Neurální lišta: její deriváty a kmenové buňky W. His (1868) Miloš Grim Anatomický ústav 1. LF UK let. semestr 2019
Struktura přednášky: 1) Proč studovat neuralní lištu (NL) 2) Metody značení buněk NL 3) Vznik a vývoj NL (indukce, epithelomesenchymová transformace, migrace, diferenciace buněk NL 4) Typy buněk, které se z NL diferencují 5) Vývojové vady podmíněné defekty NL 6) Příklady výskytu buněk NL 7) Buňky NL v epidermis
Wilhelm His Sr. c. 1900 Born 9 July 1831 Besel Died 1 May 1904 (aged 72) Leipzig
Indukce neurální ploténky a epithelomesenchymová transformace buněk neurální lišty Folistatin, Nogin, Chordin B.M. Carlson (1999) Indukci neuroektodermu chordomesodermovým materiálem popsali v r. 1924 Hans Spemann a Hilde Mangold ISH mrna Slug HH 10
e. Douarin, N.M. and Dupin, E. (1993). Cell lineage analysis in neural crest ontogeny. J. Neurobiol. 24, 146 161. Le Douarin, N.M. and Jotereau, F.W. (1975). Nicole Le Douarin, Chaya Kalcheim, Cambridge University Press - 1999 - Science Le Douarin, N.M. and Dupin, E. (1993). Cell lineage analysis in neural crest ontogeny. J. Neurobiol. 24, 146 161. Le Douarin, N.M. and Jotereau, F.W. (1975). Značení buněk NL u ptáků Details of the interphase nucleus in Japanese quail (Coturnix coturnix japonica)]. Le Douarin N. Bull Biol Fr Belg. 1969;103(3):435-52.
Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos C. S. Le Lièvre, N. M. Le Douarin Development 1975 34: 125-154;
buněčná jádra bílé leghornky x buněčné jádro japonské křepelky v jádře křepelky je velká hrudka heterochromatinu asociována s jadérkém embryonální chimérá kuřete a křepelky
Migrace buněk hlavové neurální lišty z prosencephala a mesencephala do okolí oka a čichové plakody, z rhombencephala do žaberních oblouků po obvodu faryngu R1, 3 a 5 - převážně apoptóza R2 1. žaberní oblouk R4 2. žaberní oblouk, R6 3. žab. oblouk R7 4. žab. oblouk srdeční neurální lišta ze 4. 7. rhombomery do výtokového traktu srdce ED4 kuře N. LeDouarin (1999) identita buněk neurální lišty v rhombomerách je podmíněna expresí Hox genů
Proč se věnovat studiu neurální lišty (NL) vznik NL umožnil vývoj a rozšíření obratlovců oproti strunatcům, u kterých není vytvořena, např. shift from filter feeding to active predation. rozvoj telencepala, senzitivity NL je významný embryonální orgán, který přispívá téměř ke všem orgánům těla jako 4. zárodečný list, Buňky NL slouží jako model pro studium embryonální indukce, determinace a diferenciace buněk, jejich epithelo- mesenchymové transformace a migrace, NL je model pro studium buněčné invasivity především vzniku metastás z karcinomů, klinický význam NL - její defektní vývoj podmiňuje řadu rozených vad
Molekulární mechanizmy migrace buněk NL Migraci ovlivňují tři kategorie molekul: a) permisivní contact-guidance b) chemorepelentní molekuly c) parakrinní signální systémy migrace
Molekulární mechanizmy migrace buněk NL Permisivní contact-guidance + chemorepelentní molekuly fibronektin Parakrinní signální systémy migrace: tenascin HNK-1 Scatter factor /c-met receptor, Pax3 Steel factor (stem cell factor) /c-kit receptor Chemokin SDF-1 / CXCR4 receptor
Migrace buněk NL in vivo a in vitro in vivo in vitro
Neurální lišta: diferenciace buněk neurální lišty Diferenciaci ovlivňují dvě kategorie molekul: a) signální molekuly (cytokiny, růstové faktory, hormony) b) transkripční (diferenciační) faktory
Diferenciace buněk NL a jejich regionální identita Signální molekuly na trasách migrace buněk NL indukují expresi transkripčních faktorů a jim podřízených genů: nediferencované multipotentní buňky jsou postupně transformovány v sady bipotentních a unipotentních buněk s lokálně specifickou identitou
EPIGENETICKÁ KRAJINA Epigenetic landscape was originally a metaphor for biological development. Its originator, Conrad Hal Waddington (1905-1975), said that cell fates were established in development much like a marble rolls down to the point of lowest local elevation.
