Univerzita Karlova v Praze

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Speciální chemicko-biologické obory Studijní obor: Molekulární biologie a biochemie organismů Michaela Marková Mer1p a Nam8p v regulaci sestřihu Mer1p nad Nam8p in splicing regulation Bakalářská práce Školitel: Mgr. Kateřina Abrhámová, Ph.D. Praha, 2013

Na tomto místě bych ráda poděkovala Mgr. Kateřině Abrhámové, Ph.D. za obrovskou trpělivost a užitečné rady při odborném vedení této práce. Dále bych chtěla poděkovat RNDr. Anně Valentové, Mgr. Martině Hálové i všem ostatním členům laboratoře v čele s doc. RNDr. Petrem Folkem, CSc. a doc. RNDr. Františkem Půtou, CSc. za cenné rady. V neposlední řadě mé velké poděkování patří také rodinně a Martinu Kohoutovi, za jejich neutuchající podporu. Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze, 17.05.2013 Michaela Marková

Abstrakt: Proteiny Mer1 a Nam8 vzájemnou kooperací aktivují sestřih čtyř specifických pre-mrna genů: AMA1, MER2, MER3 a SPO22 potřebných pro meiotickou rekombinaci a jaderné dělení. Exprese těchto genů se v rámci buněčného cyklu nemění, ale k efektivnímu sestřihu jejich pre-mrna dochází pouze v průběhu meiózy, protože pouze v meiotických buňkách je exprimován protein Mer1, který usnadňuje jejich sestřih. Všechny tyto pre-mrna obsahují nekonsensuální 5 sestřihové místo (5 splice site, 5 ss), které je ve srovnání s konsensuální sekvencí hůře rozpoznatelné pro podjednotkou spliceosomu U1 snrnp. Na pre-mrna těchto genů se nachází enhancerová oblast v blízkosti 5 ss, na kterou se váže Mer1p, jenž zefektivňuje vyvazování U1 snrnp. Mer1p spolupracuje prostřednictvím dalších proteinů s Nam8p, který je součástí U1 snrnp. Nam8p se váže na pre-mrna downstream od 5 ss v blízkosti enhancerové oblasti. Mer1p a Nam8p společně usnadňují sestavování spliceosomu na nekonsensuálním 5 ss a následně sestřih pre-mrna. Klíčová slova: sestřih pre-mrna, spliceosom, Saccharomyces cerevisiae, Mer1p, Nam8p

Abstract: By the mutual cooperation, Mer1 nad Nam8 proteins activate pre-mrna splicing of four specific genes: AMA1, MER2, MER3 and SPO22, that are required for meiotic recombination and nuclear division. Expression of these genes does not change during the cell cycle, nevertheless, the efficient splicing of their pre-mrna occures only during meiosis because Mer1 protein, which facilitates their splicing, is expressed only in meiotic cells. All these pre-mrnas contain nonconsensual 5 splice site (5 ss) which is less recognizable for the spliceosomal subunit U1 snrnp in comparison with the consensual sequence. There is an enhancer area near to 5 ss on the pre-mrna of this genes that serves as a binding site for Mer1p which makes recruitment of U1 snrnp more efficient. Mer1p cooperate via other proteins with Nam8p. Protein Nam8, a part of U1 sn RNP, is bound on pre-mrna downstream from 5 ss close to the enhancer area. Mer1p in cooparation with Nam8p facilitates spliceosome assembly on the nonconsensual 5 ss and subsequently pre-mrna splicing. Key words: pre-mrna splicing, spliceosome, Saccharomyces cerevisiae, Mer1p, Nam8p

Obsah 1. Úvod... 1 2. Sestřih pre-mrna... 2 2.1. Definování intronů... 2 2.1.1. Rozpoznání 5 sestřihového místa... 3 2.1.2. Rozpoznávání 3 sestřihového místa... 3 3. Sestavování spliceosomu... 4 3.1. U1 a U2 snrnp... 7 3.2. U4/U6.U5 tri-snrnp... 9 3.3. NTC (NineTeen Complex)... 10 4. Transesterifikační reakce... 11 5. Rozpad spliceosomu... 13 6. Meiotická indukce genů... 13 7. Proteiny Nam8 a Mer1... 15 7.1. Protein Nam8... 15 7.2. Protein Mer1... 16 7.2.1. Cílové pre-mrna proteinu Mer1... 16 7.2.1. Enhancerová oblast rozpoznávaná proteinem Mer1... 17 7.3. Funkce proteinů Mer1 a Nam8 v sestřihu pre-mrna... 17 7.4. Sestřih nezávislý na proteinu Mer1... 19 8. Závěr:... 22 9. Seznam použité literatury... 23

Seznam použitých zkratek: Ak Asn ATP BP CBC CC CTD FF doména Gln KH doména mrna MSE Nt NTC PPT pre-mrna RNP RRM Ser snrna snrnp aminokyselina (amino acid) asparagin (asparagine) adenosintrifosfát (adenosine triphosphate) místo větvení (branchpoint) komplex vázající čepičku (cap binding complex) commitment complex C-koncová doména (C-terminal domain) proteinová doména pojmenovaná podle 2 konzervovaných fenylalaninů (FF domain) glutamin (gluamine) K homologní doména (K homology domain) mediátorová RNA (messenger RNA) střední sporulační element (middle sporulation element) nukleotid (nucleotide) proteinový komplex pojmenovaný podle proteinu Prp19, který je jeho hlavní součástí (NineTeen complex) poly-pyrimidinový úsek (poly-pyrimidine tract) prekurzor mediátorová RNA (precursor messenger RNA) ribonukleoprotein (ribonucleoprotein) RNA rozpoznávájící motiv (RNA recognition motif) serin (serine) malá jaderná RNA (small nuclear RNA) malý jaderný ribonukleoprotein (small nuclear RNP) URS1 upstream represní sekvence 1 (upstream repression sequence 1) WW doména Y 3 ss 5 ss proteinová doména pojmenovaná podle 2 konzerovaných tryptofanů (WW domain) pyrimidin (pyrimidine) 3 sestřihové místo (3 splice site) 5 sestřihové místo (5 splice site)

1. Úvod Sestřih (splicing) je úprava pre-mrna, ke které dochází v jádře eukaryotických buněk. U prokaryotických organismů k tomuto procesu nedochází, protože jejich geny jsou rovnou transkribovány do zralé mrna. Struktura primárních transkriptů eukaryotických buněk je oproti prokaryotům mnohem složitější, protože kromě oblastí kódujích proteiny obsahuje ještě oblasti nekódující. Během sestřihu pre-mrna dochází k odstranění intronů (nekódujících oblastí), spojení exonů (oblastí kódujících) a vytvoření mrna z pre-mrna. Vzniklá mrna je následně přeložena do struktury proteinu. Sestřih je katalyzován ribonukleoproteinovým (RNP) komplexem, který se nazývá spliceosom. Spliceosom je vysoce dynamickým komplexem, který napomáhá rozpoznávání konzervovaných míst intronů, jejich přiblížení a katalyzuje tak odstranění intronů. Se spliceosomem jsou asociované různé proteiny, mezi které patří například Mer1p a Nam8p. Oba tyto proteiny nejsou vyžadovány pro sestřih všech pre-mrna, ale usnadňují sestřih pre-mrna specifických genů, jejichž produkty jsou nezbytné pro meiózu. Proces, kterým tyto dva proteiny interagují a spolupracují se spliceosomem, je nejen zajímavý, ale také důležitý pro pochopení regulace exprese některých meiotických genů. Cílem mé práce je shrnout dosavadní poznatky o funkci Mer1p a Nam8p v sestřihu pre-mrna a vytvořit ucelený pohled na jejich vzájemnou interakci. 1

