Ing. Miloš Faltus, Ph.D. Ing. Jiří Zámečník, CSc. Konzervace genetických zdrojů chmele (Humulus lupulus, L.) pomocí metody kryoprezervace METODIKA PRO PRAXI Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008
Metodika je výstupem řešení výzkumného záměru MZE0002700602 Nové poznatky, metody a materiály pro genetické zlepšování biologického potenciálu plodin a využití agrobiodiversity pro setrvalý rozvoj zemědělství. Metodika proběhla oponentním řízením. O uplatnění metodiky byla dne 16.12. 2008 uzavřena smlouva podle ustanovení 269 zákon č. 513/1991 Sb., obchodního zákoníku. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha, 2008 ISBN 978-80-87011-94-2 2
Autoři: Název: Vydal: Redakce: Ing. Miloš Faltus, Ph.D. Ing. Jiří Zámečník, CSc. Konzervace genetických zdrojů chmele (Humulus lupulus, L.) pomocí metody kryoprezervace Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, 161 06, Praha 6 Ruzyně Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, 161 06, Praha 6 Ruzyně Metodika je veřejně přístupná na adrese www.vurv.cz Náklad: 40 výtisků Vyšlo v roce 2008, první vydání Vydáno bez jazykové úpravy Kontakt na autory: Autor fotografií: faltus@vurv.cz zamecnik@vurv.cz Miloš Faltus Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha, 2008 ISBN 978-80-87011-94-2 3
KONZERVACE GENETICKÝCH ZDROJŮ CHMELE (HUMULUS LUPULUS, L.) POMOCÍ METODY KRYOPREZERVACE Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008 4
Miloš Faltus, Jiří Zámečník Konzervace genetických zdrojů chmele (Humulus lupulus, L.) pomocí metody kryoprezervace METODIKA PRO PRAXI Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008 5
Konzervace genetických zdrojů chmele (Humulus lupulus, L.) pomocí metody kryoprezervace Chmel patří mezi naše významné plodiny. Tato plodina je množena a uchovávána pomocí vegetativních částí a orgánů. Uchování genofondu chmele v polní kolekci zvyšuje riziko náhodné ztráty genotypu. Toto riziko lze omezit využitím metody kryoprezervace, při níž jsou rostlinné vzorky uloženy při ultranízké teplotě, která zastavuje všechny biochemické procesy. Kryoprezervované vzorky lze takto uchovávat bez změny po mnoho let. Tato metodika popisuje postup přípravy materiálu, postup otužování rostlin, jejich dehydrataci, kryoprezervaci a regeneraci. Jsou definovány zásady, které umožňují bezpečné uchování genotypů chmele a jejich úspěšnou regeneraci. Uživatelem metodiky je MZe, která ji uplatní v rámci Národního programu konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin, zvířat a mikroorganismů významných pro výživu a zemědělství. Conservation of hop germplasm collection (Humulus lupulus, L.) by means of cryopreservation Hop is important crop in the Czech Republic. Hop germplasm is maintained in the field collection and this fact increases risk of accidental lost of genotype. Conservation of hop germplasm by means of cryopreservation decreases risks of genotype lost. Plant samples are stored at ultralow temperature that stopped all biochemical processes. The samples can be stored without any changes for many years. This methodology describes procedure of material preparation, explant preculture and dehydration, shoot tip cryopreservation and recovery. Principles of safe genotype storage and recovery are defined. The Ministry of Agriculture of the Czech Republic is the user of this methodology and it will utilize the hop cryopreservation method in the frame of National Programme on Conservation and Utilization of Plant, Animal and Microbial Genetic Resources for Food and Agriculture. Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008 6
