OPORY KE STUDIU JEDNOOBOROVÉ BIOLOGIE NA KATEDŘE BIOLOGIE PŘF UJEP BIOLOGIE PROKARYOT A VIRŮ JAN MALÝ KATEDRA BIOLOGIE PŘF UJEP 2005
OBSAH 1. Úvod do mikrobiologie - postavení a místo mikroorganismů v přírodě 1 1.1. Mikrobiologie - význam mikroorganismů 1.2. Mikroorganismy a jejich životní prostředí 1.3. Význam mikroorganismů pro člověka 1.4. Historické kořeny mikrobiologie - Hook, van Leeuwenhoek, Cohn 1.5. Historické kořeny mikrobiologie - Pasteur, Koch a první čisté kultury 1.6. Historické kořeny mikrobiologie - položení základů obecné mikrobiologie 1.7. Moderní éra mikrobiologie 2. Struktura a funkce bakteriální buňky 3 2.1. Mikroskopie a morfologie buňky 2.2. Buněčná morfologie prokaryot 2.3. Struktura a funkce cytoplazmatické membrány prokaryot 2.4. Buněčná stěna prokaryot 2.5. Vnější membrána gram-negativních bakterií 2.6. Povrchové struktury a inkluze prokaryot 2.7. Struktura a funkce endospor 2.8. Bakteriální lokomoce a struktura bičíků 3. Růst bakterií 7 3.1. Dělení bakteriální buňky 3.2. Růst bakteriální populace 3.3. Techniky měření bakteriálního růstu 3.4. Vliv přírodních podmínek na růst bakteriální populace - vliv teploty 3.5. Vliv přírodních podmínek na růst bakteriální populace - vliv ph, osmotického tlaku a kyslíku 4. Metabolismus bakterií 10 4.1. Metabolismus fototrofů 4.2. Metabolismus fototrofů - anoxygenní fotosyntéza 4.3. Metabolismus fototrofů - oxygenní fotosyntéza 4.4. Metabolismus chemolitotrofů 4.5. Anaerobní metabolismus - anaerobní respirace 4.6. Anaerobní metabolismus - fermentace a synantrofie 4.7. Oxidace uhlovodíků a role kyslíku v katabolismu organických látek 4.8. Bakteriální fixace dusíku - nitrogenáza 5. Genetika bakterií 17 5.1. Bakteriální chromozóm 5.2. Mutace a rekombinace bakterií 5.3. Výměna genetické informace u prokaryot 5.4. Plasmidy - struktura a funkce 5.5. Bakteriální konjugace
5.6. Bakteriální genetika a klonování genů 5.7. Mutageneze in vitro 6. Evoluce a taxonomie prokaryot 21 6.1 Evoluce a první formy života 6.2 Metody studia evolučních vztahů 6.3 Evoluce prokaryot 6.4 Taxonomie prokaryot a její vztah k fylogenezi 7. Regulace růstu prokaryot a virů 24 7.1 Fyzikální metody regulace růstu bakterií sterilizace 7.2 Chemické metody regulace růstu bakterií 7.3 Antimikrobiální prostředky pro in vivo aplikaci 7.4. Rezistence a hledání nových účinných látek 8. Ekologie bakterií 27 8.1 Mikrobiální ekosystém 8.2. Výskyt bakterií v půdě a sladkovodních ekosystémech 8.3. Výskyt bakterií v mořských ekosystémech 8.4. Cyklus uhlíku a kyslíku 8.5. Cyklus dusíku 8.6. Cyklus síry a železa 8.7. Bioremediace 9. Základy virologie 31 9.1 Stavba viru a virionu 9.2 Životní cyklus viru - replikace 9.3 Diverzita virů - definice základních typů 10. Interakce mikroorganismů s člověkem 37 10.1. Základní přehled interakcí mikroorganismů s člověkem 10.2. Mikrobiální flóra člověka 10.3. Patogenní interakce - patogeneze a její příčiny 10.4. Virulentní faktory a toxiny 10.5. Faktory ovlivňující infekci 11. Základy epidemiologie 43 11.1. Základní principy a pojmy epidemiologie 11.2. Rezervoár nemocí a epidemie 11.3. Přenos infekčních onemocnění 11.4. Epidemiologie a zdravotnictví 11.5. Současná epidemiologická rizika
1. ÚVOD DO MIKROBIOLOGIE - POSTAVENÍ A MÍSTO MIKROORGANISMŮ V PŘÍRODĚ 1.1. Mikrobiologie - význam mikroorganismů Mikroorganismy představují početnou skupinu organismů zahrnující jednobuněčné, popř. klastry jednobuněčných eukaryontních mikroorganismů, prokaryontních mikroorganismů (bakterií) a nebuněčných virů. Mikroorganismy jsou často vhodné modelové organismy pro relativní jednoduchost, snadnou kultivaci, biochemické a genetické studie. Mikrobiologie patří mezi základní biologické vědy, zabývající se výzkumem mikroorganismů. Součástí mikrobiologie je jak základní, tak aplikovaný výzkum. Mikrobiologie se zabývá studiem řady praktických problémů v oblasti medicíny, zemědělství, životního prostředí, potravinářského a biotechnologického průmyslu. 1.2. Mikroorganismy a jejich životní prostředí V přírodních podmínkách se mikrobiální buňky vyskytují v asociacích zvaných populace. Populace buněk vzniká násobným dělením původní buňky. V daném prostředí je vetšinou přítomno více populací různých buněk - tzv. mikrobiální společenství. Vědní odvětví ekologie mikroorganismů se zabývá výzkumem mikrobiálních společenství. Ekosystém je soubor živých organismů a neživých složek životního prostředí v dané lokalitě. Nejdůležitější mikrobiální ekosystémy zahrnují vodní (moře, sladkovodní zdroje), terestrické ekosystémy (půda, podzemní prostory) a vyšší organismy (rostlina, živočich). Mikroorganismy jsou nezastupitelné v každém ekosystému, tvoří největší část biomasy na Zemi. 1.3. Význam mikroorganismů pro člověka. Patogenní mikroorganismy jsou původci infekčních onemocnění člověka. Počátky mikrobiologie byly spojeny s hledáním příčiny infekčních onemocnění. Znalost patogenů a mechanismu jejich působení umožnila omezit rozsah infekčních onemocnění v lidské populaci. Mikroorganismy jsou nepostradatelné v zemědělství. Symbiotické organismy fixující dusík omezují spotřebu hnojení. Bakterie v rumen přežvýkavců napomáhají trávení celulózy. Půdní bakterie přeměňují uhlík, dusík a síru do dostupné formy pro rostliny. Infekční onemocnění rostlin a živočichů způsobují ekonomické ztráty v zemědělství. Mikroorganismy způsobují velké ekonomické ztráty v oblasti potravinářské výroby. Mikrobiální hniloba znehodnocuje potraviny, je proto nutná konzervace potravin. Z důvodu potenciální kontaminace jsou nároky na hygienu přípravy potravin velmi vysoké. Důsledná - 1 -
