Název: Nanotransportéry pro teranostické aplikace Školitel: Simona Dostálová, Markéta Vaculovičová Datum: 21. 3. 2014 Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.3.00/20.0148 Název projektu: Mezinárodní spolupráce v oblasti "in vivo" zobrazovacích technik
CÍLE PRÁCE Provést literární rešerši o současném stavu teranostického výzkumu a možnostech uplatnění virových kapsid a dalších nanočástic v tomto oboru. Prostudovat možnosti virových kapsid, proteinů a anorganických sloučenin jako nanotransportérů léčiv. Charakterizovat proteinovou architekturu virové kapsidy pomocí analytických a molekulárněbiologických metod. Prakticky ověřit možnost enkapsulace léčiva do vybraného nanotransportéru Porovnat schopnost virového a proteinového nanotransportéru enkapsulovat léčivo
TERANOSTIKA = diagnostika + cílená doprava + zobrazování + odezva na léčbu Personalizace medicíny Rakovina, záněty, KVO, degenerativní onemocnění Platforma: proléčiva/nanomedicína
NANOMEDICÍNA Snížení systémové toxicity léčiv Zvýšení efektivity, doby skladovatelnosti EPR efekt - akumulace v nádorech snížení aplikované dávky léčiva
NANOTRANSPORTÉRY Enkapsulace nebo rozpouštění léčiv Cílené dopravování léčiv + zobrazování 20-100 nm Terapeutický náklad, přenašeč nákladu, cílící ligand a emitor signálu
VIRY JAKO NANOTRANSPORTÉRY Genů Doprava DNA vakcín CCMV Ftalocyanin zinku Rostlinné viry CPMV Proflavin RCNMV Zlaté nanočástice Porfyriny Léčiv MS2 Cisplatina Bakteriofágy M13 Ftalocyanin zinku Doxorubicin Doxorubicin
BAKTERIOFÁG Infikuje bakterii Escherichia coli Lyzogenní / lytická reprodukce Ikozahedrální kapsida trimery (E), hexamery a pentamery (D) E - hlavní protein kapsidy (38 kda) D minoritní protein kapsidy (12 kda) 1 virion tvoří až 50 nových virionů 1 generace se vytvoří za 5,5-6,5 hod
KULTIVACE BAKTERIOFÁGA
Intenzita fluorescence (%) Absorbance (AU) 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 ČASOVÁ ZÁVISLOST RŮSTU BAKTERIOFÁGA Růstová křivka E.coli E.coli + fág Amplifikace genu xis bakteriofága bp 1000 0 5 10 24 hod 500 % 78 88 93 100 0,10 0,05 0,00 0 6 12 18 24 Doba kultivace (hod) 120 100 80 60 y = 7,0892x + 71,988 R² = 0,9783 40 20 0 0 5 10 24 Doba kultivace (hod)
ANALÝZA PROTEINŮ VIROVÉ KAPSIDY 20% 30% 40% 6000g 130 000g 130 000g 60% Sacharózový/cesiový gradient E. coli Fág Proteiny Nečistoty
ANALÝZA PROTEINŮ VIROVÉ KAPSIDY kda L 1 2 3 4 5 6 7 8 260 150 100 75 50 37 25 20 10 Protein J (135 kda) Protein H (80 kda) Protein E (37 kda) Protein V (31 kda) Protein D (11 kda) 1 Přímo odebrané médium E. coli kultivované s bakteriofágem. 2 Supernatant po centrifugaci vzorku 1. 3 Pelet vzniklý ultracentrifugací vzorku 2 a resuspendovaný ve fosfátovém pufru. 4 První frakce sacharózového gradientu po ultracentrifugaci vzorku 3. 5 Druhá frakce sacharózového gradientu (20% sacharóza). 6 Třetí frakce sacharózového gradientu (30% sacharóza). 7 Čtvrtá frakce sacharózového gradientu (40% sacharóza). 8 Pátá frakce sacharózového gradientu (60% sacharóza).
Absorbance (AU) VLIV PŘÍDAVKU DOXORUBICINU NA RŮST BAKTERIOFÁGA E. coli E. coli + fág E. coli + doxo E. coli + fág + doxo 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 5 10 15 20 Absorbance 620 nm Doba kultivace (hod) 280 μl E. coli + 10 μl bakteriofág λ + 10 μl 2 mg/ml doxorubicinu
ENKAPSULACE DOXORUBICINU DO BAKTERIOFÁGA 2 hod, 20 C 6000g 130 000g
Fluorescence (a. u.) ENKAPSULACE DOXORUBICINU DO BAKTERIOFÁGA Fluorescence bakteriofága po přídavku různých koncentrací DOX PAGE elektroforéza 60000 50000 40000 200 μg/ml 30000 20000 100 μg/ml 50 μg/ml 25 μg/ml 0 25 50 100 200 µg/ml 10000 0 μg/ml 0 500 550 600 650 700 750 800 850 Excitace 480 nm Vlnová délka (nm) 0 25 50 100 200 µg/ml Excitace 480 nm
AMPLIFIKACE GENU XIS PO ENKAPSULACI DOXORUBICINU 0 25 50 100 200 Kontrolní PCR z komerční DNA s přídavkem doxorubicinu Ladder 0,001 0,01 0,05 0,1 1 10 100 1000
Fluorescence (a. u.) Fluorescence (a. u.) FLUORESCENCE IZOLOVANÉ DNA 500 0 μg/ml 450 400 25 μg/ml 350 50 μg/ml 300 100 μg/ml 250 200 μg/ml 200 150 100 50 0 515 565 615 665 715 765 815 Excitace 480 nm Vlnová délka (nm) Zvýšení koncentrace bakteriofága ~10 450 Kontrola 400 350 DOX 200 μg/ml 300 250 200 150 100 50 0 515 565 615 665 715 765 815 Excitace 480 nm Vlnová délka (nm)
Fluorescence 475 (a. u.) Fluorescence (a. u.) OZNAČENÍ -NH SKUPIN DOX FLUORESKAMINEM 9500 0 μg/ml 9000 25 μg/ml 8500 50 μg/ml 8000 100 μg/ml 7500 200 μg/ml 7000 6500 6000 420 470 520 Excitace 390 nm Vlnová délka (nm) 9500 9000 8500 8000 7500 7000 0 50 100 150 200 Koncentrace aplikovaného doxorubicinu (μg/ml) Excitace 390 nm
SOUHRN Provést literární rešerši o současném stavu teranostického výzkumu a možnostech uplatnění virových kapsid a dalších nanočástic v tomto oboru. Prostudovat možnosti virových kapsid, proteinů a anorganických sloučenin jako nanotransportérů léčiv. Charakterizovat proteinovou architekturu virové kapsidy pomocí analytických a molekulárněbiologických metod. Prakticky ověřit možnost enkapsulace léčiva do vybraného nanotransportéru Porovnat schopnost virového a proteinového nanotransportéru enkapsulovat léčivo
PODĚKOVÁNÍ
Děkuji za pozornost Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.3.00/20.0148 Název projektu: Mezinárodní spolupráce v oblasti "in vivo" zobrazovacích technik