vnitřní tenázu, která aktivuje faktor X na Xa. Faktor XI (PTA - plasmatický předchůdce tromboplastinu, Rosenthalův faktor) Faktor fáze kontaktu syntetizovaný v játrech v plazmě koluje ve formě proenzymu jako monodimer, je přítomen i v trombocytech, ale není stejný jako v plazmě. 13 K aktivaci dochází limitovanou proteolýzou FXIIa v přítomnosti HMWK a fosfolipidů. Při deficitu FXII dochází k aktivaci FXI pomocí prekalikreinu, který je navázán na trombocytech. 13 14

Faktor XII (Hagemanův faktor) Glykoprotein syntetizovaný v játrech. Faktor je aktivován kontaktem např. se subendotelovými strukturami, ale i jiným aktivačními povrchy sklo, kyselina elagová, chrupavka, kaolin atd. Tento faktor je nalézán jak v plazmě, tak v séru. Prekalikrein (PK, Fletcherův faktor) Prekalikrein je γ-globulin tvořený v játrech. V plazmě cirkuluje ve vazbě na vysokomolekulární kininogen. Vysokomolekulární kininogen (HMWK) HMWK je syntetizován v játrech a endotelu pupečníkových ţil. 13 Je kofaktorem aktivace faktoru FXII kalikreinem. 3.2.5. Přirozené inhibitory krevního srážení Krevní sráţení je dynamický proces, který musí být regulován, tak aby probíhal pouze v místě poranění. Tuto úlohu plní přirozené inhibitory krevního sráţení. Antitrombin je nejvýznamnějším inhibitorem serinových proteáz 3 trombinu, FXa, FXIa, FXIIa, FIXa, kalikreinu, komplexu [TF.FVIIa], tvoří s nimi ireverzibilní komplex. V přítomnosti heparinu se z něj stává progresivní inhibitor. 13 Systém proteinu C spolu s TFPI a antitrombinem patří k nejúčinnějším inhibitorům krevního sráţení. Aktivovaný protein C inaktivuje FVIIIa a FVa tak, ţe je proteolyticky štěpí. 3 K dalším důleţitým inhibitorům krevního sráţení patří inhibitor aktivovaného proteinu C (PCI), inhibitor zevní cesty koagulace (TFPI) a nespecifické inhibitory α 2 -makroglobulin, C-1 inhibitor a α 2 -antitrypsin. 3.2.6. Fibrinolytický systém Hlavní úlohou fibrinolýzy je rozpuštění sraţeniny a zprůchodnění cévy. Rozpuštění stabilního fibrinu zajišťuje plazmin, který vznikl aktivací plazminogenu. K aktivaci plazminu dochází buď vnitřní cestou pomocí faktorů fáze kontaktu (FXIIa, prekalikrein, HMWK), trombinem a trypsinem, nebo zevní cestou urokinázou (u-pa) a tkáňovým aktivátorem plazminogenu (t-pa). I tento proces musí být regulován. Tuto úlohu plní α 2 - antiplazmin, který spolu s inhibitorem aktivátoru plazminogenu (PAI) je nejdůleţitější inhibitor fibrinolytického systému. 15

3.3. Patofyziologie hemostázy Poruchy krevního sráţení mohou být provázeny krvácivými stavy hypokoagulace nebo naopak zvýšeným sklonem ke krevnímu sráţení hyperkoagulace. Stavy spojené s poruchami krevního sráţení mohou být vrozené nebo získané. 3.3.1. Poruchy cévní stěny Vrozenou poruchou cévní stěny provázenou krvácením je Oslerova-Weberova- Renduova choroba, hereditární teleangiektázie. Jedná se o onemocnění s autozomálně dominantní dědičností, 14 provázené krvácením z nosu, dělohy a konečníku. Pacienti s touto diagnózou nejsou ohroţeni na ţivotě. Ze získaných poruch cévní stěny provázených krvácením to jsou zejména avitaminózy nedostatek kyseliny askorbové a léčba glukokortikoidy například u Cuschingova syndromu. Krvácení do kůţe a do glomerulů ledvin můţe být způsobeno cirkulujícími imunokomplexy u Henochovy- Schönleinovy purpury. 3.3.2. Poruchy krevních destiček Poruchy se mohou týkat změn v počtu trombocytů nebo jejich funkčnosti: Trombocytopenie sníţení počtu destiček pod 100 150. 10 9 /l. 2 Při poklesu pod 20. 10 9 /l dochází ke spontánnímu krvácení. Ke vzniku trombocytopenie můţe dojít z důvodu sníţené tvorby destiček v kostní dřeni nebo jako důsledek předčasného zániku, ztráty nebo spotřeby. Trombocytózy stav charakterizovaný zvýšeným počtem krevních destiček nad 400 500. 10 9 /l. 2 setkáváme se s ní u stavů po splenektomii (vzestup aţ nad 1000. 10 9 /l), u infekcí, anémií z nedostatku ţeleza, po krvácení. Provází-li zvýšený počet destiček myeloprolyferativní onemocnění (esenciální trobocytémie, polycytemia vera, chronická myeloidní leukemie) hovoříme o trombocytémii. trombocytopatie porucha funkce destiček. Trombocytopatie je porucha funkce destiček, která můţe být vrozená např. Bernard-Soulierův syndrom charakteristický nálezem makrotrombocytů, Glanzmannova-Naegeliho trombastenie, s přítomností poruchy agregace po ADP, trombinu, kyselině arachidonové a epinefrinu nebo získaná, nejčastěji jako důsledek léčby např. kyselinou acetylsalicylovou, nesteroidními antiflogistiky, 16