hygiena omezuje nebezpečí potravinových nákaz. Mikroorganismy jsou nezastupitelné při fermentačních výrobách (jogurt, sýr, alkohol). Mikroorganismy přeměňují energii. Např. přírodní metan je produktem metanogenních bakterií. Fotoautotrofní organismy zachycují světelnou energii a přeměňují ji na biomasu. Bioremediace je schopnost mikroorganismů odstraňovat odpadní látky vzniklé činností člověka (pesticidy, nejrůznější toxické látky). Biotechnologie využívá mikroorganismy k průmyslovým syntézám řady látek. Rozvoj biotechnologie je umožněn rozvojem genového inženýrství. Např. inzulin je produkován modifikovanými bakteriemi s vloženým genem pro lidský inzulin. Některé příklady jsou shrnuty na Obr.1. 1.4. Historické kořeny mikrobiologie - Hook, van Leeuwenhoek, Cohn První pozorování mikroorganismů byly spojeny s vynálezem mikroskopu. V roce 1655 publikoval v časopise Micrographia Robert Hook první náčrty mikroorganismu - plodničky plísně (Obr.2). První pozorování bakterií bylo učiněno holandským obchodníkem Antoni van Leeuwenhoekem v roce 1676 a zveřejněno v roce 1684 v Londýně.. Za zakladatele bakteriologie je považován německý botanik Ferdinand Cohn (1828-1898). Jako první popsal životní cyklus rodu Bacillus a tvorbu endospor. Vytvořil základy bakteriální klasifikace a metodické postupy pro aseptickou práci při kultivaci mikroorganismů. Založil první odborný časopis věnující se bakteriologii. 1.5. Historické kořeny mikrobiologie - Pasteur, Koch a první čisté kultury O rozvoj mikrobiologie a řady mikrobiologických technik se zasloužil Louis Pasteur (1822-1895). Prokázal, že pokud je zamezeno kontaminaci okolí (vzduchu) sterilizací, nedochází k hnilobným procesům. Pasteurizace je technika sterilizace využívaná ke konzervaci potravin a nápojů. V průběhu let 1880 až 1890 vynalezl vakcínu proti anthraxu (sněti slezinné) a vzteklině. Robert Koch (1843-1910) experimentálně prokázal, že původce infekčních onemocnění je přenos mikroorganismů. Na základě studia antraxu došel k tzv. Kochovým postulátům. Vytvořil několik laboratorních metodik vedoucích k izolaci čistých bakteriálních kultur, především na podkladě ztužených medií ve formě agarových ploten. Objevil a izoloval původce tuberkulózy - bakterii Mycobacterium tuberculosis. Za tento objev obdržel Nobelovu cenu za medicínu a fyziologii v roce 1905 (Obr.3). 1.6. Historické kořeny mikrobiologie - položení základů obecné mikrobiologie - 2 -
Počátek 19. století přinesl narůstající objem poznatků o diverzitě a fyziologii mikroorganismů. Byl tak položen základ rozvoje tzv. obecné mikrobiologie. Martinus Beijerinck (1851-1931) izoloval řadu především půdních bakterií jejich kultivací na selektivních živných půdách, např. nitrifikační a sirné bakterie (Obr.4). Sergej Winogradsky (1856-1953) se zabýval rovněž studiem sirných a nitrifikačních bakterií. Je autorem konceptu chemolitotrofie, tj. schopnosti bakterií získávat energii oxidací inorganických látek (Obr.5). Objevil existenci chemoautotrofů, tj. bakterií získávajících uhlík ve formě CO2 (přičemž energii získávají z jiného zdroje než ze světelného záření, v protikladu proti fotoautotrofním organismům). Formuloval princip bakteriální fixace plynného dusíku. Objevil první virus. Je autorem klasické monografie Soil Microbiology. Shrnutí nejzásadnějších historických milníků v mikrobiologii je na Obr.6. 1.7. Moderní éra mikrobiologie Počátkem 20. století dochází k rozvoji aplikovaných odvětví mikrobiologie, jako je lékařská mikrobiologie (současně s rozvojem základů imunologie), půdní mikrobiologie, mořská mikrobiologie, ekologie mikroorganismů, mikrobiální technologie. Podstatný rozvoj zaznamenal i základní výzkum mikroorganismů. Ten přinesl nová vědní odvětví, jako je systematická mikrobiologie, fyziologie mikroorganismů, biochemie mikroorganismů. Nejvýznačnějším směrem druhé poloviny 20. st. je především rozvoj genetiky bakterií, který položil základy pro vznik molekulární biologie. Počátkem 70. let 20 st. se vyčlenil obor biotechnologie, zabývající se zpočátku genovými manipulacemi bakterií. Současná doba je charakterizována rozvojem genomiky a proteomiky (Obr.7). 2. STRUKTURA A FUNKCE BAKTERIÁLNÍ BUŇKY 2.1. Mikroskopie a morfologie buňky. Princip a základní techniky světelné mikroskopie. Limit rozlišení je 0,2 um. Při vysokém rozlišení je nutno využít modrého světla o techniky olejové imerze. Zvýšení kontrastu biologických vzorků je dosaženo barvením. K nespecifickému barvení bakterií se využívá např. metylová modř, krystalová violeť či safranin (Obr.1). Gramovo barvení umožňuje rozlišení bakterií dle stavby buněčné stěny (Obr.2, video.1). Mikroskopie s fázovým kontrastem zvyšuje kontrast buněk a snižuje tak potřebu barvení a tím i poškození mikroorganismu. Princip spočívá v existenci odlišného indexu lomu světla v buňkách a v okolním prostředí. Fluorescenční mikroskopie využívá fluorescence barviv po ozáření (např. - 3 -
barvivo DAPI). Mikroorganismy, které obsahují chlorofyl lze detekovat autofluorescencí (Obr.3). Mikroskopie atomárních sil (AFM) umožňuje vytvářet 3D obrazy mikroorganismů s vysokým rozlišením v in vivo podmínkách (Obr.4). Konfokální skenovací laserová mikroskopie (Confocal Scanning Laser Microscopy, CSLM) vytváří 3D obrazy mikroorganismů s vysokou ostrostí. Využívá se například ke studiu biofilmů (Obr.5). Obecně se využívá elektronová mikroskopie (v TEM nebo SEM uspořádání). Výhoda je velmi vysoké rozlišení, nevýhoda pozorování upraveného vzorku a možnost vzniku artefaktů (Obr.6 a 7). 2.2. Buněčná morfologie prokaryot Sférické bakterie se nazývají koky. Bakterie cylindrického tvaru označujeme jako tyčky. Existují další specifické tvary jako spirochety a filamentární bakterie (Obr.8). Časté je spojení buněk do řetízků. Prokaryota jsou proměnlivé velikosti v rozmezí 0.2 um až 750 um (rod Thiomargarita), obecně jsou menší než eukaryota. Malá velikost bakterií je podstatná z hlediska rychlé difúze molekul, rychlejšiho metabolismu a adaptace na vnější prostředí. Malý průměr zvyšuje poměr povrch/objem buněk. 