Univerzita Hradec Králové Přírodovědecká fakulta Katedra biologie. Aflatoxiny, možný vliv na lidské i zvířecí zdraví.

Univerzita Hradec Králové Přírodovědecká fakulta Katedra biologie Aflatoxiny, možný vliv na lidské i zvířecí zdraví Bakalářská práce Autor: Studijní program: Studijní obor: Kateřina Kotalová N1501 Biologie Systematická biologie a ekologie Vedoucí práce: Odborný konzultant: PharmDr. Barbora Voxová doc. RNDr. František Malíř, Ph.D. Hradec Králové červenec 2015

Univerzita Hradec Králové Přírodovědecká fakulta Zadání bakalářské práce Autor: Studijní program: Studijní obor: Název práce: Název práce v AJ: Kateřina Kotalová N1501 Biologie Systematická biologie a ekologie Aflatoxiny, možný vliv na lidské i zvířecí zdraví Aflatoxins, possible effect on human and animal health Cíl a metody práce: Cílem práce je sepsat literární rešerši o aflatoxinech, jejich toxicitě a vlivu na zdraví lidí i zvířat včetně nemocí, které mohou způsobovat, informovat o prevenci a ochraně zdraví před těmito látkami, porovnat situaci výskytu aflatoxinů v České republice, sousedních zemích a ve světě. Garantující pracoviště: Vedoucí práce: Konzultant: Oponent: Katedra biologie Přírodovědecké fakulty UHK PharmDr. Barbora Voxová doc. RNDr. František Malíř, Ph.D. Ing. Vladimír Dvořák, Ph.D. Datum zadání práce: 20. 1. 2015 Datum odevzdání práce:

Prohlášení: Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně a že jsem v seznamu použité literatury uvedla všechny prameny, z kterých jsem vycházela. V Hradci Králové dne Jméno a příjmení

Poděkování Ráda bych touto cestou poděkovala PharmDr. Barboře Voxové za vedení mé bakalářské práce, cenné rady a odborný dohled. Děkuji také doc. RNDr. Františku Malířovi PhD. za trpělivost při výběru tématu bakalářské práce a odbornou konzultaci.

Anotace KOTALOVÁ, K. Aflatoxiny, možný vliv na lidské i zvířecí zdraví. Hradec Králové, 2015. Bakalářská práce na Přírodovědecké fakultě Univerzity Hradec Králové. Vedoucí bakalářské práce PharmDr. Barbora Voxová. Aflatoxiny jsou v přírodě běžně se vyskytující mykotoxiny, které jsou produkované toxigenními vláknitými houbami rodu Aspergillus. Jedná se o látky s velmi vysokou toxicitou. Cílem práce je zaměřit se především na aflatoxiny B1, B2, G1, G2, M1, M2, jejich výskyt a možný vliv na zdraví lidí a zvířat včetně onemocnění, která mohou způsobovat. Klíčová slova Aflatoxiny, mykotoxiny, zdraví lidí, zdraví zvířat, nemoci

Annotation KOTALOVÁ, K. Aflatoxins, possible effect on human and animal health. Hradec Králové, 2015. Bachelor thesis at Faculty of Science University of Hradec Králové. Thesis supervisor is PharmDr. Barbora Voxová. Aflatoxins are naturally commonly occurring mycotoxins, which are produced by toxigenic filamentous fungi of the genus Aspergillus. These are substances with a very high toxicity. The aim of this thesis is to focus mainly on aflatoxins B1, B2, G1, G2, M1, M2, their occurrence and possible impact on human and animal health, including diseases that can cause. Keywords Aflatoxins, mykotoxins, human health, animal health, illness

Obsah Úvod... 9 1 Aflatoxiny... 10 1.1 Charakteristika... 10 1.2 Výskyt... 11 1.3 Aflatoxiny v potravinách... 12 1.3.1 Faktory ovlivňující růst plísně... 13 1.4 Historie... 14 1.5 Chemická charakteristika... 15 2 Původci... 16 2.1 Aspergillus flavus... 16 2.2 Aspergillus parasiticus... 17 3 Dělení aflatoxinů... 19 3.1 Aflatoxin B1... 19 3.1.1 Chemická struktura... 20 3.2 Aflatoxin B2... 21 3.2.1 Chemická struktura... 21 3.3 Aflatoxin G1... 22 3.3.1 Chemická struktura... 22 3.4 Aflatoxin G2... 23 3.4.1 Chemická struktura... 23 3.5 Aflatoxin M1... 23 3.5.1 Chemická struktura... 24 3.6 Aflatoxin M2... 25 3.6.1 Chemická struktura... 25

4 Vliv aflatoxinů na zdraví lidí... 26 4.1 Typy onemocnění způsobené aflatoxiny... 29 5 Vliv aflatoxinů na zdraví zvířat... 31 5.1 Typy onemocnění způsobené aflatoxiny... 33 6 Ochrana zdraví, prevence... 34 7 Výskyt aflatoxinů v ČR a okolních zemích... 36 7.1 Hradec Králové... 40 7.2 Polsko... 41 7.3 Rakousko... 42 7.4 Německo... 43 8 Výskyt aflatoxinů ve světě... 44 Diskuze... 46 Závěr... 48 Seznam použité literatury... 49 Zkratky... 55 Seznam tabulek... 56 Seznam obrázků... 57

Úvod Aflatoxiny se vyskytují po celém světě a svými toxickými, mutagenními a karcinogenními účinky ohrožují nejenom zdraví lidí, ale i zvířat. Aflatoxinům a dalším mykotoxinům je věnována pozornost již od 60. let 20. století a od této doby jsou stále předmětem studií a výzkumu. Producentem těchto toxických látek jsou mikroskopické houby rodu Aspergillus a vyskytují se především v potravinách a krmivech. Vznikají při pěstování, skladování, uchovávání i transportu surovin z odlehlých oblastí, v podmínkách, které jsou ideální pro růst plísní a následnou produkci mykotoxinů. Při konzumování kontaminovaných potravin dochází k toxikózám a dalším vážným onemocněním, které mohou ve výjimečných případech, po požití vysoké koncentrace aflatoxinů, vést k závažným poškozením orgánů nebo až ke smrti jedince. Proto je důležitost tohoto tématu velmi vysoká. Cílem práce je vytvořit souhrn informací o aflatoxinech v podobě literární rešerše z dostupných odborných zdrojů, uvést, jaký mají aflatoxiny vliv na zdraví lidí i zvířat, včetně onemocnění, která způsobují, přiblížit a porovnat situaci o výskytu aflatoxinů v České republice, sousedních zemích a ve světě. Důležitým prvkem práce je kapitola ochrana zdraví a prevence, kde jsou sepsány procesy dekontaminace aflatoxinů, informace o výskytu aflatoxinů v potravinách a soupis potravin, kterých se případně vyvarovat, užitečné rady, jak se před těmito látkami chránit nebo nejlépe, zcela se jim vyhnout. Je důležité upozornit na škodlivost aflatoxinů a informovat o tom, jak zabezpečit před těmito toxiny zdraví své i svých domácích i hospodářských zvířat. 9