Obsah: I. Cíl metodiky... 8 II. Vlastní popis metodiky... 8 a) Princip metody... 8 b) Materiál a metody... 8 c) Postup kryoprezervace chmele... 10 d) Označení a uložení kryoprezervovaných vzorků... 13 e) Záznam o provedené kryoprezervaci... 13 f) Stanovení minimálního rozsahu kryoprezervovaných vzorků... 14 III. Srovnání novosti postupů... 15 IV. Popis uplatnění metodiky... 16 V. Seznam použité literatury... 17 VI. Seznam publikací... 17 VII. Dedikace... 18 VIII. Jména oponentů:... 18 7
I. Cíl metodiky Cílem metodiky je stanovit postup pro dlouhodobé uchování genetických zdrojů chmele pomocí metody kryoprezervace. II. Vlastní popis metodiky a) Princip metody Podstatou této metody je uchování materiálu při teplotě bodu varu tekutého dusíku (-196 C), kdy se rostlinný materiál nachází v tzv. skelném stavu. Skelný stav je amorfní pevná fáze hmoty, která umožňuje uchování rostlinného materiálu ve stabilním a funkčním stavu. Další důležitou podmínkou bezpečného uchování vzorků je zamezení tvorby ledových krystalů, které letálně poškozují uložený materiál. I když je chmel obecný (Humulus lupulus, L.) druhem, který snáší mráz, jeho mrazuvzdornost, podobně jako mrazuvzdornost jiných druhů rostlin, má své limity. Metoda pro kryoprezervaci chmele tento limit překonává. Otužení nízkou teplotou však zvyšuje účinnost metody kryoprezervace. Proto metoda kryoprezervace chmele využívá vlivu nízké teploty, osmotického přizpůsobení a ochranného účinku sacharosy pro dosažení stavu rostlinného materiálu, který umožňuje překonání vlivu ultranízké teploty v životaschopném stavu. b) Materiál a metody 1. Přístrojové vybavení Pro provedení metody kryoprezervace je třeba disponovat následujícím přístrojovým vybavením: Práce s tkáňovými kulturami rostlin v in vitro podmínkách: kultivační boxy, laminární box Vybavení pro sterilizaci materiálu a kultivačních medií: autokláv, horkovzdušný sterilizátor Přístroje pro přípravu a uchování kultivačních medií: analytické váhy, přesné váhy, ph-metr, laboratorní míchačka, chladnička Vybavení pro stanovení sušiny vzorků: laboratorní sušárna, analytické váhy Uchování tekutého dusíku a kryokonzervovaných vzorků: Dewarova nádoba na tekutý dusík, Dewarova nádoba pro uložení vzorků v tekutém dusíku Záznamy, výpočty a tisk čárového kódu: PC, tiskárna čárového kódu, tiskárna 2. Chemikálie V následujícím seznamu jsou všechny chemikálie potřebné pro metodu kryoprezervace: Kultivační media: destilovaná voda soli dusičnan amonný, dusičnan draselný, kyselina dihydrogen fosforečná, chlorid vápenatý, síran hořenatý, síran manganatý, síran zinečnatý, síran železnatý, jodid draselný, kyselina boritá, molybdenan disodný, chlorid kobaltnatý, síran měďnatý 8
vitamíny thiamin, pyridoxin, kyselina nikotinová, glycin fytohormony kyselina indolyl máselná, kyselina giberelová, benzylaminopurin glukosa (P.A.) agar (Sigma Aldrich) Kryoprezervační roztok: sacharosa (P.A.), destilovaná voda Desikant: silikagel Chladící a skladovací medium: tekutý dusík 3. Drobné pomůcky Následující pomůcky jsou potřebné pro realizaci metody kryoprezervace chmele: Příprava roztoků a medií: Erlenmeyerova baňka 500 ml odměrný válec 1000 ml pasteurova pipeta 3 ml střička váženky Kultivace rostlin: kultivační zkumavky s