2.3. Struktura a funkce cytoplazmatické membrány prokaryot Cytoplasmatická membrána vytváří rozhraní mezi vnitřním a vnějším prostředím obklopujícím buňku. Je vysoce selektivní semipermeabilní bariérou. Základní struktura fosfolipidové dvojvrstvy je cca 8 nm široká (Obr.9). Jednotková membrána (jm) je tvořena jednou fosfolipidovou dvojvrstvou. Ke stabilizaci dvojvrstvy přispívají některé ionty. Rozlišujeme integrální a periferní membránové proteiny. Model tekuté mozaiky popisuje tekuté vlastnosti membrán. Prokaryota nemají ve srovnání s eukaryoty steroly v membráně (až na řídké vyjímky), obsahují však hopanoidy. Archea mají odlišnou stavbu jm od ostatních organismů. Některé termofilní Archea mají pouze lipidovou monovrstvu (Obr.10). Hlavní funkce cytoplazmatické membrány je selektivní přenos látek, ukotvení proteinů a bioenergetická funkce - zásobárna a místo vzniku energie ve formě proton-motorické síly (Obr.11). Průchod iontů přes cytoplasmatickou membránu je omezen. Voda proniká samovolně difuzí nebo přes tzv. aquaporiny. Pro většinu látek je nutný přenašečový protein (Obr.12). Přenašeče jsou vysoce specifické a projevují saturační kinetiku (Obr.13). Prokaryota mají transportní systém typu jednoduchého transportu, skupinové translokace a tzv. ABC systém (Obr.14). V těchto transportních systémech je vyžadována energie (např. ATP, proton-motorická síla, jiné energeticky bohaté látky). Bakterie využívají tři typy transportních - 4 -
mechanismů - uniport, symport, antiport (Obr.15). Bakterie Escherichia coli dopravuje disacharid laktózu přes cytoplazmatickou membránu pomocí jednoduchého transportu tzv. lac permeázou (Obr.16). Při skupinové translokaci dochází k modifikaci látky v průběhu transportu. Příkladem je fosfotransferázový systém dopravující cukry glukózu, mannosu a fruktózu do bakterie E. coli (Obr.17). Tzv. ABC transportní systém využívá vysoce specifické substrát-vázající proteiny v periplasmovém prostoru gram-negativních bakterií k jejich dopravě přes transportní kanál za současné hydrolýzy ATP cytoplasmatickou kinázou (Obr.18). Proteiny jsou přes cytoplasmatickou membránu transportovány translokázami. Nejdůležitější translokázovým systémem prokaryot je Sec (secretory) systém (např. translokace hydrolytických exoenzymů, jako amyláza nebo celluláza, nebo toxinů). 2.4. Buněčná stěna prokaryot Buněčná stěna buňky zabraňuje prasknutí (lýze) jako následku vysokého osmotického tlaku cytoplasmy (rovnající se tlaku cca 2 atmosfér). Prokaryota mají dvě základní varianty stavby buněčné stěny - gram-pozitivního a gram-negativního typu (Obr.19). Základní složkou buněčné stěny obou typů je modifikovaný polysacharid peptidoglykan. Peptidoglykan se skládá z opakujících se jednotek dvou cukerných derivátů. Vzniklé polymery jsou navzájem pospojované pomocí krátkých peptidických řetízků vycházejících z monomerních jednotek v hustou síť (Obr.20 a 21). Gram-pozitivní buňky mají tlustou vrstvu peptidoglykanu, gramnegativní tenkou vrstvu. Peptidové řetízky jsou většinou z D-aminokyselin a kyseliny diaminopimelové (DAP). Peptidoglykan je znám ve více jak 100 variantách, není u Archeot a Eukaryot. Gram-pozitivní buňky obsahují v buněčné stěně kyselinu teichovou (Obr.22). Některé řetězce kyseliny jsou ukotvené v cytoplazmatické membráně a nazývají se kyselina lipoteichová. Enzym lysozym specificky štěpí peptidoglykan a navozuje prasknutí bakterií. Lysozym je formou nespecifické obrany živočichů proti bakteriální infekci. Buňky natrávené lysozymem v izotonickém prostředí neprasknou, vznikají tak protoplasty - buňky bez buněčné stěny kulovitého tvaru (Obr.23). Některá Archea obsahují pseudopeptidoglykan - polysacharid podobný stavbou peptidoglykanu (Obr.24). Buněčná stěna Archeí je většinou tvořena polysacharidy, glykoproteiny nebo tzv. parakrystalickou S-vrstvou (Obr.24). S-vrstvy jsou tvořeny proteiny (popř. glykoproteiny) s hexagonální symetrií. 2.5. Vnější membrána gram-negativních bakterií - 5 -
Gram-negativní buňky obsahují mimo cytoplazmatické membrány i tzv. vnější membránu. Skládá se z fosfolipidové (vnitřní) a lipopolysacharidové (LPS, vnější) vrstvy (Obr.25, 26). LPS se skládá z centálního (core) polysacharidu, tzv. O-specifického polysacharidu a lipidu A. Lipoproteiny spojují vnější membránu s peptidoglykanovu vrstvou. LPS, převážně lipid A je tzv. endotoxinem, který je toxickým agens patogenních bakterií. Proteinové kanály poriny procházejí vnější membránou a umožňují snadný přestup látek. Rozlišujeme nespecifické a úzce spefické poriny. Periplasma obsahuje periplasmové proteiny (hydrolytické enzymy, vázající proteiny, chemoreceptory). 2.6. Povrchové struktury a inkluze prokaryot Fimbrie a pili jsou krátké filamentární struktury skládající se z proteinů vycházejícího ven z buňky (Obr.28, 29). Fimbrie umožňují přisednutí bakterie na substrát či hostitele. Pili jsou delší jak fimbrie. Jsou receptory virů, mají rovněž funkci adhezinů a především umožňují tzv. konjugaci (tzv. sex pili). Parakrystalické S-vrstvy se vyskytují rovněž u bakterií. Přesná funkce není známa. Slizová pouzdra (popř. obaly) jsou tvořena hydratovanými polysacharidy různé tloušťky a viskozity (Obr.30). Umožňují vazbu na hostitele popř. u nepatogenních bakterií tvorbu biofilmů na povrchu substrátu. Buněčné inkluze slouží zejména k uchování zásobních látek, nejčastěji polyhydroxymáselné kyseliny (PHB) a glykogenu (Obr.31). Polyfosfátová tělíska a elementární síra ve formě sirných globulí vznikají v důsledku metabolismu některých bakterií (Obr.32). Magnetosomy slouží k směrovému pohybu bakterie v magnetickém poli (magnetotaxe). Jsou tvořeny magnetitem a obaleny membránou (Obr.33). Plynné vesikuly umožňují planktoním prokaryotům vznášivý pohyb ve vodním sloupci regulovanou změnou jejich hustoty (sinice, purpurové a zelené fototrofní bakterie, součást vodního květu v letních měsících, Obr.34). Membrána plynného vesikula je tvořena proteiny, je nepropustná pro vodu, ale propustná pro plyny (Obr.35, 36). 