1 Aflatoxiny 1.1 Charakteristika Aflatoxiny jsou toxické látky, které se řadí mezi mykotoxiny, a jsou produkovány toxigenními vláknitými houbami rodu Aspergillus, zejména druhy Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus. Jedná se o v přírodě běžně se vyskytující toxiny nacházející se v potravinách a krmivech všude na Zemi. Aflatoxiny jsou patrně nejvíce známými a nejvíce vědecky prozkoumanými mykotoxiny na celém světě [25]. Dosud bylo popsáno přibližně 20 aflatoxinů, z nichž byly postupně identifikovány 4 přirozeně se vyskytující: aflatoxin B1 (dále též AFB1), AFB2, AFG1 a AFG2 [33]. Nejznámější aflatoxiny B1 a G1 byly objeveny již v roce 1963 [3] spolu s aflatoxiny B2 a G2. Takto nazvané jsou proto, že při chromatografii první z nich vytváří na tenké vrstvě skvrnu, která fluoreskuje modře (blue) a druhý zeleně (green) [33]. Číselný index znázorňuje pořadí v chromatografickém poli směrem od cíle ke startu. Pozornost bude také věnována aflatoxinům M1 a M2, metabolitům, které byly později nalezené v mléce dojnic krmených kontaminovanou potravou aflatoxinem B1 a B2 [49]. Jedná se o hydroxy deriváty AFB1 a AFB2. Název je odvozen od anglického Milk. V kontaminovaných produktech bývá nejvíce zastoupen aflatoxin B1. Po metabolické přeměně se v intoxikovaném organismu mohou objevit další druhy aflatoxinů (P1, Q1) [35]. Aflatoxiny a veškeré mykotoxiny jsou produkovány mikroskopickými (Micromycetes) nebo makroskopickými (Macromycetes) houbami. Mikromycety zasahují významným způsobem do života lidí tím, že mohou napadat živou tkáň a tím způsobovat mykózy, vyvolávat hyperaktivní imunitní odpověď organismu (alergie) na různé chemické látky, které produkují, nebo vyvolat onemocnění [33]. Běžně se nazývají plísně a jejich lehké spory se snadno šíří ovzduším, vodou nebo například prostřednictvím hmyzu[22]. Mykotoxiny makromycet vyvolávají po požití často i smrtelné otravy. Do těla se dostanou nejčastěji záměnou druhů hub při jejich sběru v přírodě. 10

Primárním zdrojem aflatoxinů jsou rostlinné produkty a různé výrobky z nich. Dalším zdrojem jsou produkty živočišné, např. maso, játra, mléko. V nich se nachází rezidua z krmiv [49]. 1.2 Výskyt V našich klimatických podmínkách není výskyt aflatoxinů tak častý [41], ale rok od roku může kolísat v závislosti na klimatických podmínkách, proto je důležité jejich výskyt pravidelně sledovat [23]. Růst toxigenních plísní a biosyntéza aflatoxinů závisí na vhodném substrátu, vlhkosti, ph, teplotě, přítomnosti kyslíku, obsahu stopových prvků [41], zejména Zn a Mn, [3]. Ideálními podmínkami, za kterých dochází ke kolonizaci plísně a jejího růstu, jsou vlhkost vyšší než 14% a teplota 25 C nebo vyšší [41]. Pokud plísně takové prostředí najdou, vytvoří porosty (myceliální kolonie tvořené hyfami jednotlivými vlákny), často viditelné pouhým okem. [22]. Vzhledem ke zmíněným ideálním podmínkám pro růst patogenních kmenů rodu Aspergillus je kontaminace aflatoxiny problémem především tropických a subtropických oblastí [49]. Z těchto oblastí k nám mohou být aflatoxiny dováženy v sóji, hrachu, prosu, ořechách [41], obilí, včetně kukuřice, kávových a kakaových bobech, olejninách, semenech, mandlích nebo krmných směsích pro zvířata. Většinou nejsou konzumovány jednotlivě, ale v potravě se vyskytují spolu s dalšími mykotoxiny, např. ochratoxiny, trichoteceny, námelovými alkaloidy, patuliny apod. [49]. Problematika aflatoxinů se týká ale i potravin a krmiv středoevropského původu [13]. V přírodě mykotoxiny plní nezastupitelnou roli destruentů. Nejčastěji se vyskytují v půdě a na organických zbytcích. 11

1.3 Aflatoxiny v potravinách Aflatoxiny a veškeré mykotoxiny se do potravy dostávají obvykle ze základních potravinářských surovin, které již toxické látky obsahují [11]. V takovém případě většinou nejsou k dispozici informace o pěstování, skladování ani transportu [20]. Druhou možností je tvorba toxigenních látek za příznivých podmínek přímo v potravinách [11], které se nacházejí v našich krajinných oblastech [20]. V zemědělských provozech se vytváří ideální podmínky pro přemnožení plísní v různých zapomenutých koutech skladišť nebo na různých místech uvnitř skladovacích sil, kde se díky střídání teploty sráží vlhkost. Vznik ideálních podmínek může nastat také při dlouhodobém skladování pytlovaných krmných směsí a granulátů [46]. Nejvíce jsou plísněmi napadány rostlinné produkty kyselého charakteru, jako jsou jahody, jablka, rajčata, jižní ovoce, obiloviny nebo olejniny [20]. Některé rostlinné produkty mají přirozený obranný systém, např. éterické oleje, rostlinná antibiotika (fytoncid), které je chrání v nezpracovaném stavu před napadením [11]. Ideální substrát pro výskyt plísní je sypký a vlhký. Kmeny Aspergillus se nevyskytují ani v plísňových sýrech, pokud k jejich výrobě nebylo použito již kontaminované mléko [46]. Potraviny po nákaze mění svou barvu, konzistenci a projevují se na nich další vnější změny, které můžeme pozorovat. Nicméně zde probíhají také změny vnitřní, které se nedají přímo zjistit a které závisí na intenzitě látkové výměny dané plísně. Při zpracování napadených surovin dochází ke snížení biologické hodnoty, ale také k hromadění produktů metabolismu, které se projevují organolepticky, tzn. hořkou a palčivou chutí. Bylo zjištěno, že bujný růst plísně není totožný se silnou tvorbou aflatoxinů, kdežto sotva znatelný plísňový povlak produkuje v potravinách jejich zvýšené množství, uvádí Hrdlička [11]. Přítomnost aflatoxinů byla prokázána v celé řadě potravin, avšak samotný výskyt kmenů Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus na potravinách nepodmiňuje tvorbu toxinů [11]. 12

Aflatoxiny se nevyskytují pouze v hyfách plísní, ale také v okolním substrátu. Během několika dní může toxin proniknout do celé potraviny (chléb, pečivo, těsto, marmeláda, sušené ovoce a další) [11] až do hloubky několika centimetrů ve vysokých koncentracích [8]. Při sledování výskytu aflatoxinů v poživatinách byla prokázána přítomnost aflatoxinů zejména v arašídech a výrobcích z nich. [44]. Objevují se ale i v obilovinách, olejninách, masných výrobcích, mléku [28] a veškerých surovinách, které podléhají ideálním podmínkám pro výskyt plísní. Zejména aflatoxiny B1 a M1 byly prokázány v syrovém i konzumním mléce, tvrdých sýrech a dětské výživě [2]. Jak uvádí Ostrý [32] největší produkce aflatoxinu B1 (AFB1) a aflatoxinu G1 (AFG1) byla zjištěna při sedmidenním uchování chleba v mikrotenovém sáčku při pokojové teplotě. Proto je důležité vyvarovat se plesnivým potravinám v domácnostech. Okrajování plísně také není vhodná volba pro její odstranění, protože její vlákna migrují a zasahují hluboko do potraviny a lidské oko není schopno tyto mikročástice plísně pozorovat. Mykotoxiny totiž mohou být distribuovány i do relativně zdravého pletiva [30]. 1.3.1 Faktory ovlivňující růst plísně Jsou-li všeobecně vhodné podmínky pro růst plísně, zvyšuje se obsah aflatoxinů v potravě již po 1 až 2 dnech. Produkce je mimo jiné ovlivňována také teplotou, u chlazených surovin je produkce aflatoxinů minimální. Pokud se zvyšuje teplota, dochází k výrazné produkci aflatoxinů během krátké doby, zvláště je-li přítomno mycelium. Na druhou stranu jsou aflatoxiny stabilní do 140 160 C. Nedoporučuje se používat např. plesnivou mouku při pečení chleba. Aflatoxiny se působením tepla nerozkládají a zůstaly by v upečeném chlebu. Dalším faktorem je hodnota ph. Aspergillus flavus roste od ph 2,5 po 8. Nejproduktivnější bývá v rozmezí ph 5-7. Přidá-li se k potravinářským surovinám sacharóza, je tvorba aflatoxinů výrazně snížena, spíše se nevyskytuje vůbec. Tvorbu aflatoxinů omezuje také chlorid sodný (kuchyňská 13