2. Sestřih pre-mrna 2.1. Definování intronů Různé organismy se výrazně liší délkou, počtem i množstvím intronů. V kvasince Saccharomyces cerevisiae obsahuje introny 283 genů z celkové počtu asi 6000, což představuje 5 % jejích genů. V těchto 283 genech se nachází 296 intronů, z čehož vyplývá, že kvasinkové geny obsahují převážně jeden intron (Parenteau et al., 2008). Průměrná velikost kvasinkových intronů se obvykle pohybuje přibližně kolem 100 nebo 400 nukleotidů (nt) (Spingola et al., 1999). Naproti tomu 95 % lidských genů obsahuje introny. V těchto genech se nachází vyšší počet intronů s délkou větší než 10 000 nt (Lander et al., 2001). V počátečních krocích sestavování spliceosomu dochází k rozpoznávání intronů prostřednictvím jejich sestřihových míst. Introny jsou definované typickými konzervovanými sekvencemi (viz Obr.1), které se nachází v 5 sestřihovém místě, 3 sestřihovém místě (3 splice site, 3 ss) a v místě tzv. větvení (branchpoint, BP). U vyšších eukaryot se za BP nachází tzv. polypyrimidinový úsek (PPT, poly-pyrimidine tract) (shrnuto v Will and Lührmann, 2011). BP a PPT. Obr. 1. Schéma pre-mrna obsahující jeden intron. Na obrázku je znázorněno 5 ss, 3 ss, Většina intronů kvasinky S. cerevisiae obsahuje standardní (tzv. konsensuální) sestřihové sekvence. Některé introny mají tyto sekvence nestandardní (tzv. nekonsensuální). Konsenzuální sekvence 5 ss je 5 -GUAUGU-3. BP obsahuje konsenzuální sekvenci 5 -UACUAAC-3, která obklopuje adenosin BP (podtržený) a 3 ss je definované 5 -YAG-3 (Y-pyrimidin). Pro sestřih je velice důležité nejen rozpoznávání konzervovaných míst intronů, ale také způsob, jakým je celý proces regulován (Kupfer et al., 2004). 2

2.1.1. Rozpoznání 5 sestřihového místa 5 ss je rozeznáváno na základě interakcí mezi spliceosomem a konzervovanými oblastmi na pre-mrna. Některé z těchto interakcí jsou pro sestavování spliceosomu nezbytné, jako např. interakce mezi U1 snrna a 5 ss (Seraphin and Rosbash, 1991). Jiné přispívají pouze ke stabilitě komplexu, ale nejsou pro něj esenciální. Mezi stabilizační interakce patří například asociace Nam8p a CBC (cap binding complexu) s pre-mrna, které nejsou pro pre-mrna s konsensuálním 5 ss potřebné (viz Obr.2) (Puig et al., 1999). Obr. 2. Model rozpoznávání nestandardního 5 ss. Rozpoznávání nekonsensuálního 5 ss závisí na síti interakcí mezi spliceosomem a pre-mrna. Dochází například k interakcím mezi CBC a cap strukturou, U1 snrnp a 5 ss, Nam8p a nekonzervovanou oblastí intronu (Puig et al., 1999). 2.1.2. Rozpoznávání 3 sestřihového místa Rozpoznávání 3 ss probíhá na základě různých vlastností intronů jako například umístění a typu sousedních sekvencí, jejich vzdálenosti od 3 ss a také struktury pre-mrna (záhyby či smyčky) (viz Obr.3) (shrnuto v Perez-Valle and Vilardell, 2012). Důležitou roli v rozpoznávání 3 oblasti hraje vzdálenost mezi BP a 3 ss, přítomnost PPT mezi BP a 3 ss (u vyšších eukaryot) a také interakce mezi 3 ss a 5 ss (Collins and Guthrie, 2001). Obvyklá vzdálenost mezi BP a 3 ss v S.cerevisiae je 11-60 nt (Spingola et al., 1999). 3 ss je zřejmě definováno dvěma nukleotidy AG (YAG, na první pozici je přednostně Y), které se v genomu objevují velice často, proto je do výběru tohoto místa zapojeno ještě několik dalších prvků. Během rozpoznávání 3 ss je podstatná samotná struktura pre-mrna v oblasti 3 ss. V rozmezí 10-45 nt od BP jsou všechny AG vybírány se stejnou pravděpodobností, ve vzdálenostech delších než 45 nt dochází ke snížení rozpoznávání AG jako 3 ss. Na pre-mrna však mohou vznikat vlásenkové struktury, které mají vliv na výběr AG. Pokud se AG nachází uvnitř vlásenky, dochází k jeho maskování a spliceosom jej 3

nerozezná. Vlásenky přispívají také k využití vzdálenějších AG (AG, které se nachází 50 nt a více od BP), a to tak, že tato místa přiblíží. Tvorba vlásenkových struktur a jejich velikost je vysoce variabilní (Gahura et al., 2011, Perez-Valle and Vilardell, 2012). Obr. 3. Definování 3 ss na intronu kvasinky S. cerevisiae. Pro rozpoznání 3 ss intronu je důležitá struktura pre-mrna. Zeleně jsou zobrazena upřednostňovaná AG místa (těmto místům předchází pyrimidin) před oranžově zobrazenými AG místy. Červeně znázorněná AG místa spliceosom ignoruje stejně jako AG nacházející se prvních 9 nt za BP (převzato a upraveno podle Perez-Valle and Vilardell, 2012). 3. Sestavování spliceosomu Postupným uspořádáváním jednotlivých faktorů na substrátu pre-mrna vzniká spliceosom (viz Obr.4). K sestavování spliceosomu dochází vždy znovu na každé pre-mrna. Spliceosom se skládá z malých jaderných RNA - proteinových komplexů (snrnp small nuclear ribonucleoprotein particle) a non-snrnp proteinů (shrnuto v Jurica and Moore, 2003). Součástí spliceosomu jsou také RNA-dependentní NTPázy (RNPázy), které pro svoji funkci vyžadují energii ve formě ATP případně GTP (shrnuto v Staley and Guthrie, 1998). Spliceosom kvasinek obsahuje kolem 100 proteinů a pět snrna: U1, U2, U4, U5 a U6. Složení jednotlivých kvasinkových komplexů je různé, zatímco komplex B se skládá přibližně z 60 proteinů, komplex B act ze 40 proteinů a komlex C z 50 proteinů (viz Obr.5). Lidský spliceosom je v porovnání s kvasinkovým mnohem složitější, obsahuje více než 170 různých proteinů včetně pěti snrna, čemuž odpovídá i odlišné proteinové složení jednotlivých komplexů (Fabrizio et al., 2009). 4

Obr. 4. Postupné sestavování spliceosomu a s ním spojený vznik jednotlivých komplexů. Modré obdélníky znázorňují exony, černá čára, která je spojuje, je intron a barevné kuličky jsou jednotlivé snrnp (převzato a upraveno podle Will and Lührmann, 2011) 5

Obr. 5. Složení jednotlivých spliceosomálních komplexů B, B act a C v kvasince S. cerevisiae. Proteiny jsou uspořádány podle jejich funkce a asociace s jednotlivými snrnp. Přítomnost proteinů v jednotlivých komplexech je barevně označena, pokud se protein v některém z komplexů nenachází je tento fakt označen šedým polem ohraničeným přerušovanou čarou (Fabrizio et al., 2009). 6