2.7. Struktura a funkce endospor Některé bakterie mají schopnost tvořit tzv. endospory procesem sporulace. Endospory prokazují vysokou odolnost vůči extrémním fyzikálním a chemickým vlivům. Sporulace je známa především u bakterií rodu Bacillus a Clostridium. Struktura endospory je naprosto odlišná od obecné strutury bakteriální buňky (Obr.37). Skládá se z několika vrstev. Napovrchu je exosporium, proteinový obal, kortex (peptidoglykan), jádro (protoplast spóry) - obsahuje jaderný obal, cytoplasmatickou membránu, cytoplasmu, nucleoid, ribosomy atd. - 6 -
Kyselina dipikolinová v komplexu s vápníkem stabilizuje dehydratovatovanou endospóru. Ke sporulaci dochází v nepříznivých podmínkách (vyčerpání živin) (Obr.38). Sporulaci předchází buněčná diferenciace s účastí více jak 200 genů, celkem se rozeznává 7 fází (Obr.39). Klíčení endospor je rychlé, zahrnuje proces aktivace, klíčení a objemový růst. 2.8. Bakteriální lokomoce a struktura bičíků Základem lokomoce bakterií je bičík, popř. klouzavý pohyb po substrátu. Dle umístění bičíku rozeznáváme polární bičík, peritrichu a lophotrichu (Obr.40, 41). Bičík je šroubovicovité stuktury skládající se z monomeru proteinu flagelinu. Bičík rotuje kolem osy. Vlákno bičíku je spojeno tzv. háčkem k bázi bičíku. Báze bičíku má odlišnou stavbu a je zakotvena v povrchových strukturách bakterie (buněčná stěna, membrány). Motor bičíku se skládá z několika stuktur vytvářejících strukturu rotoru a statoru (Obr.42). Stavba motoru je odlišná u gram-pozitivních a gram-negativních bakterií. Energie potřebná k rotaci bičíku pochází z protonového gradientu. Transport protonu skrze tzv. Mot protein roztáčí rotor (1 ot. spotřebuje cca 1000 protonů). Syntézy bičíku se účastní přes 40 genů. První je nasyntetizován motor a háček. Flagelin je syntetizován v cytoplasmě a dopraven kanálem na konec přirůstajícího bičíku (Obr.43). Rychlost a směr otáček bičíku je proměnlivý a regulovaný (Obr.44). U některých bakterií (filamentární sinice, myxobakterie) je znám klouzavý pohyb po substrátu (Obr.45). Existuje více mechanismů klouzavého pohybu. Např. sekrece slizu (polysacharid, cyanobakterie), pohyb vnějších proteinů (Obr.46). Bakteriální pohyb je řízen principem taxe, tj. pohybem v gradientu chemických látek (chemotaxe) nebo fyzikálního pole (např. fototaxe). Chemotaxe je umožněna směrováním pohybu bakterie činností bičíků, tj. střídáním rotace (Obr.47). Směrový pohyb za substrátem je umožněn prodloužením dopředné fáze pohybu. Chemoreceptory v membráně bakterií sledují proměnu koncentrace substrátu v čase. Existuje řada jednoduchých způsobů jak pozorovat chemotaxi bakterií (Obr.48). U řady fototrofních bakterií existuje fototaxe - pohyb organismu za zdrojem světla. Směrovost pohybu řídí fotoreceptor v membráně (Obr.49). Aerotaxe je směrový pohyb v gradientu kyslíku, osmotaxe v gradientu osmotického tlaku. 3. RŮST BAKTERIÍ 3.1. Dělení bakteriální buňky Pod pojmem růst se v mikrobiologii rozumí nárůst počtu buněk v čase. Prokaryota se množí binárním dělením, z původní mateřské buňky vznikají vždy dvě dceřinné (Obr.1). Jako - 7 -
generace buněk se označují buňky vzniklé dělením v daný okamžik do okamžiku následujícího dělení. Průměrná doba existence jedné generace u E. coli je přibližně 20 minut. Tzv. Fts proteiny (filamentous temperature sensitive proteins) obdobné tubulinu u eukaryot jsou nepostradatelné pro dělení bakterií, mitochondrií a chloroplastů. Divisom je dělící aparát prokaryotní buňky, vznikající na podkladě Fts proteinů. Divisom se utváří koncentricky kolem středu buňky a predeterminuje rovinu dělení. Váže FtsI protein (neboli PBP, penicilin binding protein) který je cílovým místem účinku penicilinových antibiotik (Obr.2). Replikace DNA předchází dělení buňky a formování divisomu. Vývoj nových farmakologicky účinných látek inhibující činnost divisomu a tím i dělení bakterií představuje nový trend vývoje antibakteriálních léčiv. Tvar bakteriální buňky je udržován speciálními proteiny, připomínající strukturou aktin eukaryot (actin like proteins). Příkladem je protein MreB. Koky postrádají tento protein - jsou sférické. Syntéza peptidoglykanové buněčné stěny vznikajících dceřiných buněk je umožněná vkládáním nových podjednotek skrze póry v membráně vytvořených enzymy, tzv. autolysiny (Obr.3). Biosyntéza peptidoglykanu je umožněna existencí proteinu baktoprenolu (C55 alkohol), který přenáší prekursory peptidoglykanu přes cytoplasmatickou membránu (Obr.4). Posledním krokem syntézy je tzv. transpeptidace, tj. vytvoření peptidických vazeb mezi peptidovými řetízky souběžných vláken peptidoglykanu. Reakce je inhibována penicilinem a jeho deriváty. 3.2. Růst bakteriální populace Čas potřebný ke zdvojení bakteriální biomasy se nazývá generační doba (čas). Její délka závisí na typu bakterie a vnějších podmínkách (minuty až týdny). V experimentálních podmínkách je počáteční růst bakteriální biomasy exponenciálního charakteru o základu 2 (Obr.5). V logaritmickém uspořádání lze snadno odečíst generační dobu jako směrnici přímky. V uzavřeném systému (tzv. batch kultura) vzniká specifický průběh růstu bakteriální biomasy, který lze popsat tzv. bakteriální růstovou křivkou (Obr.6). Lag fáze je počáteční fáze po inokulaci, způsobená regenerací (popř. adaptací) buněk. Následuje exponenciální fáze jejíž průběh je závislý na podmínkách v kultivovaném prostředí. Stacionární fáze je v batch kultuře navozena spotřebováním substrátu nebo nahromaděním toxických produktů. Fáze odumírání je rovněž exponenciální, ale přesto pomalá. 3.3. Techniky měření bakteriálního růstu - 8 -
