MBRO 208 4) Reprodukce rostlin Životní cyklus rostliny 2 a) Indukce b) Vývoj květu - stručná morfologie c) Genetická a molekulární analýza vývoje květu Martin Fellner Laboratoř růstových regulátorů PřF UP v Olomouci a ÚEB AVČR 4 a) Indukce Kvetení je indukováno fotoperiodou = poměrem mezi délkou dne a noci Indukce přeprogramování vegetativních meristémů: místo sekundárních výhonků se tvoří květní orgány Schopnost rostlin přepnout vývoj vegetativní na reprodukční ukazuje důležitý vývojový rozdíl mezi rostlinami a živočichy. Rostlina tímto přepnutím nastartuje svoje stárnutí a smrt Krátkodenní rostliny je indukováno krátkým dnem a dlouhou nocí (např. chryzantémy, odrůdy jahod, špenát) Přeprogramování musí být přesně načasováno Dlouhodenní rostliny je indukováno dlouhým dnem a krátkou nocí (např. pšenice, Arabidopsis) Neutrální rostliny není indukováno fotoperiodou (např. rajče) 5 6 List - vnímá fotoperiodický signál indukující přechod rostlin do fáze Fytochromy = fotosensitivní pigmenty v cytoplazmě absorbují červené světlo; jsou zapojeny v indukci, klíčení a ve vnímání fotoperiody. Fytochromy jsou kódovány pěti geny: PHYA, PHYB, PHYC, PHYD, PHYE PHYA a PHYB regulují čas Mutant phyb kvete brzy Mutant phya kvete pozdě Mutant phyaphyb kvete dříve než phyb Kvetení je složitý proces Kryptochromy vnímají modré světlo Fotosyntetické pigmenty
Světlo 7 Světlo (dlouhý den) AP, AP, etc. 8 Signál = florigen??? Hormony: gibereliny Sacharóza cytokininy etylén Polyamidy Místo indukce CO (CONSTANS) Světlo CO Huang T et al. (2005) CO protein Science 09: 6-772 (transkripční faktor) (FLOWERING LOCUS T) mrna Hypotéza multifaktoriálního spouštění: funkčnost jedné molekuly podmiňuje či ovlivňuje funkci jiné Pojem florigen Mikhail Chailakhyan, Rusko 96 (experimenty 92-94) Corbesier and Coupland (2005) hypotéza: Florigen je RNA či protein translokován z listů do meristému Indukce AP AP CAL Abe M et al. (2005) Science 09: 052-056 Wigge PA et al. (2005) Science 09: 056-059 (FLOWERING LOCUS D) Exprese mrna of Stonkový vrchol Jaeger KE, Wigge PA ( 2007) Cur Biol 7: -5 Mathieu J et al. ( 2007) Cur Biol 7: 055-060 Protein transportovaný z listů postačuje k indukci. protein = FLORIGEN 9 0 CONSTANS (CO) identifikován analýzou pozdě kvetoucího mutanta; Normální CO kóduje transkripční faktor a je up-regulován za dlouhého dne (LD = long day); CO aktivuje expresi květních genů Northern blot = množství RNA Konstrukt: silný promotor 5S gen CO LD SD Kvetení indukováno i za krátkého dne Indukce CO funguje jako transkripční faktor i jako co-aktivátor Krátký den (SD) CRY neaktivní=>akumulace COPv jádře =>ubiquitinuje CO => není exprimován => inhibice Dlouhý den (LD) CRY aktivní => translokace COP do cytoplazmy => akumulace CO v jádře => => je exprimován indukce 2 Geny určující identitu květních meristémů LEAFY () TERMINAL FLOWER (TFL) APETALA (AP) CAULIFLOWER (CAL) lfy TFL mutant tfl kvete brzy; vytváří primární květní stvol, netvoří boční stvoly = fenotyp opačný k lfy; TFL exprimován v apikálním meristému, místo v květních primordiích LEAFY () mutant lfy produkuje více květních stvolů než ; květy jsou zelené a mají pouze orgány podobné sepal a petals Ektopická (a konstitutivní) exprese => předčasné ; stonky se mění v květy 5S:: NEdeterminovaný růst tfl Normální funkce TFL: udržuje nedeterminovaný růst Normální funkce = přepíná nedeterminovaný růst na determinovaný Determinovaný růst TFL řach TFL a produkty působí proti sobě 2
Indukce 5 vývojových drah Dlouhý den BL 4. Fotoperiodická Fytochromy, kryptochromy, CO,, mrna, / protein, SOC) SOC = Suppressor Of Constans; transkripční faktor obsahující MADS box Indukce TFL AP AP CAL FKF a ZTL receptory interagují s proteinem GIGANTEA a komplex stabilizuje protein CONSTANS. Stabilizace je posilována modrým světlem. UPDATE 206 Zhu Y et al. (206) Nature Plants, May 26, art. no. 6075 CONSTANS aktivuje NaKR protein. NaKR reguluje pohyb na dlouhou vzdálenost až do stonkového vrcholu NaKR - SODIUM POTASSIUM ROOT DEFECTIVE NaKR protein obsahující heavy-metal-associated (HMA) doménu; typ proteinu s důležitou úlohou v transportu iontů kovů do specifických míst buňky FKF ZTL GI CO (CONSTANS) CO protein (transkripční faktor) (FLOWERING LOCUS T) Exprese mrna of AP Indukce AP AP CAL Stonkový vrchol 2. Autonomní a vernalizační Autonomní Interní signály = počet listů redukuje expresi FLOWERING LOCUS C (FLC) => stimulace SOC 5. Karbohydrátová Odráží metabolický stav rostliny = cukr stimuluje indukcí SOC => exprese 4. Giberelinová Vyžadována pro předčasné a