Souhrnná roční zpráva o řešení Výzkumného záměru Masarykova onkologického ústavu v Brně MZ 00020980501 v roce 2003 Předkládají : Doc. MUDr. Rostislav Vyzula, CSc., ředitel Masarykova onkologického ústavu Prof. MUDr. Jan Žaloudík, CSc., náměstek ředitele pro rozvoj, vědu a výuku 1
1. Zadání a průběh řešení výzkumného záměru (VZ) v roce 2003 a další výhledy : Institucionální VZ Masarykova onkologického ústavu, který pokrýval podle svého zadání hlavní oblasti diagnostické, léčebné a preventivní onkologie a zahrnoval již také nové rozvojové projekty v přípravě na další období, se dařilo v roce 2003 naplňovat novými poznatky i technologiemi. Tomu odpovídala široká publikační a přednášková činnost u nás i v zahraničí. V Masarykově onkologickém ústavu jsme programové cíle VZ dále směrovali pro užší propojení s aktuálními potřebami onkologické praxe. Prostředky VZ představovaly cennou podporu pro celoústavní inovační program TRANSIT ((Translational Research And New Strategy Implementation Trust), který byl formulován již v roce 2002, je zaměřen na propojování vědy a praxe a postupné vytěžování výzkumných výsledků pro klinické aplikace. Tento program představuje v současnosti základní výzkumnou linii institucionálně podporovaných projektů v Masarykově onkologickém ústavu a znamená vytváření kooperativních týmů, v nichž jsou zastoupeny laboratoře i klinické provozy a které mají zajišťovat převádění výsledků výzkumu do praxe. Praktickým výstupem je také akceptace a pasportizace nové metody zdravotním pojišťovnami, neboť je zřejmé, že jejich financování nelze po uvedení do praxe dále hradit z výzkumných prostředků. Ovšem i v této fázi pokračuje jejich validace klinickou praxí, což je etapa, nezřídka výzkumnými projekty opomíjená. V této etapě je zvláště zhodnocena výhoda Masarykova onkologického ústavu jako zařízení komplexní onkologické péče, v němž lze potřebnou provázanost experimentálních výsledků, klinického hodnocení a medicínské praxe zajistit jedním managementem pod jednou střechou. V roce 2003 byla nadále dodržována struktura výzkumného záměru o 6 programech, z nichž každý zahrnuje několik dílčích projektů, účastnících se na naplňování cíle programu a VZ jako celku. Programy mají své koordinátory, projekty své vedoucí. V roce 2003 byly v omezené míře zaváděny čtyři rozvojové projekty s perspektivou rozvinutí v dalších letech, tři z nich byly v omezené míře podpořeny také z prostředků VZ. Jde o projekty genomiky, farmakogenetiky, positronové emisní tomografie a telemedicíny, do nichž MOÚ investoval v míře přesahující o dva řády podporu VZ. Hospodaření s prostředky VZ projektů je ve vnitroústavním účetnictví vedeno pod samostatnými nákladovými středisky pro každý dílčí projekt. Tento přehledný způsob byl 2
v roce dále podpořen speciálním softwarovým zajištěním grantového účetnictví v programu evidence grantů MOÚ EVIGRANT. S ohledem na dosavadní úspěšnost výzkumného záměru MOÚ nejen po stránce získávání nových poznatků a publikační činnosti, ale především rozvoje technologií o nových metod jsme již požádali MZd ČR o prodloužení VZ MOÚ č. 00020980501 jak umožňuje usnesení Vlády ČR z 18.11.2002. a počítáme tedy s pokračováním výzkumného záměru také v roce 2004. 1.1. Struktura VZ - dílčí odborné programy : I. Prevence nádorů a organizace onkologické péče II. Genetika nádorové predispozice III. Úloha antionkogenů a jejich homologů v maligní přeměně buňky IV. Prediktivní onkologie V. Lokoregionální léčba nádorů VI. Optimalizace a monitorace systémové léčby nádorů Rozvojové projekty v přípravné fázi : RI : DNA mikročipy pro onkologii RII: Farmakogenetika cytostatik a cytotoxinů RIII: Funkční zobrazování nádorů RIV: Telemdicína v onkodiagnostice 3