3.1. U1 a U2 snrnp U1 snrnp se skládá z U1 snrna, sedmi Sm proteinů a z dalších deseti proteinů (viz Obr. 5) (Fabrizio et al., 2009). Pro kvasinku jsou esenciální všechny součásti U1 snrnp mimo Nam8p a Mud1p (Fortes et al., 1999). U2 snrnp se skládá z U2 snrna, sedmi Sm proteinů a dalších jedenácti proteinů (Fabrizio et al., 2009). Esenciálními proteiny U2 snrnp jsou proteiny komplexu SF3b: Rse1, Hsh155, Cus1, Hsh49, Rds3 a Ysf3 (Igel et al., 1998). Jednou ze součástí U1 snrnp je protein Prp40 (viz Obr. 6), jehož funkce spočívá zřejmě v propojení sestřihu a transkripce, protože se váže přímo na CTD (C-koncovou doménu) RNA polymerázy II (Morris and Greenleaf, 2000). Prp40p se skládá ze dvou N-koncových WW 1 domén a ze 4 FF 2 (zprostředkovávají protein-proteinové interakce), pomocí kterých interaguje s dalšími podjednotkami U1 snrnp (Bedford and Leder, 1999). Interakce Prp40p s BBP zřejmě usnadňuje vznik CC2 a následná interakce Prp40p s Prp8p (protein, který je součástí U5 snrnp) vede k usnadnění vazby U4/U6.U5 tri-snrnp na pre-mrna (Görnemann et al., 2011). Obr. 6. Schematické znázornění stavby U1 snrnp. Modře je znázorněna oblast konzervovaná v kvasinkovém a lidském U1snRNP. Oranžově jsou zvýrazněny jednotlivé domény Prp40p, žlutě Nam8p, červeně Snu71p, zbylé součástí U1 snrnp jsou znázorněny zeleně. Černé šipky označují faktory, které zřejmě interagují s Prp40p (Görnemann et al., 2011). 1 WW doména je proteinovou doménou, která obsahuje dva vysoce konzervované tryptofany (W) vážící se na oblasti peptidů bohaté na prolin (Chen, H. I., and M. Sudol. 1995). 2 FF doména je proteinová doména charakterizovaná dvěma vysoce konzervovanými fenylalaniny (F) (Allen et al. 2002). 7

V prvním kroku sestavování spliceosomu dochází k rozpoznání 5 ss prostřednictvím U1 snrnp. Tato interakce probíhá na základě komplementarity 5 ss a 5 konce U1 snrna. K vazbě U1 snrnp na pre-mrna není potřebná energie ve formě ATP (Bindereif and Green, 1987). Po navázání U1 snrnp vzniká tzv. commitment complex 1 (CC1). Následně U1 snrnp interaguje s BP, a to prostřednictvím dvou faktorů BBP (jehož savčím homologem je sestřihový faktor SF1) a Mud2p (savčím homologem je U2AF65) za vzniku commitment complexu 2 (CC2) (Abovich and Rosbash, 1997). Je tedy patrné, že pro vznik CC1 je potřebná pouze přítomnost 5 ss na cílové pre-mrna, zatímco pro vznik CC2 je navíc potřebná i sekvence BP (Seraphin and Rosbash, 1991). Oba komplexy obsahují také malou podjednotku cap-binding complexu (CBC) Mud13p (Colot et al., 1996). Klíčovou roli v interakci mezi U1 a U2 snrnp hrají proteiny Sub2 a Prp5. Protein Sub2 (viz Obr.7) funguje nejspíše dvěma způsoby; nejprve ATP nezávislým a poté ATP závislým. Při prvním z nich pomáhá vázat Mud2p a zřejmě i BBP na pre-mrna substrát a následně za přítomnosti ATP tyto dva proteiny odstraňuje, aby mohlo dojít k vazbě U2 snrnp (Kistler and Guthrie, 2001). Pro umožnění vazby U2 snrnp na pre-mrna jsou potřebné kromě Sub2 ještě proteiny Cus2 a Prp5. Protein Cus2 se váže na U2 snrna, přispívá ke změně její konformace a tím k aktivaci U2 snrnp. Posléze Prp5p v ATP závislém kroku odstraní protein Cus2 z U2 snrna a stabilizuje vzniklou aktivní konformaci U2 snrnp. Funkcí proteinu Prp5, která je zřejmě nezávislá na ATP je stabilizace vazby U2 snrnp na pre-mrna (Perriman et al., 2003). Vazbou U1 a U2 snrnp vzniká komplex A (= prespliceosome) (shrnuto v Will and Lührmann, 2011). 8

Obr. 7. Model fungování proteinů Sub2 a Prp5. CC označuje commitment complex, PS prespliceosome, B-BBP, M-Mud2p. Na obrázku je znázorněna funkce proteinu Sub2 nejprve nezávislá a poté závislá na ATP a také funkce Prp5p při zprostředkování vazby U2 snrnp na pre-mrna (převzato a upraveno podle Kistler and Guthrie, 2001). 3.2. U4/U6.U5 tri-snrnp Proces sestavování spliceosomu dále pokračuje vznikem prekatalytického komplexu B, a to tak, že se na komplex A naváže U4/U6.U5 tri-snrnp (předem sestaven z U5 a U4/U6 snrnp). Touto vazbou dojde ke změnám interakcí mezi RNA-RNA a RNA a proteiny, což vede k destabilizaci a odvázání U1 a U4 snrnp a tím ke vzniku aktivovaného spliceosomu (B act ). Následně prostřednictvím ATPázy Prp2p dochází k přechodu spliceosomu B act na katalyticky aktivní spliceosom B *, který katalyzuje první ze dvou kroků sestřihu 9

(transesterifikační reakci) (shrnuto v Will and Lührmann, 2011). Pro aktivační proces je potřebný také komplex NTC (NineTeen Complex) (Chang et al., 2009). S U4/U6.U5 tri-snrnp asociuje nejméně 28 proteinů. První skupinu tvoří Sm proteiny interagující s U4 a U5 snrna v tri-snrnp. Další skupina se skládá z Sm-like proteinů (Lsm) asociujích s U6 snrna. Interakcí s tri-snrnp se účastní ještě řada dalších proteinů (viz Obr.5) (Stevens et al., 2001). Významnými součástmi U5 snrnp jsou proteiny Prp8, Brr2 a Snu114, které společně tvoří vysoce stabilní trimer (Hacker et al., 2008). Tyto proteiny hrají klíčovou roli v katalytické aktivaci spliceosomu. Prp8p je jedním z vysoce konzervovaných proteinů. Interaguje s mnoha spliceosomálními proteiny, s U5 snrna, 5 ss i s 3 ss intronu (Teigelkamp et al., 1995). Snu114p funguje jako regulační GTPáza (Small et al., 2006), která zřejmě společně s Prp8p reguluje aktivitu Brr2 v průběhu aktivace spliceosomu. Brr2p je RNA helikáza umožňující odvázání U4 snrnp ze spliceosomu (shrnuto v Chen and Cheng, 2012). 3.3. NTC (NineTeen Complex) NTC je vysoce konzervovaný proteinový komplex, jehož hlavní součástí je protein Prp19 (Ohi et al., 2005). Tento komplex je potřebný pro aktivaci spliceosomu. Do spliceosomu se NTC váže ještě před odvázáním U1 a U4 snrnp (Fabrizio et al., 2009). NTC je potřebný pro stabilizaci asociace U5 a U6 snrnp se spliceosomem během tvorby aktivovaného spliceosomu a je vyžadován také pro specifickou interakci těchto dvou snrnp (U5 a U6) (Chang et al., 2009). Se spliceosomem zůstává NTC spojen až do ukončení katalytické reakce. Dosud není známý přesný způsob, jakým se NTC do spliceosomu váže (Chan et al., 2003). Jednotlivé komponenty NTC jsou vysoce konzervované. NTC se skládá nejméně z osmi proteinů: Prp19, Syf1/Ntc90, Cef1/Ntc85, Clf1/Ntc77, Syf2/Ntc31, Isy1/Ntc30, Snt309/Ntc25 a Ntc20. Existuje ještě řada dalších proteinů, které s NTC asociují (shrnuto v Hogg et al., 2010). Tyto proteiny mají různé funkce v posledních fázích působení spliceosomu: v aktivaci, katalýze a recyklaci (Saha et al., 2012). Protein Prp19 je potřebný pro asosiaci NTC se spliceosomem. Zmíněný protein interaguje s dalšími proteiny komplexu (viz Obr.8) jako například s Ntc85p (který následně interaguje s Ntc90p a Ntc77p při tvorbě NTC), Ntc25p a také s proteiny asocovanými s NTC, např. Cwc2 (Ohi et al., 2005). Protein 10