hliníkovým uzávěrem 12 x 1,7 cm stojánek na zkumavky plastové kultivační nádoby 10 x 10 x 9 cm (Duchefa) plastové Petriho misky 6 cm skleněné Petriho misky 15 cm Předkultivace rostlin: Erlenmeyerova baňka 25 ml Izolace a dehydratace vzrostných vrcholů: injekční jehly 0,7 x 40 mm filtrační papír 11 cm hliníkové plíšky 20 x 6 x 0,05 mm nádobky na silikagel 200 ml skleněné Petriho misky 4, 12, 15 a 20 cm stříkačky 10 ml Kryoprezervace: stojánek na kryozkumavky kryozkumavky 1,8 ml (NUNC) polystyrénový džbán 1L Odtání vzorků: Erlenmeyerova baňka 100 ml nerezová miska parafilm 9
4. Výchozí rostlinný materiál a kultivační podmínky Explantátové kultury chmele v podmínkách in vitro jsou výchozím materiálem popisované metody. Explantáty jsou pěstovány v aseptických podmínkách na pevném agarovém mediu v kultivačním boxu při teplotě 25 ± 1 C, hustotě světelného toku 80 µmol m -2 s -1 a fotoperiodě 16/8 h. Plastové krabičky o velikosti 10 x 10 x 9 cm obsahují 100 ml media a třicet explantátů chmele odvozených ze stonkových nodálních segmentů. Pro otužování explantátů se používá stejný režim jako při kultivaci rostlin, ale při snížené teplotě (2 ± 1 C). 5. Složení kultivačních medií Pro kultivaci rostlin se použije agarové kultivační medium podle Murashige a Skooga (1964) se sníženým obsahem dusíku a bez rostlinných fytohormonů (Faltus et al. 2007) se 40 g l -1 glukosy a 7 g l -1 agaru. Toto medium se použije jak pro multiplikaci rostlin, tak pro otužování explantátů před jejich kryoprezervací. Pro regeneraci rostlin se použije regenerační medium, které má shodné složení jako kultivační medium, ale pro vyšší regeneraci rostlin po kroprezervaci obsahuje směs fytohormonů (0,02 mg l -1 kyseliny giberelové, 0,1 mg l -1 kyseliny indolyl máselné, 0,01 mg l -1 6-benzylaminopurinu) (Faltus et al. 2007). 6. Příprava silikagelu pro dehydrataci rostlinného materiálu Dehydratace explantátů chmele probíhá ve skleněných nádobkách (200 ml) s 50 g vysušeného sterilního silikagelu. Silikagel je sušen dva dny v horkovzdušném sterilizátoru při teplotě 170 C. Poté následuje sterilace při stejné teplotě, ale se zavřenými nádobkami po dobu 10 hodin. c) Postup kryoprezervace chmele Postup kryoprezervace explantátů chmele tvoří šest základních kroků: Multiplikace explantátů Otužování explantátů Příprava vzrostných vrcholů Dehydratace vzrostných vrcholů nad silikagelem Vlastní kryoprezervace vzrostných vrcholů chmele Hodnocení životnosti a regenerace 1) Multiplikace explantátů Explantáty chmele mají subkultivační interval 6 až 8 týdnů. Z toho vyplývá náročnost při plánování jejich kryoprezervace. Při dvou pasážích rostlin trvá pouze multiplikace rostlinného materiálu pro kryoprezervaci až téměř čtyři měsíce. Explantáty chmele ve stáří 6 až 8 týdnů se použijí pro nařezání nodálních segmentů. Nodální segmenty se kultivují v počtu 30 kusů v krabičkách se 100 ml multiplikačního media. Při první multiplikaci se vysadí jedna krabička s třiceti nodálními segmenty a dalších dvacet explantátů se vysadí do deseti zkumavek pro uchování klonu v in vitro podmínkách. Při druhé multiplikaci se z třiceti rostlin odvodí sto nodálních segmentů a vysadí se do třech krabiček. Postup multiplikace explantátů je schématicky znázorněn na Obrázku 1. 10