sůl), přesněji omezuje přechod aflatoxinů z hyf do substrátu. Koncentrace soli v rozmezí od 2 do 10 % sice nezamezuje růstu plísně, ale případně vzniklý aflatoxin není přítomen v takovém množství, jako bez přídavku soli. Nejdůležitějším faktorem pro růst plísní je vlhkost. Jak dále uvádí Hrdlička [11], nejspodnější hranice je 15 % vody, např. u obilí. Novější poznatky však uvádí Nedělník [30], který tvrdí, že pokud vlhkost klesne pod 12 %, životní cyklus plísní se zastaví. 1.4 Historie Akutní toxické účinky aflatoxinů jsou v současnosti pozorovatelné pouze ve výjimečných případech, ale přesto k těmto situacím dochází [25]. Aflatoxiny byly poprvé identifikovány začátkem 60. let 20. století v okolí Londýna ve Velké Británii ve spojitosti s epidemií, při které zahynuly statisíce krůtích mláďat. Otrava se projevila anorexií, letargií a ochablostí křídel. Jelikož se nejednalo ani o virové ani bakteriální agens, označilo se onemocnění jako intoxikace [33] a nejdříve neznámá choroba byla nazvána Turkey X Disease. Po roce se již podařilo zjistit příčinu tohoto onemocnění [6]. Bylo prokázáno, že v drcené podzemnici olejné, dovezené z Brazílie a konzumované těmito mláďaty, byla nalezena toxická substance identifikovaná jako metabolit plísně Aspergillus flavus [26], proto se toxin označil podle svého producenta Aspergillus flavus pomocí počátečních písmen - Aspergillus flavus toxins [19]. Jak uvádí Malíř a Ostrý [25], mezi známé otravy, způsobené aflatoxiny, patří otrava z roku 1988 v Malajsii, kdy během čínské slavnosti zemřelo 13 dětí, které požily nudle kontaminované aflatoxiny. K dalším otravám aflatoxiny došlo v Keni v roce 2004, kde zemřelo 125 lidí po konzumaci aflatoxiny kontaminované kukuřice. 14

1.5 Chemická charakteristika Chemicky jsou aflatoxiny definovány jako komplexní organické látky s odlišnou chemickou strukturou [27]. Jedná se o polycyklické, nesaturované a vysoce substituované kumariny nebílkovinné povahy [25] s difuranomarinovým skeletem. Mechanismus toxického účinku aflatoxinu B1 je poněkud komplikovaný, protože látka sama není toxická. Toxickou se stává až po metabolické aktivaci mikrozomálními cytochrom P450 dependentními oxidázami na aktivní metabolit AFB1-8,9-epoxid [33]. Tento epoxidový derivát je mnohem reaktivnější než původní aflatoxin a váže se na buněčné makromolekuly, bílkoviny, RNA a DNA [25]. 15

2 Původci Při produkci aflatoxinů se uplatňují především vláknité mikroskopické houby rodu Aspergillus [25]. Jedná se o vřeckovýtrusé houby [49]. 2.1 Aspergillus flavus Aspergillus flavus je vřeckovýtrusá houba z čeledi Trichocomaceae běžně se vyskytující v přírodě, např. v půdě jako saprofyt. Pro rod Aspergillus jsou typické konidiofory hustě pokryté fialidami [17]. A. flavus je významným původcem toxigenních metabolitů, z nichž nejznámější jsou právě aflatoxiny, dále sterigmatocystiny a cyklopiazonové kyseliny [14]. Jedná se o nejvýznamnější oportunní patogen člověka, tzn. původce nemoci, který využívá příležitosti a vyčkává na oslabení jedince, kterého napadne. Způsobuje kožní mykózy, orgánové infekce až po smrtící diseminované (roztroušené) infekce. Zárodky A. flavus byly nalezeny v ovzduší Nigérie, Texasu, Barcelony, dále v bytech Londýna, v centrálním Skotsku, v jeskynních Jihomoravského krasu a ve státech USA, jako jsou například Virginia, Maryland nebo Georgia. Ve vodě byl tento druh nalezen v Jaderském moři, v sedimentu některých japonských řek, v pitné vodě ve Zlíně nebo v plaveckých bazénech v Egyptě (ve všech z 50 testovaných). Dále se druh A. flavus vyskytuje v zemině, potravinách, krmivech atd. [14]. Nejhojněji se vyskytuje mezi 26 a 35 zeměpisné šířky [4]. 16

Obr. č. 1: Aspergillus flavus, (převzato z: http://www.mycology.adelaide.edu.au/fungal_descriptions/hyphomycetes_ (hyaline)/aspergillus/flavus.html) Tabulka č. 1: Systematické zařazení druhu Aspergillus flavus: Říše Oddělení Řád Čeleď Rod Druh Fungi Ascomycota Eurotiales Trichocomaceae Aspergillus Aspergillus flavus 2.2 Aspergillus parasiticus Aspergillus parasiticus je vřeckovýtrusá houba, velmi podobná druhu A. flavus zmiňovanému výše. Jedním z diferenciálně diagnostických znaků těchto dvou druhů je to, že Aspergillus parasiticus je kromě aflatoxinu B1 a B2 také producentem aflatoxinů G1 a G2. Kolonie A. parasiticus mají tmavší odstín zelené barvy než A. flavus, kratší konidiofory a ježovité konidie. A. parasiticus způsobuje mykotoxikózy stejně jako kmen A. flavus, taktéž producent aflatoxinů. Avšak zatím se nikdo nesnažil posoudit a odlišit, do jaké míry se v chronickém nebo akutním působení tohoto mykotoxinu u člověka podílí právě kmen Aspergillus parasiticus [15]. Podle [15] není ani potřeba toto odlišení zjišťovat. 17

Kolonie A. parasiticus se vyskytují v ovzduší, např. v Kuvajtu, Egyptě a Indii v ovzduší parků, ulic či jezer. Nejvyšší počet byl zaznamenán v červnu, potom postupně klesal do října, kdy bylo pozorování ukončené. Ve vodě byl tento druh nalezen v Egyptě v 1 vzorku z padesáti. Dále se vyskytuje v potravinách, zemině apod. [15]. Obr. č. 2: Aspergillus parasiticus (převzato z: http://www.icrisat.org/aflatoxin/aflatoxin.asp) Tabulka č. 2: Systematické zařazení druhu Aspergillus: Říše Oddělení Řád Čeleď Rod Druh Fungi Ascomycota Eurotiales Trichocomaceae Aspergillus Aspergillus parasiticus 18