Nejjednoduším způsobem počítání buněk spočívá ve využití počítací komůrky (Obr.7). V určitých případech se buňky barevně popř. fluorescenčně značí. Metoda počítání kolonií je výhodná ve stanovení počtu pouze živých buněk (Obr.8). Je vždy nutné vytvoření série ředění (Obr.9). Faktor cfu (colony forming units) vyjadřuje počet narostlých kolonií. Využití turbidometrických měření (stanovení optické hustoty, OD) spočívá ve sledování rozptylu procházejícího světelného paprsku kyvetou s bakteriální biomasou. Vztah mezi hodnotou OD a množstvím biomasy vyjadřuje kalibrační křivka (Obr.10). Kontinuální kultura je narozdíl od batch kultury otevřeným systémem s konstantním kultivačním objemem. Nejčastějším uspořádáním kontinuální kultury je chemostat. Chemostat kontroluje stálou hustotu bakteriální biomasy a stálou koncentraci nejdůležitějších živin (Obr.11). Výhodou je možnost dosáhnout ustálého růstu kultivovaných buněk. 3.4. Vliv přírodních podmínek na růst bakteriální populace - vliv teploty Kardinální body teploty (minimum, optimum, maximum) charakteristické pro každý organismus vymezují oblast teplot, při které je organismus schopný přežít. Nad maximální teplotou dochází k denaturaci proteinů, pod minimální teplotou pravděpodobně k nadměrnému tuhnutí membrán a nemožnosti produkce energie (Obr.12). Psychrofilové mají nízké teplotní optimum, mesofilové průměrné teplotní optimum, thermofilové optimum s vysokou teplotou a hypertermofilové mají extrémně vysoké teplotní optimum (Obr.13). Extremofilové obývají prostředí s extrémními podmínkami - extrémně chladné (antarktida, ledové pole) (Obr.14), popř. extrémně horké (horké prameny, podmořské vývěry horké vody atd.) prostředí. Psychrotolerantní organismus má teplotní optimum kolem 20 stupňů celsia, krátkodobě toleruje i velmi nízké teploty (kolem 0 C). Molekulární podstata odolnosti k mrazu spočívá v odlišné stavbě proteinů (více alfa-helixů) a membrán (více nenasycených mastných kyselin, membrána je tekutější). Hypertermofilové obývají horké prameny, blízko nebo dokonce nad bodem varu. Jedná se o širokou skupinu prokaryot zahrnující bakterie a Archea (Obr.15). Termofilové obývají stejné lokality v chladnějších zónách díky existenci teplotního gradientu (Obr.16). Princip teplotní odolnosti termofilů spočívá v termostabilních proteinech, stabilizátorech (např. diglycerol fosfát), membrány také obsahují nasycené mastné kyseliny (jsou tužší při běžné teplotě) popř. pouze lipidickou monovrstvu (Archea). Enzymy z termofilních organismů se uplatňují v biotechnologii (např. DNA polymeráza z Thermus aquaticus). - 9 -
3.5. Vliv přírodních podmínek na růst bakteriální populace - vliv ph, osmotického tlaku a kyslíku Každý mikroorganismus má své růstové ph optimum. Acidofil je organismus, který roste optimálně při nízkém ph (např. bakterie Acidithiobacillus, Sulfolobus (Archea)). Alkalifilové obývají extrémně zásadité prostředí (ph 10 a více). Tato skupina je zastoupená např. bakterií rodu Bacillus a halofilními (slanomilnými) zástupci Archeií. Alkalifilové jsou zdrojem biotechnologicky významných enzymů (proteázy, lipázy). Neutrofilové mají ph optimum při ph 6 až 8. Halofilové vyžadují k růstu přítomnost vyšší koncentrace Na+ ve vodě (např. mořské bakterie). Halotolerantní organismus nevyžaduje přítomnost soli ve vodě, do jisté míry ji však toleruje. Extrémní halofil vyžaduje až 30% NaCl pro optimální růst (Obr.17). K překonání vysokého osmotického tlaku (k čerpání vody do buňky) koncentrují buňky v cytoplasmě osmoticky aktivní látky (manitol, glycin betain, glycerol atd). Aerob vyžaduje k růstu kyslík v množství (parciální tlak) rovnající se parciálním tlaku kyslíku v atmosféře za běžných podmínek. Mikroaerofil vyžaduje menší množství (parciální tlak) než je přítomno v atmosféře. Fakultativní aerob může růst i v anaerobních podmínkách. Anaerob nerespiruje kyslík. Aerotolerantní anaerob toleruje kyslík, přestože ho nespotřebovává. Obligátní (striktní) anaerob je v přítomnosti kyslíku inhibován v růstu či usmrcen (Obr.18). 4. METABOLISMUS BAKTERIÍ 4.1. Metabolismus fototrofů Fototrofní bakterie využívají jako zdroje energie fotosyntézu. V závislosti na způsobu příjmu uhlíku rozeznáváme fotoautotrofy a fotoheterotrofy (Obr.1). Některé bakterie využívají vodu jako donor elektronů v oxygenní fotosyntéze. V jiných případech je donorem elektronů jiná molekula, kyslík nevzniká (anoxygenní fotosyntéza) (Obr.2). Bakterie obsahují chlorofyl (sinice), popř. bakteriochlorofyl. Absorpční spektrum bakteriochlorofylu je výrazně posunuto do oblasti dlouhovlnného červeného záření (Obr.3). Existuje řada bakteriochlorofylů lišících se strukturou a absorpčními maximy (Obr.4). Fotosynteticky aktivní membrány bakterií nejsou lokalizovány v chloroplastu jako u vyšších rostlin. Vznikají invaginací cytoplasmatické membrány (purpurové bakterie), jako uzavřené membránové systémy chlorosomy (zelené bakterie) a thylakoidní membrány (sinice). Bakteriochlorofyl je přítomný v tzv. reakčních centrech (RC) a světlosběrných anténnách (Obr.5). Nejefektivnější světlosběrnou anténou je chlorosom bakterie Chloroflexus (Obr.6). - 10 -
