Izolace a identifikace půdních mikroorganismů Mgr. Petra Straková Podzim 2014
Půdní mikroorganismy Půda - stanoviště nesmírně různorodé mikrobiální komunity Viry, bakterie, houby, řasy, protozoa Normální/extrémní podmínky
Půda Podporuje/umožňuje růst rostlin Mikroorganismy výrazně přispívají k úrodnosti půdy Rostliny mají velký vliv na mikrobiální komunity v půdy Kořenové exudáty a staré části rostlin potrava pro MO Kolonie na půdních částicích, víc než ve vodním prostředí Všeobecně dostatek živin - heterotrofové
Půdní mikroorganismy Obligátní aerobové, fakultativní anaerobové, mikroaerofilní, obligátní anaerobové (záplavy fak. a oblig. anaerobové) Teplota (roční období) většina mezofilní, kompost - termofilové Vlhkost kyselost (plísně) jehličnaté lesy půdní typ, dostupnost kyslíku, živin (C, N, P), atd. Bakterie, houby -> houby na povrchu, bakterie níže (nejvíc v prvních 15 cm) Archeae extrémy v ph, polární půdy, pouštní půdy
Půdní mikroorganismy Půdní profil - Vzniká zvětráváním a následnými půdotvornými procesy - Specifické chemické a fyzikální vlastnosti - Odpovídající fauna a flora - Různá úrodnost půdy
Půdní mikroorganismy Autochtonní druhy přirozené; ta mikroflóra, která je schopna využívat odolné huminové látky; pomalá ale konstantní aktivita (G- tyčky, aktinobakterie) Zymogenní (oportunistické) druhy závislost na přítomnosti zvýšené koncentrace; vysoká růstová rychlost a aktivita díky jednoduše využitelných substrátech, ale stále autochtonní druhy Allochtonní druhy nenachází v půdy dobré růstové podmínky Běžné druhy: Acinetobacter, Agrobacterium, Bacillus, Celulobacter, Cellulomonas, Clostridium, Corynebacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Xanthomonas, Streptomyces, Myxococcus, Actinomyces
Půdní mikroorganismy Houby - významná část půdní mikroflóry Volně žijící, součást mykorhizy, nejvíce v horních 10cm, málo pod 30 cm Nejčastěji: Aspergillus, Geotrichium, Penicillium, askomycety, bazidiomycety Většina hub zymogenní (oportunistické), za příznivých podmínek adekvátní vlhkost, aerace a relativně vysoká koncentrace využitelného substrátu
- dekompozitoři (rozkládači), - koloběh prvků v přírodě - mutualisti (N 2 fixující organismy) - patogeni (Clostridium) - tvorba humusu humifikace - mineralizace - tvorba půdní struktury - interakce mezi mikroorganismy a prostředím -> aktuální stav Ekologická role
Izolace půdních mikroorganismů 1) Mikroorganismy poutající vzdušný dusík (Azotobacter) 2) Izolace klostrídií 3) Izolace celulotytických mikroorganismů Izolace v čistých kulturách, využití selektivních médií Čím jsou tyto skupiny zajímavé?
Azotobacter Azotobacter - G- bakterie, aerobní, netvoří spóry, druh náročný na podmínky prostředí, ve vzduchu a ve vodě, cukry-zdroj E využit při fixaci N 2 Některé bakterie umí fixovat vzdušný dusík za pomocí enzymu nitrogenázy (energeticky velmi náročné), buď ve spojení s rostlinami nebo samostatně volně v půdě Redukce plynného dusíku na NH 3 za striktně anaerobních podmínek!! v našem případě spotřebování kyslíku na povrchu buňky aerobní respirací
Azotobacter postup izolace Selektivní médium: Ashbyho agar bezdusíkaté médium Rozdrobíme zeminu a kultivujeme 72 hodin 25-30 C Vyrostou pouze ty bakterie, které umí fixovat dusík z atmosféry
Clostridium G+ bakterie, obligátně anaerobní, tolerantní ke kyselému prostředí, dobře snáší i nižší teploty (rozmezí 10-65 C), malé nároky na prostředí, tvoří endospory (oválné či kulaté), v počtu 103-105 buněk/g půdy, výskyt: voda, stoční kal, půda, mořské sedimenty, GIT
Clostridium postup izolace 10 min protřepáváme 10 g půdy v destilované vodě (100 ml), následně 2x přefiltrujeme; pasterizace 15 minut při 75-80 C ve vodní lázni Do horkého sterilního média (MPB) pipetujeme 1ml pasterizovaného extraktu a převrstvíme 1 ml parafínu
Izolace celulolytických bakterií Součástí buněčné stěny rostlin je celulóza + další těžce odbouratelné chemické látky (lignin, pektin, hemicelulóza) Na jejich rozkladu se podílí mikroorganismy, které je umí hydrolyticky štěpit až na glukózu Aerobní celulolytické organismy = ukazatele úrodnosti půdy!! Cytophaga, Cellvibrio
Celulolytické bakterie postup izolace na Petriho misku do 2/3 rozdrobíme zeminu, navlhčíme a položíme: filtrační papír, buničinu a noviny a sledujeme jejich rozklad
Hodnocení Azotobacter po prvních dnech kultivace slizovité bílé/bezbarvé kolonie, po týdnu hnědé slizovité kolonie (stářím hnědnou) Clostridium sediment; zápach; tvorba plynu Celulolytické bakterie pozorování rozkladu po 1.,2. a 3. týdnech, pigment kolonií? Hodnotíme úrodnost půdy