3 Dělení aflatoxinů 3.1 Aflatoxin B1 Aflatoxin B1 je biologicky nejvýznamnější aflatoxin považovaný za jeden z nejsilnějších a nejvíce známých karcinogenů [25]. Je prokázáno, že aflatoxin B1 představuje zvýšené riziko ohrožení organismu (jak celkové, tak orgánové), a to buď příjmem kontaminovaných potravin, nebo při různých chorobných stavech, které narušují fyziologické detoxikační schopnosti [23]. Mezi toxické účinky AFB1 patří hepatotoxicita, imunotoxicita, mutagenita, karcinogenita, teratogenita. První příznaky u nakažených lidí jsou úbytek hmotnosti až anorexie, pocit neklidu, zvýšení teploty. Akutní toxicita aflatoxinem B1 může vyvolat akutní hepatitidu se zvracením, bolestí břicha až smrt. Akutní letální dávka pro dospělého údajně činí 10-20 mg AFB1 [25]. Jak uvádí Suchý a Herzig [41], v játrech a plicích uvnitř organismu dochází k biotransformaci aflatoxinu B1, která vede k tvorbě aktivních epoxidů. Tyto látky se váží na makromolekuly (proteiny, DNA) a tím způsobují buněčnou toxicitu a poškození DNA. Po intoxikaci dochází k poklesu vitamínu A v játrech a je narušen jaterní metabolismus lipidů (hyperlipémie). Podle Malíře a Ostrého [25] nese mnohem větší riziko chronická toxicita daným aflatoxinem, která vede k rozvoji rakoviny, potlačení imunity a dalším patologickým účinkům, např. u samic změny na vaječnících a pokles objemu ejakulátu a hmotnosti gonád u samců [41]. Aflatoxikózu může zesílit vitamínová deficience (např. pyridoxin), podvýživa, alkoholismus a infekční onemocnění. Dle epidemiologických studií je prokázáno až 600 000 úmrtí ve světě na rakovinu jater, především v Číně, jihovýchodní Asii a subsaharské Africe. Je odhadnuto, že riziko karcinomu se zvyšuje 10x vlivem AFB1, a infekční hepatitida, která ve vyjmenovaných oblastech často spolupůsobí s aflatoxinem B1 na lidstvo, zvyšuje rizikový faktor také 10x. Pokud tyto dva faktory spolu působí současně, riziko se zvyšuje až 100x [25]. 19

Aflatoxin B1 může být přijímán orálně, intraperitoneálně nebo intravenózně. Je rychle absorbován a dostává se do krve, odkud je rychle eliminován. Dále putuje do jater a odtud majoritní exkreční cestou do žlučového systému a minoritní exkreční cestou do ledvin, kde je vylučován. Z krve je odstraněno až 65% vstupní dávky aflatoxinu a do žlučového systému se vylučuje během 90 minut [25]. K aflatoxinu B1 jsou velice citlivá káčata, odolné jsou naopak myši. Při perorálním podání dochází u experimentálních zvířat k těžkým nekrózám jater [33]. 3.1.1 Chemická struktura Sumární vzorec: C17H12O6 Strukturní vzorec (převzato z www.fermentek.co.il/aflatoxin_b1.htm): Popis: nažloutlé krystaly Teplota tání: 268 C Barva fluorescence: modrá Zdroj: A. flavus, A. parasiticus, A. nominus 20

3.2 Aflatoxin B2 3.2.1 Chemická struktura Sumární vzorec: C17H14O6 Strukturní vzorec (převzato z www.fermentek.co.il/aflatoxin_b2.htm): Popis: bílé jehlice Teplota tání: 310 C Barva fluorescence: modrá Zdroj: A. flavus, A. parasiticus, A. nominus 21

3.3 Aflatoxin G1 3.3.1 Chemická struktura Sumární vzorec: C17H12O7 Strukturní vzorec (převzato z www.fermentek.co.il/aflatoxin_g2.htm): Popis: krystalické zelené jehlice Teplota tání: 258 C Barva fluorescence: zelená Zdroj: A. parasiticus, A. nominus 22

3.4 Aflatoxin G2 3.4.1 Chemická struktura Sumární vzorec: C17H14O7 Strukturní vzorec (převzato z www.fermentek.co.il/aflatoxin_g2.htm): Popis: bezbarvé jehlice Teplota tání: 237-240 C Zdroj: A. parasiticus, A. nominus [10] 3.5 Aflatoxin M1 Aflatoxin M1 je metabolit aflatoxinu B1. Byl nalezen v kravském mléce roku 1960, avšak jeho strukturní vzorec byl objasněn až o šest let později. Vzniká hydroxylací AFB1, konkrétně je 4-hydroxyderivátem AFB1 a ve srovnání s tímto toxinem je méně toxický a karcinogenní. Aflatoxin M1 se váže na proteinové složky mléka, do organismu se dostává konzumací kontaminovaných mléčných výrobků [29]. Pokud je odstraněna přítomnost aflatoxinu B1 z krmné dávky, vymizí v mléce hladina Aflatoxinu M1 [41]. 23

Ve studii Veselé et al. [48] bylo v roce 1980 po dobu necelých 3 měsíců analyzováno 67 vzorků konzumního mléka. Aflatoxin M1 byl nalezen v 9 vzorcích v množství 0,05 0,10 µg v litru mléka. Nalezené množství nepředstavuje vážné ohrožení pro zdraví člověka, ale kontaminované mléko by již nevyhovovalo jako surovina pro výrobu sušené mléčné kojenecké výživy. Jak uvádí Suchý a Herzig [41]: Současná maximální akceptovatelná množství AFM1 v mléce jsou 10 50 ng/kg. 3.5.1 Chemická struktura Sumární vzorec: C17H12O7 Strukturní vzorec (převzato z www.fermentek.co.il/aflatoxin_m1.htm, upraveno): Popis: bezbarvé pravoúhlé destičky, metabolit AFB1 Teplota tání: 299 C Barva fluorescence: modrá Zdroj: A. parasiticus, A. nominus 24

3.6 Aflatoxin M2 3.6.1 Chemická struktura Sumární vzorec: C17H14O7 Strukturní vzorec (převzato z www.fermentek.co.il/aflatoxin_m2.htm): Popis: Bezbarvé pravoúhlé destičky Teplota tání: 293 C Barva fluorescence: modrá Zdroj: A. parasiticus, A. nominus [10] 25

4 Vliv aflatoxinů na zdraví lidí Aflatoxiny jsou pro lidský organismus velmi nebezpečné. Vedle toxických účinků mají i účinky mutagenní, teratogenní, imunosupresivní a karcinogenní. Kvůli prokázané karcinogenitě a akutním toxickým účinkům u zvířat i u člověka jim je věnována větší pozornost, než ostatním mykotoxinům [25]. Mezi nejsilnější karcinogeny patří aflatoxiny B1, B2, G1 a G2 (dle Mezinárodní agentury IARC WHO se sídlem v Lyonu). Na možnost karcinogenního rizika aflatoxinů pro člověka upozornili v roce 1962 Le Breton a Fraysinet několikaletou epidemiologickou studií v Africe a Asii v oblastech s vysokou incidencí primárního karcinomu jater. Byla prokázána přímá závislost mezi tímto nádorem a stupněm kontaminace potravy [6]. Toxicita aflatoxinů klesá v pořadí: AFB1 AFG1 AFB2 AFG2 M1. Přitom odpověď organismu na aflatoxiny je závislá na živočišném druhu, pohlaví, věku, způsobu výživy a dalších faktorech, což zřejmě souvisí s rychlostí a způsobem biotransformace, přítomností hormonů a různými faktory prostředí, v němž organismus vyrůstá. Obecně platí, že citlivost vůči aflatoxinům se snižuje s věkem (u dětí je extrémní vnímavost do 1 roku) a samice bývají méně citlivé než samci [49]. Nejcitlivější bývají tedy samčí mláďata. Nicméně případy intoxikace aflatoxinem u dospělých jsou také známy. Z roku 1972 je znám případ 56letého muže, který zemřel na otravu aflatoxinem po požití velkého množství kontaminovaných ořechů. V Indii v roce 1975 byla popsána aflatoxikóza u 40 osob, z nichž třetina zemřela po požití kontaminované kukuřice. Dalším případem je 33letý muž, který pytloval zaplísněné obilí a onemocněl hepatocerebrálním syndromem. V jeho séru byl nalezen aflatoxin [7]. Akutní i chronická toxicita se projevuje především v játrech, kde dochází k tukovatění tkáně a k proliferacím žlučovodů, dále také ke krvácivým nekrózám a k mozkovým otokům [47]. V mnohých případech dochází k poškození ledvin, kde vznikají nekrózy v tubulech (glomeruly zůstávají nezměněny) a nadledvin (dochází k hemoragii a nekróze) [49]. 26

