Testování inhibičního potenciálu reaktivátorů lidské acetylcholinesterasy in vitro

UNIVERZITA KARLOVA FARMACEUTICKÁ FAKULTA Katedra farmakologie a toxikologie Testování inhibičního potenciálu reaktivátorů lidské acetylcholinesterasy in vitro Rigorózní práce Vedoucí rigorózní práce: PharmDr. Jana Ţďárová Karasová, PhD. Konzultant: PharmDr. Marie Vopršalová, CSc. Hradec Králové 11 Mgr. Vendula Šepsová

Prohlašuji, ţe jsem tuto rigorózní práci na téma Testování inhibiĉního potenciálu reaktivátorů lidské acetylcholinesterasy in vitro vypracovala samostatně pod vedením vedoucí práce PharmDr. Jany Ţďárové Karasové, PhD. a konzultantky PharmDr. Marie Vopršalové, CSc. Uvedla jsem všechny pouţité prameny a literaturu, jejichţ seznam je uveden na konci práce. V Hradci Králové dne Podpis: 2

PODĚKOVÁNÍ: Ráda bych zde poděkovala mojí vedoucí práce PharmDr. Janě Ţďárové Karasové, PhD. za odborné vedení, pomoc v laboratoři, cenné připomínky a taky ochotu a ĉas, který mi poskytla během realizace celé práce. Díky patří PharmDr. Marii Vopršalové, CSc. za konzultace a ĉas, který věnovala mé práci. Děkuji kolektivu zaměstnanců katedry toxikologie Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany v Brně za moţnost realizace mé práce, za příjemné pracovní prostředí a dále díky všem, kteří jakkoliv přispěli k dokonĉení této rigorózní práce. 3

ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Kandidát: Mgr. Vendula Šepsová Vedoucí práce: PharmDr. Jana Ţďárová Karasová, PhD. Konzultant: PharmDr. Marie Vopršalová, Csc. Název rigorózní práce: Testování inhibiĉního potenciálu reaktivátorů lidské acetylcholinesterasy in vitro Testované reaktivátory jsou slouĉeniny obsahující oximovou skupinu připojenou na pyridinový kruh, který umoţňuje navázání do aktivního místa acetylcholinesterasy (AChE). Tato struktura zaruĉující nukleofilitu jim umoţňuje reaktivovat inhibovanou AChE ireverzibilně se váţícími organofosfátovými inhibitory (OFI). Reaktivace je moţná pouze, dokud esterové substituenty nejsou hydrolyzovány (Kassa, 2). Reaktivátory mají relativně vysokou afinitu k aktivnímu místu AChE. Vyjádření afinity oximových reaktivátorů k AChE můţe být uváděno jako schopnost inhibovat tento enzym a jsou pak ĉíselně vyjádřeny pomocí IC 5. Cílem této práce bylo zaměřit se na vliv strukturních změn na schopnost oximů inhibovat AChE. Získané poznatky mohou být vyuţity při syntéze nových periferně působících inhibitorů AChE s reverzibilním úĉinkem. Mechanismus periferní inhibice AChE se jiţ dnes vyuţívá při profylaxi otrav nervově paralytických látek (NPL). Reverzibilní inhibitor se naváţe na AChE a tím brání OFI se navázat do aktivního centra enzymu. Reverzibilní inhibitory AChE s periferním úĉinkem jsou dále vyuţívány v léĉbě Myastenie gravis. Stanovení inhibiĉního potenciálu reaktivátorů probíhalo in vitro. Jako enzym byla pouţita lidská rekombinantní AChE. Stanovení aktivity enzymu bylo prováděno podle Ellmanovy metodiky (Ellman, 1961) modifikované dle Bajgara (Bajgar, 1972). Jelikoţ reaktivátory ve vyšších koncentracích samovolně štěpí DTNB, byly změřeny hodnoty oximolýzy, které byly následně odeĉteny od hodnot absorbance. Předešlo se tak vzniku falešně pozitivních výsledků. 4

V první skupině, kde byl zkoumán vliv délky spojovacího řetězce na inhibiĉní potenciál oximů, byl nejvyšší inhibiĉní potenciál zaznamenán u oximu K 338 s 1 uhlíky ve spojovacím řetězci. V druhé skupině byl zjišťován vliv polohy oximové skupiny u monokvarterních reaktivátorů. Poloha meta měla nejvyšší schopnost inhibovat AChE. Další dvě skupiny tvořily biskvarterní reaktivátory s tří nebo ĉtyř uhlíkatým spojovacím řetězcem. I zde se měnila poloha oximových skupin. Největší vliv na inhibici enzymu měla u obou skupin poloha ortho oximových skupin na pyridinovém kruhu. V poslední skupině bylo zjištěno, ţe dvojná vazba sniţuje a substituce ve spojovacím řetězci naopak tuto schopnost inhibovat AChE zvyšuje. 5

ABSTRACT Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Kralove Department of Farmacology and Toxicology Candidate: Mgr. Vendula Šepsová Supervisor: PharmDr. Jana Ţďárová Karasová, PhD. Consultant: PharmDr. Marie Vopršalová, Csc. Title of thesis: Inhibition potencial of human acetylcholinesterase reactivators in vitro testing Tested reactivators are substances with oxime moiety attached to a ring with quaternary nitrogen, which enable binding to active site of acetylcholinesterase (AChE). This nucleophilic structure can reactivate inhibited AChE by organophosporus compounds. Reactivation is possible only if the bond between inhibitor and AChE is not established (Kassa, 2). Reactivators have relative high affinity to active site of AChE. The value of affinity can be expressed by their values of inhibition potential. The aim of this study was observed influence of structural changes in oximes to AChE inhibition ability. This knowledge can be used in further designing new structures with peripheral and reversible activity against to AChE. The mechanism of peripheral inhibition against to AChE is already used in prophylaxis of nerve agent poisoning. The reversible inhibitor binds into AChE active site and thus, prevents subsequent binding of nerve agent. Reversible AChE inhibitors with peripheral effect are also used in Myasthenia gravis treatment. The reactivator inhibition potency against to AChE was determined by using modified method according by Ellman et al. (1961). It was in vitro testing, the pure recombinant human AChE (rhache) was used. The absorbance was 412 nm. The measurement was started in cuvette by addition reactivator (every point in the concentration range from 1-1 to 1-8 mmol / l) to rhache. The inhibition time period was 1 min, after this time interval phosphate buffer (.1 M, ph 7.4) with DTNB and solution with acetylthiocholine was added. This measuring of each concentration points were triplicate. The blind sample was also tested for each concentration range; it shows activity of enzyme without influence of reactivator. Then was measured oximolysis to 6

avoid reading false-positive results, because reactivators in higher concentrations are able to split DTNB. Structural influence on inhibition potency was studied on tested reactivators with different constitutions. It was determined that longer connecting chain in bisquaternary oxime was able to increased inhibition potency against AChE. Meta position in monoquaternary and ortho position in bisquaternary oximes also increase inhibition potential. Next structural sign that increase inhibition potency was substitution in connecting chain. However, double bond in linker decreased inhibition effect. 7

1. OBSAH 1. OBSAH...8 2. ÚVOD..9 3. CÍL.11 4. MYASTENIA GRAVIS...12 4.1. Úvod...12 4.2. Historie 12 4.3. Epidemiologie.12 4.4. Klasifikace..13 4.5. Anatomie neuromuskulárního spojení a fyziologie svalové kontrakce..15 4.6. Klinické příznaky 17 4.7. Léĉba...17 4.8. Myastenická krize...19 4.9. Souĉasné pokroky.. 19 5. REAKTIVÁTORY... 5.1. Úvod... 5.2. Chemická struktura.21 5.3. Mechanismus úĉinku...22 5.4. Farmakokinetika..23 6. METODIKA..25 6.1. Princip metody 25 6.2. Příprava základních roztoků 27 6.3. Postup měření inhibiĉního potenciálu reaktivátorů 27 6.4. Zpracování výsledků...28 7. VÝSLEDKY 29 8. DISKUSE..43 9. ZÁVĚR.48 1. PŘEHLED ZKRATEK 49 11. PŘEHLED LITERATURY.5 8