1. multiplikace 2. multiplikace Uchování genotypu Obrázek 1. Postup multiplikace in vitro rostlin chmele 2) Otužování explantátů Nodální segmenty se v počtu 100 kusů vysadí do krabiček s 50 ml multiplikačního media. Od každého genotypu se vysadí 300 nodálních segmentů. Po 7 až 10 dnech kultivace při 25 C se krabičky s nodálními segmenty přenesou do kultivačního boxu s teplotou 2 C. Po 7 až 10 dnech otužování nízkou teplotou se do krabiček s nodálními segmenty aplikuje 25 ml 0,7 M roztoku sacharosy, který se nechá působit dalších 7 až 10 dní. Postup otužování explantátů chmele je znázorněn na Obrázku 2. Odvození nodálních segmentů Otužování nízkou teplotou Aplikace 0,7 M sacharosy Společné působení nízké teploty a roztoku sacharosy Obrázek 2. Otužování in vitro rostlin chmele 3) Příprava vzrostných vrcholů Vzrostné vrcholy (1 až 2 mm) se vyřežou z nodálních segmentů pomocí injekční jehly, která se použije jako mikroskalpel. Vrcholy chmele se umístí na 20 hodin při teplotě 22 C do Petriho misky (12 cm) na sterilní filtrační papír nasycený 0,7 M roztokem sacharosy (14 ml) s fytohormony shodného složení jako v regeneračním mediu (0,02 mg l -1 kyseliny giberelové, 0,1 mg l -1 kyseliny indolyl máselné, 0,01 mg l -1 6-benzylaminopurinu) (Obrázek 3). 11
Izolace vzrostných vrcholů Sycení vrcholů 0,7 M sacharosou Obrázek 3. Sycení vzrostných vrcholů chmele 0,7 M sacharosou. 4) Dehydratace vzrostných vrcholů nad silikagelem Vrcholy chmele nasycené sacharosou se umístí na hliníkové plíšky po deseti kusech a vždy dva plíšky se umístí do jedné Petriho misky (4 cm). Spodní díl Petriho misky s plíšky a explantáty se umístí pomocí sterilní pinzety do nádoby se silikagelem (Obrázek 4). Dehydratace vzrostných vrcholů chmele probíhá při teplotě 22-23 C. Dehydratace explantátů probíhá přibližně 1,5 1,75 hodiny do dosažení vlhkosti materiálu přibližně 0,4 g vody na 1 g sušiny. Uvedená doba dehydratace platí pouze pro nádoby a množství silikagelu a rostlinného materiálu, které jsou uvedeny v této metodice; jakákoliv změna způsobuje změnu doby dehydratace vzrostných vrcholů. Obsah vody ve vzorcích je stanoven vážením u kontrolních vzorků, které se připravují shodným způsobem jako vzorky kryoprezervované, ale nejsou uloženy v tekutém dusíku a namísto toho se vysuší v sušárně pro stanovení hmotnosti sušiny. Nejprve je stanovena hmotnost vzorků před dehydratací, poté hmotnost vzorků po dehydrataci a nakonec hmotnost sušiny po dosušení vzorků v sušárně při 105 C po dobu 72 hodin. Umístění vrcholů na plíšky Dehydratace vrcholů nad silikagelem Obrázek 4. Dehydratace vzrostných vrcholů chmele nad silikagelem. 5) Vlastní kryoprezervace vzrostných vrcholů chmele Nejprve se připraví polystyrenová nádoba s kryozkumavkami a naplní se tekutým dusíkem. Vysušené explantáty umístěné na hliníkových plíšcích jsou kryoprezervovány prudkým ponořením do tekutého dusíku. Víčko kryozkumavky se nechá mírně uvolněné a tím dochází k pronikání tekutého dusíku přes závit do kryozkumavky v Dewarově nádobě. Postup zamrazení vzorků je znázorněn na Obrázku 5. Ponoření vrcholů do tekutého dusíku Obrázek 5. Zamrazení a uložení vzorků v tekutém dusíku. Uložení vzorků do Dewarovy nádoby 12