Cwc2 obsahuje RNA vazebnou doménu prostřednictvím které přímo interaguje s U6 snrna a tím zřejmě zajišťuje propojení NTC se spliceosomem (McGrail et al., 2009). Obr. 8. Schéma interakcí mezi komponenty NTC. Ntc85p, Ntc90p a Ntc30p jsou dimery, zatímco protein Prp19p je tetramerem. Proteiny kódované esenciálními geny jsou označené šedě a neesenciálními geny černě. Šedý kruh označuje stabilní asociaci Ntc90p, Ntc31p, Ntc30p a Ntc20p (Chen et al., 2002). 4. Transesterifikační reakce Katalytické jádro spliceosomu vzniká po párování U6 snrna s 5 ss intronu a U2 snrna a je stabilizováno vazbou NTC a proteinových komponent snrnp. K vlastnímu sestřihu pre-mrna dochází během dvou transesterifikačních reakcí v katalyticky aktivním spliceosomu (shrnuto v Chen and Cheng, 2012). Prvním krokem sestřihu vzniká komplex C, který katalyzuje druhý krok sestřihu, při němž vzniká post-spliceosomální komplex a mrna. Součástí obou katalytických kroků jsou strukturální změny spliceosomu závislé na ATP a následně reakce na ATP nezávislé (Liu et al., 2007). Pro konformační změny potřebné pro první katalytický krok je nezbytná DExD/H-box 3 ATPáza Prp2p. Pro vazbu Prp2p do spliceosomu je vyžadován kofaktor Spp2p. Tento protein asociuje se spliceosomem po jeho sestavení, ale ještě před prvním katalytickým krokem (Roy et al., 1995). Protein Prp2 je nezbytný pro odvázání proteinů ze subkomplexů 3 DExD/H-box helikázy jsou enzymy SF2 (superfamily 2) (shrnuto v Cordin et al. 2006). 11

U2 snrnp SF3a a SF3b. Uvolnění SF3b z BP vede k odkrytí BP a iniciuje tak chemickou reakci prvního katalytického kroku (Yeh et al., 2011). Společně s SF3a a SF3b jsou odvinuty ze spliceosomu i proteiny Prp2 a Spp2. (Chiu et al., 2009). DExD/H-box ATPázou nezbytnou pro druhý katalytický krok sestřihu je Prp16p, která utváří konformační změnu spliceosomu, díky níž může dojít k druhému katalytickému kroku (Tseng et al., 2011). Následně jsou vyžadovány proteiny Slu7, Prp18 a Prp22, které nezávisle na ATP podporují druhý katalytický krok sestřihu (shrnuto v Horowitz, 2012). Vlastní sestřih intronů probíhá ve dvou po sobě následujících krocích. Při prvním z nich 2 OH skupina adenosinového zbytku z BP uskuteční nukleofilní atak na 5 fosfát 5 ss intronu. Tím dojde ke vzniku 2 struktur: exonu1, končícího 3 OH skupinou, a RNA, ve které je 5 konec intronu kovalentně připojen k adenosinu z BP (tato struktura se označuje jako lariát lasovitá struktura). V druhém transesterifikačním kroku dochází k tomu, že 3 OH skupina exonu1 napadne 3 fosfát 3 ss intronu. Následně dojde k ligaci exonů a ke vzniku vlastní mrna. Intron je odstraněn ve formě lariátu (viz Obr.9) (shrnuto v Perez-Valle and Vilardell, 2012). Obr. 9. Transesterifikační reakce probíhající při sestřihu pre-mrna. Červeně jsou zobrazeny konzervované sekvence sestřihových míst intronu (Chen and Cheng, 2012). 12

5. Rozpad spliceosomu Po ligaci exonů je mrna uvolněna ze spliceosomu, a to ještě před jeho rozpadem. Je také potřebné, aby došlo k uvolnění jednotlivých komponent ze spliceosomu pro jejich následné použití. Za uvolnění zralé mrna ze spliceosomu je zodpovědná DExD/H-box ATPáza Prp22p (Schwer and Meszaros, 2000). Klíčovou roli v rozpadu spliceosomu hraje také další DExD/H-box ATPáza Prp43p. Jejím úkolem je uvolnění vystřiženého intron-lariátu ze spliceosomu (Martin et al., 2002). Pro funkci Prp43p jsou vyžadovány dva kofaktory: Ntr1p a Ntr2p. Vzájemnou interakcí všech tří proteinů vzniká stabilní komlex NTR (NineTeen complex-related proteins). Tento komplex katalyzuje rozpad spliceosomu tím, že z něj uvolňuje U2, U5, U6 snrnp a intron-lariát (Tsai et al., 2005). Pro rozpad spliceosomu jsou potřebné ještě další faktory. Autoři Small et al. prostřednictvím in vivo systému potvrdili interakci Brr2p s Prp43p a také to, že ATPázová aktivita Brr2p je regulována prostřednictvím Snu114p (Small et al., 2006). V nedávné době prostřednictvím in vitro systému autoři Fourmann et al. zjistili, že pro uvolnění intron-lariátu je dostačující pouze aktivita Prp43p a nepotvrdili úlohu Brr2p při rozpadu spliceosomu (Fourmann et al., 2013). Tento rozpor může být způsoben použitým systémem. 6. Meiotická indukce genů Jednou ze skupin genů, které obsahují introny v kvasince S. cerevisiae, jsou geny indukované během meiózy. V průběhu vegetativního růstu je potlačen sestřih intronů třinácti meiotických genů a je indukován až při sporulaci (Juneau et al., 2007). Jedním z nejlépe charakterizovaných je meiotický sestřih regulovaný proteinem Mer1 (viz Obr.10), který hraje klíčovou roli v propojení exprese časných a středních meiotických genů (Munding et al., 2010). Transkripce časných meiotických genů je aktivována prostřednictvím transkripčního aktivátoru Ime1p. Tento protein je v hladovějících buňkách fosforylován, což umožňuje jeho interakci s Ume6p, který je navázán do Upstream repression sequence 1 (URS1) (shrnuto v Vershon and Pierce, 2000). Interakce výše zmíněných proteinů vyvolá degradaci Ume6p 13

a umožní aktivaci transkripce časných meiotických genů (Mallory et al., 2007). K těmto genům patří i MER1 a tři ze čtyř pre-mrna genů, jejichž sestřih je aktivován Mer1p. Aktivací transkripce genu MER1 dojde k aktivaci sestřihu pre-mrna čtyř genů AMA1/SPO70, MER2/REC107, MER3/HFM1 a SPO22/ZIP4 prostřednictvím Mer1p. Produkty genů dvou z nich: MER3 a SPO22, jsou potřebné pro následnou aktivaci transkripčního regulátoru středních meiotických genů NDT80 (Munding et al., 2010). Ndt80p se váže do konzervované oblasti Middle sporulation element (MSE) v promotoru středních meiotických genů a aktivuje jejich transkripci (shrnuto v Vershon and Pierce, 2000). Tímto uspořádáním dochází ke zpoždění exprese čtyř meiotických genů sestřih jejichž pre-mrna je aktivovaných Mer1p v porovnání s ostatními geny, které jsou pod kontrolou Ume6p. Existence této sestřihové sítě zřejmě přispívá k přesnější koordinaci genové exprese (Munding et al., 2010). Obr. 10. Schéma meiotické indukce genů. Degradace Ume6p vede k aktivaci časných meiotických genů včetně MER1. Mer1p následně aktivuje sestřih pre-mrna čtyř genů MER3, SPO22, AMA1 a MER2. Produkty genů MER3 a SPO22 jsou potřebné pro aktivaci NDT80. V rámečcích jsou vyznačeny jednotlivé meiotické geny. Šipky znázorňují interakce mezi geny (Kalsotra and Cooper, 2011). 14