kortikosteroidy, antibiotiky, ale téţ jako průvodní jev myeloprolyferativního onemocnění, myelodysplastického syndromu, renální insuficience, leukemie, jaterního onemocnění nebo lymfoprolyferativního onemocnění. 3.3.2. Poruchy koagulačních faktorů Vrozené krvácivé stavy způsobené deficitem nebo dysfunkcí koagulačních faktorů jsou velmi vzácné Sníţené hladiny faktorů nebo jejich poruchy mohou být odhaleny příslušnými koagulačními testy protrombinový čas, aktivovaný tromboplastinový čas, trombinový čas. Hemofilie Hemofilie je vzácné gonosomálně recesivní onemocnění s vazbou na chromozom X. Aby trpěla hemofilií ţena, musí být dvojitý heterozygot X H X H, nebo hemizygot např. Turnerův syndrom (X0). 15 Podle postiţeného faktoru rozlišujeme hemofilii A postiţení faktoru VIII a hemofili B postiţení faktoru IX. Stupeň závaţnosti hemofilie je dán koagulační aktivitou daného faktoru. U hemofilie A rozlišujeme: subhemofilii u které se pohybuje funkční aktivita faktoru VIII (FVIII:C) 16-50% a projevuje se hematomy po úrazu, lehká hemofilie FVIII:C 5 15 % je provázena pooperačním krvácením, u středně těţké hemofilie FVIII:C 2 4 % se tvoří hematomy po lehkém traumatu u těţké hemofilie FVIII:C 1 % je přítomno spontánní krvácení a vţdy hemartros. 16 Defekt faktoru XI S vrozeným deficitem faktoru XI se setkáváme v ţidovské populaci Aškenázy. 17 Je provázen těţkými krvácivými stavy. U koagulopatií se setkáváme s různými projevy krvácení epistaxe, menoragie, tvorba hematomů, zvýšené krvácení u operačních výkonů a s opakovanými aborty u ţen. Častěji se setkáváme se získanými poruchami krevního sráţení zejména u onemocnění jater, z nedostatku vitamínu K, u novorozenců nebo u léčby kumariny. 17

3.4. Trombotické stavy Trombofilie je porucha krevního sráţení, charakterizovaná zvýšeným sklonem ke sráţení krve v cévním řečišti. Na rozdíl od krvácivých stavů, kde k projevu nemoci stačí porucha pouze jednoho faktoru, u trombofílie se většinou jedná o kombinaci více rizikových faktorů. Tyto faktory mohou být: Vrozené např. nedostatek proteinu C a S, rezistence na aktivovaný protein C (mutace faktoru V, tzv. Leidenská mutace), Mutace faktoru II (protrombin 20210G A), nedostatek antitrombinu. Získané - zejména obezita, věk nad 45 let, poruchy lipidů, kouření, hormonální léčba (zejména hormonální kontraceptiva), imobilizace, rozsáhlé ortopedické operace, varixy, poranění, těhotenství a šestinedělí. U pacientů se mohou rozvinout onemocnění, která mohou vyvolat trombotické příhody. Patří sem choroby autoimunitní (systémový lupus erythematodes, ulcerózní kolitida), endokrinní choroby (diabetes mellitus, Cushingův syndrom), abnormality koagulace a fibrinolýzy (diseminovaná intravaskulární koagulace - DIC, hemolytickouremický syndrom - HUS, nefrotický syndrom), jaterní onemocnění a hematologické malignity. 3.4.1. Zvýšení faktoru VIII Zvýšení faktoru VIII nad 150 % je spojeno s ţilní trombofilií. 12 Primární zvýšení faktoru VIII se vyskytuje přibliţně u 11 % populace a zvýšené hodnoty jsou prokazovány u 25 % nemocných s ţilní trombózou. 18 Hladina faktoru VIII se zvyšuje s přibývajícím věkem a dále při zánětech, kdy zároveň prokazujeme zvýšený C- reaktivní protein, který u dědičného zvýšení faktoru VIII chybí. 12 3.4.2. Defekt faktoru XII Vrozený deficit tohoto faktoru nevyvolává krvácivé projevy, jeho nedostatek je spojen spíše s trombofilií. Nedostatek faktoru XII u ţen je spojen s opakovanými potraty. 19 18