2. ÚVOD Acetylcholin (ACh) působí na dvou typech receptorů, na muskarinových a nikotinových. Nikotinové receptory se objevují v autonomním systému a na neuromuskulární ploténce. Jsou řízeny iontovými kanály a zodpovídají za rychlou transmisi. Zatímco muskarinové receptory patří do rodiny G proteinových receptorů a objevují se v hladkém svalstvu, nervovém zakonĉení a na glandulárních buňkách (Soukup 1, Amici 1). Muskarinové receptory mohou být rozděleny do 5 podskupin M 1 -M 5. M 1 receptory se nacházejí ve slinných ţlázách a sympatických gangliích. M 3 jsou rozšířeny v hladkém svalstvu GIT, moĉovém systému, v oĉích a exokrinních ţlázách. M 5 byly identifikovány na povrchu krevních elementů. M 2 lze detekovat v hladkém svalstvu různých orgánů, v srdci a v mozku. Poslední skupina M 4 receptorů se nachází v plicích, mozku a malé mnoţství ve slinných ţlázách a ileu (Levey, 1993). Mezi agonisty patří např. ACh, arekolin, karbachol a zástupci antagonistů jsou pirenzepin, methokramin a atropin. Cholinesterasy patří do skupiny hydrolas, které katalyzují hydrolytické reakce, štěpí substráty za vstupu vody do reakce. Jejich substrátem je neurotransmiter acetylcholin (ACh), který je jimi rozloţen na zbytek kyseliny octové a cholin. Spoleĉně s ACh se vyskytují na neuromuskulárním spojení, na membránách erytrocytů, atd. Pokud acetylcholinesterasa (AChE) neplní v organismu svojí funkci, ACh není rozkládán a tudíţ se zvyšuje jeho nabídka v synapsích. Inhibitory esteras zabraňují jejich správné fyziologické funkci. Existuje několik moţných dělení inhibitorů AChE. Nejjednodušší rozdělení je na inhibitory irreverzibilní váţící se na enzym kovalentní vazbou, mezi které řadíme organofosfátové bojové chemické látky (sarin, soman, VX) a inhibitory reverzibilní, ty tvoří nekovalentní vazbu enzym-inhibitor a patří mezi ně hlavně léĉiva pouţívaná v terapii Alzheimerovy choroby ĉi Myastenie gravis (galanthamin, pyridostigmin, tacrin) nebo v terapii po intoxikaci organofosfáty - reaktivátory (HI-6, obidoxim). Inhibitory AChE se také pouţívají se v zemědělství jako pesticidy a herbicidy (paraoxon, parathion). K léĉbě po zasaţení OFI byly vyvinuty reaktivátory AChE (oximy). Jsou to mono nebo biskvarterní pyridinové slouĉeniny s jednou ĉi více oximovými skupinami. Pyridinová jádra u biskvarterních oximů bývají spojena řetězcem. Jejich funkcí je znovuobnovení aktivity inhibované AChE. Aby byly schopné vytěsnit OFI z vazby 9

na AChE, musí mít k danému enzymu alespoň nějakou afinitu. Míra afinity se dá vyjádřit inhibiĉním potenciálem těchto látek. Jelikoţ jejich molekula obsahuje kladně nabitý dusík, který způsobuje omezení v prostupu přes HEB, působí tedy převáţně na periferii. Tyto vlastnosti vytvářejí dobrý základ pro odvození nové potenciální skupiny léĉiv proti Myastenii gravis, kdy je potřeba úĉinně zvýšit mnoţství ACh na nervosvalové ploténce, tedy na periferii. Myastenii gravis není běţné autoimunitní onemocnění. Typickým příznakem je ochablost svalstva, především obliĉejového, šíjového a svalů konĉetin z důvodu zhoršeného neuromuskulárního přenosu. K léĉbě jsou kromě inhibitorů AChE pouţívána také parasympatomimetika, imunosupresiva a kortikosteroidy. Terapie tohoto onemocnění není ještě stále úspěšně vyřešena, je proto i nadále je potřeba hledat a vyvíjet nové léky s lepším léĉebným úĉinkem a menšími úĉinky neţádoucími. 1

3. CÍL Hlavním cílem této rigorózní práce bylo změřit hodnoty inhibiĉního potenciálu dvacetišesti reaktivátorů. Reaktivátory se uţívají jako antidota po zasaţení organofosfátovými inhibitory. Jejich mechanismus úĉinku spoĉívá ve štěpení kovalentní vazby mezi organofosfáty a enzymem AChE. K oximům mají organofosfáty vyšší afinitu neţ k AChE, coţ zaruĉuje vysoce nukleofilní oximová skupina reaktivátorů. K vyjádření afinity oximových reaktivátorů k AChE slouţí hodnoty inhibiĉního potenciálu. Byly vytvořeny logické řady reaktivátorů, které se strukturně lišily. Dřívějšími studiemi bylo prokázáno, ţe největší vliv na reaktivaĉní potenciál, co se týĉe struktury reaktivátoru, má poĉet a poloha oximových skupin, délka spojovacího řetězce mezi pyridinovými jádry a nebo substituce v tomto spojovacím řetězci. Inhibiĉní potenciál vybraných 26 reaktivátorů byl jiţ dříve změřen. Měření bylo prováděno na enzymu úhoří AChE. Nyní byl pouţit jiný enzym, lidská rekombinantní AChE. Mezi další cíle této práce patří i porovnání získaných výsledků. Získané znalosti o ovlivnění inhibiĉní potenciálu strukturou reaktivátoru by měli slouţit jako podklad pro syntézu nových inhibitorů AChE, které by méně prostupovaly přes HEB. Tyto inhibitory by mohly být vyuţity jako potencionální léĉiva při terapii autoimunitního onemocnění Myastenii gravis. 11

4. MYASTHENIA GRAVIS 4.1 ÚVOD Autoimunitní onemocnění Myastenia gravis (MG) je způsobeno poškozením synaptického přenosu na neuromuskulárním spojení. Charakteristickým znakem této choroby je zvětšující se ochablost svalů, z ĉehoţ vyplývá i název onemocnění. Řecké slovo myasthenia v překladu znamená chorobnou slabost svalů a latinský výraz gravis překládáme jako váţný nebo těţký. 4.2 HISTORIE První zmínky o MG jsou datovány roku 1672, kdy anglický lékař Thomas Willis, popsal ve své knize pacientku, které se s přibývajícím ĉasem zhoršovala pohyblivost jazyka. Dalším významným mezníkem byl rok 1895, kdy bylo toto onemocnění pojmenováno německým neurologem F. Jollym jako myasthenia gravis pseudoparalytic. Následovala léta objevování moţností léĉby tohoto onemocnění - 1935 první orální podání inhibitorů AChE, 1911 provedení thymektomie Sauerbruchem, 19 vyslovení hypotézy Simpsonem, ţe se jedná o autoimunitní onemocnění, 1978 Lindtröm popsal protilátky proti acetylcholinovým receptorům (AChR) (Pourmand, 1997). 4.3 EPIDEMIOLOGIE MG je jedna z nejběţněji se vyskytujících poruch neuromuskulárního spojení. Incidence stále stoupá. Nyní ji nejpřesněji vyjadřuje hodnota 4,6/ 1. Prevalence je kolem 61 případů na 1 milion. Souĉastná léĉba je vysoce úĉinná, hodnota mortalita je velice nízká 1/1 (Philllips 2nd LH, 1996). Je zajímavé, ţe u ţen se vrchol výskytu onemocnění objevuje mezi -24 rokem. U muţů převaţuje spíše období mezi 3-34. V tomto mladém období je poměr výskytu 7:3 (ţeny:muţi). Druhý vrchol objevení se tohoto onemocnění je u obou pohlaví mezi 7-74. rokem a u obou pohlaví se vyskytuje stejně ĉasto (Somnier FE, 1991). 12