7. Proteiny Nam8 a Mer1 Proteiny Mer1 a Nam8 nejsou obecně vyžadované pro sestřih, ale zvyšují efektivitu sestřihu několika pre-mrna, které jsou potřebné pro meiózu (meiotickou rekombinaci a jaderné dělení). Původní analýzy odhalily, že Mer1p a Nam8p společně aktivují sestřih pouze tří pre-mrna meiotických genů AMA1/SPO70, MER2/REC107 a MER3/HFM1 (Davis et al., 2000). Následná analýza odhalila ještě další pre-mrna, jejíhož sestřihu se tyto dva proteiny společně účastní. Jedná se o pre-mrna genu SPO22/ZIP4. Transkripty, jejichž sestřih je regulován Mer1p a Nam8p, mají buď nekonsensuální 5 ss, BP, 3 ss, dlouhý exon1, případně nestandardní vzdálenost mezi BP a 3 ss. Díky tomu dochází k velice nízké účinnosti jejich sestřihu. Mer1p a Nam8p společně kompenzují slabý sestřih těchto intronů (Qiu et al., 2011b). 7.1. Protein Nam8 Gen NAM8 byl nejprve objeven jako multikopiový supresor nedostatečného mitochondriálního sestřihu (Ekwall et al., 1992). Nam8p (z anglického nuclear accommodation of mitochondria) je 523 aminokyselin (ak) dlouhý protein, který je RNA-vazebnou součástí kvasinkového U1 snrnp (Gottschalk et al., 1998). Nam8p je potřebný pro stabilizaci CC na pre-mrna s nekonsensuálním 5 ss případně pre-mrna postrádající čepičku. Interakce Nam8p s pre-mrna probíhá downstream od 5 ss v nekonzervované oblasti v blízkosti intronového Mer1 elementu (viz níže) (Puig et al., 1999). Součástí Nam8p jsou 3 RRM (RNA recognition motif) domény, a to RRM1, RRM2 a RRM3 (viz Obr.11). Před doménami RRM1 a RRM2 se nachází 40 ak dlouhý N-konec. Dvě RRM domény (RRM1 a RRM2) jsou od domény RRM3 odděleny 63 ak dlouhou oblastí obsahující převážně hydrofilní ak jako Ser, Asn a Gln. Za RRM3 doménou se nachází 130 ak dlouhý C-konec, který je také bohatý na Ser, Asn a Gln. Bylo zjištěno, že pro meiotické funkce Nam8 jsou potřebné RNA-vazebné povrchy jak domény RRM2 tak i domény RRM3 (Qiu et al., 2011a). 15

al., 2011b). Obr. 11. Struktura proteinu Nam8. Šedé válce zobrazují jednotlivé RRM domény (Qiu et Savčím homologem Nam8p je RNA-vazebný protein a sestřihový faktor TIA-1. Nam8p a TIA-1 mají podobnou organizaci jednotlivých domén a také obdobnou aminokyselinovou sekvenci. TIA-1 stejně jako Nam8p obsahuje tři RRM domény. Kromě strukturální podobnosti tyto dva proteiny vykazují také podobnost funkční. TIA-1 obdobně jako Nam8p napomáhá rozpoznávání slabého 5 ss na pre-mrna (Forch et al., 2000). 7.2. Protein Mer1 Sestřihový regulátor Mer1p (z anglického meiotic recombination) je 270 ak dlouhý RNA vazebný protein. Mer1p je produkován u kvasinky S. cerevisiae pouze během meiozy (Engebrecht et al., 1991). Jeho exprese je kontrolována meiotickým transkripčním faktorem Ime1p (Engebrecht and Roeder, 1990). Mer1p se skládá ze dvou funkčních domén: C-koncové KH domény (z anglického hnrnp K homology domain) a N-koncové domény. KH-doména rozpoznává introny obsahující sestřihový enhancer Mer1p, zatímco N-koncová doména interaguje se spliceosomem a aktivuje sestřih (Spingola et al., 2004). 7.2.1. Cílové pre-mrna proteinu Mer1 Prvním z Mer1p regulonu je pre-mrna genu MER2. Na intronu tohoto genu se nachází nekonsensuální 5 ss 5 -GUUCGU3, které se od konsensuálního 5 ss místa 5 -GUAYGU-3 liší pozicí třetího nukleotidu (místo A se zde nachází U). Pre-mRNA genu MER2 obsahuje dlouhý exon1 (Nandabalan et al., 1993). Kvasinkové exony1 jsou v porovnání s exony1 ostatních organismů velice krátké. Většina jich má velikost do 160 nt (Hawkins, 1988). Hlavním faktorem, díky němuž pre-mrna genu MER2 vyžaduje pro svůj účinný sestřih Mer1p je zřejmě její nekonsensuální 5 ss. Tento fakt byl potrvzen tím, že při změně nekonsensuálního 5 ss na konsensuální, se sestřih pre-mrna genu MER2 stal nezávislý na Mer1p (Nandabalan et al., 1993). Délka exonu1 také určitým způsobem ovlivňuje setřih. Při experimentálním zkrácení exonu1 pre-mrna genu MER2 z 316 nt na 106 nt (exon1 byl zkrácen ve vzdálenosti 30 240 nt) již dále nebyl potřebný Mer1p pro její 16

efektivní sestřih (Nandabalan and Roeder, 1995). MER2 je transkribován v průběhu celého buněčného cyklu, ale pouze během meiózy dochází k účinnému sestřihu jeho transkriptu prostřednictvím Mer1p (Engebrecht et al., 1991). Druhou pre-mrna z Mer1p regulonu je pre-mrna genu MER3. Intron této pre-mrna obsahuje konsensuální 3 ss. Jeho 5 ss je nekonsenzuální kvůli tomu, že postrádá čtvrtý nukleotid 5 -GUA_GU-3. Nekonsensuální je i sekvence v okolí BP 5 -GACUAAC-3 a také vzdálenost BP a 3 ss je delší než je obvyklé, a to 83 nt. Další zvláštností pre-mrna genu MER3 je přítomnost PPT dlouhého 12 nt a nacházejícího se v blízkosti BP. K určení toho, který z těchto prvků je rozhodující pro závislost sestřihu pre-mrna genu MER3 na Mer1p a Nam8p byl proveden pokus, při kterém byly nahrazeny nekonsensuální 5 ss a BP intronu sekvencemi konsensuálními. Bylo zjištěno, že prvkem určujícím tuto závislost je stejně jako v případě pre-mrna genu MER2 nekonsensuální 5 ss (Qiu et al., 2011b). Třetí pre-mrna genu, pro jejíž sestřih jsou potřebné Mer1p a Nam8p, je SPO22. Na intronu tohoto genu se nachází nekonsensuální 5 ss, BP i 3 ss. Sekvence nekonsensuálního 5 ss je 5 -GUAUAU-3, sekvence v okolí BP je 5 -AACUAAC-3 a 3 ss obsahuje sekvenci 5 -AAG-3. Faktorem určujícím závislost pre-mrna genu SPO22 na Mer1p je v tomto případě opět nekonsensuální 5 ss (Qiu et al., 2011b). Poslední ze čtveřice je pre-mrna genu AMA1. Tento gen obsahuje dlouhý exon1 (1183 nt) a nekonsensuální 5 ss 5 -GUACGU-3. Ostatní konzervované sekvence (BP a 3 ss) jsou konsensuální (Spingola and Ares, 2000). 7.2.1. Enhancerová oblast rozpoznávaná proteinem Mer1 Na pre-mrna genů AMA1/SPO70, MER2/REC107, MER3/HFM1 a SPO22/ZIP4 se nachází specifická enhancerová oblast 5 -AYACCCUY-3, do které se váže Mer1p a tím aktivuje jejich sestřih. Funkce enhanceru je závislá na jeho pozici. Enhancerový element se nachází v intronech do vzdálenosti 25 nt downstream od 5 ss. Pokud se enhancer nachází dále od 5 ss nedochází k aktivaci sestřihu. Přítomnost sestřihového enhanceru je nezbytná pro sestřih pre-mrna genů aktivovaný prostřednictvím Mer1p (Spingola and Ares, 2000). 7.3. Funkce proteinů Mer1 a Nam8 v sestřihu pre-mrna Mer1p se účastní několika počátečních kroků sestavování spliceosomu. K tomuto zjištění přispělo hned několik faktů. Za prvé Mer1p může aktivovat sestřih intronů, které mají 17