Popis dosažených výsledků v dílčích projektech programů v roce 2003 : P 1 : Prevence nádorů a organizace onkologické péče Koordinátor programu : MUDr. J. Novák 1.1. Primární prevence a onkologická výchova veřejnosti Vedoucí projektu : Dr. Z. Joukalová Masarykův onkologický ústav je jediné specializované zařízení komplexní onkologické péče v rámci celé České republiky. Jako jediné se výhradně a na jednom místě zabývá prevencí, diagnostikou a léčbou onkologických onemocnění, podílí se na vědě, výzkumu a vzdělávání. Proto také pokládá za svou povinnost systematicky se věnovat zdravotní výchově veřejnosti a průběžně vyhodnocovat poptávku veřejnosti po informacích o onkologické problematice. Z toho důvodu v MOÚ už dva roky (od 3. prosince 2001) pracuje Onkologické informační centrum, které je zaměřeno jak na prevenci, tak na léčbu rakoviny. V roce 2003 OIC osobně navštívilo 1 577 občanů, pacientů, jejich příbuzných, zájemců i klientů preventivní péče. Je to o celou třetinu více než v roce 2002. Bezplatnou telefonickou linku 800 222 322 využilo 751 tazatelů. Loni to bylo 573 telefonátů. Z přehledu návštěv i telefonických kontaktů je zřejmé, že veřejnost se o službě postupně dozvídá a učí se jí využívat. rok 2003 - přehled návštěv a telefonátů v OIC telefonáty 32% návštěvy 68% návštěvy telefonáty Vzhledem k tomu, že také máme k dispozici materiály se základními onkologickými diagnózami, léčebnými postupy, preventivním programem, zavedli jsme zásilkovou službu. Za rok 2003 jsme rozeslali po celé republice nejen jednotlivcům, ale také zdravotnickým zařízením a školám 47 100 brožur a letáků to vše je hrazeno z režijních prostředků MOÚ. 4
V letošním roce jsme také využili služby ČTK tzv. Protextu, ve kterém jsme si během roku předplatili 5 zpráv, které se týkaly činnosti MOÚ: preventivní prohlídky, týdenní kurz Balance, výročí OIC, činnost Oddělení genetiky a epidemiologie nádorů a Klinické studie. Staráme se také o dvě internetové domény www.prevencenadoru,cz a www.mou.cz. V obou adresách je možnost kontaktovat přímo OIC s jakýmkoliv dotazem. Od dubna 2003 (do té chvíle se neevidovaly) do konce roku 2003 jsme vyřizovali 150 dotazů, které se týkaly jednak konkrétních diagnóz a způsobu léčby a jednak preventivních prohlídek. Funkční součástí je poradna pro odvykání kouření a poradna zdravé výživy. Dvakrát do měsíce zajišťujeme exkurze středních a vyšších zdravotních škol z celé republiky. Díky všem skutečnostem, které jsem uvedla výše, jsme se při řešení VVZ soustředili na prezentaci naší činnosti, která je pro všechny zájemce bezplatná, a na vydávání dalších materiálů: Přednášky a postery : Joukalová Z.: Zdravotnická zařízení a obecná informovanost veřejnosti. XXVII. Brněnské onkologické dny, Brno, 22.-24.5. 2003. Joukalová Z.: Informovanost široké veřejnosti. Veletrh MEFA Brno, 4. - 7. 11. 2003 Joukalová Z., Navrátilová D., Puchriková H.: Informovanost veřejnosti jako základ onkologické prevence. Seminář, Vyšší zdravotní škola Vsetín, 27.11.2003. Joukalová Z., Puchriková H.: Onkologické informační centrum. XXVII. Brněnské onkologické dny, Brno, 22. - 24. 5. 2003. Dvořáčková B.: Nemocné dítě. XXVII. Brněnské onkologické dny, Brno, 22. - 24. 5. 2003. Nové brožury OIC MOÚ : Co potřebujete vědět o nádorech slinivky břišní Co potřebujete vědět o nádorech žlučníku 5
1.2. Parametrizace onkologických záznamů a ekonomika zdravotní onkologické péče Vedoucí projektu : doc. MUDr.R. Vyzula, CSc. Spolupráce : MUDr. J. Novák, prof. MUDr. Jan Žaloudík, CSc., doc. Dr. L. Dušek, PhD (CBA MU) V roce bylo 2003 provedeno: a) Zpracování nákladů péče primárního onemocnění u zbývajících četných onkologických diagnóz modelově, pomocí účelové softwarové aplikace (EZOP) Náklady péče byly stanoveny modelově pro jednotlivá klinická stadia u diagnóz: C18-19-ZN kolon, C20-ZN rekta, C43-maligní melanom kůže a C61-ZN prostaty. V rámci dané diagnózy a stadia byla studie doplněna o analýzy jednotlivých součástí péče jako jsou diagnostika, jednotlivé léčebné modality a dispenzarizace. U všech studovaných diagnóz byl potvrzen proporcionální růst nákladů na primární péči pacienty s nádorovým onemocněním se zvyšujícím se rozsahem, respektive klinickým stadiem zhoubného nádoru ( viz příklady v grafech u ca rekta a ca prostaty). Tento tzv. onkologický paradox, kdy péče s lepšími výsledky stojí méně než nákladná péče se zhoršujícími se výsledky byl předmětem jednání MOÚ se zástupci VZP i MZd při přípravě způsobu plateb za zdravotní péči podle DRG. Stanovisko MOÚ o nutnosti zapracování klinického stadia nádorového onemocnění do klasifikačního systému DRG, vzešlé z výsledků analýz u nejčastějších diagnóz solidních zhoubných nádorů, bylo podpořeno výborem České onkologické společnosti a je akceptová MZd po další práci na DRG. ZN konečníku - náklady péče u jednotlivých klinických stadií 400000 344355 Náklady v Kč 300000 200000 100000 50458 56367 125024 150876 0 0 I II III IV Stadium 6