Graf ĉ. 1: Průběh mortality a prevalence během. století 4.4 KLASIFIKACE MG můţeme rozdělit podle několika hledisek. 1. Podle přítomnosti nebo nepřítomnosti protilátek proti AChR Seropozitivní Je nejběţnějším typem. Tato forma se vyskytuje u -85 % pacientů s celkovou MG a u 5 % pacientů s takzvanou izolovanou okulární MG (Turner, 7). Autoprotilátky IgG, které jsou přítomny u % poĉtu nemocných, způsobují významnou redukci funkĉních AChR. Protilátka se naváţe na dva sousední AChR a aktivuje komplement. Dochází tak k postupnému zániku receptorů (Špalek, 7). Seronegativní Mezi 1- % pacientů se získanou MG nemá protilátky proti AChR. U některých těchto pacientů byly zaznamenány protilátky proti svalové tyrozin kináze (MuSK, muscle specific kinase). MuSK je protein v postsynaptické membráně spojený s AChR (Turner, 7). Jakým mechanismem působí autoprotilátky proti MuSK postsynaptickou poruchu nervosvalové transmise je v souĉasnosti stále nejasné (Špalek, 7). Seronegativní s negativními protilátkami proti MuSK Jde o pacienty s okulární nebo generalizovanou MG, kteří nemají autoprotilátky ani proti AChR ani proti MuSK. Brzlík (thymus) bývá u této formy hypeplazický 13

s germinativními centry. Tento nález spolu s efektivní thymektomií svědĉí o úĉasti thymu v patogenezi onemocnění (Špalek, 8). 2. Podle stupně, úrovně poškození Osserman (1958) rozdělil MG na ĉtyři základní skupiny, které bývají dále podrobněji rozděleny dle potřeb. Okulární MG Úplná MG mírné tuhosti Váţná MG Myasthenická krize s dýchací nedostateĉností 3. Podle etiologie Získaná MG, která je nejĉastější formou v dospělosti. Přechodná neonatální MG, jeţ je způsobena pasivní transportem matĉiných protilátek proti AChR. Lékově podmíněná MG. Mezi léĉiva navozující MG patří antibiotika (hlavně penicilíny, aminoglykosidy), léky na kardiovaskulární systém (zejména beta blokátory), antikonvulziva, anestetika, hormony, Vrozený myastenický syndrom, způsobený mutací proteinů zapojených do postsynaptického přenosu (Turner, 7). 14

4.5 ANATOMIE NEUROMUSKULÁRNÍHO SPOJENÍ A FYZIOLOGIE SVALOVÉ KONTRAKCE Neuromuskulární spojení se skládá z presynaptické ĉásti (nervové zakonĉení), postsynaptické ĉásti (svalová membrána) a prostorem mezi nimi nazývaným synaptická štěrbina. Obr.ĉ.1: Anatomie neuromuskulárního spojení V terminálním axonu se nachází několik tisíců molekul acetylcholinu (Ach). Neurotransmiter ACh je syntetizován v cytoplazmě nervového zakonĉení z cholinu (přijímán ze synaptické štěrbiny) a acetyl-co-a (syntetizován v mitochondriích z prekurzorů) enzymem acetylcholintransferasou. ACh je transportován prostřednictvím specifických proteinů do vezikul, kde je skladován. Akĉní potenciál (AP), který dosáhne nervového zakonĉení, iniciuje vstup iontů Ca 2+ do nervového zakonĉení napěťově řízenými kanály a umoţní splynutí membrány vezikul (v poĉtu 15-) s plazmatickou membránou nervového zakonĉení. Následuje vylití obsahu vezikul exocytózou do synaptické štěrbiny. Uvolněný ACh pak působí na postsynaptické receptory a vyvolává parasympatomimetické úĉinky, nebo na presynaptické autoreceptory, kdy reguluje výdej ACh. Molekula ACh je velmi krátce (asi 2ms) navázána na receptor a po uvolnění je okamţitě hydrolyzována AChE na cholin a acetát (Lincová, 2). Obsazení ACh receptorů aktivuje Na + /K + pumpu, sarkolema se stává více pozitivní a přenáší se potenciál (vzruch). Díky T- tubulům se akĉní potenciál šíří dále svalem. Po depolarizaci nastává vyplavení Ca 2+ ze sarkoplazmatického retikula. Tropomyozin 15

stericky brání navázání myozinu na aktinové vlákno. Po navázání Ca 2+ na troponin C, který je přítomný na aktinovém vlákně, dochází k modulaci a pohybu tropomyozinu a tudíţ k uvolnění místa pro navázání myozinu na aktin. Nastává kontrakce příĉně pruhovaného svalstva. Obr.ĉ. 2: Průběh svalové kontrakce Při MG dochází ke zhoršenému neuromuskulárnímu přenosu. Způsobují ho hlavně protilátky proti AChR. Ty mají na svědomí blokování AChR, degradaci receptorů a zmenšení jejich syntézy. Tyto protilátky mohou být téţ zodpovědné za zahájení rozpadu postsynaptické membrány (Thomann, 1995). Ĉást seronegativních pacientů nemá protilátky proti AChR, ale proti MuSK, tento protein umoţňuje inkorporaci AChR do postsynaptické membrány. V patogenezi nemoci hrají svoji roli i T-buňky, které aktivují AChR specifické B lymfocyty. Přesný mechanismus je nejasný, ale je zřejmé, ţe velkou roli hraje thymus. 75 % pacientů s MG vykazuje abnormality brzlíku, u 15 % je prokázán jeho nádor (Jaretzki, 4). 16

4.6 KLINICKÉ PŘÍZNAKY MG je charakterizována slabostí a únavou skeletálního svalstva, které se zhoršují jakoukoliv aktivitou a opakovaným cviĉením a naopak zlepšují po odpoĉinku. Mezi faktory zhoršující slabost patří cviĉení, stres, vysoká teplota, léky (aminoglykosidy, anestetika), chirurgické zákroky, menstruace a těhotenství (Turner, 7). Nejĉastěji bývají postiţeny svaly oĉí (levator palpebrae superiosis, extraokulární svaly), svaly obliĉeje a krku a také svaly konĉetin. Aţ 9 % pacientů je postiţeno padáním víĉka (ptosis). Zlepšení přichází po spánku nebo po aplikaci ledu na oĉní víĉko. Dalším velmi ĉastým příznakem je dvojité vidění (doplopia), jeţ je způsobeno únavou extraokulárního svalstva (Thomann, 1995). Ţivot ohroţující je postiţení dýchacích svalů. Při slabosti bránice a interkostálních svalů má dechová nedostateĉnost (dispnoe) inspiraĉní charakter. Pokud jsou výraznější expiraĉní potíţe je více postiţeno svalstvo abdominální (Špalek, 8). Obr. ĉ. 3: Klasické znaky MG při postiţení obliĉejových a oĉních svalů 4.7 LÉĈBA Aĉkoliv je léĉba MG velmi úspěšná, stále se hledá nejvhodnější individuální farmakologická léĉba pro kaţdého pacienta. Inhibitory acetylcholinesterasy (IAChE) IAChE bývají léky první volby, hlavně v poĉátcích onemocnění a u mírně probíhajících MG, protoţe je zde stále moţnost výskytu alespoň malého mnoţství AChR (Richman, 3). Mechanismus úĉinku IAChE, je zvyšování mnoţství ACh na nervosvalovém spojení. Po navázání inhibitoru na AChE nedochází k rozkladu 17

