Název: Chemická kinetika - enzymy Autor: Mgr. Štěpán Mička Název školy: Gymnázium Jana Nerudy, škola hl. města Prahy Předmět, mezipředmětové vztahy: chemie, fyzika, biologie Ročník: 5. Tématický celek: Biochemie Stručná anotace: Pracovní list je koncipován jako podklad pro laboratorní práci, která názorně demonstruje biologickou aktivitu enzymů. V pracovním listu jsou obsaženy dva experimenty. První ukazuje různé způsoby denaturace a může být využit jako demonstrační experiment během běžné vyučovací hodiny nebo jej studenti mohou provádět v rámci laboratorních cvičení. Zajímavou možností je zařazení experimentu před teoretickým vysvětlením principů inhibice studenti na základě pozorování mohou navrhnout předpokládaný mechanismus. Druhý z navržených pokusu je zaměřen na aktivitu enzymů a je koncipován jako laboratorní práce. Cílem druhého úkolu je naučit žáky systematické a přesné práci, vyhodnocování a interpretaci dat. Časová dotace: Práce se dá provést během 1 vyučovací hodiny, ale vzhledem k náročnosti je vhodnější ji provádět během 2 vyučovacích hodin v menším časovém presu. Žáci pracující ve skupinách po 3 až 4 na základě experimentálních dat navrhnout teoretické vysvětlení pozorované závislosti. Tento výukový materiál byl vytvořen v rámci projektu Přírodní vědy prakticky a v souvislostech inovace výuky přírodovědných předmětů na Gymnáziu Jana Nerudy (číslo projektu CZ.2.17/3.1.00/36047) financovaného z Operačního programu Praha - Adaptabilita.
Pomůcky (seznam potřebného materiálu) Viz pracovní list Teorie Viz pracovní list Postup práce Pro úspěšné splnění druhého úkolu je nezbytné, aby žáci pracovali co nejpřesněji (příprava roztoků, měření časových intervalů) a veškeré roztoky měli řádně popsané. Dále je rozumné doporučit žákům, aby si nejprve vyzkoušeli manipulaci s kolečkem a až poté experimentovali. Manipulovat s kolečkem by pro eliminování chyby měl pouze jeden žák. Výsledky Koncentrace peroxidu vodíku (hm. %) 0,0 Čas (s) 1500, poté bylo měření ukončeno 0,1 113 0,5 39 1,0 21 3,0 10 Obrázek 1: Závislost času, ve kterém vyplavalo kolečko, na koncentraci peroxidu vodíku. Za daných podmínek můžeme považovat enzymatickou reakci jako reakci prvního řádu, závislost rychlosti enzymatické rychlosti na čase bude exponenciální (graf závislosti by byl symetrický dle osy x ke grafu na Obrázku 1).
Diskuze Oba dva uváděné pokusy je možné propojit s následnou diskusí o možných příčinách pozorovaných jevů. Cílem diskuze je naučit žáky argumentovat a obhájit si svůj návrh teoretického vysvětlení experimentu nebo vyvrátit návrh jiné skupiny. Učitel funguje jako moderátor a udržuje diskuzi v rozumných mezích, vysvětluje chyby diskutujících a pomáhá při tvorbě argumentů. Další aplikace, možnosti, rozšíření, zajímavosti, Laboratorní práce může snadno doplněna o další měření (měření opakovatelnosti experimentu při jedné koncentraci, závislost rychlosti enzymatické reakce na teplotě, na ph.), popřípadě o matematické zpracování výsledků. Zdroje: VODRÁŽKA, Z.: Biochemie. 2. vydání, Praha: Academia, 2007. http://www.vscht.cz/fch/cz/pomucky/bartovska/kin-teorie/9-enzymovakatalyza.pdf, [cit. 2013-01-25].
Pracovní list pro žáka Enzymatická aktivita Laboratorní práce číslo:. Jméno Teorie Třída Datum Enzymy jsou makromolekulární biokatalyzátory proteinové povahy. V živých organismech katalyzují neuvěřitelné množství reakcí, které by za fyziologických podmínek probíhaly velmi pomalu nebo by neprobíhaly vůbec. Podstata enzymatického působení je znázorněna na Obrázku 1. Každá chemická reakce potřebuje pro svůj průběh dodání určitého množství energie, tzv. aktivační energie. Tuto energii lze v chemické laboratoři snadno dodat např. zahřátím reakční směsi, ale za fyziologických podmínek nastává problém. Z tohoto důvodu se v živých systémech vyvinuly vysoce specifické a účinné enzymy. Enzym vede potřebnou reakci jiným reakčním mechanismem a rozkládá původně vysokou aktivační energii (E A ) do několika menších příspěvků (na obrázku 1 označeny jako E A1, E A2 ). Tyto menší energetické příspěvky už je možné v živém systému dodat, přestože jejich součet může být dokonce vyšší než původní E A. Enzymatické působení má v podstatě stejný princip jako hypotéky. Stejně jako rodina není schopna zaplatit za dům najednou 4 miliony, ale je schopná zaplatit 6 milionů během 30 let, tak organismus není schopen dodat najednou velké množství energie, ale je schopen dodat postupně několik menších příspěvků. Energie přechodový stav aktivační energie Reaktanty E A energie uvolněná do okolí E A1 E A2 Produkty Průběh reakce Obrázek 2: Srovnání nekatalyzované a enzymaticky katalyzované reakce. Enzymatické reakce jsou regulované na mnoha úrovních. Kromě regulace na buněčné úrovni (kompartmentace, genová exprese), jsou velmi významné fyzikálně-chemické faktory (teplota, ph, množství enzymu a substrátu) a dále přítomnost efektorů, látek, které podporují enzymatickou aktivitu (aktivátory), nebo ji tlumí či dokonce zastavují (inhibitory).