Karotenoidy se v bakteriální fotosyntéze podílí na transferu energie do reakčního centra a detoxifikaci reaktivních kyslíkových radikálů (Obr.7). Fykobiliproteiny jsou hlavním pigmentem světlosběrných antén sinic a jsou uspořádány v komplexních proteinových komplexech fykobilisomech (Obr.8). 4.2. Metabolismus fototrofů - anoxygenní fotosyntéza Fotosyntetické reakční centrum purpurových bakterií je uloženo ve vchlípeninách cytoplasmatické membrány (Obr.9). Skládá se z několika transmembránových alfa-helixů, které tvoří tři základní proteiny L,M,H. Uvnitř RC se nachází tzv. speciální reakční pár bakteriochlorofylu a, který je zodpovědný za nábojovou separaci (Obr.10). Světelná energie zachycená anténou je transportována pomocí tzv. excitonů do RC, kde dochází k excitaci bakteriochlorofylu a. Elektron vzniklý nábojovou separací v RC je transportován po směru spádu redoxní energie mezi řadou kofaktorů na mobilní přenašeč v membráně bakterie QB a dále na membránové cytochromy (Obr.10, 11). Transport elektronu skrze membránu je spojen s transportem protonu a vzniku protonového gradientu. Cyklickou fotofosforylací se elektrony z cytochromů vrací do RC a vytváří se cyklus, při kterém jsou pumpovány protony přes membránu. Vzniklý protonový gradient je využit k tvorbě ATP protonovou ATPázou (Obr.11). Modelovou purpurovou bakterií s prostudovanými geny zodpovědnými za fotosyntézu je rod Rhodobacter. V případě autotrofních purpurových bakterií je tvořeno NADH, přičemž donorem elekronů jsou redukované anorganické látky, převážně sulfan (purpurové sirné bakterie). Ten je oxidován cytochromy c asociovanými s povrchem membrány. NADH je tvořeno zpětným elektronovým tokem z QB (Obr.12, 13). Vzniklá síra vytváří sirné globule uvnitř buňky (Obr.14). Systém tvorby redoxní síly pro fixaci oxidu uhličitého se mírně liší u jednotlivých typů anoxygenních bakterií (Obr.15). 4.3. Metabolismus fototrofů - oxygenní fotosyntéza Oxygenní fototrofní bakterie využívají světla k tvorbě ATP a NADPH za oxidace vody na kyslík. V membráně těchto bakterií existují dva odlišné proteinové komplexy zachytávající světelnou energii - fotosystém I a fotosystém II. Oba systémy jsou lokalizovány ve speciálních membránách - thylakoidech. Thylakoidy sinic (cyanobakterií) nejsou umístěny ve specializovaných organelách (chloroplastech), jako je tomu u vyšších rostlin. Elektronový transport v thylakoidech lze znázornit tzv. fotosyntetickým Z-schématem, který vyjadřuje závislost směru toku elektronů na redoxním potenciálu jednotlivých přenašečů (Obr.16). - 11 -
Prvním krokem transportu elektronu je oxidace molekul vody na kyslík fotosystémem II. Po excitaci centrálního páru chlorofylu a (P680) je elektron předán následujícím přenašečům v řetězci. Po přijmutí elektronu z přenašeče plastocyaninu dojde k zachycení kvanta energie centrálním párem chlorofylu P700 fosystému I a předání elektronu řadou přenašečů na NADP za vzniku NADPH (Obr.16). Transportem elektronů přes membránu je vytvářen protonový gradient. Využitím protonového gradientu je syntetizováno ATP protonovou reverzibilní ATPázou. Tento systém současné tvorby ATP a NADPH je označován jako necyklická fotofosforylace. Při cyklické fotofosforylaci vzniká pouze ATP, elektron je namísto NADP vracen zpět do membrány na cytochrom b6f. Některé sinice dokáží využít sulfan k cyklické fotofosforylaci anoxygenního typu za tvorby NADPH a ATP. Vznikají opět sirné globule (Oscillatoria limnetica). Autotrofní fixace oxidu uhličitého je umožněna existencí Calvinova cyklu (Obr.17, 18). Karboxysomy prokaryot jsou buněčné inkluze obalené membránou obsahující enzym ribulóza-bisfosfát karboxylázu (RubisCO). Karboxyzomy zvyšují efektivitu fixace CO2. Obrácený Krebsův cyklus je alternativní fixační cestou CO2 zelených sirných bakterií (Obr.19a). Enzym citrát-lyáza štěpí citrát na acetyl-koenzym A a oxalacetát. Acetyl- CoA je využit k syntéze pyruvátu z CO2 za přítomnosti redukovaného ferredoxinu. Tzv. hydroxypropionátová cesta fixace CO2 je popsána u zelené bezsirné bakterie Chloroflexus (Obr.19b). Dvě molekuly CO2 jsou redukovány na glyoxylát. Tato fixace představuje evolučně nejstarší způsob autotrofního způsobu získávání uhlíku z CO2. 4.4. Metabolismus chemolitotrofů Chemolitotrofové získávají energii oxidací anorganických látek. Z hlediska příjmu CO2 jsou tyto bakterie jak autotrofní, tak v některých případech mixotrofní. Mixotrofie znamená možnost získání energie z anorganické látky a spotřeby organické látky za ůčelem získání uhlíku. Způsob získání ATP je podobný chemoorganotrofům, donorem elektronů je však anorganická látka, která je v průběhu procesu oxidována. Redoxní síla pro fixaci CO2 je buď samotná anorganická látka, popř. zpětný elektronový transport. Zdrojem anorganických látek jsou výsledkem geologické, biologické či antropogenní činnosti. Vhodnou anorganickou látkou je taková, při které se při spalování na kyslík (O2 je akceptorem elektronu) uvolní dostatek energie (Obr.20). Oxidace vodíku. Existuje řada bakterií a Archeí, které oxidují vodík kyslíkem, nitrátem, sulfátem atd. Membránový enzym hydrogenáza katalyzuje oxidaci vodíku a předává elektrony chinonovým přenašečům. Elektrony jsou přes řadu přenašečů dopraveny na kyslík - 12 -