ACh. ACh se hromadí a zvyšuje se tak poĉet moţných interakcí mezi ACh a jeho receptorem. Tím se zlepšuje neuromuskulární přenos. Nejĉastěji bývá podáván pyridostigmin bromid (Mestinon ), méně ĉasto neostigmin bromid, pro jeho neţádoucí úĉinky, zejména gastrointestinální potíţe (Juel, 5). Podává se orálně v dávkách 15- mg po 3-6 hod (Drachman, 1994). Po uţití vyšších dávek se můţe vyskytnout cholinergní krize, ktrerá je těţko rozeznatelná od krize myastenické.. Další méně pouţívaným léĉivem je krátce působící edrofonium. Jako jediný se váţe pouze na aniontové místo enzymu, váţe se kladně nabitou ĉástí molekuly inhibitoru. Takto vzniklá vazba má charakter vazby iontové a tak inhibiĉní úĉinek trvá pouze několik minut. Slouţí hlavně k diagnostice onemocnění (Lincová, 2). Kortikosteroidy Patří mezi léĉiva indikována u mírné formy MG. Obvykle jsou uţívány dlouhodobě. Zaĉíná se s niţšími dávkami kolem 1 mg/den a pomalu se zvyšuje aţ na mg/den. Následuje pomalé vysazování (Turner, 7). Vedlejší úĉinky Prednisonu, jako hlavního zástupce kortikosteroidů, jsou osteoporóza, hyperglykemie, zvýšení krevního tlaku a příznaky Cushingova syndromu. Další imunosupresiva Kvůli mnohým neţádoucím úĉinkům kortikosteroidů bylo zapotřebí doplnit spektrum léĉby o další nesteroidní látky potlaĉující imunitní systém. Azatioprin má výhodu menších neţádoucích úĉinků, kdyţ je pouţívám po delší dobu. U 1 % pacientů se vyskytly neţádoucí úĉinky typu hepatotoxicity, potlaĉení kostní dřeně. Zahajovací dávka je 2-3 mg/kg (Saperstein, 4). Cyklosporin je také uţíván, přestoţe zde existuje riziko zvýšené nefrotoxicity a hypertenze. Standardní dávka je 5 mg/den ve dvou denních dávkách (Juel, 5). Cyklofosfamid je alkylaĉní agens, které zabraňuje buněĉné proliferaci a je indikován u forem těţké MG při intoleranci steroidů. Vedlejší úĉinky zahrnují váţné potlaĉení kostní dřeně s následným výskytem infekcí a ţaludeĉní toxicitu (Richman, 3). Ve velmi váţných případech mohou být předepsány i nízké dávky takrolimu, makrolidu potlaĉujícímu produkci různých cytokinů (Schreiber, 1992) 18

Plazmaferéza Tato metoda je pouţívána přes 3 let. Bývá vyuţívána při myastenické krizi a těţké MG. Zlepšení je rychlé, ale bohuţel pouze doĉasné. Během výkonu se redukuje mnoţství protilátek proti AChR v krvi. Plazmaferéza se pouţívá méně kvůli nároĉnosti na vybavení, personálu a moţnosti vzniku komplikací, mezi které patří hypotenze a vznik sraţenin (Chiu, ). Intravenózní imunoglobulin (IVIg) IVIg má stejné indikace jako plazmaferéza, jeho nástup je pomalejší, ale déle trvající. Mechanismus úĉinku není znám (Gajdos, 1997). Thymektomie Existují dvě indikace pro provedení thymektomie. První je thymom a za druhé se provádí u mladých pacientů s celkovou MG. Thymektomie je povaţována za relativně bezpeĉnou proceduru a její benefit trvá měsíce aţ roky (Richman, 3). 4.8 MYSTHENICKÁ KRIZE Krize se můţe objevit při špatné léĉbě MG, např. při podávání vyššího mnoţství steroidů, nebo jako následek infekce po uţívání kortikosteroidů. Krize se projevuje oslabením respiraĉních svalů. Pro zvládnutí krize se provádí plazmaferéza a IVIg. 4.9 SOUĈASNÉ POKROKY Většina pacientů ţije díky lékům normální ţivot. Prognóza je horší u starších pacientů s thymomem. Nadále je ale potřeba vyvíjet nové léky s menšími neţádoucími úĉinky. Mezi novější slouĉeniny patří mykofenolát mofetil, rituximab (lidská/myší monoklonální protilátka), etanercept (rekombinantní lidský TNF α). Tyto látky jsou především vyuţívány u MG, kde uţ vznikla resistence na běţně pouţívaná léĉiva (Turner, 7). 19

5. REAKTIVÁTORY 5.1 ÚVOD Reaktivátory se téţ nazývají téţ kauzální antidota, jelikoţ to jsou látky uţívané v terapii otrav OFI. Dále je lze pojmenovat jako oximy a to díky jejich funkĉní oximové skupině. Mechanismus úĉinku těchto slouĉenin je reaktivovat inhibovanou AChE. Ale stále ještě nebylo vyvinuto univerzální antidotum, schopné obnovit funkci inhibované AChE různými typy OFI (Musílek, 5). Přehled nejúĉinnějších a v praxi vyuţívaných reaktivátorů je zpracován v tabulce ĉ. 1. Název reaktivátoru Chemický název Další používaný název pralidoxim 2-hydroxyiminomethyl-1-methylpyridinium chlorid 2-PAM 1,3-bis-(4-hydroxyiminomethylpyridinium)-2-oxa-propan obidoxim dichlorid Toxogonin trimedoxim HI-6 methoxim 1,3-bis(4-hydroxyimonomethylpyridinium)propan dobromid) 1-(2-hydroxyiminomethylpyridinium)-3-(4- karbamoylpyridinium)-2--oxapropan dichlorid 1,1-bis(4-hydroxyiminomethylpyridinium)-methan dibromid TMB4 MMB4 Tab.ĉ.1: Přehled pouţívaných reaktivátorů (Kassa, 2).

5.2 CHEMICKÁ STRUKTURA Reaktivátory AChE jsou oznaĉovány také jako oximy, protoţe obsahují v molekule funkĉní oximovou skupinu (R-CH=NOH), která je při fyziologickém ph lidského těla ĉásteĉně disociována na nukleofilní oximátový anion (Kuĉa, 3). Chemická struktura reaktivátorů AChE zásadně ovlivňuje proces reaktivace AChE inhibované jak NPL, tak organofosforovými pesticidy (Kuĉa, 6). Jedním ze základních strukturních poţadavků při syntéze úĉinného reaktivátoru AChE je zavedení kladného náboje do jeho struktury. Tento kladný náboj má vliv na afinitu reaktivátorů k aktivnímu místu AChE. Ĉím větší je afinita těchto látek k AChE, tím větší je pravděpodobnost, ţe nový reaktivátor AChE bude reaktivovat organofosfáty inhibovanou AChE (Cabal, 3). Přítomnost kladného náboje ale znesnadňuje prostup těchto látek přes HEB. Ĉím více kladných nábojů molekula reaktivátoru obsahuje, tím větší je její afinita k aktivnímu místu AChE a zároveň, tím méně látka prostupuje přes HEB a tedy působí převáţně jen na periferii. Podle poĉtu kladně nabitých dusíků, které zajišťují afinitu k enzymu, rozdělujme oximy na monokvarterní (monopyridinové), jejichţ zástupcem je například pralidoxim a biskvarterní (bispyridinové), coţ je třeba obidoxim. Další vliv na úĉinnost a rychlost reaktivace má poĉet a poloha oximových skupin navázaných na jednom ĉi dvou pyridinových jádrech. Tato nukleofilní skupina je schopna zvrátit vznik kovalentní vazby mezi inhibitorem a AChE. Jiţ dříve se zkoušely nukleofilní látky typu hydroxylaminů, hydroxámových kyselin, ketoximů, ale jako nejvhodnější se ukázala aldoximová skupina (-CH=NOH). Reaktivátor můţe obsahovat jednu aţ ĉtyři oximové skupiny. Zvyšující se poĉet, ale nezvyšuje efektivitu reaktivace (Kuĉa, 7). Univerzální poloha oximových skupin neexistuje. Úĉinnost reaktivace závisí hlavně na typu inhibitoru. Např. cyklosarinem inhibovanou AChE nejlépe reaktivují reaktivátory s oximovou skupinou v poloze 2, ale pro AChE inhibovanou tabunem jsou vhodnější reaktivátory s oximovou skupinou v poloze 4 (Kuĉa, 7). Struktura biskvarterních reaktivátorů se ještě můţe lišit tvarem ĉi délkou spojovacího řetězce. V posledních letech byly vyuţity jiţ známé vědomosti o vlivu struktury oximu na reaktivaĉní proces a byla na katedře toxikologie FVZ a spolupracujících pracovištích (Korea, Austrálie, Turecko, Brazílie, ) syntetizována široká škála struktur nových reaktivátorů. Oznaĉují se jako K-substance. V souĉasnosti u nich probíhá in vitro a in 21