3.4.3. Získané inhibitory krevního srážení Cirkulující antikoagulans svědčí pro přítomnost protilátek vzniklých buď imunizací (např. inhibitor proti FVIII u hemofiliků) nebo autoimunitním mechanismem. Získané inhibitory můţeme rozdělit do tří skupin: 1. globální aktivita heparinového typu 2. nespecifické paraproteiny, lupus antikoagulans, štěpné produkty fibrinogenu/fibrinu 3. specifické inhibitory proti koagulačním faktorům VIII, IX, V, II, vwf 3.4.4. Antifosfolipidový syndrom Antifosfolipidový syndrom vyvolávají autoprotilátky proti negativné nabitým fosfolipidům, které jsou uloţeny na povrchu většiny buněk v lidském organismu. Inhibují i protektivní antitrombotický vliv annexinu V. 20 Pro tento syndrom jsou nejdůleţitější dva typy antifosfolipidových protilátek lupus antikoagulans (LA) a antikardiolipinové protilátky (ACLA). 20 V indukci autoimunity se můţe uplatňovat více situací. Vznik autoimunity je multifaktoriální, za hlavní příčinu je povaţována genetická predispozice a virová infekce. Podpůrnými vlivy pro vznik autoimunity jsou faktory hormonální a psychoneuro-imunologické. 21 3.5. Možnosti léčby krvácivých stavů U vrozených trombocytopatií jsou podávány léky na potlačení krvácivých příznaků - kryoprecipitát, trombocytární preparáty, desmopressin (DDAVP). U trombocytopenií se léčba zaměřuje na její příčinu a na léčbu krvácivé diastézy trombokoncentráty, hemostyptik (etamsylát, dobesilát) nebo antifibrinolytik. Imunitně podmíněné trombocytopenie jsou léčeny převáţně imunosupresivy (prednison, cyklosporin A), intravenózně gamaglobuliny. U některých chronických syndromů je moţné pouţít danazol, moţné je přistoupit ke spelenktomii. Léčba vrozených krvácivých stavů je zaloţena na podávání koncentrátů daného faktoru nebo čerstvou zmraţenou plazmu. 19

3.6. Možnosti léčby trombotických stavů Podstatou léčby trombofilie je zamezení zvýšenému sráţení krve. Ke sníţení sráţlivosti krve jsou uţívána antikoagulancia (hepariny, kumariny, přímé inhibitory trombinu), proti účinku krevních destiček protidestičková léčba (inhibitor fosfodiesterázy, cyklooxygenázy, thienopyridiny, inhibitory glykoproteinu IIb IIIa), substituční léčba podávání inhibitorů krevního sráţení (koncentráty antitrombinu a proteinu C), defibrinační léčba ke sníţení hladiny fibrinogenu a léčba trombolytická k rozpouštění fibrinových sraţenin. 13 Vzhledem k tomu, ţe práce pojednává o významu stanovení aptt, bude z výše uvedené léčby podrobněji zmíněn pouze heparin. 3.6.1. Heparin Je to látka ţivočišného původu, která má okamţitý protisráţlivý účinek. Ke své funkci potřebuje kofaktor, kterým je antitrombin. Jedná se o nepřímý inhibitor volného trombinu a faktoru Xa. Indukuje uvolnění inhibitoru tkáňového faktoru z endotelu. 13 Pokud není antitrombin v organismu přítomen, je heparin bez uţitku vyloučen. 3.6.2. Standardní heparin (UHF) Standardní (nefrakcionovaný) heparin je vyráběn ze zvířecích sliznic hlavně střev a plic vepřů. 22 Nejčastěji je podáván pomocí trvalé kapénkové infúze nebo kontinuální aplikace i.v. pomocí infuzního dávkovače. Léčba je zahájena počátečním bolusem, po němţ následuje udrţovací infúze roztoku s heparinem. Po zlepšení klinického stavu pacienta se většinou přechází na antikoagulační léčbu warfarinem. 3.6.3. Nízkomolekulární heparin (LMWH) Nízkomolekulární hepariny jsou na rozdíl od nefrakcionovaného heparinu účinné i při denní dávce subkutánně, protoţe se pozvolna uvolňují do cirkulace. Působí antitromboticky, blokují aktivovaný faktor Xa, méně trombin a indukují více uvolnění inhibitoru tkáňového faktoru z endotelu, aktivaci fibrinolýzy a inhibují i aktivaci destiček vyvolanou trombinem. 20

3.6.4. Monitorování léčby heparinem Mezi nejčastěji pouţívané testy k monitorování léčby heparinem patří aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aptt), Odběr se doporučuje provádět kaţdých 6 hodin a jednou denně kontrolovat krevní obraz, hlavně počet krevních destiček (heparinem indukovaná trombocytopenie). Dále se doporučuje při léčbě standardním heparinem provádět kontrolu funkční aktivity antitrombinu, protoţe můţe dojít k poklesu jeho hladiny, který je vyvolán jeho spotřebou. Zejména u osob s poruchou tvorby antitrombinu můţe dojít k poklesu pod kritickou hranici 50 % aktivity. Při účinné léčbě standardním heparinem dochází k prodlouţení času tohoto testu na 1,5 2,0 násobek času denního normálu. Z ostatních koagulačních testů je moţné vyuţít i trombinového času (TT) nebo aktivovaný koagulační čas vhodný zejména pro pacienty na mimotělním oběhu. Pro monitorování léčby LMWH není ţádný z těchto testů vhodný, protoţe při správném dávkování nedochází k prodlouţení aptt ani TT. K monitorování LMWH jsou pouţívány testy na principu chromogenního substrátu nebo protrombinázou indukovaného koagulačního času (PiCT). 3.6.5. Reptilázový čas Reptilázový čas (nebo také batroxobinový čas) se v současné době vyuţívá hlavně k průkazu heparinu ve vzorku, nejčastěji při kontaminacích při odběrech prováděných z kanyl. Výsledky vyšetření reptilázového času jsou interpretovány současně s výsledkem trombinového času, popřípadě s hodnotou fibrinogenu. Je-li přítomen heparin dochází k prodlouţení trombinového času, ale reptilázový čas je normální, u poruch fibrinogenu dochází k současnému prodlouţení trombinového času i reptilázového času. 21

