Téma: DEMONSTRACE SYMPTOMŮ ZPŮSOBENÝCH FYTOPLAZMAMI, PŘENOSU KOKOTICÍ A ROUBOVÁNÍ Ing. Jana Fránová, Dr., Biologické centrum AV ČR v.v.i. Symptomatologie Fytoplazmy vyvolávají u infikovaných rostlin různé příznaky včetně žloutenky a svinutky listů, chlorózy, malolistosti, proliferace (či abnormální růst z postranních pupenů) u výhonů i kořenů, zakrslosti, zelenokvětosti (virescence), zlistnatění květních orgánů (fylodie), květní sterility, prodlužování nebo zkracování internodií, červenání rostlin, nekrózy až odumírání částí nebo celých rostlin. Vnější symptomy vyvolané přítomností fytoplazem naznačují, že hostitelská rostlina má narušenou hormonální rovnováhu a funkci floému. Symptomy indukované u napadených rostlin mohou velmi kolísat. U dřevin může exprese symptomů značně kolísat v období několika let, včetně spontánní remise příznaků u infikovaných rostlin, která může, ale nemusí, znamenat eliminaci patogena. Nerovnoměrná distribuce patogena v různých částech hostitelské dřeviny a jeho sezónní migrace může velmi komplikovat diagnostiku fytoplazem. Výhodou odborné znalosti symptomatologie a tím i bezprostřední určení infikovaných rostlin je jednoznačně rychlost a velmi nízké náklady. Nevýhodou je nerozpoznání příznaků v době latence či ranném stadiu infekce, nezbytná je dlouhodobá zkušenost diagnostika a i to, že podobné příznaky mohou být způsobeny herbicidy či jinými patogenními organismy (ricketcie, háďátka). Ukázky příznaků: Abnormální zvětšení palistů, malolistost, předčasné žloutnutí až červenání listů a proliferace jednoletých výhonů u stromů napadených fytoplazmou proliferace jabloně (apple proliferation) ve srovnání s větvičkou ze zdravého stromu. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 1
Předčasné červenání listů u stromů napadených fytoplazmou chřadnutí hrušně (pear decline). Zelenokvětost a červenání korunních lístků, částečná až úplná fylodie (zlistnatění) a deformace květních orgánů u jahodníku napadeného fytoplazmou strawberry green petal phytoplasma ve srovnání s květem ze zdravé rostliny. Malformace plodů, deformace a červenání listů až odumírání celé rostliny jahodníku. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 2
Deformace a červenání květů třapatky nachové napadené fytoplazmou clover phyllody ve srovnání s květem ze zdravé rostliny. Malformace květů, abnormální proliferace bočních výhonů, žloutnutí, červenání a nekrózy listů, deformace a zakrslost až odumírání celých rostlin slaměnky způsobené fytoplazmou aster yellows ve srovnání se zdravou rostlinou (vpravo). Další ukázky příznaků lze sledovat na stránkách COST Action FA0807 Integrated Management of Phytoplasma Epidemics in different Crop systems EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 3
(http://www.costphytoplasma.eu) ve fotogalerii pracovní skupiny WG1 (Photogalery of WG1). Přenos kokoticí Důležitou roli v klasifikaci fytoplazem podle symptomů hrál experimentální hostitel Catharanthus roseus (barvínek růžový), na kterého byla přenesena řada fytoplazem a jenž zároveň slouží také k udržování jejich jednotlivých izolátů. Tento hostitel reaguje na infekci různými fytoplazmami tvorbou odlišných symptomů. Klasifikace fytoplazem udržovaných v barvínku byla vypracována Marwitzem (1990) a vykazovala některé podobnosti s nynější genetickou klasifikací, ale v současnosti se tento způsob klasifikace již nepoužívá. Na barvínek můžeme fytoplazmy přenášet propojením s nemocnou rostlinou pomocí haustorií kokotice (Cuscuta sp.), roubováním nebo vektory a jednotlivé izoláty fytoplazem v rostlinách barvínku dlouhodobě udržovat. V současné době je na Univerzitě v Boloni (Itálie) udržována sbírka fytoplazem in vitro na C. roseus (Bertaccini, 2003). Zdravá rostlina barvínku růžového a ukázka přenosu fytoplazem propojením nemocné rostliny jahodníku pomocí haustorií kokotice se zdravou rostlinou barvínku. Metodika přenosu: - napěstování zdravých rostlin barvínku růžového - napěstování kokotice: do hlíny musí být vysety zároveň semínka např. vojtěšky a kokotice jetelové; samotná kokotice bez přítomnosti odpovídajících rostlin jejich hostitelů neklíčí (nezbytná přítomnost EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 4