6) Hodnocení životnosti a regenerace Hodnocení životnosti a regenerace rostlin chmele po kryokonzervaci se provede u kontrolních vzroků, které se připravují paralelně jako vzorky pro uložení do Dewarovy nádoby naprosto shodným způsobem. Minimální doba pobytu vzorků v tekutém dusíku je 1 hodina. Kryozkumavky se umístí do stojánku s tekutým dusíkem. Pinzetou se rychle vytáhnou hliníkové plíšky s vrcholy z kryozkumavek a ponoří se do vodní lázně o laboratorní teplotě. Explantáty se pomocí pinzety vyjmou z vody a přenesou na regenerační medium s fytohormony (0,02 mg l -1 kyseliny giberelové, 0,1 mg l -1 kyseliny indolyl máselné, 0,01 mg l -1 6-benzylaminopurinu). Vyjmutí vzorků z tekutého dusíku Odtání vzorků ve vodní lázni Hodnocení životnosti a regenerace Vysázení na regenerační medium Obrázek 6. Odtání a regenerace vzrostných vrcholů chmele. Po dvou týdnech kultivace na regeneračním mediu se provede hodnocení životnosti rostlin a po osmi týdnech hodnocení jejich regenerace. Živé explantáty jsou takové, u nichž je patrný růst a nedochází u nich ke ztrátě chlorofylu. Regenerace rostlin je definována jako apikální růst stonku s tvorbou nových nodálních uzlů. d) Označení a uložení kryoprezervovaných vzorků Kryozkumavky se označí specifickým čárovým kódem. Kód obsahuje pořadové číslo kryoprezervace dané položky, její přesnou lokalizaci ve skladovacím systému a datum jejího uložení. Kryoprezervované vzorky se v označených kryozkumavkách umístí do Dewarovy nádoby naplněné tekutým dusíkem. Z důvodu odparu je třeba zabezpečit pravidelné doplňování tekutého dusíku do Dewarových nádob. e) Záznam o provedené kryoprezervaci Postup kryoprezervace každé položky se zaznamená v kryoprotokolu, který obsahuje základní identifikační údaje o kryoprezervovaných vzorcích a o metodě kryoprezervace a jejím výsledku. Tyto informace lze v případě potřeby doplnit dalšími údaji, které přesněji definují podmínky kryoprezervace a vlastnosti kryoprezervovaných vzorků. 13
Základní údaje: Materiál: plodina, genotyp, identifikátor EVIGEZ, interní identifikátor Množství: počet kryoprezervovaných vzrostných vrcholů, počet kontrolních rostlin Označení: číslo položky, pozice v kryoskladu, datum zamrazení Kryo: metoda kryoprezervace Výsledek: životnost, regenerace Doplňující údaje: Předkultivace: počet dní kultivace, počet dnů otužování, počet dnů působení roztoku sacharosy Dehydratace: čerstvá hmotnost vzrostných vrcholů, počáteční obsah vody, konečný obsah vody, doba dehydratace, podíl krystalické fáze, přítomnost a charakteristika skelných přechodů (teplota skelného přechodu, změna tepelné kapacity) Poznámky: odchylky od standardního postupu f) Stanovení minimálního rozsahu kryoprezervovaných vzorků Výsledky regenerace rostlin kontrolního vzorku lze použít pro výpočet počtu rostlin, které budou regenerovat při dané pravděpodobnosti z rostlin uložených v tekutém dusíku (Dussert et al. 2005). Minimální počet kontrolních rostlin, které musí regenerovat, aby existovala 95%- ní pravděpodobnost regenerace alespoň jedné rostliny ze vzorků uložených v tekutém dusíku, závisí na velikosti kontrolního souboru a na počtu uložených vzorků v Dewarově nádobě (Tabulka 1). Pro jeden genotyp je doporučeno použít 120 vzrostných vrcholů pro uložení v tekutém dusíku a 40 vzrostných vrcholů pro kontrolu životnosti a regenerace rostlin. Za těchto podmínek musí zregenerovat alespoň 4 rostliny (10 %), aby existovala 95 % pravděpodobnost, že ze 120 uložených vzrostných vrcholů zregeneruje alespoň 1 rostlina. Ačkoliv v průměru zregeneruje ze 120 uložených vzrostných vrcholů 12 rostlin (10 %), s pravděpodobností vyšší než 95 % zregeneruje nejméně 1 rostlina, což je zárukou zachování a obnovení uloženého genotypu. Tabulka 1 prezentuje minimální počty rostlin, které musí zregenerovat v kontrolním vzorku v závislosti na