4. Praktická část 4.1. Definice souboru 4.1.1. Kontrolní soubor Soubor je tvořen 30-ti jedinci (18 ţen a 12 muţů), u nichţ nebyl prokázán lupusový inhibitor a byly zjištěny fyziologické hodnoty protrombinového času, aptt, fibrinogenu a faktoru VIII. Tab. č. 1: Definice kontrolního souboru věk PT (INR) aptt (ratio) Fibrinogen (g/l) FVIII (%) LA (LCA-B) Průměr 37 1,00 1,00 2,84 99 negativní Maximum 78 1,08 1,08 3,46 120 - Minimum 17 0,94 0,94 2,22 71 - Medián 35 0,99 1,00 2,83 99-4.1.2. Soubor lupus anikoagulans Do tohoto souboru bylo zařazeno 25 jedinců (20 ţen a 5 muţů). U všech byl prokázán lupusový inhibitor. Všichni ze souboru měli provedeno vyšetření protrombinového času, aptt a fibrinogenu. U 23 pacientů byly vyšetřeny antifosfolipidové protilátky (APA, normální hodnoty IgG i IgM: 0 10 U/ml). Tab. č. 2: Definice souboru lupus antikoagulans věk PT (INR) aptt (ratio) Fibrinogen (g/l) LA (LCA-B) APA IgG (U/ml) APA IgM (U/ml) Průměr 47 1,37 1,57 3,54 45,3 48,27 24,51 Maximum 74 3,11 4,20 5,22 116,9 152,10 131,66 Minimum 28 0,83 0,86 2,49 16,7 0,91 0,70 Medián 43 1,05 1,32 3,48 40,3 23,56 13,75 22

4.1.3. Soubor vysoký faktor VIII Do souboru bylo zařazeno 30 jedinců s vysokou hodnotou faktoru VIII (18 ţen a 12 muţů). U všech byla provedena vyšetření: protrombinový čas, aptt a fibrinogen. U 27 pacientů byl změřen C-reaktivní protein (CRP, normální hodnoty: <10 mg/l), z toho pouze u jednoho byla naměřena zvýšená hodnota a u nikoho nebyl prokázán lupusový inhibitor koagulace. Tab. č. 3: Definice souboru vysoký faktor VIII věk PT (INR) aptt (ratio) Fibrinogen (g/l) FVIII (%) CRP (mg/l) LA (LCA-B) Průměr 53 1,27 1,01 3,88 191,1 4,15 negativní Maximum 79 2,40 1,39 6,22 237,0 15,11 - Minimum 26 0,80 0,74 2,44 152,0 3,16 - Medián 52 0,99 0,90 3,70 189,5 3,16-4.1.4. Soubor nízký faktor VIII Do tohoto souboru bylo zařazeno 14 jedinců (10 ţen a 4 muţi). U všech byla nalezen nedostatek koagulační aktivity faktoru VIII. U pěti jedinců byl zároveň prokázán nedostatek faktoru XII, u dvou nedostatek von Willebrandova faktoru a u jednoho nedostatek faktorů IX a XI. U jednoho pacienta byl současně s deficitem faktoru VIII prokázán i lupusový inhibitor koagulace. Tab. č. 4: Definice souboru nízký faktor VIII věk PT (INR) aptt (ratio) Fibrinogen (g/l) FVIII (%) Průměr 35 1,13 1,44 2,87 48,79 Maximum 54 1,92 2,35 4,11 64,00 Minimum 4 0,88 0,96 2,00 14,00 Medián 36 0,99 1,26 2,73 53,00 23

4.1.5. Soubor heparin Poslední soubor je tvořen 30-ti pacienty (10 ţen a 20 muţů) léčenými standardním heparinem. Tab. č. 5: Definice souboru heparin věk aptt (ratio) Průměr 65 1,76 Maximum 78 3,68 Minimum 48 0,85 Medián 68 1,66 4.2. Odběr a zpracování vzorků Ţilní krev byla odebrána do 0,129 mol/l citrátu sodného v poměru citrát ku krvi = 1:9 a následně centrifugována při 3 000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut. Z citrátové plazmy chudé na destičky byly vyšetřeny následující koagulační testy: protrombinový čas, aptt, trombinový čas, fibrinogen, hladina faktoru VIII na referenčním koagulometru BCS XP Siemens SRN. Plazma pro vyšetření lupus antikoagulans byla opakovaně centrifugována 5 minut při 12 000 otáčkách za minutu. Takto získaná bezdestičková plazma byly vyšetřen na koagulometru AMAX DESTINY Trinity Biotech USA. 4.3. Metodika pro koagulační stanovení Kromě aptt, byly ve studii měřeny i další základní koagulační testy protrombinový čas a fibrinogen, aby se odhalilo případné ovlivnění výsledků aptt jinými vadami koagulace např. nízkým fibrinogenem a ostatními faktory zevní cesty koagulace např. u nemocí jater nebo, aby se odhalila případná léčba kumarinovými deriváty. 24