experimentálně mutovaný BP. Za druhé Mer1p nedokáže aktivovat sestřih za absence neesenciálno U2 snrnp proteinu Snu17. A za třetí Mer1p interaguje jak s proteiny CC2 (BBP a Mud2) tak i s Prp11p, který je proteinem U2 snrnp vázajícího se do BP až po vytvoření CC2 (Spingola et al., 2004). Nam8p pomáhá stabilizovat CC (Puig et al., 1999), a to proto, že se váže na pre-mrna jen několik nukleotidů za 5 ss v blízkosti enhancerové oblasti Mer1p. Samotný Mer1p není schopen CC stabilizovat, proto pro efektivní sestřih pre-mrna čtyř meitockých genů je vyžadována přítomnost nejen Mer1p, ale i Nam8p (Spingola et al., 2004). Mer1p pro svoji funkci vyžaduje kromě Nam8p přítomnost proteinu Snu17 (Spingola et al., 2004). Tento protein obdobně jako Nam8p není ryze meitotický, k jejich expresi na rozdíl od Mer1p dochází i během vegetativního růstu buňky. Protein Snu17 je součástí proteinového komplexu SF3b, který je komponentou U2 snrnp (Gottschalk et al., 2001). Je tedy patrné, že pro to, aby mohl Mer1p aktivovat sestřih, musí interagovat jak s proteinovými komponentami U1 snrnp (Nam8p) tak i s proteiny U2 snrnp (Spingola et al., 2004). Přestože pro sestřih aktivovaný prostřednictvím Mer1p jsou potřebné proteiny Nam8 a Snu17 jejich přímé interakce s tímto proteinem nebyly prokázány. Vzájemná kooperace těchto proteinů s Mer1p je zřejmě zajištěna prostřednictvím dalších proteinů (viz Obr. 12). V případě Snu17p je takovýmto proteinem nejspíše Prp11. Tento protein je součástí proteinového komplexu SF3a, který je komponentou U2 snrnp. Pomocí dvouhybridní analýzy byla potvrzena interakce Prp11p s Mer1p (Spingola et al., 2004). Dalšími proteiny potřebnými pro správnou funkci Mer1p a Nam8p v sestřihu pre-mrna jsou Snu56p a Snu71p. Tyto proteiny jsou součástí U1 snrnp a jejich interakce s Mer1p a Nam8p byla také prokázána prostřednictvím dvouhybridní analýzy. Protein Snu56 interaguje obdobně jako Mer1p s proteiny Prp11 a Mud2 (Balzer and Henry, 2008). 18

Obr. 12. Protein-proteinové interakce během časné fáze formování spliceosomu. Černé obdélníky znázorňují exony, černá čára intron jehož sestřih je aktivovaný Mer1p. A) Snu56p stabilizuje Nam8p v U1 snrnp B) a asociuje s Mer1p, aby podpořil vazbu U1 snrnp do intronu během formování commitment complexu I. C) Znázornění interakce s Mud2p během sestavování commitment complexu II. D) Interakce s Prp11p během formování komplexu A zřejmě pomáhá stabilizovat jednotlivé meziprodukty spliceosomu. Černé obdélníčky označují interakce mezi proteiny (převzato a upraveno podle Balzer and Henry, 2008). 7.4. Sestřih nezávislý na proteinu Mer1 Nam8p kromě spolupráce s Mer1p ovlivňuje sestřih ještě dalších pre-mrna. Příkladem je pre-mrna genu PCH2, jejíž sestřih je nezávislý na Mer1p (viz Obr.13) Pre-mRNA genu PCH2 postrádá intronový enhancer, do kterého se váže Mer1p (Qiu et al., 2011c). Na pre-mrna tohoto genu se nachází optimální 5 ss, nestandardní sekvence v okolí BP 5 -CACUAAC-3 a také dlouhý exon1 (1551 nt). Nam8p zřejmě usnadňuje sestřih této pre-mrna prostřednictvím makromolekulárních interakcí, které zprostředkovávají přístup U2 snrnp do jeho nestandardního BP (Qiu et al., 2011b). 19

Nam8p se také účastní sestřihu intronu pre-mrna genu SRC1. SRC1 je indukován během meiózy a obsahuje intron, který prochází alternativním sestřihem. Tento intron obsahuje dvě nestandardní 5 ss 5 -GCAAGU-3, 5 -GUGAGU-3 a také dlouhý exon1 (1920 nt). Je velice pravděpodobné, že i v tomto případě Nam8p svoji funkcí napomáhá sestřihu pre-mrna tohoto genu, a to nezávisle na Mer1p. Přesný mechanismus funkce Nam8p při sestřihu pre-mrna tohoto genu ale není zcela objasněn. Zřejmé je pouze to, že tento sestřih není zcela závislý na Nam8p, protože i za nepřítomnosti Nam8p dochází k odstranění intronu (Rodriguez-Navarro et al., 2002). Obr. 13. Činnost Nam8p ve dvou meiotických regulonech. Modře je znázorněn regulon Mer1p, červeně regulon Nam8p a zeleně geny, jejichž sestřihu se účastní Mer1p a Nam8 splolečně. Je patrné, že se Nam8p účastní dvou odlišných meiotických sestřihových regulonů (viz Obr. 14). V prvním z nich spolupracuje s Mer1p při sestřihu již zmíněných čtyř pre-mrna meiotických genů, které obsahují nestandardní 5 ss (5 ss*) (viz Obr.14A). V tomto případě dochází k vazbě Mer1p do enhancerové oblasti. Následnou interakcí Mer1p s proteiny U1 snrnp - Snu56p a Snu71p dochází k usnadnění vazby U1 snrnp (obsahujícího Nam8p). Druhý typ regulonu je nezávislý na Mer1p a týká se hlavně sestřihu pre-mrna genu PCH2 (viz Obr.14B). Její intron obsahuje nestandardní sekvenci v okolí BP (BP*). V tomto případě by zřejmě mohlo docházet i k fyzické interakci Nam8p s U2 snrnp, ať již prostřednictvím proteinu vážícího se do BP - BBP (nepřímá interakce) nebo přímou interakcí Nam8p s U2 snrnp (Qiu et al., 2011b). 20

Obr. 14. Dva modely sestřihu závislého na Nam8p. Obr. A) zobrazuje sestřih pre-mrna závislý na Mer1p a Nam8p. Obr. B) zobrazuje sestřih pre-mrna zprostředkovaný Nam8p, ale nezávislý na Mer1p (Qiu et al., 2011b). 21