(redukce na vodu). Výsledkem je tvorba protonového gradientu a ATP (Obr.21). Ve vodě rozpustná hydrogenáza vytváří NADH nutný k fixaci CO2 Calvinovým cyklem. Oxidace redukovaných forem síry. Nejběžnějším zdrojem elektronů v tomto případě je sulfan, elementární síra a thiosulfát. Produktem je sulfát. Při oxidaci sulfanu na sulfát dochází k uvolnění značné energie a okyselení prostředí. Sulfit-oxidáza je centrálním enzymem oxidující sulfit na sulfát. Elektron je transportován na cytochrom c a vzniká protonový gradient a ATP (Obr.22, 23). Ostatní redukované formy jsou nejdříve převedeny na sulfit příslušnými redoxními enzymy (např. APS reduktáza). Uvolněné elektrony jsou opět využity k membránovým procesům, k produkci NADH a fixaci CO2 v Calvinově cyklu. Oxidace železnatých iontů. Oxidace dvojmocného železa na trojmocné je energeticky málo významná a musí být produkována ve velkém množství aby vystačila k růstu bakterie. Trojmocné železo vytváří ve vodě nerozpustný hnědý hydroxid (Obr.24). Řada bakterií oxidujících železnaté ionty patří k obligátním acidofilům, neboť Fe2+ je stabilní v kyselém prostředí. Bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans roste v prostředí s ph okolo 1 v důlních nádržích. V periplasmě bakterie oxiduje enzym rusticyanin Fe2+ na Fe3+ a odevzdává elektrony cytochromu c v cytoplasmatické membráně. Elektron je přenesen na cytochrom a a kyslík, který je redukován na vodu. Odejímané protony kompenzují případný pokles vnitřního ph, který vzniká při syntéze ATP. NADH pro Calvinův cyklus je tvořen zpětným elektronovým tokem z cytochromu c (Obr.25). Fe2+ je často zdrojem elektronu pro Calvinův cyklus anoxygenních fototrofů (fototrofních purpurových bakterií) (Obr.26). Nitrifikace. Nejběžnějším donorem elektronů jsou amoniak a nitrit. V průběhu nitrifikace dochází k oxidaci těchto molekul chemolitotrofními nitrifikačním bakteriemi. Nitritové bakterie (např. rod Nitrosomonas) oxidují amoniak na nitrit, nitrátové bakterie (např. rod Nitrobacter) oxidují nitrit na nitrát. Klíčovým enzymem nitritových bakterií je ammonium monooxygenáza, oxidující amoniak na hydroxylamin a hydroxylamin oxidoreduktáza, oxidující vznikající hydroxylamin na nitrit (Obr.27). Vzniklé elektrony jsou částečně využity terminální oxidázou Cyt aa3 k produkci protonového gradientu a redukci kyslíku na vodu. Klíčovým enzymem nitrátových bakterií je nitrit oxidoreduktáza, oxidující nitrit na nitrát. Elektrony uvolněné reakcí jsou dopraveny na terminální oxidázu Cyt aa3 a využity k tvorbě protonového gradientu a ATP (Obr.28). Oba druhy bakterií patří mezi autotrofy a vytváří NADH zpětným tokem elektronů. Některé nitrifikační bakterie mohou v anaerobních podmínkách oxidovat amoniak anoxygenní oxidací (tzv. anammox). V této reakci dochází - 13 -
oxidaci amoniaku nitritem za vzniku plynného dusíku. Proces je lokalizován v speciální membránou uzavřené organele anammoxosomu (Obr.29). Všechny typy nitrifikačních bakterií lze nalézt především v dusíkem bohatých odpadních vodách, kde jsou přítomny jak oxygenní, tak anoxygenní podmínky. 4.5. Anaerobní metabolismus - anaerobní respirace V procesu anaerobní respirace dochází k oxidaci substrátu, přičemž jako konečný elektronový akceptor slouží jiné molekuly, než kyslík (železité ionty, nitrát, nitrit, síranový aniont, elementární síra, CO2). Anaerobní respirace je umožněna existencí membránových systémů podobných membránovému systému aerobní respirace. Prokaryota jsou jak obligátními, tak fakultativními anaeroby. Anaerobní respirace je vždy méně energeticky výhodná než oxidace kyslíkem (Obr.30). Assimilační metabolismus anorganických látek slouží k jejich zabudování do složitějších molekul potřebných v organismu. V dissimilačním metabolismu jsou stejné typy molekul využity pouze jako akceptor elektronů. Produkt je v tomto případě vylučován z buněk ven exkrecí. Nitrátová respirace a denitrifikace. Nejčastějším dusíkatým akceptorem elektronů je nitrát. Procesem denitrifikace vzniká řada plynných produktů, včetně molekulárního dusíku (Obr.31). Dusík tak uniká z životního prostředí mnoha organismů do atmosféry. Toto je výhodou např. při čištění odpadních vod, naopak způsobuje určitou ztrátu v zemědělství. Klíčovým ezymem denitrifikace je nitrát reduktáza, která je snadno inhibována kyslíkem (Obr.32). Produkt reakce - nitrit je redukován nitrit reduktázou na oxid dusnatý (NO). V závislosti na typu bakterie proces redukce pokračuje až k plynnému molekulárnímu dusíku (např. Pseudomonas stutzeri) (Obr.33). Sulfátová respirace. Existuje celá řada potenciálních akceptorů obsahujících síru, z nichž nejčastější je sulfát (Obr.34). Sulfát redukující bakterie redukují sulfát až na plynný sulfan. Tyto bakterie jsou v biosféře velmi rozšířené. Sulfát je nejdříve aktivován ATP sulfurylázou na adenosinfosfosulfát (APS), ten redukován APS reduktázou na sulfit a ten redukován sulfit reduktázou na sulfan. Z APS je možné assimilační cestou přes meziprodukt fosfoadenosinfosfosulfát (PAPS) vytvářet organické molekuly využitelné v metabolismu (cystein, methionin) (Obr.35). Nejlépe je prostudován membránový systém bakterie Desulfovibrio (Obr.36). Zdroj elektronů je vodík, který je oxidován hydrogenázou. Elektrony jsou dopraveny transmembránovým complexem HMC pro enzymy redukující sulfát. - 14 -
Bakterie může rozkládat též pyruvát (nebo laktát), ale ten opět produkuje vodík využitý hydrogenázou. Vzniká protonový gradient a ATP. Jako příklad častých substrátů u dalších bakteriálních zástupců lze uvést acetát (je rozkládán na CO2, který je využit v Calvinově cyklu) a HPO3-. Acetogeneze a methanogeneze. Acetogenní a methanogenní bakterie jsou striktní anaerobové využívající CO2 jako akceptor elektronů. Donorem je plynný vodík (Obr.37). Energie uvolněná během reakce je využita k tvorbě protonového gradientu a ATP. Donorem elektronů acetogenních bakterií jsou kromě vodíku i cukry, alkoholy a aminokyseliny, které jsou cestou přes acetyl-coa a za spotřeby CO2 transformovány na kyselinu octovou. Metanogenní prokaryota (Archea) využívají H2 a CO2 k produkci methanu. Tento proces je velmi složitý a zahrnuje několik komplexních kroků. 