V rámci laboratorní práce budete pracovat s enzymem katalasou, který je obsažen prakticky ve všech aerobních organismech. Katalasy přeměňují pro buňky nebezpečný peroxid vodíku na vodu a kyslík a patří mezi nejrychlejší enzymy. Úkol č. 1: Ověřte, zda je možné inhibovat bramborovou katalasu změnou ph, působením těžkého kovu a varem. Chemikálie Brambora, koncentrovaný peroxid vodíku, sůl těžkého kovu (např. dusičnan stříbrný, pentahydrát síranu mědnatého), 15% kyselina sírová Pomůcky 4 skleněné misky (kádinky), 4 Petriho misky, chemické kleště, nůž, kádinka, trojnožka, keramická síťka, kahan, zápalky Postup práce Z brambory vykrojte čtyři stejně velké kvádříky (1 x 1 x 2 cm). Jeden z kvádříků umístěte do skleněné misky s nasyceným roztokem modré skalice (nebo s nasyceným roztokem jiného těžkého kovu), tak aby byl kvádřík zcela ponořen. Druhý z kvádříků umístěte stejným způsobem do misky s 15% kyselinou sírovou, třetí z kvádříků ponořte do misky s vodou a čtvrtý uvařte. Po 30 minutách přeneste jednotlivé kvádříky pomocí chemických kleští na Petriho misky, opatrně je zalijte koncentrovaným peroxidem vodíku a pozorujte. Navržené teoretické vysvětlení experimentů: Na základě pozorování navrhněte možné vysvětlení proč jednotlivé faktory (teplota, ph, přítomnost těžkých kovů) působí jako inhibitory, tedy zpomalují/zastavují enzymatickou reakci. Úkol č. 2: Experimentálně ověřte závislost rychlosti enzymatické reakce na koncentraci substrátu. Pro experimentální ověření rychlosti enzymatické reakce na koncentraci substrátu použijeme bramborovou katalasu, která katalyzuje přeměnu peroxidu vodíku na vodu a kyslík. Vzniklé plyny se uchytí ve vláknech kolečka z filtračního papíru a zapříčiní, že kolečko vyplave na povrch. Každé kolečko bude obsahovat stejné množství enzymu, ale bude ponořené v roztoku o různé koncentraci peroxidu vodíku (substrát). Takové uspořádání nám umožní na základě měření času, kdy kolečko vyplavalo, pozorovat vliv koncentrace substrátu na rychlost enzymatické reakce. Chemikálie Brambora, koncentrovaný peroxid vodíku, voda, led
Pomůcky Nůž, struhadlo, nůžky, kádinky (6 malých, jednu velkou), filtrační papír, stopky, pinzeta, fix Postup práce Jeden člen skupiny oloupe středně velkou bramboru a nastrouhá ji do velké kádinky, přidá 200 ml studené vody s kostkami ledu. Mezitím ostatní členové skupiny připraví do malých kádinek vždy 25 ml roztoku peroxidu vodíku o koncentracích 0,1; 0,5; 1,0; 3,0 a jednu kádinku naplní 25 ml vody. Dále vystřihnou 10 koleček filtračního papíru o průměru 1 cm. Do malé kádinky odlijte část tekutiny, která se uvolnila z brambory. Všechny kádinky musí být řádně popsány. V rámci měření jeden člen skupiny uchopí do pinzety kolečko a ponoří jej na 5 sekund do kádinky s extraktem z brambory, poté se kolečko 10 sekund suší mezi listy filtračního papíru, následně co nejrychleji kolečko pinzetou ponoří/stlačí až na dno kádinky s roztokem peroxidu vodíku o koncentraci 0,1% a měří se čas, kdy kolečko vyplave na hladinu. Celý proces se opakuje dvakrát pro každou koncentraci peroxidu vodíků, jednou pro vodu. Kádinka s vodou slouží jako kontrola, že kolečko nevyplave v čisté vodě, a proto je vhodné ji zařadit co nejdříve nebo ji použít jako pro natrénování manipulace s kolečky. Pozorování a výsledky koncentrace peroxidu vodíku 1. pokus 2. pokus průměr 0,1 % 0,5 % 1,0 % 3,0 % Průměrné hodnoty vyneste do grafu čas vs koncentrace peroxidu vodíku a proložte polynomickou regresní funkcí. Jak by vypadal graf rychlost enzymatické reakce vs koncentrace peroxidu vodíku za předpokladu konstantní koncentrace enzymu na kolečku?