Signální molekuly působí mezi buňkami a indukují expresi transkripčních faktorů a jim podřízených genů. Vážou se na specifické receptory v cytoplasmatické membráně. Receptory mají nitrobuněčnou složku zajišťující přenos signálu do jádra, které odpovídá změnou genové exprese Transkripční faktory jsou proteiny, které působí v jádře jako regulátory genové exprese. Jejich společnou vlastností je schopnost vazby na specifické sekvence DNA - promotory a enhancery V embryu určuje lokální signalizace jaké typy buněk se budou diferencovat na kterém místě a ve kterém čase In vitro lze embryonální signalizaci nahradit složením media - přidáním růstových faktorů a signálních molekul lze cíleně navodit proliferaci a určitou diferenciaci buněk
Neurální lišta: její deriváty a kmenové buňky
Typy buněk, které se diferencují z NL (na hlavě také ektomesenchym) Ectomesenchym: osteoblasty, fibroblasty, chondroblasty, hladké svalové buňky, tukové buňky, odontoblasty
Buňky z hlavové neurální lišty část sensit. ganglií V., VII., IX., X. parasymp. ganglia a jejich satelitní buňky Schwannovy buňky, glomus caroticum parafolikulární C buňky (kalcitonin), melanocyty, ectomesenchym skelet, chrupavky a vazivo v obličejové části hlavy, odontoblasty, hlavový leptomeninx, část střední a zevní vrstvy oční koule, m. ciliaris, vazivové stroma thymu, štítné žlázy, příštítných tělísek, slinných žláz a slzné žlázy, stěna cév žaberních oblouků (bez endotelu), hladké svalové buňky, tukové buňky srdeční neurální lišta výtokový trakt srdce, velké cévy z oblouku aorty
Podíl NL na vzniku periferního nervového systému HNK-1
Jacob HJ, Christ B, Grim M. Prog Clin Biol Res. 1982;110 Pt B:333-41 Problems of muscle pattern formation and of neuromuscular relations in avian limb development. Grim M, Christ B. Neural crest cell migration into the limb bud of avian embryos. Prog Clin Biol Res. 1993;383A:391-402. von Kirschhofer K, Grim M, Christ B, Wachtler F. Emergence of myogenic and endothelial cell lineages in avian embryos. Dev Biol. 1994 May;163(1):270-8. Szeder, V., Grim, M., Halata, Z., Sieber-Blum, M.: Neural crest origin of mammalian Merkel cells. Develop. Biol.253: 258-263, 2003.