jeho velikosti a celkovém počtu uložených vzorků v kryobance, aby došlo k regeneraci alespoň jedné rostliny z uložených vzorků při pravděpodobnosti 95 %. Tab. 1: Minimální počet rostlin zregenerovaných v kontrolním vzorku, který umožňuje regeneraci alespoň jedné rostliny s pravděpodobností 95 %, v závislosti na počtu kontrolních jedinců a počtu jedinců uložených v kryobance. Velikost uložené kolekce (počet uložených jedinců) Velikost kontrolního vzorku (počet jedinců) 20 40 60 80 100 100 3 4 5 6 7 120 3 4 5 6 6 140 3 4 4 5 6 160 3 3 4 5 5 180 2 3 4 5 5 200 2 3 4 4 5 14
Pro obnovení kryoprezervovaného genotypu chmele je nezbytná regenerace alespoň tří explantátů z celkového počtu uložených vzorků daného genotypu. Při stodvaceti explantátech chmele uložených v tekutém dusíku a čtyřiceti explantátech kontrolního vzorku musí v kontrole zregenerovat alespoň 6 rostlin, aby s pravděpodobností minimálně 95 % existovaly minimálně tři explantáty chmele, které jsou schopné regenerace z celkového počtu vzorků uložených v kryobance (Tab. 2). Při minimálně třech explantátech schopných regenerace z celkového počtu uložených jedinců lze tvrdit, že po regeneraci jednoho explantátu potřebného pro obnovu genotypu, zůstávají v kryobance uloženy nejméně dva explantáty schopné regenerace. Tab. 2: Minimální počet regenerujících rostlin chmele z celkového počtu uložených explantátů (120 ks) v tekutém dusíku při 95 %-ní pravděpodobnosti v závislosti na počtu zregenerovaných rostlin chmele po kryoprezervaci v kontrolním vzorku o rozsahu 40 explantátů. Regenerace v kontrolním vzorku (počet jedinců) Minimální regenerace rostlin v kryobance (počet jedinců) 4 1 5 2 6 3 7 5 8 7 10 10 12 14 Na základě odhadu pravděpodobnosti regenerace uložených rostlin, lze rozsahem kryoprezervovaných vzorků ovlivnit jistotu (a bezpečnost) uchování a regenerace uložených genotypů a případně i cenu za jejich uložení do tekutého dusíku. Pokud je regenerace rostlin v kontrolním vzorku nízká, lze dosáhnout zvýšení pravděpodobnosti regenerace kryoprezervovaného genotypu zvýšením rozsahu uložených vzorků (opakováním postupu kryoprezervace). V případě stabilně vysoké regenerace kontrolních vzorků lze snížit náklady na uložení genotypu snížením počtu uložených vzorků. III. Srovnání novosti postupů V současné době je kolekce genetických zdrojů chmele v rámci Národního programu konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin, zvířat a mikroorganismů významných pro výživu a zemědělství uchovávána v polní kolekci v Chmelařském institutu v Žatci. Metodika kryoprezervace umožňuje uchovat genetické zdroje po velice dlouhou dobu při nízkých provozních nákladech, což je spolu se stabilitou uchovávaného materiálu hlavní výhodou metody v porovnání se stávající metodou uchování genofondu chmele. Vzhledem k dlouhodobému charakteru růstu chmelové kultury není metoda kroprezervace chmele 15
elektivní pro tvorbu aktivní kolekce s častým odběrem uložených položek. Metoda kryoprezervace je proto vhodnou metodou, která doplňuje stávající metodu konzervace chmele. Zatímco polní kolekce zajišťuje rychlou dostupnost materiálu, metoda kryoprezervace výrazně zvyšuje bezpečnost konzervace genofondu chmele bez vlivu škodlivých biotických a abiotických faktorů. Původní metodika kryoprezervace chmele (Reed et al., 2003) je tzv. metoda řízeného mrznutí za použití směsi kryoprotektantů (polyetylen glykol 8000, glukosa, dimethylsulfoxid) (Reed, 