vivo testování. Z těchto nově syntetizovaných reaktivátorů pak zejména oximy K27 a K48 vykazují nízkou toxicitu a lepší úĉinnost v reaktivaci AChE in vitro inhibovanou různými organofosfáty zahrnující jak NPL tabun a VX, tak i pesticidy (Kassa, 6). Oxim K27 vykazuje dobré výsledky při reaktivaci AChE inhibované NPL (kromě cyklosarinu a somanu) a také je schopen velmi dobré reaktivace AChE při otravách způsobených širokou škálou pesticidů (Kuĉa, 1). Nově připravený reaktivátor s oznaĉením K3 by mohl v budoucnu nahradit obidoxim, jelikoţ K3 má vyšší reaktivaĉní úĉinnost vůĉi AChE inhibované tabunem. Jeho efektivita je dokonce vyšší i při niţších koncentracích, tedy těch, kterých je po podání terapeutických dávek reálně dosaţeno v organismu (Kovarik, 9). 5.3 MECHANISMUS ÚĈINKU Antidotní úĉinek oximů spoĉívá v jejich schopnosti reaktivovat fosforylovanou ĉi fosfonylovanou AChE. Podstatou reaktivace je vytvoření komplexu fosforylovaná (fosfonylovaná) AChE-oxim a poté přenesení fosforylové ĉi fosfonylové skupiny z enzymu na oxim. K oximům mají organofosfáty vyšší afinitu neţ k AChE, coţ zaruĉuje vysoce nukleofilní oximová skupina. Komplex fosforylovaného oximu (Poxim) můţe být také povaţován za potencionální inhibitor AChE. Jakmile v těle nastanou nestabilní fyziologické podmínky, můţe docházet k hydrolýze tohoto komplexu hydrolázami (paraoxonasa) a tak nastat re-inhibice AChE (Jonaković, 6). Reaktivace je moţná pouze do doby, neţ dojde k tzv. stárnutí komplexu, při kterém probíhá dealkylace a tyto vzniklé slouĉeniny jsou uţ nereaktivovatelné (obsahují ireverzibilní kovalentní vazbu). Rychlost stárnutí (aging) závisí jak na délce kontaktu AChE s inhibitorem tak i na chemické struktuře inhibitoru (Patoĉka, 4). Tento proces (aging) probíhá u různých NPL odlišnou rychlostí. Poloĉas dealkylace somanu je 5 min, sarinu 12 hod a u VX je tato rychlost zanedbatelná (Bajgar, 4). Při intoxikaci somanem probíhá dealkylace velmi rychle, proto je povaţována za nejhůře léĉitelnou otravu těmito typy inhibitoru. Nejvyšší rychlost reaktivace AChE inhibované somanem byla stanovena po podání oximu HI-6 (Cabal, 4). Tento reaktivátor má také nejširší spektrum úĉinku ze všech doposud syntetizovaných reaktivátorů. Oxim HI-6 byl zaveden do antidotní výbavy AĈR. Naopak otrava látkou VX, která vykazuje nejvyšší toxicitu vůĉi teplokrevným 22

organismům, je z hlediska terapie zvladatelná nejlépe (Prymula, 2). Toxicita látky VX je dána především její vysokou stálostí v prostředí, nízkou těkavostí, navíc je dobře rozpustná v tucích a organismy nemají vhodné detoxikaĉní enzymy pro její odbourání (Bajgar, 1991). Rychlost reaktivace je různá. Závisí na struktuře fosforylové (fosfonylové) skupiny, zdroji enzymu, struktuře a koncentraci oximu a na rychlosti stárnutí tohoto komplexu (Jonaković, 6). Obr.ĉ.4: Schéma inhibice a reaktivace AChE 5.5 FARMAKOKINETIKA Stejně jako u ostatních léků je u oximů jejich podání a dostupnost omezena jejich farmakokinetikou, stabilitou, úĉinností a toxicitou. Reaktivátory jsou podávány většinou ve formě solí (chloridy, bromidy, methylsulfáty apod.) Typická je intramuskulární aplikace. Terapeutická dávka je úĉinná, pokud je aplikovaná v mnoţství pohybující se v miligramech na kilogram zasaţeného jedince. Pralidoximu bývá podáváno 1 mg/kg, doba nástupu je 5-1 min a jeho úĉinek trvá 5-55 min (Sidell a Groff, 1971). U obidoximu se podává 5 mg/kg, nástup úĉinku je podobný, ale úĉinnost je delší 1-1 min (Sidell a Groff, 197). Kdybychom měli seřadit reaktivátory dle toxicity, tak nejméně toxickým se zdá být methoxim následovaný pralidoximem a HI-6. Nejvíce toxické antidotum je 23

obidoxim (Dawson, 1994). Výše letální dávky se liší podle různých organismů a podle způsobů podání. Jeden z hlavních důvodů, který můţe vést aţ k úmrtí je dechová paralýza (Kassa, 2). Další vedlejší úĉinky prokázané ve studiích na lidech byly např. závratě, nauzea, zvracení, dvojité vidění (Shrot, 9). Po podání oximu je sledováno několik farmakokinetických parametrů. Neĉastěji to bývá hodnota maximální koncentrace (c max ), které v krvi nebo mozku reaktivátor dosáhne. Dále se sleduje ĉas (t max ), kdy tato maximální koncentrace nastane. Thompsom et al. (1987) navrhl systém podání pralidoximu pouţívaného při otravách OFI. Nejdříve je vhodné podat bolus a poté se pokraĉuje v kontinuální infuzi, aby se dodrţovala hladinu pralidoximu v krvi větší 4 μg/ ml. Koncentrace odpovídající mnoţství 4 μg/ ml nebo vyšší je jiţ schopná prokazatelně reaktivovat AChE v organismu. Reaktivátory jsou látky nesoucí náboj, v jejich molekule je kvarterní dusík a po aplikaci dochází k vzniku oximátového anionu. Tato struktura zajišťuje úĉinnost oximu, ale zároveň zamezuje prostupu přes hematoencefalickou bariéru (HEB). Vyluĉování oximů probíhá z 99 % moĉí (Sidell a Groff, 1971). Rychlost eliminace se u jednotlivých reaktivátorů liší. Například trimedoxim se eliminuje dvakrát rychleji neţ obidoxim.(karasová JZ, 1). 24

6. METODIKA 6.1.PRINCIP METODY Ke stanovení inhibiĉního potenciálu jednotlivých reaktivátorů byla pouţita standardní Ellmanova metoda (Ellman, 1961) modifikovaná dle Bajgara (Bajgar, 1972). Měření byla prováděna na spektrofotometru Helios alpha (Electroncorporation, Velká Británie) při vlnové délce 412 nm. Při této vlnové délce lze nejlépe detekovat produkt reakce mezi 5,5 - dithiobis (2-nitrobenzoovou kyselinou) (DTNB) a acetylthiocholinem (ATCh) (Šinko, 7). Princip této reakce je následující. Substrát ATCh jodid je štěpen AChE na thiocholin a příslušnou kyselinu (kyselinu octovou). Thiocholin dále reaguje s DTNB, kde rozštěpí sulfidický můstek, sám se naváţe na jednu vzniklou SH- (triolovou) skupinu. U druhé poloviny molekuly DTNB kyseliny 5-merkapto-2- nitrobenzoové dochází ke konjugaci dvojných vazeb. Tento produkt reakce je fotometricky stanovován. 1. Rozštěpení ATCh acetylcholinesterasou S N O acetylthiocholin acetylcholinesteráza O O kyselina octová N S thiocholin 25