4.3.1. Stanovení aptt Stanovení aptt bylo provedeno s pěti reagenciemi různých výrobců na plně automatickém koagulometru BCS XP turbidimetricky. 50µl citrátové bezdestičkové plazmy bylo inkubováno s 50µl reagencie 180 sekund při 37 C, po této době bylo přidáno 50µl 25mmol/l CaCl 2. Po přidání CaCl 2 byl měřen čas potřebný k utvoření fibrinového vlákna. Jako referenční metoda pro stanovení aptt byla pouţita reagencie Pathromtin*SL SIEMENS, která je pouţívána v běţném rutinní provozu a je rovněţ průběţně kontrolována (interní kontrola kvality, mezilaboratorní porovnání, Externí kontrola kvality). Normální hodnoty: 25,6 40 s (0,8 1,2 ratio) Na základě různého sloţení byly vybrány tyto reagencie: APTT-SP Instrumentation Laboratory, PTT-LA STAGO, APTT-P DIALAB, APTT-LS Pacific Hemostasis. Tab. č. 6: Sloţení parciálních tromboplastinů pouţitých ve studii Název Výrobce Aktivátor Fosfolipidy Pathromtin*SL SIEMENS Oxid křemičitý Rostlinné APTT-SP Instrumentation Laboratory Oxid křemičitý Syntetické APTT-P DIALAB Křemičitan hořečnatohlinitý Králičí mozek APTT-LS Pacific Hemostasis Kyselina elagová Králičí mozek PTT-LA STAGO Oxid křemičitý v glycinovém pufru Králičí mozek 25

4.4. Analyzátory Výsledky jednotlivých vyšetření byly pořizovány na automatických analyzátorech různých výrobců. 4.4.1. Koagulometr BCS XP BCS XP (Behring Coagulation System) firmy Siemens je plně automatický počítačem řízený velkokapacitní koagulometr, který pracuje na principu změny průchodnosti světla testovací kyvetou turbidimetrie. Lze na něm provádět stanovení pomocí chromogenního substrátu, imunologické a aglutinační metody. Na tomto přístroji byly pořízeny výsledky aptt, protrombinového času, trombinového času a fibrinogenu s reagenciemi všech výrobců vybraných do studie. 4.4.2. Koagulometr AMAX Destiny AMAX Destiny je automatický analyzátor. Optické, chromogenní a imunoturbidimetrické testy jsou měřeny při vlnové délce 405 nm, zároveň je moţnost detekce koagula na mechanickém kanálu. 23 S výhodou se této kombinované moţnosti detekce koagula vyuţívá u metod, kde se kladou větší nároky na přesnost měření nebo je koagulum obtíţněji detekovatelné. Na tomto analyzátoru byly získány hodnoty souboru s lupus antikoagulans. 4.5. Kontrola kvality Zajištění spolehlivosti analytických metod je zajištěno prováděním kontroly kvality, která je pravidelně prováděna samotnou laboratoří a nezávislým kontrolním institutem. 4.5.1. Vnitřní kontrola kvality Protrombinový čas, aptt, fibrinogen, faktor VIII: kaţdý den prováděna kontrola správnosti pomocí komerčně vyráběné kontrolní plazmy SIEMENS. Pouţití Control plasma N (normální plazma) a Control plasma P (patologická plazma) zajišťuje kontrolu na dvou různých hladinách normální fyziologické a patologické. Lupus antikoagulans: pozitivní kontrola dodávána současně s reagenciemi je měřena s kaţdou sérií měření. 26

4.5.2. Vnější (externí) kontrola kvality Externí kontrola kvality je zajištěna mezinárodní kontrolou INSTAND, certifikát udělován pro protrombinový čas a aptt na 6 měsíců, pro fibrinogen a faktor VIII na 12 měsíců. U lupus antikoagulans je prováděna mezinárodní kontrola kvality ECAT s platností certifikátu na 12 měsíců. Všechny uvedené metody jsou akreditovány dle ISO 15189, zdravotnická laboratoř č.8041 akreditovaná ČIA. 4.5.3. Nejistota měření Nejistota je definovaná jako údaj, charakterizující rozsah, v němţ se výsledek měření odůvodněně nachází (s danou pravděpodobností). Pro kontrolní materiály pouţívané na koagulačních analyzátorech nejsou definovány nejistoty cílové hodnoty. Nejistotu měření tedy vyjadřujeme jako koeficient variace mezilehlé preciznosti zjištěný laboratoří. 4.6. Zpracování naměřených dat Naměřená data byla zpracována v aplikaci Microsoft Office Excel 2007. 4.6.1. Data kontrolního souboru Tab. č. 7: Porovnání hodnot aptt kontrolního souboru aptt Pathromtin*SL SP (IL) P (DIALAB) LS (PH) Průměr 1,00 1,00 1,00 1,00 Medián 0,98 0,97 0,99 1,01 Maximum 1,23 1,25 1,26 1,17 Minimum 0,78 0,76 0,73 0,80 27