1990). Explantáty chmele jsou otužovány nízkou teplotou a izolované vrcholy se zamrazují ve dvou fázích. V první fázi dochází k řízenému poklesu teploty rychlostí 0,1 C za minutu až do teploty -40 C pak jsou vzorky ponořeny do tekutého dusíku. Tání vzorků probíhá ponořením kryozkumavek do 40 C teplé vody po dobu 1 minuty. Nová metodika kryoprezervace chmele je odvozena od tzv. kapkové metody (Shafer-Menhur et al., 1996), která byla původně vyvinuta pro brambor, ale nyní se její různé varianty aplikují na širokou škálu plodin. Nová metodika kryoprezervace chmele se poměrně dosti liší od původní metodiky. Nová metodika využívá pro otužování explantátů společné působení nízké teploty a roztoku sacharosy, které se ukázalo z hlediska úspěšnosti kryoprezervace mnohem účinnější než jejich samostatné působení. Zatímco původní metodika využívá směsi kryoprotektantů, nová metodika používá jako kryoprotektant pouze sacharosu. Původní metodika využívá k dehydrataci vzrostných vrcholů působení mrazu při řízeném mrznutí, naproti tomu nová metodika využívá k dehydrataci vzorků suchý vzduch nad silikagelem. Zamrazení vzorků je u původní metodiky pomalé a postupné, zatímco u nové metodiky se využívá rychlé zamrazení vzorků přímým ponořením do tekutého dusíku. Tání vzorků probíhá u původní metodiky ohřevem kryozkumavek a tedy menší rychlostí než u nové metodiky, kdy dochází k přímému ohřevu vzorků ve vodě. Poslední významnou odlišností je fytohormonové složení regeneračního media. Zatímco původní metodika využívá k podpoře regenerace jeden fytohormon (benzylaminopurin), nová metoda využívá směsi tří fytohormonů (kyselina indolyl máselná, kyselina giberelová, benzylaminopurin) v poměru, který je vhodný pro většinu klonů chmele než při využití pouze benzylaminopurinu. Hlavní výhodou nové metodiky jsou nižší nároky na přístrojové vybavení než u původní metodiky (zařízení pro řízené zmrazování vzorků). Další výhodou je, že nová metodika nevyužívá jako kryoprotektant dimethylsulfoxid, který není příliš vhodný pro jeho negativní vlastnosti (genotoxicita, nestálost, neautoklávovatelnost). Výhodou nové metodiky je i nové složení regeneračního media ve srovnání s původní metodikou. IV. Popis uplatnění metodiky Uživatelem metodiky kryoprezervace je MZe ČR a to prostřednictvím Národního programu konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin, zvířat a mikroorganismů významných pro výživu a zemědělství. Využitím této metodiky kryoprezervace chmele dojde k uložení vybraných genetických zdrojů chmele ve stabilním (skelném) stavu v tekutém dusíku a tím dojde k eliminaci rizik ztráty cenných genotypů. Tím dojde k vytvoření bezpečnostní zálohy nejcennějších genetických zdrojů chmele podobně jako je tomu již po několik let na předních pracovištích ve světě, které se zabývají konzervací a kryoprezervací genofondu chmele NCGR (National Clonal Germplasm Repository) (Reed, 2001, Reed et al,. 2003) v Corvallis a NCGRP (National Center for Genetic Resources Preservation) ve Fort Collins (Ellis a Jenderek, 2008) v USA. Úpravy postupů této metodiky jsou možné pouze v případech, že tyto úpravy povedou prokazatelně (na základě opakovaných pokusů) k statisticky významně vyšší regeneraci rostlin po kryoprezervaci nebo když změny metodiky povedou k úspoře finančních prostředků pro kryoprezervaci jedné položky, aniž by byla negativně ovlivněna regenerace kryoprezervovaného genotypu. 16