Znázornění buněk neurální lišty v embryonálních chimérách bílé leghornky a japonské křepelky QCPN
ED 3 ED 17
Q/C ED 17
Buňky neurální lišty v končetině Do základu končetiny migrují: buňky neurální lišty angiogenní buňky myogenní buňky
Vývojové vady z defektů neurální lišty CHARGE syndrom (Coloboma iridis, Heart defects, Atresia choanae, Retardation of development, Genital hypoplasia in males, Ear anomalies) DiGeorgeův syndrom (hypofunkce příštítných žláz a štítné žlázy, hypoplasie thymu, defekty septace aorty a truncus pulmonalis anomálie zubů albinismus Waardenburgův syndrom (Pax3 mutace defekty pigmentace, defekty konč. svalů, rozštěp patra, kardiovaskulární defekty, hypertelorismus) Hirschsprungova choroba Piebaldism
Pax3 mutace u myši (splotch mutace) ED 13.5 Sp 1H /+ Sp 1H / Sp 1H
Piebaldism (defekty pigmentace, sterilita, anemie) mutace KIT genu a podobná mutace Kit genu u myši
Merkelův karcinom
Merkelův karcinom je vzácný vysoce agresivní neuroendokrinní kožní nádor, který bývá také označován jako neuroendokrinní karcinom nebo malobuněčný kožní karcinom. Má 4x vyšší úmrtnost než melanom a jeho výskyt stoupá, nyní připadá 5 6 případů na 1 milion obyvatel. V roce 2008 byl ve tkáních Merkelova karcinomu objeven do té doby neznámý polyomavirus a označen jako polyomavirus karcinomu Merkelových buněk. Je považován za hlavní etiologické agens tohoto nádoru. Tento onkogenní virus byl zjištěn u 80% těchto nádorů, ale vyskytuje se i u naprosto zdravých jedinců.buňky MCC exprimují cytokeratiny 8, 18,19 a 20 a neuroendokrinní markery.
Tilling, Moll J. Skin Cancer, 2012 Scheme of potential cells of origin of Merkel cell carcinoma (MCC) from an ontogenetic perspective. Arrows: hypothetic lineage relationships..
Značení buněk neurální lišty u savců pomocí reportérového genu lacz (E. coli) transgenní myš Wnt1/lacZ trvalá exprese reportérového genu lacz s využitím cre-lox systému: transgenní myš Wnt1-cre/R26R průkaz exprese reporterového genu lacz indigogenní metoda (Xgal) při ph 7.5 imunohistochemicky (Bgal) (rabbit anti-e. coli -galaktosidase; Chemicon)
Průkaz buněk neurální lišty sledováním exprese genu Wnt1 pomocí reporterového genu lacz Wnt1-lacZ ED 9.5 Xgal Bgal
Cre-lox systém (B.Sauer, 1987): trvalá exprese reportérového genu v buňkách neurální lišty myš Wnt1-cre / + myš R26R / + Cre-rekombináza loxp loxp Wnt1 promotor (specifický pro neurální lištu) R26R STOP promotor (ubikvitérní) -gal loxp loxp Wnt1-cre / R26R myš -gal R26R promotor STOP -gal Cre-rekombináza rozpozná loxp a vystřihne označený STOP -galaktozidáza je exprimována konstitutivně
ED13, X gal ED13, B gal
Jiang et al., Dev Biol 241:106, 2002
Vývoj zubu u myši (Wnt1-cre/R26R) (Chai et al. Development 127:1671, 2000) Z NL pochází mesenchym dentální papily: odontoblasty, vazivo pulpy, cementoblasty, periodontium Xgal Bgal
Srdeční neurální lišta oblast 4. 8. rhombomery z NL pochází výtokový trakt srdce a velké cévy z oblouku aorty Wnt1-cre/R26R transgenní myš, Xgal, 7. 9. týden Jiang et al.: Development 127:1607, 2000
Fate Maps of Neural Crest and Mesoderm in the Mammalian Eye P. J. Gage, W. Rhoades, S. K. Prucka and T. Hjalt, Invest Ophthalm & Vis Sci. 46:4200 8, 2005