Graf č. 1: rozmístění hodnot kontrolního souboru; očekávané rozmezí 0,80-1,20 ratio. 4.6.2. Data souboru lupus antikoagulans Tabulka č.8: porovnání hodnot aptt souboru lupus antikoagulans aptt Pathromtin*SL SP (IL) P (DIALAB) LS (PH) LA (Stago) Průměr 1,68 2,42 1,58 2,11 2,34 Medián 1,31 2,28 1,35 1,67 1,97 Maximum 3,95 3,97 3,39 4,26 4,63 Minimum 0,93 0,49 0,84 0,90 0,86 28

Graf č. 2: Rozmístění hodnot souboru lupus antikoagulans, očekávané hodnoty > 1,21 ratio Graf č. 3: Korelace hodnot LCAi a aptt-la 29

4.6.3. Data souboru vysoký faktor VIII Tab. č. 9: Porovnání hodnot souboru vysoký faktor VIII aptt Pathromtin*SL SP (IL) P (DIALAB) LS (PH) Průměr 0,95 0,93 0,93 1,00 Medián 0,88 0,91 0,88 0,96 Maximum 1,38 1,22 1,26 1,39 Minimum 0,70 0,76 0,74 0,75 Graf č. 4: Rozmístění hodnot souboru vysoký faktor VIII, očekávané hodnoty < 0,85 ratio 30

4.6.4. Data souboru nízký faktor VIII Tab. č. 10: Porovnání hodnot souboru nízký faktor VIII aptt Pathromtin*SL SP (IL) P (DIALAB) LS (PH) Průměr 1,41 1,43 1,32 1,40 Medián 1,24 1,14 1,22 1,33 Maximum 2,42 3,97 2,22 2,46 Minimum 0,88 0,86 0,88 0,89 Graf č. 5: Rozmístění hodnot souboru vysoký faktor VIII, očekávané hodnoty > 1,21 ratio 31

4.6.5. Data souboru heparin Tab. č. 11: Porovnání hodnot souboru heparin aptt Pathromtin*SL SP (IL) P (DIALAB) LS (PH) Průměr 1,60 1,30 1,02 1,30 Medián 1,55 1,22 1,02 1,30 Maximum 3,14 3,45 1,80 1,91 Minimum 0,88 0,86 0,37 0,88 Graf č. 6: Rozmístění hodnot souboru heparin, očekávané hodnoty > 1,21 ratio 32

4.6.6. Vyhodnocení citlivostí jednotlivých reagencií Tab. č. 12: Procentuální vyjádření citlivosti jednotlivých reagencií podle očekávaných hodnot soubor Lupus Vysoký Nízký Kontrolní Heparin aptt antikoagulans FVIII FVIII Pathromtin*SL 93% 71% 37% 64% 80% APTT-SP (IL) 93% 88% 30% 50% 50% APTT-P (DIALAB) 90% 50% 40% 50% 20% APTT-LS (PH) 100% 83% 10% 64% 57% APTT-LA (STAGO) 80% Graf č. 7: Porovnání citlivosti parciálních tromboplastinů 33

5. Diskuze Pro studii bylo zpracováno celkem 129 vzorků rozdělených do 5 souborů. Hlavní poţadavek byl kladen na různé zastoupení aktivátorů a fosfolipidů v parciálních tromboplastinech. Pro kaţdý soubor jsme stanovili očekávanou hodnotu: U kontrolního souboru jsme očekávali hodnoty aptt pohybující se v mezích normálních hodnot tj. od 0,8-1,2 ratio. V tomto intervalu se nacházely všechny výsledky změřené s reagencií APTT-LS. U Pathromtinu*SL a aptt-sp leţelo tomto rozmezí 28 vzorků tj. 93% a aptt-p mělo v očekávaném rozmezí jen 27 vzorků 90%. V diagnostice lupus antikoagulans se vyuţívá schopnosti antifosfolipidových protilátek prodluţovat testy závislé na fosfolipidech, proto jsme očekávali prodlouţení časů aptt - ratio vyšší neţ 1,21. Nejvyšší citlivost jsme prokázali u APTTSP 88%, APTT-LS 83% a APTT-LA 80%. Uspokojivou citlivost k lupus antikoagulans 71% má pathromtin *SL a nejniţší pouze 50% citlivost má APTT-P. Vysoká hladina faktoru VIII je nacházena přibliţně u 11% populace proto jsme chtěli ověřit, zda jsou hodnoty aptt zkráceny. U tohoto souboru jsme stanovili hodnotu ratio niţší neţ 0,85 za moţný ukazatel přítomnosti vysoké hladiny faktoru VIII. Ţádný z parciálních tromboplastinů nedosáhl citlivosti ani 50%. Nevíce nízkých hodnot bylo naměřeno u APTT-P 40%, nejniţší citlivost byla prokázána u APTT LS - 10%. Vrozené poruchy koagulačních faktorů nejsou časté, proto soubor se sníţenou hladinou faktoru VIII zahrnuje pouze 14 jedinců Očekávané hodnoty ratio u tohoto souboru byly vyšší neţ 1,21. Citlivost Pathromtinu*SL a APTT-LS k defektu koagulačních faktorů byla 64%, APTT-P a pomocí APTT-SP byl odhalen defekt faktorů u 50% vyšetřovaných vzorků. Poslední soubor, u kterého jsme testovali citlivost parciálních tromboplastinů zahrnoval pacienty léčené nefrakcionovaným heparinem. Pokud je tato léčba neúčinná, je nebezpečí recidiv trombotických komplikací. Naopak při předávkování heparinem se mohou rozvinout krvácivé komplikace. Z našeho měření vyplývá, ţe nejméně vhodný k monitorování léčby heparinem je APTT-P u kterého pouze 20% výsledků leţelo v očekávaných hodnotách ratio vyšších neţ 1,21. Uspokojivé výsledky jsme získali u 34