V. Seznam použité literatury Dussert S, Engelmann F, Noirot M, 2003, Development of probabilistic tools to assist in the establishment and management of cryopreserved plant germplasm collections. CryoLetters 24, s. 339-350. Ellis D. D., Jenderek M. M., 2008, Operational cryopreservation of multi-genera plant genetic resources collections at the National Center for Genetic Resources Preservation, In: Proceeding Joint Meeting of Working Group 1 and 2, COST871, 20th-23rd of February 2008, Oulu, Finland, s. 8-9. Faltus M., Bilavčík A., Zámečník J., Svoboda P., 2007, Effect of phytohormone composition of nutrient medium on in vitro plant regeneration in hop clones with different sensitivity to indole-3-butyric acid, ISSN 0394-6169, Advances in Horticultural Science, 21(4), s. 219-224. Murashige T., Skoog F.A., 1962, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15 : 473 497 Reed B. M., 2001, Implementing cryogenic storage of clonally propageted plants, CryoLetters 22, s. 97-104. Reed B. M., Okut N., D'Achino J., Narver L., Denoma J., 2003, Cold Storage and Cryopreservation of Hops (Humulus L.) Shoot Cultures Through Application of Standard Protocols, Cryoletters 24, s. 389-396. Reed, B. M., 1990, Survival of in vitro-grown apical meristems of Pyrus following cryopreservation. HortScience 25, s. 111-113. VI. Seznam publikací Faltus M., Bilavčík A., Zámečník J., Svoboda P., 2007, Effect of phytohormone composition of nutrient medium on in vitro plant regeneration in hop clones with different sensitivity to indole-3-butyric acid, ISSN 0394-6169, Advances in Horticultural Science, 21(4), s. 219-224. Faltus M., Zámečník J., Bilavčík A., 2007, Odolnost in vitro rostlin chmele k desikaci ve vztahu k jejich kryoprezervaci, ISBN 978-80-87011-00-3, In: Vliv abiotických a biotických stresů na vlastnosti rostlin 2007, Praha 21.3.2007, s. 558-562. Zámečník J., Faltus M., Bilavčík A., 2007, Cryoprotocols used for cryopreservation of vegetatively propagated plants in the Czech cryobank, ISSN 0394-6169, Advances in Horticultural Science, 21(4), s. 247-250. Zámečník J., Bilavčík A., Faltus M., 2007, Metody dehydratace vzrostných vrcholů pro kryoprezervaci vegetativně množených plodin, ISBN 978-80-87011-00-3, In: Vliv abiotických a biotických stresů na vlastnosti rostlin 2007, Praha 21.3.2007, s. 573-576. Faltus M., Bilavčík A., Zámečník J., 2006, Effect of different pretreatment on hop cryopreservation, In: Plenary papers of the Conference "Biotechnology 2006", 15th-16th February 2006, University of South Bohemia, České Budějovice, s. 558-560. Zámečník J., Faltus M., Bilavčík A., 2006, Conservation of biodiversity of vegetative propagated crops by cryopreservation methods, In: Plenary papers of the Conference "Biotechnology 2006", 15th-16th February 2006, University of South Bohemia, České Budějovice, s. 493-495. 17
VII. Dedikace Metodika je výstupem řešení výzkumného záměru MZE0002700602 Nové poznatky, metody a materiály pro genetické zlepšování biologického potenciálu plodin a využití agrobiodiversity pro setrvalý rozvoj zemědělství. VIII. Jména oponentů: Odborný oponent: Doc. Ing. Václav Hejnák, Ph.D., Katedra botaniky a fyziologie rostlin Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Česká zemědělská univerzita v Praze Oponent ze státní správy: Ing. Ivan Branžovský, CSc. Odbor zemědělských komodit, MZe Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008 18