2. Rozštěpení S-S můstku a vazba thiocholinu na DTNB O 2 N NO 2 N thiocholin S HO O S S DTNB O OH O 2 N NO 2 HO O S S N S O OH 3. Konjugace dvojných vazeb kyseliny 5-merkapto-2-nitrobenzoové NO 2 NO 2 S O OH S O OH Obr. č. 5: Princip Ellmanovy metody 26

6.2. PŘÍPRAVA ZÁKLADNÍCH ROZTOKŮ 1. Fosfátový pufr (,1 M, ph 7,6): Upravena směs připravená firmou Sigma Aldrich dle doporuĉného postupu výrobce. 2. ATChJ:,29 g bylo rozpuštěno v destilované vodě na objem 1ml. 3. DTNB:,5 g bylo rozpuštěno v 5 ml fosfátového pufru (,1M ph 7,6). 4. Reaktivátory: Připravena koncentraĉní řada od 1-1 do 1-8. Př. HI-6 :,377g rozpuštěno v 1 ml fosfátového pufru (koncentrace 1-1 ). Z tohoto roztoku odpipetováno,1 ml a přidáno,9 ml pufru, tím byla získána koncentrace 1-2. Stejně se postupovalo aţ do koncentrace 1-8. 5. AChE: Do fosfátového pufru se přidávala lidská rekombinantní AChE. Měřila se aktivita roztoku AChE. Základní aktivita AChE byla upravena tak, aby objem uţitý v měření inhibiĉního potenciálu reaktivátorů (9 μl) odpovídal potřebám měření. 6.3. POSTUP MĚŘENÍ INHIBIĈNÍHO POTENCIÁLU REAKTIVÁTORŮ Do jednorázové plastové kyvety o objemu 1ml bylo napipetováno 9 μl úhoří AChE. Po minutě bylo přidáno 1 μl reaktivátoru o zvolené koncentraci (od 1-1 do 1-8 ). Tato směs byla 1 minut inkubována při laboratorní teplotě (22 ± 2 C). Poté bylo přidáno μl DTNB, μl,1m fosfátového pufru o ph 7,6 a reakce byla odstartována přidáním μl ATCh jako substrátu reakce. Celý obsah kyvety byl promíchán a kyveta byla ihned vloţena do spektrofotometru, kde byla změřena hodnota absorbance při standartní vlnové délce 412 nm. Oximy ve vyšších koncentracích jsou schopny štěpit vazby v DTNB a tudíţ můţe docházet k odeĉtu falešně pozitivních výsledků. Tento jev byl eliminován 27

změřením tzv. oximolýzy (Jun, 8; Sakurada, 7). Kdy byla do kyvety místo lidské AChE přidána destilovaná voda. Aktivita enzymu byla měřena a hodnota oximolýzy byla odeĉtena od hodnoty dříve naměřené aktivity enzymu po přidání příslušné koncentrace oximu (Šinko, 6). Ke kaţdé koncentraĉní řadě reaktivátoru byl také připraven slepý vzorek, kde byl oxim nahrazen stejným objemem (1 μl) destilované vody, tak byla změřena aktuální aktivita enzymu neovlivněného oximem. Takto získaná hodnota pak odpovídala % aktivity enzymu. 6.4. ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ Do poĉítaĉového programu Prisma 4. byly zadány procentuální hodnoty odpovídající aktivitě enzymu po přidání jednotlivých koncentrací reaktivátorů AChE. Z těchto údajů byla vypoĉítána hodnota IC 5 v odpovídajícím ĉasovém intervalu (1 min), coţ je koncentrace reaktivátoru, při které klesne aktivita enzymu na 5 % aktivity původní. Takto byla urĉena IC 5 u dvacetišesti strukturně rozdílných oximů. 28

7. VÝSLEDKY V této práci bylo hodnoceno 26 oximových reaktivátorů. Byly rozděleny do pěti skupin. První skupinu tvoří dvanáct biskvarterních reaktivátorů s oximovými skupinami v poloze para (Tab.ĉ.2). Liší se tedy pouze délkou spojovacího řetězce. Druhou skupinu tvoří pouze monokvarterní reaktivátory lišící se polohou oximové skupiny na pyridinovém jádře (Tab. ĉ.3). Následují dvě skupiny jsou opět biskvarterní reaktivátory se spojovacím řetězcem o třech (Tab ĉ.4) nebo ĉtyřech (Tab. ĉ.5) uhlících, u kterých se opět měnila poloha oximové skupiny. V poslední skupina (Tab. ĉ.6) lze porovnat oximy se substituovaným řetězcem nebo dvojnou vazbou ve spojovacím řetězci. Všechny tyto strukturní závislosti (délka spojovacího řetězce, poĉet a poloha oximových skupin, poĉet pyridinových jader) mají vliv na reaktivaĉní úĉinnost. V průběhu testování bylo sledováno, jak tyto strukturní obměny ovlivňují schopnost inhibovat AChE. U kaţdého reaktivátoru byly připraveny koncentraĉní řady od 1-1 po 1-8 mmol/l. Měření kaţdého koncentraĉního bodu jednotlivých reaktivátorů se vţdy opakovalo třikrát. Naměřené hodnoty absorbance byly přepoĉítány na procenta aktivity AChE. V poĉítaĉovém programu Prisma 4. byly vytvořeny grafy závislosti zmíněné aktivity AChE na koncentraci daného reaktivátoru. V grafech lze vidět i směrodatné odchylky a vypoĉtené hodnoty IC 5 měřeného reaktivátoru. IC 5 byly taktéž určeny pomocí statistického programu Prisma 4.. Ĉím je hodnota IC 5 menší, tím větší má reaktivátor schopnost AChE inhibovat. 29

Tab. č. 2: Přehled vzorců bispyridinových reaktivátorů s uhlíkatým spojovacím řetězcem 1C- 12C a hodnoty jejich IC 5. K154 (1C) IC5 =,2138-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 K 191 (2C) IC5 =,3689-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 K 18 (3C) IC5 =,2437-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 3

K 74 (4C) IC5 =,3436-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 K 35 (5C) IC5 =,1342-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 K 194 (6C) IC5 =,6471-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 31

K 39 (7C) IC5 =,3338-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 K 197 (8C) IC5 =,1361-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 K 31 (9C) IC5 =,85-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 32

K 338 (1C) IC5 =,55-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 K 339 (11C) IC5 =,6-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 K 3 (12C) IC5 =,775-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 33

Z naměřených hodnot IC 5 a z následujícího grafu (Graf ĉ.1) je zřejmý postupný nárůst schopnosti inhibovat od bispiridinových reaktivárů se spojovacím řetězcem 1C po 1C. U následující reaktivátorů (11C a 12C) se schopnost inhibovat AChE mírně sniţuje. Graf č. 1: Srovnání trendů v hodnotách IC 5 u bispyridinových reaktivátorů se spojovacím řetězcem 1C-12C. 34

U monopyridinových reaktivátorů byl změřen nejvyšší inhibiĉní potenciál u reaktivátoru 3 PAM, který má oximovou skupinu v poloze meta. U reaktivátoru 4 PAM nedochází za daných koncentrací ani k 5% inhibici enzymu, nelze tedy stanovit hodnotu IC 5. Tab. č. 3: Přehled vzorců monopyridinových reaktivátorů s rozdílným umístěním oximové skupiny a hodnoty jejich IC 5. 2 PAM IC5 =,458-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 3 PAM IC5 =,4157-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 35

4 PAM -9-8 -7-6 -5-4 -3-2 -1 Třetí skupina je tvořena opět reaktivátory s dvěma pyridinovými jádry, které jsou spojeny tří uhlíkatým řetězcem. Byla zde sledována změna polohy oximových skupin. Nejvyšší inhibice byla zaznamenána u K5 s oximovými skupinami v polohách 2,2. Tab. č. 4: Přehled vzorců bispyridinových reaktivátorů s 3C spojovacím řetězcem, které mají rozdílné umístění oximových skupin a hodnoty jejich IC 5. K5 (2,2) N 2 Br N CH=NOH CH=NOH IC5 =,223-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 36