Jak uvádí Veres [47], aflatoxiny napadají také slezinu. To však nevzbudilo hlavní zájem o aflatoxiny. Velmi brzy byly usvědčeny jako jedny z nejsilnějších karcinogenů látek vyvolávající zhoubné bujení [42], které vedou k tvorbě rakovinných nádorů. Hlavní cestou absorpce aflatoxinu je určitě alimentární intoxikace [7] požití jedů v potravě [34]. Jak uvádí Dvořáčková [7], nelze vyloučit cestu intrauterinní (nitroděložní), kdy byl aflatoxin nalezen v orgánech dvou 3 dny starých novorozenců, jejichž matky pracovaly v JZD, kde je možnost styku s touto toxickou látkou velmi pravděpodobná, a také cestu inhalační, kde popisuje dva případy plicního karcinomu s pozitivním nálezem aflatoxinu ve vzorcích plic. V prvním případě šlo o pracovníka, který se delší dobu zabýval detoxikací kontaminovaného krmiva, v druhém případě šlo o zemědělského pracovníka. Další nákazy inhalační cestou byly podle Malíře et al. [23] zjištěny u mlynářů, pracovníků v mísírnách krmiv a u laboratorních pracovníků. Detekovatelné množství aflatoxinů může po požití zůstat v tkáních a tělesných tekutinách jen krátkou dobu, proto negativní důkaz výskytu nevylučuje dřívější aflatoxinovou intoxikaci [12]. Tabulka č. 3: Maximální limity pro výskyt aflatoxinů ve vybraných potravinách v Evropské unii [50]: Potraviny Maximální limity (µg/kg) Aflatoxiny B1 Suma B1, M1 B2, G1, G2 Jádra podzemnice olejné a ostatní olejnatá semena, lískové ořechy a para 8 15 - ořechy, jež mají být před použitím k lidské spotřebě nebo před použitím jako potravinová složka tříděna nebo jinak fyzikálně ošetřena. Mandle, pistácie a meruňková jádra, jež mají být před použitím k lidské 12 15 - spotřebě nebo před použitím jako 27

potravinová složka tříděna nebo jinak fyzikálně ošetřena. Skořápkové plody, sušené ovoce, kukuřice a rýže, jež mají být před 5 10 - použitím k lidské spotřebě nebo před použitím jako potravinová složka tříděny nebo jinak fyzikálně ošetřeny. Lískové ořechy a para ořechy určeny k přímé lidské spotřebě nebo k použití 5 10 - jako potravinová složka. Sušené ovoce a výrobky z něj zpracované, obiloviny a výrobky z nich 2 4 - vycházející určené k přímé lidské spotřebě nebo k použití jako potravinová složka. Syrové mléko, tepelně ošetřené mléko a mléko pro výrobu mléčných výrobků - - 0,050 Koření: pepř (plody, černý a bílý pepř), muškátový oříšek, zázvor, kurkuma, 5 10 - chilli, kayenský pepř, paprika Počáteční a pokračovací kojenecká výživa - - 0,025 Dietní potraviny pro zvláštní léčebné účely určené speciálně pro kojence 0,10-0,025 28

4.1 Typy onemocnění způsobené aflatoxiny Aflatoxiny mohou svými účinky u člověka způsobovat několik druhů nemocí. Zde jsou popsány nejzávažnější z nich: Aflatoxikóza - Nadměrný příjem aflatoxinů organismem má za následek otravy zvané aflatoxikóza. Při jednorázové aplikaci látek do těla dochází k akutní aflatoxikóze. Typické, ale nespecifické, projevy akutní aflatoxikózy jsou žloutenka, nízká teplota, deprese, anorexie a průjem. [4]. Dochází k částečnému poškození jater, v extrémním případě k selhání jejich funkce [35]. U zvířat se akutní toxicita projevuje buď úhynem bez jakýchkoliv příznaků, nebo s příznaky anorexie, deprese, anemie, krvácení a dyspnoe [41]. Akutní toxicita všech mykotoxinů je relativně nízká. Naopak bývá nebezpečná spíše v chronickém působení [33], kdy se do těla dostávají toxické látky opakovaně. Často je spojována s hepatocelulárním karcinomem [4]. Aflatoxikóza hrozí i nepřímo konzumováním plesnivých potravin, kdy se aflatoxiny dostávají do těla v mléčných a masných produktech takto krmených zvířat [37]. Je také prokázán transplacentární přenos aflatoxinu B1 z matky na dítě [25]. Reyův syndrom - neboli encefalopatie a tuková degenerace jater [10. ]Encefalopatie je odborné označení pro narušení mozkových funkcí důsledkem selhávání jater [34]. Toto onemocnění je velmi problematické. Bylo spojováno s aflatoxiny, protože byly tyto toxické látky nalezeny u všech pacientů s Reyovým syndromem v Thajsku, na Novém Zélandu, ve Spojených státech a bývalém Československu [4]. I když s největší pravděpodobností se nejedná o nemoc způsobenou samotnými aflatoxiny, ale společně se zde uplatňují další faktory, zejména virové infekce [7]. Jedná se o onemocnění dětského věku a probíhá ve dvou fázích. První se jeví jako virová respirační infekce, o několik hodin později přechází do druhé fáze spojené se zvracením. Morfologickým nálezem byla steatóza (ztučnění) orgánů a edém mozku [6]. Aflatoxiny (především B1) byly prokázány u dětí v Thajsku v roce 29

1971 jak v potravě, kterou děti před smrtí požily (kojenecká mléčná výživa, např. Sunar, Malcau a dětská krupička v bývalém Československu), tak v jejich orgánech [6]. Karcinom jater neboli hepatocelulární karcinom je nádorové onemocnění jater. V současnosti v různých státech Afriky a Asie [7] představuje primární karcinom jater 30-50 % všech zhoubných nádorů, oproti tomu je tento nádor relativně vzácný v Evropě a USA, i když jeho výskyt v posledních 25 letech vzrostl [6]. kvašiorkor (kwashiorkor) onemocnění způsobené těžkou poruchou výživy, zejména nedostatkem bílkovin v potravě. Nejčastěji se vyskytuje v rozvojových zemích, zvláště pak v Africe u malých dětí, nejčastěji do 5 let [21], které přijímají dostatečné množství potravy, ale hlavně sacharidů. Nedostatkem bílkovin v krvi dochází k edémům (otokům), děti mají zvětšená bříška a pohublé končetiny. Trpí průjmy a celkově špatným vývojem. Kvašiorkor byl zjištěn hlavně v Etiopii, ale i v dalších afrických zemích, kdy v tělních tekutinách dětí (krev a moč) bylo nalezeno toxikologicky významné množství aflatoxinů [19]. Tabulka č. 4: Výskyt kwashiorkoru podle věku [21]: Věk Počet nemocných % 2-6 měsíců 21 2 6-12 měsíců 174 15 1-2 roky 516 45 2-3 roky 271 24 3-4 roky 80 7 4-5 roky 53 5 5-9 roků 24 2 9-20 roků 2 0, 2 Z tabulky jednoznačně vyplývá, že největší procento výskytu tohoto onemocnění je mezi 1-2 rokem, tedy v batolecím věku [21]. 30