8. Závěr: S. cerevisiae. Cílem této práce bylo shrnout regulační role Mer1p a Nam8p v sestřihu kvasinky Přechod kvasinek z vegetativního stavu do stavu meiotického vyžaduje přesnou regulaci tohoto procesu. Mer1p a Nam8p jsou příklady proteinů, které tento proces regulují. Mer1p hraje klíčovou roli v přechodu od časných meiotických genů ke středním meiotickým genům. Mer1p a Nam8p svoji spoluprací aktivují sestřih pre-mrna čtyř genů: AMA1/SPO70, MER2/REC107, MER3/HFM1 a SPO22/ZIP4, které jsou potřebné pro meiotickou rekombinaci a jaderné dělení. Tedy pro jedny ze základních procesů probíhajících během meiózy. Introny pre-mrna výše zmíněných čtyř genů obsahují nekonsensuální sestřihová místa, BP, dlouhý exon1 případně další faktory, které oslabují jejich sestřih. Mer1p se váže do enhancerové oblasti nacházející se v blízkosti 5 ss a prostřednictvím proteinů Snu56p a Snu71p usnadňuje vazbu U1 snrnp obsahujícího Nam8p do nekonsensuálního 5 ss. Hlavním rysem, který zřejmě určuje závislost sestřihu pre-mrna meiotických genů na Mer1p a Nam8p je jejich nekonsensuální 5 ss, které můžeme nalézt ve všech čtyřech genech. Ostatní vlastnosti pre-mrna však také určitou měrou přispívají k této závislosti. V současné době jsou již zřejmě známy všechny pre-mrna, pro jejichž sestřih je vyžadována kooperace proteinů Mer1 a Nam8 (Qiu et al., 2011a). Otázkou však nadále zůstává, zda se procesu regulace sestřihu těchto pre-mrna neúčastní ještě nějaké další doposud neznámé proteiny. Přesný proces sestřihu aktivovaného Mer1p totiž i přes všechny dostupné informace není zcela objasněn. 22

Seznam použité literatury: Abovich, N., and M. Rosbash. 1997. Cross-intron bridging interactions in the yeast commitment complex are conserved in mammals. Cell 89:403-412. Allen, M., A. Friedler, O. Schon, and M. Bycroft. 2002. The structure of an FF domain from human HYPA/FBP11. Journal of Molecular Biology 323:411-416. Balzer, R. J., and M. F. Henry. 2008. Snu56p is required for Merlp-activated meiotic splicing. Molecular and Cellular Biology 28:2497-2508. Bedford, M. T., and P. Leder. 1999. The FF domain: a novel motif that often accompanies WW domains. Trends in Biochemical Sciences 24:264-265. Bindereif, A., and M. R. Green. 1987. An ordered pathway of snrnp binding during mammalian pre-messenger-rna splicing complex assembly. Embo Journal 6:2415-2424. Collins, C. A., and C. Guthrie. 2001. Genetic interactions between the 5' and 3' splice site consensus sequences and U6 snrna during the second catalytic step of pre-mrna splicing. Rna-a Publication of the Rna Society 7:1845-1854. Colot, H. V., F. Stutz, and M. Rosbash. 1996. The yeast splicing factor Mud13p is a commitment complex component and corresponds to CBP20 the small subunit of the nuclear cap-binding complex. Genes & Development 10:1699-1708. * Cordin, O., J. Banroques, N. K. Tanner, and P. Linder. 2006. The DEAD-box protein family of RNA helicases. Gene 367:17-37. Davis, C. A., L. Grate, M. Spingola, and M. Ares. 2000. Test of intron predictions reveals novel splice sites, alternatively spliced mrnas and new introns in meiotically regulated genes of yeast. Nucleic Acids Research 28:1700-1706. Ekwall, K., M. Kermorgant, G. Dujardin, O. Groudinsky, and P. P. Slonimski. 1992. The NAM8 gene in saccharomyces-cerevisiae encodes a protein with putative RNA-binding motifs and acts as a suppressor of mitochondrial splicing deficiencies when overexpressed. Molecular & General Genetics 233:136-144. Engebrecht, J., and G. S. Roeder. 1990. Mer1, a yeast gene required for chromosome-pairing and genetic-recombination, is induced in meiosis. Molecular and Cellular Biology 10:2379-2389. Engebrecht, J., K. Voelkelmeiman, and G. S. Roeder. 1991. Meiosis-specific RNA splicing in yeast. Cell 66:1257-1268. 23

Fabrizio, P., J. Dannenberg, P. Dube, B. Kastner, H. Stark, H. Urlaub, and R. Luhrmann. 2009. The evolutionarily conserved core design of the catalytic activation step of the yeast spliceosome. Molecular Cell 36:593-608. Forch, P., O. Puig, N. Kedersha, C. Martinez, S. Granneman, B. Seraphin, P. Anderson, and J. Valcarcel. 2000. The apoptosis-promoting factor TIA-1 is a regulator of alternative pre-mrna splicing. Molecular Cell 6:1089-1098. Fortes, P., D. Bilbao-Cortes, M. Fornerod, G. Rigaut, W. Raymond, B. Seraphin, and I. W. Mattaj. 1999. Luc7p, a novel yeast U1 snrnp protein with role in 5 ' splice site recognition. Genes & Development 13:2425-2438. Fourmann, J. B., J. Schmitzova, H. Christian, H. Urlaub, R. Ficner, K. L. Boon, P. Fabrizio, and R. Luhrmann. 2013. Dissection of the factor requirements for spliceosome disassembly and the elucidation of its dissociation products using a purified splicing system. Genes & Development 27:413-428. Gahura, O., C. Hammann, A. Valentova, F. Puta, and P. Folk. 2011. Secondary structure is required for 3 ' splice site recognition in yeast. Nucleic Acids Research 39:9759-9767. Görnemann, J., C. Barrandon, K. Hujer, B. Rutz, G. Rigaut, K. M. Kotovic, C. Faux, K. M. Neugebauer, and B. Seraphin. 2011. Cotranscriptional spliceosome assembly and splicing are independent of the Prp40p WW domain. Rna-a Publication of the Rna Society 17:2119-2129. Gottschalk, A., C. Bartels, G. Neubauer, R. Luhrmann, and P. Fabrizio. 2001. A novel yeast U2 snrnp protein, Snu17p, is required for the first catalytic step of splicing and for progression of spliceosome assembly. Molecular and Cellular Biology 21:3037-3046. Gottschalk, A., J. Tang, O. Puig, J. Salgado, G. Neubauer, H. V. Colot, M. Mann, B. Seraphin, M. Rosbash, R. Luhrmann, and P. Fabrizio. 1998. A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snrnp reveals five novel proteins. Rna-a Publication of the Rna Society 4:374-393. Hacker, I., B. Sander, M. M. Golas, E. Wolf, E. Karagoez, B. Kastner, H. Stark, P. Fabrizio, and R. Luhrmann. 2008. Localization of Prp8, Brr2, Snu114 and U4/U6 proteins in the yeast tri-snrnp by electron microscopy. Nature Structural & Molecular Biology 15:1206-1212. Hawkins, J. D. 1988. A survey on intron and exon lengths. Nucleic Acids Research 16:9893-9908. * Hogg, R., J. C. McGrail, and R. T. O'Keefe. 2010. The function of the NineTeen Complex (NTC) in regulating spliceosome conformations and fidelity during pre-mrna splicing. Biochemical Society Transactions 38:1110-1115. 24