4.6. Anaerobní metabolismus - fermentace a synantrofie Fermentace. Fermentace probíhá v anoxygenním prostředí za nedostatku alternativních elektronových akceptorů (sulfát, nitrát atd.). V průběhu fermentace je organická látka přeměněna na energii v podobě ATP (defosforylačními reakcemi) a na konečný fermentační produkt reakce, který je exkretován ven z buňky (Obr.38). Fermentace je energeticky nejméně výhodným způsobem oxidace organických látek. Energii (množství ATP) vytvořenou fermentací určité látky na produkt lze odhadnout ze znalosti energie hydrolýzy energeticky bohatých meziproduktů, které při fermentaci vznikají (Obr.39). Nejběžnější fermentační cesty běžné u bakterií (substrát a jednolivé produkty) jsou uvedené na Obr.40 a 41. Synatrofie označuje vzájemné, velmi úzké propojení metabolismu dvou odlišných druhů bakterií. V rámci této koexistence bakterií dochází k vzájemnému těsnému vyměňování produktů a substrátů metabolismu. Příkladem je produkce H2 jedním druhem bakterie a jeho okamžitá spotřeba jinou bakterií (Obr.42). Velmi často se s synantrofií setkáváme v anoxygenním prostředí. 4.7. Oxidace uhlovodíků a role kyslíku v katabolismu organických látek. Molekulární kyslík může být využit nejen jako akceptor elektronů v aerobní respiraci, ale jako přímý oxidant v nejrůznějších anabolických a katabolických pochodech prokaryot. Oxygenázy jsou enzymy které katalizují začlenění kyslíku do organických látek. - 15 -
Dioxygenázy začlení oba atomy O2 do organické látky. Monooxygenázy pouze jeden atom, druhý je redukován na vodu. Donorem elektronu pro reakci je většinou NADH (Obr.43). Oxidace uhlovodíků. Řada bakterií je schopna využívat alifatické nasycené a nenasycené uhlovodíky jako zdroj elektronů v anaerobních podmínkách. Klíčovou reakcí je oxidace uhlovodíku kyslíkem pomocí monooxygenázy. Konečným produktem posloupností reakcí je acetyl-coa (Obr.43). Bakterie rodu Pseudomonas mají schopnost využívat aromatické uhlovodíky (katechol, toulen, benzen) v aerobních podmínkách. První krok je opět oxidace uhlovodíku kyslíkem v přítomnosti mono- popř. dioxygenázy (Obr.44). Podobný proces je znám u některých anaerobních bakterií. Metanotrofie a metylotrofie. Methanotrofie je schopnost metabolizovat metan (CH4) na oxid uhličitý. Jedná se o speciální případ metylotrofie. Prvotním krokem reakce je oxidace metanu metan-monooxygenázou v aerobních podmínkách. Elektron potřebný k reakci je dodán cytochromem c z membrány, přičemž zdrojem energie je NADH (Obr.45). Metylotrofie spočívá v schopnosti bakterie získat energií oxidací C1 metylové skupiny přítomné v organické látce. 4.8. Bakteriální fixace dusíku - nitrogenáza Fixace molekulárního dusíku je významným místem vstupu dusíku do biosféry. Schopnost fixovat N2 mají pouze některá prokaryota (Obr.46). Řada z nich žije volně, valná část jako symbiont s vyššími rostlinami. Klíčovým enzymem je nitrogenáza, která katalizuje redukci N2 až na amoniak. Nitrogenáza se skládá z monomeru dinitrogenázy a dinitrogenázyreduktázy. Katalitická doména enzymu obsahuje tzv. FeMo-co centrum, které se skládá z atomů železa a molybdenu (Obr.47). Pro velmi nízkou reaktivitu N2 je k jeho redukci na NH3 (6 elektronů) vyžadována vysoká spotřeba energie (16-24 ATP). Nitrogenáza je účinně inhibována kyslíkem, jeho přístupu často brání heterocysta (sinice), rostlina (nody), popř. existence speciálních proteinů ostraňujících kyslík z okolí nitrogenázy (Obr.48). Princip redukce N2 na amoniak je znázorněn na Obr.49 a 50. Detekce přítomnosti a funkce nitrogenázy se provádí v přítomnosti acetylénu, který je nitrogenázou redukován na plynný ethylen. Ten je pomocí plynové chromotografie detekován (Obr.51). - 16 -
5. GENETIKA BAKTERIÍ 5.1. Bakteriální chromosom Nejlépe prostudovaným bakteriálním chromosomem je chromosom bakterie Escherichia coli (Obr.1). Pro sestavení podrobné mapy kruhové DNA byly původně využity techniky transdukce a konjugace. Dnes jsou více využívány techniky klonování genů a sekvenování DNA. Celková mapa genomu je rozdělena na "minuty" (jednotky používané hlavně v minulosti, dnes se využívají vzdálenosti v Kbp, tj. tisíce párů bazí) a velmi často se vyznačuje poloha několika restrikčních míst. Analýza genomů o velikosti jednotek Mbp je dnes prováděna automaticky a obrovský nárůst informací spojený s mapováním vytvořil nový vědní obor - bioinformatiku. Chromosom bakterie E.coli, v přírodě se nacházejícího kmene K-12 má velikost cca 4,6 Mbp a obsahuje přibližně 4300 otevřených čtecích rámců (ORF), tj. 88% genomu. Ostatní části jsou tvořeny geny pro trna a rrna (1%), regulační sekvence (10%) a nekódující opakující se sekvence (0,5%). Strukturální geny jsou jak v klasterech, tak volně rozptýlené po genomu. Některé operony jsou transkribovány po směru chromosomu, jiné v protisměru. Replikace je zahajována v replikačním počátku, v tzv. oric. Ukončena je v místě terminus. Přibližně 38% strukturálních genů je neznámé funkce. Průměrná délka proteinu je cca 300 aminokyselin. V genomu bakterie existují genové rodiny. Přibližně 20% genomu pochází z jiných bakteriálních druhů, které byly přeneseny horizontálním (laterálním) přenosem genetické informace. 5.2. Mutace a rekombinace bakterií Mutace je změna genetické informace kódované DNA, vetšinou malého rozsahu. Genetická rekombinace je záměna částí genomů dvou organismů velkého rozsahu. Prokaryota mají haploidní genom a nerozmnožují se pohlavní cestou. Genetická rekombinace je však umožněna tzv. laterálním (horizontálním) přenosem informace mezi dárcovskou a recipientní buňkou. Pro sledování výměny genetické informace mezi dvěma genomy je třeba využít tzv. genetické markery. Mutant je organismus nesoucí příslušnou mutaci. Mutant se liší od své původní linie genotypem a v určitých případech i fenotypem (mutantní fenotyp). Kmen, který je izolován z přírodních zdrojů se označuje jako divoký kmen (wild type). Bakteriální genotyp se vždy označuje třemi malými písmeny a koncovým velkým (hisc), které charakterizují genový produkt (protein HisC). Mutantní genotyp se dále označuje číslicí (hisc1). Bakteriální fenotyp se označuje rovněž třemi písmeny (první velké) a - 17 -