APTT-LS - 57% a APTT-SP - 50%. Nevyšší citlivost k heparinu vykazuje Pathromtin- SL - 80%. Z naměřených dat jsme zjistili, ţe ţádný z testovaných tromboplastinů není 100% citlivý ke všem zmíněným faktorům. Pathromtin*SL je vyuţíván hlavně pro rutinní stanovení a kontrolu léčby heparinem. Pro záchyt sníţených hladin faktoru VIII se jeví jako nejlepší Pathromtin*SL a APTT-LS. Na vysoké hladiny faktoru VIII nejcitlivěji reaguje APTT-LS a na screeningový záchyt LA je citlivý APTT-SP, APTT- LS a Pathromtin*SL. Z výsledků v tabulce a grafů je patrné, ţe pro upozornění na moţnou přítomnost Lupus antikoagulans je nejspolehlivější reagencie APTT-SP. U reagencie APTT-LA byla prokázána citlivost 80% a tato reagencie vykazuje vysokou specifitu u komplexního vyšetření LA. Nebyla však prokázána přímá závislost mezi hodnotou LA a prodlouţením aptt. Tato reagencie se pro svou vysokou citlivost nehodí pro rutinní stanovení. Kaţdá z porovnávaných reagencií je vhodnější pro jiný účel a v běţné praxi ani není poţadováno, aby reagencie byla současně citlivá na všechny výše uvedené parametry. Vysoká citlivost parciálních tromboplastinů by vedla k obrovskému nárůstu speciálních vyšetření. 35

6. Závěr V naší práci jsme si ověřili na pěti skupinách vybraných jedinců, jak mohou různá sloţení reagencií ovlivnit výsledky testu aptt. Při výběru vhodné reagencie pro vyšetření aptt je potřeba dobře uváţit, pro jaké účely se bude test pouţívat. Podle výsledků v naší práci je zřejmé, ţe hodnoty při pouţití různých parciálních tromboplastinů a aktivátorů se mohou značně odlišovat. Záleţí také ve velké míře na normálních mezích, které jsou pro jednotlivé reagencie doporučeny a které by si měly jednotlivé laboratoře vyšetřením skupiny zdravých jedinců ověřit. Při provádění testu aptt je velmi důleţitá správná laboratorní praxe s dodrţením všech zásad kontroly kvality. Správná hodnota výsledku aptt můţe odhalit poruchy v koagulačním systému a při monitorování léčby napomáhá správnému dávkování antikoagulační léčby. 36

7. Použitá literatura 1. PECKA, M., et al., Praktická hematologie, Laboratorní metody, Český Těšín, FINIDR s. r. o., 2010, s. 343, ISBN 978-80-903871-9-5 2. PENKA, M., BULIKOVÁ, A., MATÝŠKOVÁ, M., et al., Hematologie I, Neonkologická hematologie, Praha, Grada Publishing, 2001, s. 204+10, ISBN 80-247-023-9 3. PECKA, M., Laboratorní hematologie v přehledu, Fyziologie a patofyziologie hemostázy, Český Těšín, FINIDR, 2004, s. 237, ISBN 80-86682-03-X 4. BROWN, B. A.,Hematology: Principles and procedures, Lea&Febiger, 1993, s. 453 5. RACEK, J., et al., Klinická biochemie, Praha, Galén, 1999, s. 316, ISBN 80-7262-023-1 6. Preanalytická příručka klinických laboratoří ÚKBLD, VFN a 1. LF Praha, 2009, s.39 7. http://www.dialab.cz/data/sharedfiles/prednasky_z_odbornych_akci/i_malikova _2.ppt. [staţeno 14.4.2011] 8. DRÁBKOVÁ D., KOHOUTOVÁ S., Monitorování léčby heparinem, Florence: časopis moderního ošetřovatelství, číslo 04/2010, 6/9 11 9. Manzato F, Mengoni A, Grilenzoni A, Lippi G., Evaluation of the activated partial thromboplastin time (APTT) sensitivity to heparin using five commercial reagents: implications for therapeutic monitoring. Istituto di Chimica e Microscopia Clinica, Università degli Studi di Verona, Ospedale Policlinico, Italy. 1998 Dec;36(12):975-80. PMID: 9915232 [PubMed - indexed for MEDLINE 10. VOJÁČEK, J., MALÝ, M., et al., Arteriální a žilní trombóza v klinické praxi, Praha, Grada Publishing a. s., 2004, s. 276, ISBN-10: 80-247-0501-X 11. LEDVINA, M., STOKLASOVÁ, A., CERMAN, J., Biochemie pro studující medicíny: II. Díl, Praha, Nakladatelství Karolinum, 2004, s. 281, ISBN 978-80- 246-1415-1 12. KVASNIČKA, J., Trombofilie a trombotické stavy v klinické praxi, Praha, Grada Publishing a.s., 2003, s. 299, ISBN 80-7169-993-4 13. MATÝŠKOVÁ, M., ZAVŘELOVÁ, J., HRACHOVINOVÁ, I.,Hematologie pro zdravotní laboranty: Krevní srážení:svazek 2, Brno, Institut pro další vzdělávání zdravotníků, 199, s. 203 37