pro za krátkého dne 6 Vernalizační: nízká teplota Redukce represoru FLC => stimulace SOC - GAs indukuji transkripční faktor typu GAMYB => stimulace => přepnutí do generativní fáze - GAs interagují přímo se SOC => aktivace - aktivním giberelinem je GA 4 UPDATE 206 Nízká teplota rovněž přímo indukuje expresi genů CONSTANS a. GAs ELA GA 4 SPL9 DELLA AP ELA = EUI-LIKE P450 A cytochrome P450, katabolizuje GA 4 5. Věková - odráží věk rostliny 7 b) Vývoj květu stručná morfologie 8 Mladá rostlina => vysoká hladina mir-56 Modelová rostlina Arabidopsis =>. přednáška MBR SPL9 Struktura květu Arabidopsis a jeho vývoj SOC Indukce Signál => indukce => apikální meristém produkuje květy Dráhy 5 se soustřeďují v SOC Indukce a AP Indukce květních homeotických genů (model ABC) Primární květenství Sekundární květenství Stonkový list Stamen UPDATE 205 Song YH et al. (205) Annu Rev Plant Biol 66: 44-464 Matsoukas IG (205) Essays Biochem 58: -49 Johansson M, Staiger D (205) J Exp Biol 66: 79-70
9 c) Genetická a molekulární analýza vývoje květu 20 Analýza genetických mutací, které mění specifikaci vývoje květu umožňuje definovat a odlišit základní procesy na molekulární úrovni Květy se tvoří ve spirále kolem centrálního meristému ABC model Díky mutacím (knihovna T-DNA mutantů), které vedou k redukci, změně či změně polohy květních orgánů, byly nalezeny 4 geny, které hrají klíčovou roli ve vývoji květních orgánů: AP2, AP, PI, AG. Anther (prašník) Izolace a charakterizace mutantů Klonování genů a návrh ABC modelu Bowman JL et al. (99) Development 2: -20 Gynoecium (carpels = pestíky) Prof. M. Koornneef (Wageningen, Holandsko) Prof. John Bowman Prof. Elliot Meyerowitz http://www.dbs.ucdavis.edu/ http://www.its.caltech.edu/~plantlab/ Geny hrající klíčovou roli ve vývoji květních orgánů (květní homeotické geny, flower homeotic genes): 2 22 ABC model vývoje květních orgánů Květní primordium jsou koncentrické a překrývající se pole genové aktivity: A, B, C Květní fenotypy mutantů B Mutant ap2 : sepals carpels petals petals sepals Mutant ap : Mutant pi : Mutant ag : petals carpels A C carpels AP2 řídí pole A = sepals petals 2. ag květ AP / PI řídí pole B = petals AP2, AP, PI, AG byly nazvány homeotické geny, protože byly nalezeny i u jiných rostlinných druhů. Na rozdíl od klasických homeotických genů však nekódují proteiny s homeodoménou. AG řídí pole C = carpels 2 24 ag : všechny geny fungují normálně AG gen je off => AG nepůsobí proti AP2 => AP2 expanduje do části a 4 => petals carpels sepals 4
25 26 ap2 ap / pi AP2 gen je off => AP2 nepůsobí proti AG => AG expanduje do části a 2 => sepals carpels petals AP / PI geny jsou off => AP/PI nepůsobí v kombinaci s AP2 v 2 ani v kombinaci s AG v části : petals sepals carpels 27 ABC model byl revidován na základě studie exprese genů pomocí in situ hybridizace v průběhu vývoje květu. Exprese genů v orgánech rostlin 28 Pozorované fenotypy Fenotypy na základě ABC modelu 2 4 Odchylka od pozorovaného fenotypu Odchylka od pozorovaného fenotypu ABC model dobře koresponduje z pozorovanými fenotypy mutantů. Ne však na 00%. Revize modelu Exprese AP2 v a 2 OK. Ale, exprese v a 4 nečekaná; model předpokládá potlačení vlivem AG Avšak, když je AP2 exprimován v a 4, pak by měl v těchto částech potlačit expresi genu AG ale nepotlačuje! Revize modelu: neznámý gen X gen AP OK, AP / PI je OK, AG je exprimován ve a 4 exprimován ve 2 a Další revize ABC modelu model ABCE 29 Produkty homeotických genů = proteiny 0 AG, PI, AP, AP, SEP -4 skupina evolučně konzervovaných transkripčních faktorů. Každý z nich obsahuje konzervovanou DNA-binding doménu: MADS box. APETALA a 2 SEPALLATA - 4 Quadruple mutant ap/ap2/ap/pi/ag AP a 2 AP a 2 SEP-4 SEP-4 AP a 2 SEP-4 AP PI AG SEP-4 AP PI AG SEP-4 AG SEP-4 Biochemický Quartet model specifikace květních orgánů u Arabidopsis interakce proteinů Proteiny fungují většinou jako tetramery. Homeotické proteiny se váží MADS doménou k sekvenci CC(A/T) 6 GG (nazývaná CArG-box) = regulační oblast na terčových genech pro květní orgány. AP2 není podobný žádnému ze známých proteinů. Patří k nové velké skupině proteinů schopných vázat se k DNA. Obsahuje serine-rich acidic doménu, která se váže k DNA. 5
Základní principy kontroly vývoje květů na základě genetické a molekulární analýzy homeotických genů: ) Geny, kódující transkripční faktory kontrolují celou řadu genů, které specifikují osud květů 2) Tyto geny fungují ve vzájemné kombinaci ) Produkty některých z těchto genů (např. AP2 a AG; AP/PI a AP) kontrolují vzájemně svoji aktivitu 6