5 Vliv aflatoxinů na zdraví zvířat Aflatoxiny působí na zvířata, především hospodářská a homoiotermní [39] stejně jako na lidi, proto je důležité i jim věnovat pozornost. Aflatoxiny se do těla zvířat dostávají především kontaminovaným krmivem, které nebylo dobře konzervováno nebo skladováno, a zvláště pokud se nacházelo v teplém a vlhkém prostředí, ideálním pro růst plísní. V České republice je každý zodpovědný výrobce krmiv zaregistrován a schválen SÚJB (Státní ústav pro jadernou bezpečnost), konkrétně na oddělení pro kontrolu zákazu biologických zbraní. Toto oddělení vykonává dozor nad nakládáním s VRAT, což je zkratka pro vysoce rizikové biologické agens a toxiny, kam patří aflatoxin a trichothecenové toxiny. Tito výrobci si kontrolují obsah např. aflatoxinů v nakupovaných surovinách a k jejich stanovení používají laboratorní kity s tzv. pozitivním vzorkem [16]. V České republice se v krmivech podle druhu pohybují limity v rozmezí 5 50 µg/kg aflatoxinu B1. Aflatoxiny jsou primárně hepatotoxické (napadají játra). Ostatní mykotoxiny mohou napadat i jiné systémy u zvířat, a to i několik systémů najednou. V těle zvířat jsou aflatoxiny převedeny na jiný toxický metabolit, který se vylučuje do mléka. Těžké ekonomické ztráty v důsledku přítomnosti aflatoxinů se vyskytují např. u drůbeže, kdy dochází ke snížené produktivitě a nemocím [4]. Aflatoxiny napadají převážně hospodářská zvířata. Nejcitlivější bývají vůči těmto látkám drůbeží mláďata, hlavně krůťata a kachňata. Vnímaví mohou být i koně a prasata. Mezi tolerantnější zvířata vůči aflatoxinům patří přežvýkavci, nejodolnější bývají ovce [41]. Rozsáhlé experimenty prokázaly, že aflatoxiny jsou schopné snížit odolnost řady živočišných druhů proti bakteriálním, houbovitým a parazitárním infekcím [4]. 31

Vliv aflatoxinů na jednotlivá hospodářská zvířata [41] : Skot příznaky po požití kontaminovaného krmiva jsou omezený příjem potravy, snížená produkce mléka, zvýšený výskyt potratů a embryonální mortality, zánět dělohy nebo snížená imunita. Drůbež příznaky nakažení mykotoxiny jsou zhoršený růst, snížený příjem krmiva, atrofie vaječníků, snížená líhnivost a deformovaná vejce, ztučnění jater, snížený počet bílých krvinek a T-lymfocytů nebo nižší koncentrace fagocytů. Prasata po požití mykotoxinů se projevují příznaky jako nechutenství, poruchy reprodukce, průjmy či zvracení. Tabulka č. 5: Nejvyšší přípustný obsah AFB1 v krmivech dle vyhlášky 194/1996 Sb. (Vyhláška Ministerstva zemědělství, zákon o krmivech) [41]: Krmivo bavlníkové semeno, podzemnice olejná, kokosová moučka, kukuřičné zrno, palmové jádro a produkty jejich zpracování kompletní a doplňková krmiva pro skot, ovce, kozy s výjimkou telat, jehňat a dojnic kompletní krmiva pro prasata a drůbež s výjimkou mláďat doplňková krmiva pro prasata a drůbež s výjimkou mláďat doplňková krmiva pro dojnice v laktaci, kozy v laktaci a ovce v laktaci ostatní krmné suroviny ostatní kompletní a doplňková krmiva obsah aflatoxinů 20 µg/kg 50 µg/kg 20 µg/kg 30 µg/kg 5 µg/kg 50 µg/kg 10 µg/kg 32

5.1 Typy onemocnění způsobené aflatoxiny Aflatoxikóza - Otrava způsobená nadměrným příjmem aflatoxiny. Onemocnění aflatoxikóza a veškeré mykotoxikózy jsou důkladněji prostudované u zvířat, než u lidí. Prvním experimentálním zvířetem použitém v rané studii aflatoxikózy byl pstruh, u kterého se předpokládalo, že bude na aflatoxiny reagovat poměrně citlivě [4]. Onemocnění jater I u zvířat aflatoxiny napadají primárně játra [42]. Aflatoxiny jsou velmi silnými toxiny a mnoho zvířecích druhů, které jsou vystavené těmto mykotoxinům, ukazují znaky jaterního onemocnění v rozmezí od akutní po chronický stupeň. Ponoření rybího potěru nebo jiker do roztoku o koncentraci 0,5 miliontiny aflatoxinu B1 vedlo po 9 měsících z 30-40% k výskytu hepatocelulárního karcinomu [4]. Nádor jater byl v pokusech na krysách vyvolán stoprocentně při koncentraci aflatoxinu v krmivu 0,1 mg, při koncentraci 7x nižší se pak nádor vytvořil u 20% krys [42]. 33

6 Ochrana zdraví, prevence Vzhledem k velmi vysoké toxicitě a jiným výše zmíněným účinkům aflatoxinů je velmi důležité pravidelně kontrolovat potraviny i krmiva, sledovat původ, zacházení, skladování i transport potravin dovezených z oblastí, kde se aflatoxiny nejčastěji vyskytují vzhledem k ideálním podmínkám pro růst kmenů rodu Aspergillus, původcům těchto toxigenních látek. Samozřejmě nejlepší způsob ochrany zdraví lidí i zvířat by bylo úplné zabránění výskytu mykotoxinů v krmivech i surovinách. V praxi se nejedná o příliš lehký úkol. Veškeré technologie a postupy, které by vedly k bezpečnému, rychlému a snadnému odstranění aflatoxinů, jsou stále předmětem výzkumu [39]. Aflatoxiny jsou látky velmi termostabilní, tzn. pasterizace ani var v neutrálním prostředí je nerozloží. Rovněž pokus využít ultrafialového záření ke snížení toxicity krmiva z burských oříšků kontaminovaných aflatoxiny byl neúspěšný [18]. Při chemické dekontaminaci se spíše využívá reakcí založených na citlivosti aflatoxinů vůči oxidaci a nestabilnosti při nízkých i vysokých hodnotách ph. Metoda pro snížení obsahu aflatoxinů se nazývá amoniakalizace, kdy působí NH4OH za zvýšeného tlaku při teplotě 118 C. Určité výsledky také přináší adiční reakce s alkoholem v kyselém prostředí [49]. Nejspolehlivější a nejpraktičtější způsob, jak zabránit aflatoxinům a ostatním mykotoxinům, aby se dostaly do těla, jsou preventivní opatření. Preventivní opatření by podle Suchého a Herziga [41] měla zabránit infekci již při pěstování a sklizni krmiv a to střídáním plodin v osevních postupech, zpracováním půdy, protiplísňovým opatřením (použitím fungicidů), stejně jako zabránit výskytu plevele, škůdců a chorob. Je potřeba dbát na kvalitní ošetření a uskladnění krmiv po sklizni, protože ke kontaminaci dochází především tehdy, kdy není obilí dostatečně vysušeno nebo během skladování stoupne vlhkost. Zvláště u cereálií je potřeba do 48 hodin po sklizni snížit vlhkost pod 14%. Prevence zabraňuje také kontaminaci a růstu plísní při skladování a konzervaci krmiv. Důležitými kroky, jak ochránit krmiva před kontaminací, je zajistit méně než 14% vody v krmivu, uskladňovat suroviny v suchém prostředí (do 65% relativní vlhkosti), minimalizovat 34

přístup O2, pravidelně odstraňovat zbytky starých krmiv ze skladovacích prostor. V průběhu výroby, transportu a uskladnění krmiv je dobré zajistit takové podmínky, aby se zabránilo jejich kontaminaci sporami, růstu plísní a tím produkci mykotoxinů. Tato ochrana potravin je ale velmi obtížně uskutečnitelná. 35