K99 (3,3) 2 Br HON=HC N N CH=NOH IC5 =,76-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 K18 (4,4) IC5 =,23-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 K7 (2,3) CH=NOH CH=NOH N (CH 2 ) 3 N 2 Br IC5 =,796-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 37

K 8 (2,4) CH=NOH 2 Br N (CH 2 ) 3 N CH=NOH IC5 =,4264-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 K 9 (3,4) CH=NOH 2 Br N (CH 2 ) 3 N CH=NOH IC5 =, -9-8 -7-6 -5-4 -3-2 -1 38

Předposlední skupina zahrnuje reaktivátory AChE se dvěma pyridinovými jádry spojené ĉtyř uhlíkatým řetězcem, sledována byla obměna poloh oximových skupin. U reaktivátoru K 33 byla schopnost inhibovat AChE nejvyšší. Oxim K 33 má obě oximové skupiny v polohách ortho na pyridinových jádrech. Tab. č. 5: Přehled vzorců bispyridinových reaktivátorů s 4C spojovacím řetězcem, které mají rozdílné umístění oximových skupin a hodnoty jejich IC 5. K 33 (2,2) N 2 Br N CH=NOH CH=NOH IC5 =,1142-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 K 11 (3,3) HON=HC N 2 Br N CH=NOH IC5 =,129-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 39

K 74 (4,4) HON=HC N 2 Br N CH=NOH IC5 =,344-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 Tab. č. 6: Přehled vzorců trimedoximu, obidoximu, K74 a K75 a hodnoty jejich IC 5. V poslední, páté skupině lze vidět, ţe inhibiĉní schopnost byla zvýšena zavedením kyslíkového substituentu do spojovacího řetězce a naopak byl sníţen zavedením dvojné vazby do spojovacího řetězce. K 18 (3C) IC5 =,2437-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1

K318 HON=HC 2 Cl CH=NOH N O N IC5 =,1733-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 K 74 (4,4) HON=HC N 2 Br N CH=NOH IC5 =,344-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 K75 HON=HC N 2 Br N CH=NOH IC5 =,87-9 -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 41

Tab.ĉ.7: Souhrnný přehled IC 5 testovaných reaktivátorů Počet uhlíků ve spojovacím řetězci 1 2 3 4 5 6 IC 5,2138,3689,2437,3436,1342,6471 Počet uhlíků ve spojovacím řetězci 7 8 9 1 11 12 IC 5,3338,1361,85,55,6,775 Polohy oximové skupiny - spojovací 2-2 3-3 4-4 řetězec 4C IC 5,1142,129,344 Polohy oximové skupiny - spojovací 2-2 3-3 4-4 2-3 2-4 3-4 řetězec 3C IC 5,223,76,23,796,4264,6 Změna polohy oximové skupiny na 2 3 4 jádře IC 5,458,4157 Změny ve spojovacím řetězci c-c-c c-o-c c-c-c-c c-c=c-c IC 5,2437,1733,3436,87 42

8. DISKUZE Hlavním mechanismem úĉinku oximů je reaktivovat inhibovanou AChE (Wilson, 1992). AChE je enzym zajišťující rozklad neurotransmiteru ACh. Inhibice AChE vede ke kumulaci ACh na cholinergních synapsích a hyperstimulaci muskarinových a nikotinových receptorů. Následek silné stimulace cholinergních receptorů je popisován jako tzv. cholinergní syndrom. Mezi běţné příznaky patří např. slinění, pocení, zvýšená bronchiální sekrece, miosa, průjem, třes a další poruchy CNS (Suchopár, 9). V nejzazším případě můţe dojít k úmrtí intoxikovaného organismu, které je způsobeno především dechovou nedostateĉností díky útlumu dechových center v mozkovém kmeni (Lotti, 1). Oximy mají relativně vysokou afinitu k aktivnímu místu AChE. Vyjádření afinity oximových reaktivátorů k AChE můţe být uváděno jako schopnost inhibovat tento enzym a jsou pak ĉíselně vyjádřeny pomocí IC 5. Reaktivátory se vyznaĉují vysokou nukleofilitou (Calic, 6). Tyto vlastnosti umoţňují reaktivaci inhibované AChE. Odstoupením fosforylové ĉi fosfonylové skupiny z aktivního místa enzymu a souběţnou fosforylací ĉi fosfonylací oximu se znovu obnovuje fyziologická funkce AChE. Takto vzniklý komplex můţe být také potencionálním inhibitorem AChE (Harvey a kol., 1986). Nicméně, tento komplex můţe být nestabilní ve fyziologických podmínkách, můţe být hydrolyzován, běţně se v těle vyskytující paraoxonázou. Takto uvolněný inhibitor tak můţe způsobit re-inhibici jiţ reaktivovaného enzymu (Jonaković, 6). Proces reaktivace je moţný pouze, dokud esterový substituent organofosfátu není hydrolyzován, tedy neproběhne tzv.aging charakterizovaný vznikem kovalentní vazby mezi AChE a inhibitorem (Shrot, 9). Reaktivátory jsou díky jejich mechanismu úĉinku povaţovány za kauzální antidota v léĉbě otrav způsobených OFI. Dále se podávají funkĉní antidota, coţ jsou anticholinergika (benaktyzin, atropin), která předcházejí nadměrnému působení nahromaděného ACh na muskarinových receptorech (Bajgar, 1972).Proti moţným křeĉím, které vznikají v důsledku nahromadění ACh na nikotinových receptorech, působí antikonvulzivum Diazepam. Po otravě OFI mohou nastat ještě centrální (nespecifické) příznaky, mezi něţ patří bolesti hlavy, závratě, nauzea a zvracení, neklid, deprese a další, které jsou řešeny individuálně standardními léĉivy. Specifickou komplikací léĉby bývá remise otravy daná buď vyplavením NPL z depotních míst 43

(např. vyplavení somanu z tukových zásob intoxikovaného ĉlověka), nebo uvolněním NPL z vazeb na krevní bílkoviny (Patoĉka, 4). Místem navázání oximů na AChE můţe být aktivní místo enzymu nebo alosterické místo ĉi místa obě (Jonaković, 6). Takto navázaný oxim chrání AChE před fosforylací (fosfonylací). Tato vazba je reverzibilní a tudíţ je moţné vyuţít reaktivátory také jako reverzibilní inhibitory pro profylaxi před moţnou otravou OFI. Zavedeným profylaktickým a léĉebným transdermálním antidotem je TRANSANT obsahující reaktivátor HI-6 (Patoĉka, 4). V souĉasnosti se uvaţuje i o jiných moţných úĉincích reaktivátorů. Kromě reaktivace by oximy mohly mít také přímý farmakologický úĉinek (Jonaković, 6). V minulosti proběhly studie, kde antidotní úĉinek oximů nemohl být vysvětlen pouze jejich reaktivaĉní úĉinností. (Clement, 1981, Schoene 1976) Například Melchers a kol. (1994) navrhli hypotézu, ţe oxim HI-6 můţe mít efekt na GABA-ergní (γ- amino máselná kyselina) neurotransmisi v CNS. Dalším moţným vysvětlením působení oximů je jejich zapojení do různých stupňů cholinergního přenosu. Jak bylo potvrzeno, oximy jsou schopny ovlivnit nejen syntézu ACh (Clement, 1979), ale také uvolnění ACh do synaptické štěrbiny (van Helden a kol, 1998), dále byla prokázána jejich přímá interakce s pre- a post- synaptickými receptory (Aas,1996) a jak se zdá ovlivňují také zpětné vychytávání neurotransmiteru. Zdá se, ţe tyto doposud opomíjené vedlejší úĉinky oximů by v budoucnu mohly vést k novým léĉebným moţnostem. Mimo vedlejších farmakodynamických úĉinků oximů, je také v souĉasné době diskutována jejich farmakokinetika, zvláště pak jejich schopnost prostupovat přes HEB. Jejich struktura obsahuje nejen kvarterní dusík (kladný náboj), ale také při fyziologickém ph vznikající oximátový aniont, jeţ obecně znesnadňují prostup přes biologické bariéry. Byla diskutována moţnost zvýšení schopnosti penetrace oximů přes HEB, například po otravě OFI, díky lokálnímu zánětlivému procesu (Maxwell a kol., 1987). Jiţ dříve (Gray, 1984) bylo zjištěno, ţe reaktivátory mají kromě reaktivaĉního úĉinku i úĉinek inhibiĉní. Na oba tyto úĉinky má jednoznaĉný vliv struktura reaktivátoru. V diplomové práci (Šepsová, 1) jsme sledovali vliv strukturálních změn oximů na schopnost inhibovat úhoří AChE. Jelikoţ existuje šest hlavních forem AChE, je velmi pravděpodobné, ţe se organismy budou lišit v procentuálním zastoupení těchto forem. Tři jsou formy globulární oznaĉované jako G1, G2 a G4, podle poĉtu jednotek a tři formy jsou asymetrické oznaĉované A4, A8 a A12. V lidské AChE má 44