metabolitů vylučovaných vojtěškou pro klíčení semen kokotice jetelové) - napikýrování malých rostlinek vojtěšky společně s haustorii kokotice do malých květináčků - propojení haustorií kokotice se zdravou rostlinou barvínku, nárůst haustorií na barvínku a následné propojení s infikovanou rostlinou - spojení infikované rostliny a barvínku pomocí haustorií musí být alespoň 2 měsíce, aby došlo k přenosu fytoplazem - cca po 3 měsících propojení následuje odstranění haustorií kokotice z rostlin - potencionálně infikované rostliny barvínku pozorujeme nejméně 6 měsíců, zda dojde k projevu příznaků či ne Příznaky výrazné etiolizace, prodlužování a proliferace bočních výhonů, malolistost a deformace květů barvínku růžového infikovaného izolátem fytoplazmy aster yellows. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 5
Příznaky zelenokvětosti, deformace květních orgánů (prodloužení kališních lístků) a prosvětlování žilek na rostlinách Catharanthus roseus po přenosu fytoplazmy clover phyllody pomocí kokotice (vpravo zbytek haustorií kokotice na infikované rostlině vinky) Přenos roubováním Roubování rostlin Catharanthus roseus (vinka, barvínek) Pokud se podařilo jakýmkoliv způsobem přenést fytoplazmu na rostliny barvínku, je jedním z nejjednodušších způsobů další její kultivace přenos roubováním na další zdravé rostliny barvínku. Pro nejrychlejší projev příznaků se osvědčilo použít mladé (cca 3 měsíce staré), na jaře napěstované rostliny barvínku. Seříznutý prýt nemocné vinky (barvínku) roubujeme z boku do stonku zdravého barvínku, pevně omotáme parafilmem či jinou vhodnou páskou (např. nastříhanou z igelitových sáčků) a necháme úplně srůst. Dostatečnou vlhkost zajistíme zakrytím roubované části igelitovým sáčkem. Projev příznaků je poměrně rychlý, někdy již po 1. měsíci po naroubování. Roubování dřevitých indikátorů Biologické testy na dřevitých indikátorech se často využívají pro certifikaci ovocných dřevin. K testování fytoplazmy proliferace jabloně se používá nejčastěji podle doporučení EPPO Golden delicious, který reaguje na infekci fytoplazmou proliferací a výrazně zvětšenými palisty. Fytoplazma chřadnutí hrušně je potom testována na hrušni Doyenné du Comice nebo Pyronia veitchii reagující svinutkou a zkrabacením listů a předčasným červenáním listů. Fytoplazma Evropské žloutenky peckovin je nejčastěji testována na semenáči broskvoně GF 305, který reaguje chlorózou a odumíráním výhonů. Pro přenosy se nejčastěji používá očkování třemi očky a indikátorové rostliny jsou hodnoceny po dobu 2 až 3 EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 6
let. Příkladem je testování fytoplazmy chřadnutí hrušně ve Výzkumném a šlechtitelském ústavu ovocnářském Holovousy, s.r.o., kde používají tzv. dvojité očkování (double budding). Na zdravou podnož se naočkuje jedno očko z indikátorové rostliny (pro testování hrušní Pyronia veitchii) a pod ně očko z testovaného stromu. Když z očka indikátora vyroste výhonek s minimálně třemi listy, podnož zakrátíme. Vývoj prvních příznaků na indikátoru lze pozorovat již po 1. roce, lépe je však rostliny udržovat až do 3 let po očkování, kdy dochází k plnému rozvoji onemocnění, často až k odumírání testovaných rostlin. rootstock bud of indicator rootstoc k branch growing from the bud of indicator bud of tested pear tree bud of tested pear tree Schéma dvojitého očkování u hrušní. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 7
Ukázka rostlin Pyrus communis cv. Rogue Red 2 roky po dvojitém očkování. Tytéž rostliny 3 roky po očkování. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 8
Srovnání se zdravou kontrolou Pyronia veitchii, též 3 roky po roubování. Výhody a nevýhody biologických přenosů: - jednoduchost provedení - dlouhodobá existence přenesených izolátů a možnost jejich detailní charakterizace, zdroj charakterizovaných izolátů fytoplazem - omezený počet testovaných rostlin - udržování indikátorů v hmyzutěsných sklenících - časová náročnost měsíce až roky a tím rostoucí náklady EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů 9