7 Výskyt aflatoxinů v ČR a okolních zemích V České republice je dovoz surovin a potravin přísně kontrolován. Například z Brazílie jsou podle Evropské unie kontrolovány para ořechy ve skořápce nebo směsi ořechů či sušeného ovoce. Z Číny jsou kontrolovány hlavně arašídy a pražené arašídy o čisté hmotnosti převyšující 1 kg, dále pak podzemnice olejná. Z Íránu bývají dováženy a kontrolovány pistácie a pražené pistácie, z Turecka fíky, lískové ořechy, pistácie, směsi ořechů a sušeného ovoce, mouka, krupice a další. Určená místa dovozu musí splňovat určitá kritéria. Musí zde být přítomní vyškolení pracovníci k provádění předních kontrol zásilek potravin, dostupnost odborných pokynů pro odběr vzorků a jejich zasílání do laboratoře, možnost vykládky a odběru vzorků na zastřešeném místě, dostupnost skladovacích místností, úředních laboratoří pro analýzu aflatoxinů a další [50]. Vzhledem k tomu, že v České republice dříve nebyla k dispozici aktuální data o míře kvalitativní a kvantitativní kontaminace potravin vláknitými mikromycety a o výskytu toxigenních mikromycetů, které produkují aflatoxiny a ochratoxin A, byla v letech 1999 2001 připravena studie MYKOMON v rámci projektu Monitoringu zdravotního stavu obyvatelstva ČR ve vztahu k životnímu prostředí. Cílem studie bylo získat informace o aktuální míře kontaminace potravin uvedenými mikromycety v ČR. Výzkum byl zaměřen na potraviny, které byly v minulosti u nás i ve světě kontaminovány toxigenními mikromycety. Vzorky byly zakoupeny náhodně v tržní sítí ČR. Tím došlo k simulaci reálných situací při nákupu potravin spotřebitelem [31]. V každém roce bylo ve 4 termínech odebráno 25 druhů komodit na 12 odběrových místech v ČR. To představuje 300 jednotlivých kusů potravin [31]. 36

Tabulka č. 6: Přehled odebraných potravin v České republice [31]: Odběrový termín Potravina Počet odebraných vzorků 1. salám Vysočina, 7x12 = 84 salám Selský, salám polosuchý, salám Poličan, rozinky, těstoviny, rýže 2. sýr Eidam 1x12 = 12 3. paprika sladká, 3x12 = 36 kmín, pepř černý 4. čočka, 14x12 = 168 fazole, hrách, ořechy vlašské, arašídy, mouka polohrubá, mouka hladká, mouka hrubá, vločky ovesné, kroupy, krupice dětská, krupice dětská instantní, čaj ovocný, čaj černý Celkem 300 V roce 2001 byla prokázána přítomnost potenciálně toxinogenních mikromycetů Aspergillus flavus ve 13 vzorcích (18%) uvedených typů potravin. 37

Tabulka č. 7: Frekvence výskytu potenciálně toxinogenních kmenů Aspergillus flavus v potravinách v roce 2001 [31]: Potravina Počet vzorků % (pozitivní/celkem) čaj černý 4/12 33 čaj ovocný 1/12 8 kmín 1/12 8 mouka hladká 1/12 8 pepř černý 5/12 42 vločky ovesné 1/12 8 Celkem 13/72 18 Potenciálně toxinogenních kmenů Aspergillus flavus bylo 13 z celkových 72 vzorků. Z tohoto výsledku bylo všech 13 vzorků potravin zkoumáno a zjistilo se, které druhy jsou toxigenní a které ne. Jejich toxinogenita byla ověřena stanovením produkce aflatoxinů na testovací živné půdě (YES médiu) metodou HPTLC [31]. Jedná se o vysoce výkonnou tenkostěnnou chromatografii, která má mnoho výhod: je citlivější, a je možné zkoumat více vzorků najednou [1]. Tabulka č. 8: Frekvence výskytu toxinogenních kmenů u izolovaných kmenů Aspergillus flavus z potravin, na základě výsledků stanovení jejich toxicity v roce 2001 [31]. Potravina Počet kmenů Aspergillus flavus (toxinogenní/celkem čaj černý 3/4 75 čaj ovocný 1/1 100 kmín 1/1 100 mouka hladká 0/1 0 pepř černý 5/5 100 vločky ovesné 0/1 0 celkem 10/13 77 % 38

Výsledky Ze všech 25 druhů bylo vybráno 6, které prokazovaly potenciální výskyt toxigenních kmenů Aspergillus flavus. Celkem se jednalo o 13 vzorků. Z těchto zkoumaných kusů prokazovalo toxicitu 10 vzorků potravin. Vzhledem k tomu, že původně bylo odebráno 300 vzorků potravin, nejedná se o příliš vysoké číslo výskytu toxinogenních kmenů. Avšak z výsledků vyčteme, že v České republice se tyto mikromycety v potravinách nacházejí a tomu by se podle mého názoru mělo zabránit zcela. Další studie byly celosvětově zaměřeny na aflatoxin M1 v mléku a mléčných produktech. Byly stanoveny limity maximálního obsahu aflatoxinu M1 v mléku, kojenecké výživě a sýru. V Rakousku a Německu je maximální obsah aflatoxinu M1 0, 05 µg/l. Stejný limit je určen v Nizozemí, Itálii a Švýcarsku. Například ve Francii je tento limit posunut až na 0, 2 µg/l. V kojenecké výživě je maximální obsah aflatoxinu M1 rovněž pro Rakousko a Německo totožný, jedná se o 0, 01 µg/kg. V Itálii a Nizozemí je limit aflatoxinu M1 v kojenecké výživě 0, 05 µg/kg [9]. Dále byly odebrány vzorky mléka od farmářských zvířat v různých zemích. Výsledky jsou znázorněny v následující tabulce. Tabulka č. 9: v sousedních zemích České republiky [9]. Výskyt a množství aflatoxinu M1 v mléku zvířat Rok Země Typ mléka Počet vzorků Počet pozitivních vzorků Rozsah obsahu AFM1 (µg/l) 1980 Rakousko sušené 837 468 0,03 0,69 1981 Německo kravské 60 4 0,1 6,5 1982 Polsko kravské 22 11 0,01 0,25 39

7.1 Hradec Králové Podle studie docenta Malíře et al. [24], která probíhala během referencí a odborných činností IPH (Institute of public health) v Hradci Králové v letech 2000-2004, byl zkoumán mimo jiné výskyt aflatoxinů B1, B2, G1, G2 a M1 v syrových produktech a potravinách. Výsledky jsou znázorněny v tabulce č. 10 a 11. Tabulka č. 10: Výskyt aflatoxinů B1, B2, G1, G2 v syrových produktech a potravinách v Hradci Králové v roce 2000-2004 [24]: Potravina počet vzorků počet pozitivních vzorků % minimum (µg/kg) maximum (µg/kg) Arašídy 893 72 8,1 4,0 540,0 Pistácie 30 2 6,7 4,0 62,2 Mandle 26 0 - - - Cereálie 72 0 - - - Slad 148 3 4,2 0,4 0,8 Cereální kaše Pšeničná mouka Sušené mléko Dětská výživa 75 0 - - - 77 2 2,6 0,9 1,4 140 2 1,4 0,6 0,9 210 0 - - - 40

Tabulka č. 11: v roce 2000-2004 [24]: Výskyt aflatoxinu M1 v potravinách v Hradci Králové Potravina počet vzorků počet pozitivních vzorků % minimum (µg/kg) maximum (µg/kg) Mléko 118 1 0,9-0,5 Mléčná kaše 52 0 - - - 7.2 Polsko V Kujavsko-pomořském vojvodství v Polsku bylo cílem studie stanovit kontaminaci aflatoxiny B1, B2, G1, G2 v 84 vzorcích vybraných koření. Materiál pro tuto studii zahrnoval 43 vzorků koření pepře, chilli, muškátového oříšku, zázvoru a kurkumy, které byly shromážděny v roce 2011, a 41 vzorků shromážděných v roce 2012. Koření byla zakoupena v náhodně vybraných obchodech v Bydgoszczi [45]. Tabulka č. 12: Odebrané vzorky v Polsku [45]: Typ koření Počet vzorků Počet vzorků Země původu v roce 2011 v roce 2012 Pepř 5 6 Španělsko, Jižní Afrika sladká paprika 6 6 Španělsko, Jižní Afrika Černý pepř 6 6 Vietnam, Indonésie Bílý pepř 6 5 Vietnam, Indonésie Chilli 5 5 Španělsko, Indie, Čína 41