14. POVÝŠIL, C., ŠTEINER, I. et al., Speciální patologie: Druhé, doplněné a přepracované vydání, Praha, Galén, 2007, s. 430, ISBN 987-80-7262-494-2 15. SMEJKAL, P., MATÝŠKOVÁ, M., PENKA M., Hemofilie: Přehledný referát, Vnitřní lékařství, 2008, 54(10):992-999 16. HEROLD, G. Et al., Vnitřní lékařství 2000: systematické vnitřní lékařství pro studenty i lékaře, Praha, Petr Dlouhý, 2000, s. 735, ISBN 80-238-6356-8 17. ASAKAI,R., CHUNG, D.W., DAVIE E.W., Factor XI deficiency in Ashkenazi Jews in Israel, New England Journal of Medicine, 6. 4. 2011 18. ROSENDAAL, F. R., Venous thrombosis: a multicausal disease. Lancet, 3. 4. 1999, 353(9159):1167-73 19. PAUER, H.-U., BURFEIND, P., KÖSTERING, H.,Factor XII deficiency is strongly associated with primary recurrent abortions, Fertility and Sterility, Volume 80, Issue 3, Pages 590-594, September 2003 20. GREER, J., FOERSTER, J., RODGERS, G.M., PARAXEVAS, F., GLADER, B., ARBER, D.A., MEANS, R.T.: Wintrobe s Clinical Hematology, 12.edice, Philadelphia, Lippincott Williams and Wilkins,2009, s. 3232, ISBN: 978-0- 7817-6507-7 21. FUČÍKOVÁ, T. Imunologie. In KLENER P. et al.vnitřní lékařství, Sv. 5,Praha: Galén- Univerzita Karlova, 2002, s. 58 22. KVASNIČKA J., Heparin a nízkomolekulární hepariny v prevenci a léčbě hyperkoagulačních stavů. Farmakoterapeutické informace. Praha, SÚKL, 5, 1999, s. 1-4, ISSN: 1211-0647 23. http://www.sysmex.cz/index.asp?id=9570 [staţeno 20.4.2011] 24. POORT, S. R., ROSENDAAL, F. R., REITSMA, P.H., A common genetic variation in the 3'-untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis, bloodjournal.hematologylibrary.org, 1996 25. COOK, N. S., UBBEN, D.; Fibrinogen as a Major Risk Factor in Cardiovascular Disease, 1990, TiPS 11: 444 451 38

8. Přílohy Tab. č. 13: Referenční meze metoda jednotka referenční meze protrombinový čas INR 0,80-1,25 aptt ratio 0,80-1,20 fibrinogen g/l 2,00-4,00 faktor VIII % 60,00-150,00 lupus antikoagulans LCA index < 15 APA IgG U/ml 0-10,00 APA IgM U/ml 0-10,00 CRP mg/l 0-10,00 39

Tab. č. 14: Naměřená data kontrolního souboru číslo LA Pathromtin* věk pohlaví aptt-sp aptt-p aptt-ls vz. (LCA-B) SL 1N 55 ţ 11,60 1,11 1,03 0,98 1,11 2N 37 ţ neg 0,87 0,92 0,98 1,04 3N 51 m neg 1,23 1,19 1,15 1,10 4N 37 ţ 6,40 1,15 1,15 0,95 1,07 5N 34 ţ 6,00 1,01 0,97 0,93 1,03 6N 46 m 2,30 1,12 1,06 1,08 1,09 7N 30 ţ 0,90 0,98 1,05 1,03 1,04 8N 35 m 6,20 0,91 1,19 0,99 1,06 9N 56 ţ neg 1,06 0,93 0,88 0,94 10N 21 ţ 8,80 1,02 1,20 0,95 1,02 11N 18 ţ 2,80 1,15 1,15 1,16 1,13 12N 55 ţ neg. 0,96 0,95 1,01 0,92 13N 17 m neg. 1,14 1,05 1,26 1,05 14N 19 ţ neg 0,89 0,88 1,03 0,90 15N 35 m neg 0,78 0,76 0,73 0,80 16N 31 ţ neg 1,10 1,03 1,20 1,17 17N 26 m neg 0,97 0,84 0,99 1,01 18N 31 ţ 11,50 1,10 1,12 1,09 1,08 19N 78 ţ neg. 0,90 0,92 0,97 1,01 20N 51 ţ neg. 0,98 0,92 0,85 0,91 21N 37 m neg. 0,88 0,87 0,86 0,97 22N 32 ţ neg. 1,04 1,25 1,20 1,14 23N 26 m neg. 0,89 0,94 1,01 0,98 24N 37 m neg. 0,90 0,92 0,98 0,85 25N 26 m neg. 0,94 0,93 0,93 0,92 26N 30 ţ neg. 0,98 0,86 0,86 0,81 27N 18 ţ neg. 1,07 1,04 1,00 1,01 28N 49 m neg. 1,15 1,05 0,99 0,94 29N 40 ţ neg. 0,94 0,93 1,03 0,97 30N 60 m neg. 0,81 0,91 0,94 0,95 40