hlavní zastoupení forma G4 (-9 %), u hmyzu, obojţivelníků a ryb se A forma můţe vyskytovat více jak z 15 % (Kerkut, 1984). A forma se vyskytuje hlavně ve svalech ĉlověka, u úhoře lze nalézt tuto A formu i v jiných orgánech (Aldunate, 4). U různých druhů zvířat se liší kvarterní struktura AChE, ale primární strukturu AChE mají podobnou. Lidská AChE obsahuje tři moţná místa, kdy můţe být glykosilována. Právě glykosilace je zodpovědná za rozdíly ve struktuře AChE v různých tkáních lidského organismu (Soreq et al., 199). Za rozdíly v termostabilitě můţe přítomnost různého poĉtu S-S vazeb v různých formách AChE. Pro přesnější posouzení úĉinku reaktivátorů na lidský organismus byla v této rigorózní práci pouţita lidská rekombinantní AChE. Přestoţe byla u měření inhibiĉního potenciálu reaktivátorů pouţita lidská rekombinantní AChE, byly získány velmi podobné výsledky jak při pouţití enzymu úhoří AChE. V první skupině tvořené bispyridinovými reaktivátory s oximovými skupinami v poloze para na obou jádrech, u kterých byla měněna délka spojovacího řetězce od 1C po 12C, bylo dosaţeno největší schopnosti inhibovat u reaktivátoru K338 s 1C spojovacím řetězcem, coţ je stejný poĉet uhlíků, jako při testování reaktivátorů na úhoří AChE. Rozdíl byl v ale v řádu koncentrace odpovídající hodnotě IC 5, kdy oxim K338 byl schopen sníţit aktivitu úhoří AChE na 5% v koncentraci 4x1-4 mmol/l, ale u lidské rekombinantní AChE uţ v koncentraci o jeden řád niţší, tedy 5x1-5 mmol/l. Těchto koncentrací (1-4 ) jiţ můţe být reálně v organismu dosaţeno při podání terapeutických dávek oximů (Karasová JZ, 1). Tudíţ u podání reaktivátorů se spojovacím řetězcem do 5C (u úhoří AChE pouze do 4C), kteří dosahují hodnot IC 5 aţ v koncentracích 1-3 mmol/l, není třeba se obávat jejich inhibiĉního úĉinku. Proto jsou reaktivátory s 3C a 4C pouţívány jako antidota při terapii po zasaţení OFI. Další skupinu reaktivátorů tvořily oximy s jedním pyridinovým jádrem. Byla zde obměňována poloha oximové skupiny. Opět jako u testování úhoří AChE, byla potvrzena nejvyšší schopnost inhibovat u reaktivátoru 3PAM, s oximovou skupinou v poloze meta, i kdyţ hodnota IC 5 byla velmi podobná u 2PAM s oximovou skupinou v poloze 2. IC 5 byla naměřena u obou oximů řádově v koncentraci 4x1-2 mmol/l. U poslední reaktivátoru této skupiny, 4PAM, nebyla hodnota IC 5 stanovena, protoţe v dané koncentraĉní řadě nebylo dosaţeno sníţení aktivity AChE na 5%. Třetí skupina byla tvořena opět bispyridinovými reaktivátory, které měly jádra spojena 3C řetězcem a byla u nich měněna poloha oximových skupin. Nejvyšší inhibice dosáhl reaktivátor K5 s oximovými skupinami navázanými v poloze ortho. Hodnota IC 5 všech 3C reaktivátorů (kromě K18) byla řádově v koncentraci 1-3 mmol/l. Pouze 45

trimedoxim (K18) s oximovými skupinami v poloze para, který se v praxi pouţívá jako antidotum měl hodnotu IC 5,2437 mmol/l, coţ znamená, ţe musí dosáhnout větší koncentrace v těle, aby byl schopen sníţit aktivitu AChE na 5%. Po podání terapeutické dávky, jak bylo výše uvedeno, je nereálné této koncentrace (1-2 mmol/l) dosáhnout. Další skupina byla velmi podobná té předchozí, pouze místo 3C měla 4C ve spojovacím řetězci. Nejvyšší inhibiĉní potenciál měl opět reaktivátor s oximovými skupinami v poloze 2,2 tedy ortho, jehoţ IC 5 byla ve stejném řádu jako u předchozí skupiny, 1-3 mmol/l. Jeden reaktivátor, K 11 s oximovými skupinami v poloze meta, dosáhl IC 5 v koncentraci v řádu 1x1-2 mmol/l. Poslední skupinu tvořily reaktivátory s obměnou ve spojovacím řetězci. Zavedením dvojné vazby do spojovacího řetězce se IC 5 zvětšila z 3x1-3 mmol/l na 8x1-3 mmol/l. Tato změna ponechává řádově stejnou koncentraci, není tedy tak výrazná jako například prodlouţení spojovacího řetězce, ale jako jedna z mála sniţuje schopnost inhibovat AChE. Vysvětlení lze hledat v délce dvojné vazby - je kratší neţ vazba jednoduchá. Hodnota IC 5 odpovídá tedy hodnotě mezi 3C (IC 5 =,2437 mmol/l) a 4C (,3436 mmol/l). Navíc dvojná vazba neumoţňuje takovou rotaci zbytku molekuly, tudíţ komplikuje usazení reaktivátoru do kavity AChE (Kuĉa, 6). Další obměnou ve spojovacím řetězci byla náhrada uhlíkového atomu atomem kyslíku. Substituce inhibiĉní schopnost reaktivátoru nepatrně zvyšovala. IC 5 se z 2x1-2 mmol/l sníţila na 1x1-2 mmol/l. Řádově stejné koncentraĉní hodnoty byly naměřeny i u úhoří AChE. V porovnání se získanými výsledky IC 5 reaktivátorů testovaných na úhoří AChE (Šepsová, 1), byly u lidské rekombinantní AChE zjištěny následující rozdíly. V první skupině, u které se prodluţoval spojovací řetězec, jako první dosáhl koncentrace v řádu 1-4 mmol/l (koncentrace dosaţitelná v organismu po podání terapeutické dávky reaktivátoru) oxim s 5C (K35), kdeţto u úhoří AChE to byl oxim uţ se 4C (K74). U oximů s 9C a výše byla naměřena koncentrace 1-5 mmol/l, u úhoří AChE ţádný z reaktivátorů této koncentrace nedosáhl. Je tedy vidět, ţe na lidskou rekombinantní AChE mají reaktivátory nepatrně vyšší inhibiĉní úĉinek. Shodné bylo zjištění, ţe nejvyšší schopnost inhibovat měl oxim s 1C (K338). U druhé skupiny, kde byly reaktivátory pouze monopyridinové s různými polohami oximových skupin, byla nalezena shoda, jak v řádu koncentrace, tak i v typu reaktivátoru s nejvyšším inhibiĉním úĉinkem (3PAM, IC 5 =,4157 mmol/l). U třetí skupiny tvořené bispyridinovými 46