Muškátový oříšek 5 5 Indonésie, Grenada Zázvor 5 4 Čína, Nigérie Kurkuma 5 4 Indie Celkem 43 41 - Aflatoxiny byly nalezeny v 63,1% analyzovaných vzorků. Kontaminovaný byl převážně pepř, muškátový oříšek a kurkuma. Maximální limit pro obsah aflatoxinů B1, B2, G1 a G2 je 10 µg/kg. Limit byl překročen v jednom vzorku muškátového oříšku, kde byl obsah aflatoxinů 16, 91µg/kg, a v jednom vzorku pepře, kde byl zjištěn obsah aflatoxinů 12, 1 µg/kg. Nejnižší míra kontaminace byla zjištěna u černého pepře. Při další studii bylo zkoumáno 366 vzorků arašídů dovezených do Polska z Brazílie a Indie v letech 1984-1986, které měly být použity do krmiv pro zvířata. V arašídech byly analyzovány aflatoxiny B1 a B2. Průměrná míra kontaminace byla pro aflatoxin B1 71 µg/kg a pro aflatoxin B2 16µg/kg [40]. 7.3 Rakousko V rakouském hlavním městě, Vídni, bylo analyzováno 81 vzorků rýže pro možný obsah aflatoxinů. Ty byly odebrány na různých trzích ve Vídni a obsahovaly rýži basmati, celozrnnou rýži, dlouhozrnnou rýži, krátkou rýži nebo například burizony. Z výsledků vyplynulo, že ze všech vzorků jich bylo aflatoxiny kontaminováno 24. Podle výsledků byl rozsah kontaminace uveden mezi hodnotami 0,45 µg/kg a 9,86 µg/kg u aflatoxinu B1 a 1,5 µg/kg u aflatoxinu B2, který byl zjištěn pouze v jednom vzorku. Aflatoxiny G1 a G2 nebyly ve vzorcích detekovány. Tři vzorky překročily maximální limity obsahu aflatoxinu stanovené Evropskou unií [38]. 42

7.4 Německo V Německu byly analyzovány výrobky ze sóji pro mykotoxiny. Dohromady bylo odebráno 50 vzorků sójových jídel, z toho bylo 25 vzorků vysoce proteinové sójové mouky a 1 vzorek ze sójových slupek získaných z potravinářského průmyslu v Německu. Aflatoxin B1 byl zjištěn u 32 vzorků, ale maximální koncentrace byla pouze 0,41 µg/kg. Ze vzorků bylo dále zkoumáno množství dalších mykotoxinů, především ochratoxinu A, zearalenonu a deoxynivalenolu [46]. 43

8 Výskyt aflatoxinů ve světě Ve světě se aflatoxiny vyskytují převážně v tropických a subtropických oblastech, protože zde jsou ideální podmínky pro růst plísní a produkci toxigenních látek. Zde dochází k přemnožení kmene Aspergillus během sklizně nebo před ní a při skladování obilovin, olejnin, nebo například bobů. Pro rozvoj plísní je příznivý také dlouhodobý transport surovin, např. v lodních prostorách [47]. Dle tvrzení FAO (Organizace pro výživu a zemědělství) je 25% celosvětové sklizně zemědělských plodin napadeno mykotoxiny [16]. To má vliv na zdraví lidí i zvířat. V USA se testováním na přítomnost aflatoxinů v potravinách a krmivech zabývá FDA (Úřad pro kontrolu potravin a léčiv). Každoročně kontroluje okolo 300 vzorků dovážených potravin a 200 vzorků dovážených krmiv. Tímto úřadem byly zveřejněny výsledky vzorků pozitivních na aflatoxiny v období let 1987-1997. Kontaminovanými potravinami byly například mandle, para ořechy, kukuřičná mouka, fíky, arašídy a mnoho dalších. Z krmiv byla zastoupená kukuřice a bavlníková mouka [4]. Zajímavým bylo ve Spojených státech amerických zjištění, že konzumace AFB1 v kukuřici a potravinách na arašídovém základě byla z hlediska rakoviny jater významnější oproti příjmu AFM1 v mléce a mléčných výrobcích [23]. Tabulka č. 13: Výskyt významných aflatoxigenních druhů rodu Aspergillus sekce Flavi v potravinách v zahraničí [31]: Druh Aspergillus flavus Potravina kukuřice, čirok, rýže, oves, pšenice (pšeničná zrna, pšeničná mouka), obiloviny a výrobky z obilovin, chléb, těstoviny, otruby, ječmen boby, sója mungo, sójové boby, hrách, čerstvé ovoce, citrusy, rajčata, liči, ananas, granátová jablka 44

ořechy, ořechy kemiri, arašídy, pistácie, pekanové ořechy, lískové ořechy, vlašské ořechy, kokosové ořechy, betelové ořechy pepř, černý pepř, koriandr zpracovaná masa, uzená masa, šunky, slanina, šunky ze Španělska, africké rybí výrobky, sušené, uzené nebo solené ryby z jichovýchodní Asie Aspergillus parasiticus mléko, sýr sójové boby arašídy, lískové ořechy, vlašské ořechy, pistácie, pekanové ořechy Aspergillus tamarii zpracovaná masa pšenice, ječmen, čirok, kukuřice, rýže sójové boby, zelené kávové boby, černé fazole, sója mungo, kopra arašídy, pistácie, pekanové ořechy, lískové ořechy, vlašské ořechy, betelové ořechy, kopra, kakao, palmové jádro, kešu, ořechy kemiri koření, pepř masné výrobky, solené sušené ryby, uzené sušené ryby 45

Diskuze Výskyt aflatoxinů je celosvětovým problémem, který je od samého počátku jejich objevení předmětem výzkumu. Sice je jejich výskyt omezen hlavně na teplé oblasti, ale do České republiky a ostatních zemí se většina surovin (i kontaminovaných) neustále dováží. Hlavním problémem je výživa hospodářských zvířat, u kterých aflatoxiny způsobují řadu onemocnění a mají ekonomický dopad na jejich reprodukci. Konzumací živočišných výrobků se případná kontaminace krmiv dostává až do organismu lidí. Aflatoxiny jsou staré jako lidstvo samo, jenom se o nich dříve nevědělo. Od té doby, co byly aflatoxiny objeveny a popsány, se neustále zkoumají a zároveň se zdokonalují metody, jak jejich výskyt a produkci minimalizovat, případě úplně odstranit, ale vzhledem k jejich vysoké odolnosti je tento problém stále nevyřešený. Za rizikové potraviny můžeme považovat všechny v minulosti kontaminované. Patří sem téměř všechny obilniny, olejniny, luskoviny a produkty z nich vyrobené [41]. Z výše uvedených tabulek můžeme vyčíst, že maximální limity u potravin jsou nižší než maximální limity u krmiv. U potravin jsou tolerantnější limity například u mandlí a pistácií, kde je maximální limit aflatoxinů 15 µg/kg. Naopak nejnižší maximální hodnoty výskytu aflatoxinu B1 jsou u kojenecké výživy a dietních potravin, kde je maximální povolené množství aflatoxinu M1 0,025 µg / kg. Aflatoxiny napadají často stejné nebo podobné druhy potravin a surovin. To je na jednu stranu pro lidi výhodné, protože vědí, kterým potravinám se případně vyvarovat a ochránit tak své zdraví. Na druhou stranu není tato prevence stoprocentně spolehlivá. Jak je již v textu zmíněno, aflatoxiny se mohou do organismu dostat také jinými cestami, než jen požitím kontaminovaných potravin. K porovnání kontaminace potravin aflatoxiny v České republice a Polsku je dobré uvést příklad černého pepře, kdy v České republice bylo odebráno 5 vzorků v roce 2001 a všechny vzorky prokázaly přítomnost toxinogenních kmenů Aspergillus flavus. V Polsku byl naopak prokázán nejmenší výskyt aflatoxinů ve vzorcích černého pepře, v porovnání s ostatními 46