Buňky neurální lišty v epidermis (myš, člověk) (melanocyty, Merkelovy buňky) (Grim M, Halata Z: Developmental origin of avian Merkel cells Anat Embryol 202: 401-410, 2000)
Merkelova buňka je receptivní jednotkou mechanického podnětu, kontakt s axonem je místem synaptického přenosu Halata Z, Grim M, Bauman K: Anat Rec 271A: 225, 2003
F. S. Merkel: Tastzellen v kůži savců a ptáků (1875)
Merkelova buňka: velká, světlá buňka, která spolu s nervovým zakončením tvoří pomalu se adaptující mechanoreceptor v kůži a ektodermové sliznici obratlovců Merkelovy buňky u člověka představují 3.6-5.7% buněk bazální vrstvy epidermis (Fradette et al., 2003)
The follicle of sinus hair (whisker) contains the largest known accumulation of Merkel cells
sea-lion
Folikuly hmatových (sinusových) chlupů - whiskers
The follicle of sinus hair (whisker) contains the largest known accumulation of Merkel cells CK8/H
The follicle of sinus hair (whisker) blood sinus, innervation, bulge
Merkelovy buňky ve vlasovém folikulu a v kůži cel pro jejich původ z NL svědčí: Bgal K8 U dvojítě transgenní myši Wnt1-cre/R26R exprimuijí beta-galactosidasu (marker NL) a v kolokalisaci exprimují Keratin 8 (marker Merkelových buněk) Xgal / K8 Bgal/K8 Szeder V, Grim M, Halata Z, Sieber-Blum M: Dev Biol 253: 258, 2003
NCCs in hair follicles from the back skin Wnt1-cre/ R26R Xgal / CK8 Xgal / nucl. red c-kit Xgal
Kmenové buňky neurální lišty ve vlasových folikulech myši
Dissection of the bulge from adult whisker follicle Xgal + NCCs emigrated 4 days after explantation
Bulge explant-derived NCCs are pluripotent (2 weeks in culture) Smooth muscle cells Neurons Schwann cells SCIP Ab; anti-s-100 Xgal anti-sma anti-ß-iii tubulin DAPI Melanocyte progenitors Xgal MelEM Xgal
Bulge-derived NCCs undergo self-renewal (determined by serial cloning) Primary clone 6 h 18 h 48 h 72 h 5-day-old secondary clone ß-III tubulin Xgal anti-sma Xgal cells from 2-weeks secondary clones
Morphology of EPI-NCSC implants in the lesioned spinal cord Nestin GAD67 RIP
Sieber-Blum M, Schnell L, Grim M, Yao Fei Hu, Schneider R, Schwab ME: Characterization of Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Grafts in the Lesioned Spinal Cord. Molecular and Cellular Neuroscience (accepted February 2006) EPI-NCSC získané z vlasových folikulů byly transplantovány do mechanicky poškozené míchy u dospělé myši a jejich osud byl sledován 3. týden 6. měsíc po transplantaci. Bylo zjištěno, že jsou integrovány, přežívají, neproliferují, netvoří tumor a diferencují se v GABAergní neurony a oligodendrocyty (exprimují neuron-specifický beta III-tubulin, marker GABAergních neuronů glutamate decarboxylase-67, marker oligodendrocytů RIP a basický myelinový protein. Mohou se tedy uplatnit při náhradě lokálních neuronů a při remyelinizaci.
Kmenové buňky neurální lišty ve vlasových folikulech u člověka
Růstový cyklus vlasu. Růstová fáze, anagen (2-6 let), začíná regenerací dolního segmentu folikulu. Tvoří se nová cibulka, dermální papila se zvětšuje, buňky v cibulce tvoří kořenové pochvy a v nich nový vlas. Involuce folikulu, katagen (1-2 týdny), je krátká fáze zástavy růstu vlasu. Nové fázi růstu předchází poměrně dlouhé klidové období, telogen (2-6 týdnů), dokud není folikul aktivován k novému růstovému cyklu.