* Horowitz, D. S. 2012. The mechanism of the second step of pre-mrna splicing. Wiley Interdisciplinary Reviews-Rna 3:331-350. Chan, S. P., D. I. Kao, W. Y. Tsai, and S. C. Cheng. 2003. The Prp19p-associated complex in spliceosome activation. Science 302:279-282. Chang, K. J., H. C. Chen, and S. C. Cheng. 2009. Ntc90 is required for recruiting first step factor Yju2 but not for spliceosome activation. Rna-a Publication of the Rna Society 15:1729-1739. Chen, C. H., W. C. Yu, T. Y. Tsao, L. Y. Wang, H. R. Chen, J. Y. Lin, W. Y. Tsai, and S. C. Cheng. 2002. Functional and physical interactions between components of the Prp19p-associated complex. Nucleic Acids Research 30:1029-1037. * Chen, H. C., and S. C. Cheng. 2012. Functional roles of protein splicing factors. Bioscience Reports 32:345-359. Chen, H. I., and M. Sudol. 1995. The WW domain of yes-associated protein binds a proline-rich ligand that differs from the consensus established for SRC homology 3-binding modules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92:7819-7823. Chiu, Y. F., Y. C. Liu, T. W. Chiang, T. C. Yeh, C. K. Tseng, N. Y. Wu, and S. C. Cheng. 2009. Cwc25 Is a Novel Splicing Factor Required after Prp2 and Yju2 To Facilitate the First Catalytic Reaction. Molecular and Cellular Biology 29:5671-5678. Igel, H., S. Wells, R. Perriman, and M. Ares. 1998. Conservation of structure and subunit interactions in yeast homologues of splicing factor 3b (SF3b) subunits. Rna-a Publication of the Rna Society 4:1-10. Juneau, K., C. Palm, M. Miranda, and R. W. Davis. 2007. High-density yeast-tiling array reveals previously undiscovered introns and extensive regulation of rneiotic splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104:1522-1527. * Jurica, M. S., and M. J. Moore. 2003. Pre-mRNA splicing: Awash in a sea of proteins. Molecular Cell 12:5-14. * Kalsotra, A., and T. A. Cooper. 2011. Functional consequences of developmentally regulated alternative splicing. Nature Reviews Genetics 12:715-729. Kistler, A. L., and C. Guthrie. 2001. Deletion of MUD2, the yeast homolog of U2AF65, can bypass the requirement for Sub2, an essential spliceosomal ATPase. Genes & Development 15:42-49. 25

Kupfer, D. M., S. D. Drabenstot, K. L. Buchanan, H. S. Lai, H. Zhu, D. W. Dyer, B. A. Roe, and J. W. Murphy. 2004. Introns and splicing elements of five diverse fungi. Eukaryotic Cell 3:1088-1100. Lander, E. S., et al.; Int Human Genome Sequencing. 2001. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409:860-921. Liu, Y. C., H. C. Chen, N. Y. Wu, and S. C. Cheng. 2007. A novel splicing factor, Yju2, is associated with NTC and acts after Prp2 in promoting the first catalytic reaction of pre-mrna splicing. Molecular and Cellular Biology 27:5403-5413. Mallory, M. J., K. F. Cooper, and R. Strich. 2007. Meiosis-specific destruction of the Ume6p repressor by the Cdc20-directed APC/C. Molecular Cell 27:951-961. Martin, A., S. Schneider, and B. Schwer. 2002. Prp43 is an essential RNA-dependent ATPase required for release of lariat-intron from the spliceosome. Journal of Biological Chemistry 277:17743-17750. McGrail, J. C., A. Krause, and R. T. O'Keefe. 2009. The RNA binding protein Cwc2 interacts directly with the U6 snrna to link the nineteen complex to the spliceosome during pre-mrna splicing. Nucleic Acids Research 37:4205-4217. Morris, D. P., and A. L. Greenleaf. 2000. The splicing factor, Prp40, binds the phosphorylated carboxyl-terminal domain of RNA polymerase II. Journal of Biological Chemistry 275:39935-39943. Munding, E. M., A. H. Igel, L. Shiue, K. M. Dorighi, L. R. Trevino, and M. Ares. 2010. Integration of a splicing regulatory network within the meiotic gene expression program of Saccharomyces cerevisiae. Genes & Development 24:2693-2704. Nandabalan, K., L. Price, and G. S. Roeder. 1993. Mutations in U1 snrna bypass the requirement for a cell type-specific RNA splicing factor. Cell 73:407-415. Nandabalan, K., and G. S. Roeder. 1995. Binding of a cell-type-specific RNA splicing factor to its target regulatory sequence. Molecular and Cellular Biology 15:1953-1960. Ohi, M. D., C. W. V. Kooi, J. A. Rosenberg, L. P. Ren, J. P. Hirsch, W. J. Chazin, T. Walz, and K. L. Gould. 2005. Structural and functional analysis of essential pre-mrna splicing factor Prp19p. Molecular and Cellular Biology 25:451-460. Parenteau, J., M. Durand, S. Veronneau, A. A. Lacombe, G. Morin, V. Guerin, B. Cecez, J. Gervais-Bird, C. S. Koh, D. Brunelle, R. J. Wellinger, B. Chabot, and S. Abou Elela. 2008. Deletion of many yeast introns reveals a minority of genes that require splicing for function. Molecular Biology of the Cell 19:1932-1941. 26

* Perez-Valle, J., and J. Vilardell. 2012. Intronic features that determine the selection of the 3' splice site. Wiley Interdisciplinary Reviews-Rna 3:707-717. Perriman, R., I. Barta, G. K. Voeltz, J. Abelson, and M. Ares. 2003. ATP requirement for Prp5p function is determined by Cus2p and the structure of U2 small nuclear RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100:13857-13862. Puig, O., A. Gottschalk, P. Fabrizio, and B. Seraphin. 1999. Interaction of the U1 snrnp with nonconserved intronic sequences affects 5 ' splice site selection. Genes & Development 13:569-580. Qiu, Z. C. R., B. Schwer, and S. Shuman. 2011a. Defining the Mer1 and Nam8 meiotic splicing regulons by cdna rescue. Rna-a Publication of the Rna Society 17:1648-1654. Qiu, Z. C. R., B. Schwer, and S. Shuman. 2011b. Determinants of Nam8-dependent splicing of meiotic pre-mrnas. Nucleic Acids Research 39:3427-3445. Qiu, Z. C. R., S. Shuman, and B. Schwer. 2011c. An essential role for trimethylguanosine RNA caps in Saccharomyces cerevisiae meiosis and their requirement for splicing of SAE3 and PCH2 meiotic pre-mrnas. Nucleic Acids Research 39:5633-5646. Rodriguez-Navarro, S., J. C. Igual, and J. E. Perez-Ortin. 2002. SRC1: An intron-containing yeast gene involved in sister chromatid segregation. Yeast 19:43-54. Roy, J., K. Kim, J. R. Maddock, J. G. Anthony, and J. L. Woolford. 1995. The final stages of spliceosome maturation require Spp2p that can interact with the deah box protein Prp2p and promote step-1 of splicing. Rna-a Publication of the Rna Society 1:375-390. Saha, D., P. Khandelia, R. T. O'Keefe, and U. Vijayraghavan. 2012. Saccharomyces cerevisiae NineTeen complex (NTC)-associated factor Bud31/Ycr063w assembles on precatalytic spliceosomes and improves first and second step pre-mrna splicing efficiency. Journal of Biological Chemistry 287:5390-5399. Seraphin, B., and M. Rosbash. 1991. The yeast branchpoint sequence is not required for the formation of a stable U1 snrna-pre-messenger RNA complex and is recognized in the absence of U2 snrna. Embo Journal 10:1209-1216. Schwer, B., and T. Meszaros. 2000. RNA helicase dynamics in pre-mrna splicing. Embo Journal 19:6582-6591. Small, E. C., S. R. Leggett, A. A. Winans, and J. P. Staley. 2006. The EF-G-like GTPase Snu114p regulates spliceosome dynamics mediated by Brr2p, a DExD/H box ATPase. Molecular Cell 23:389-399. 27