Coexpression of Sox10 and Nestin, Expression of Nanog Sox10 + Nestin Nanog + DAPI hepi-ncscs in tissue culture after emigration from back skin follicles
Differentiation of human epidermal neural crest stem cells fom hair follicles into neural crest progeny Folia Biol. (Praha) 56, 149-157, 2010 Schwann cells Neurons GFAP Beta III tubulin Smooth muscle cells Smooth muscle actin Schwann cells S100
Folia Biologica (Praha) 56, 149-157 (2010)
RT-PCR analysis of expression of some neural crest related genes in hepi-ncscs BMP4 snail slug sox9 twist nanog nestin TYRP1 MITF1 biiitub desmin MAP2 calponin CK20 18s rrna BMP4, snail, slug, sox9, twist neural crest related genes nestin, nanog markers of stemness TYRP1, MITF1 melanocyte markers desmin, calponin smooth muscle cell markers beta III tubulin, MAP2 neuronal markers CK20 marker of Merkel cell 18S 18S r RNA
Poděkování spoluautorům publikací: M. Sieber-Blum, E. Krejčí, V. Szeder, Z. Halata, Yao Fei Hu za poskytnutí transgenních myší: A. P. McMahon, P.S. Danelian,P. Soriano, H. Sucov,, B. Fritzsch za poskytnutí protilátky α-math1 Ab J.E. Johnson za technickou pomoc: A. Kvasilová, E. Kluzáková, M. Pleschnerová, J. Ward za finanční podporu: MŠMT ČR - Výzkumný záměr 1111 00003-3, 0021620806 Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad LN-00A065, 1M 0021620803 (MG), R01 NS38500 (MSB), F05 NS11111 (VS)
Halata Z, Grim M, Christ B: Origin of spinal cord meninges, sheaths of peripheral nerves, and cutaneous receptors including Merkel cells. An experimental and ultrastructural study with avian chimeras. Anat Embryol 182: 529 537, 1990 Grim M, Halata Z, Franz T: Schwann cells are not required for guidance of motor nerves in the hindlimb in Splotch mutant mouse embryos. Anat Embryol 186: 311 318, 1992 Grim M, Christ B: Neural crest cell migration into the limb bud of avian embryos. In: Limb development and regeneration. JF Fallon, PF Goetinck, RO Kelley, DL Stocum (eds). J. Wiley- Liss, Inc. 1993, pp. 391-402 Grim M, Halata Z: Developmental origin of Merkel cells in birds. In: Merkel Cells, Merkel Cell Carcinoma and Neurobiology of the Skin. eds.: H Suzuki, T Ono, pp. 23-32 Excerpta Medica Internat. Congress Series 1187, Elsevier, 2000 Grim M, Halata Z: Developmental origin of avian Merkel cells Anat Embryol 202: 401-410, 2000 Grim M, Riedlbauchová L, Valášek P: Interaction of head mesoderm and cells of neural crest in the chick. In: Origin and Fate of Somites. Eds.:E.J.Sanders, J.W.Lash, C.P. Ordahl, IOS Press, 2001, NATO Sci. Ser. I. Vol. 329, pp. 48-55 Szeder V, Grim M, Halata Z, Sieber-Blum M: Neural Crest Origin of Mammalian Merkel Cells. Dev Biol 253: 258 263, 2003 Halata Z, Grim M, Baumann KI: Merkelova buňka: morfologie, vývojový původ, funkce. Čas Lék čes 142: 4 10, 2003 Halata Z, Grim M, Baumann KI: Friedrich Sigmund Merkel and his Merkel Cell, morphology, development and physiology review and new results. Anat Rec 271A: 225-239, 2003 Grim M, Halata Z, Szeder V and M Sieber-Blum: Merkel Cells are Postmitotic Cells of Neural Crest Origin. In: The Merkel Cell, eds. Baumann KI, Halata Z, Moll I, Springer, 2003 pp. 89 96 Sieber-Blum M and Grim M: The adult hair follicle cradle for pluripotent neural crest stem cells. Embryo Today 72: 162-172, 2004 Sieber-Blum M, Grim M, Hu YF, Szeder V: Pluripotent Neural Crest Stem Cells in the Adult Hair Follicle. Dev Dyn 231: 258 269, 2004 Sieber-Blum M, Schnell L, Grim M, Yao Fei Hu, Schneider R, Schwab ME: Characterization of Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Grafts in the Lesioned Spinal Cord. Molecular and Cellular Neuroscience April 2006 Krejčí E, Grim M: Isolation and Characterization of Neural Crest Stem Cells from Adult Human Hair Follicles Folia Biologica (Praha) 56, (4): 149 157, 2010
Otázka k zápočtu: Uveďte příklad alespoň dvou vývojových vad nebo syndromů vyvolaných defektním vývojem neurální lišty