ZN prostaty - náklady péče u jednotlivých klinických stadií 400000 Náklady v Kč 300000 200000 100000 51743 119990 189490 207729 0 I II III IV Stadium b) Analýza nákladů péče u vybraného souboru 74 pacientek s karcinomem prsu U dg. C50 -ZN prsu byla provedena studie nákladů péče na konkrétním souboru 74 pacientek. s onemocněním v jednotlivých klinických stadiích, jímž byla v MOÚ v období I/2000 až I/2002 poskytnuta kompletní péče. Pro jednotlivá klinická stadia byly stanoveny náklady celkové, náklady za sledovanou dobu péče, náklady za 12 měsíců péče a náklady na vlastní onkologickou léčbu a její jednotlivé součásti. Byly studovány vzájemné vazby mezi sledovanými ukazateli. Porovnání nákladů na primární léčbu jednotlivých klinických stadií dg. C50 stanovených modelově a nákladů zjištěných u reálného souboru nemocných ilustruje graf. 7
Dg. C50 - NÁKLADY NA PRIM.TERAPII [Kč] 180000 reál (median) model 168258 160000 140000 120000 100000 93714 97668 110310 123139 80000 60000 51124 49771 63027 40000 20000 0 I II III IV Zjevný je 10-30% nárůst nákladů při modelovém hodnocení, což je nutno vzít v úvahu v přípravě všech paušalizujících systémů plateb, které pracují s modelovými předpoklady bez korekce reálnými soubory. Jinou interpretací ovšem může být skutečnost, že centra komplexní péče jakým je Masarykův onkologický ústav dosahují integrací činností a přímočarým vedením diagnosticko-léčebného algoritmu pod jednou střechou právě této 10-30%-ní úspory obecně kalkulovaných nákladů. To by statně bylo v souladu s mezinárodními zjištěními o ekonomické výhodnosti specializace. Publikace : Novák J., Koukalová H., Široký P. :Karcinom prsu žen - náklady péče u jednotlivých klinických stadií. Sborník Symposia Onkologie v gynekologii a mammologii, Brno 16.-17. 1. 2004 Žaloudík J : EZOP aneb ekonomika zdravotní onkologické péče. Konference Farmacie 2003, Špindlerův Mlýn, 17.6.2003 c) Vývoj softwarového řešení pro hodnocení ceny a kvality péče na modelu C50 st II-III. Vývoj a výzkum v předchozích etapách zajistil pro projekt funkční databázovou základnu pracující nad reálnými klinickými daty například na modelové diagnóze karcinom prsu. Byla provedena pilotní studie se záznamy 141 žen léčených na MOÚ s diagnózou C50 a od těchto pacientek byly retrospektivně pořízeny elektronické záznamy vývoje jejich nemocnění se zvláštním zaměřením na hodnocení neoadjuvantní terapie. Studie umožnila optimalizovat 8
datový model software tak, aby skutečně vyhovoval vývoji onemocnění onkologického pacienta a zahrnoval jasné oddělení zásadních fází léčby. Z hlediska analytického byla tato studie úspěšná a získaný soubor představuje i v mezinárodním měřítku významný odborný příspěvek ke studiu neoadjuvantní terapie a mechanismů její účinnosti. Vedle prognostického významu obsahu ER a PR receptorů byl hodnocen i prediktivní potenciál nádorových markerů C15-1 a CEA, včetně stanovení diagnosticky využitelných hraničních koncentrací. Z hlediska vývoje software však kritické vyhodnocení studie otevřelo významné otázky, které se staly hlavní náplní řešení v roce 2003, především: - retrospektivní sběr takto rozsáhlých dat z chorobopisů je v podmínkách zařízení velikosti MOÚ nezvládnutelný při počtech záznamů > 100 - retrospektivně dostupná data trpí řadou nedostatků, včetně chybějících hodnot a tento problém snižuje analyzovatelné velikosti vzorků Jednoznačným závěrem tedy bylo konstatování, že má-li vyvíjený software skutečně sloužit reálné klinické praxi, pak musí být posíleny následující atributy: - software musí plně komunikovat s nemocničním informačním systémem a předávání dat nesmí zatěžovat běžnou péči o pacienta, - systém musí být nastaven pro průběžné sbírání klinických údajů, nikoli pouze pro retrospektivní sběr - systém musí v maximální možné míře využívat dostupných datových zdrojů, které byly v dosavadním vývoji částečně opomíjeny, nicméně v průběžném sběru dat budou hrát velmi významnou roli o data v nemocničním informačním systému (provedená vyšetření, jejich datumy, výsledky vyšetření, apod. ) o data z hlášení zdravotním pojišťovnám velmi cenná databáze s daty běžně dostupnými pro analýzy, tedy s daty, která jsou rutinně pořizována a lze je využít bez další zátěže pro personál - systém musí být obohacen o relativně jednoduchý a přímočarý nástroj umožňující klinickému specialistovi interaktivní prohlížení záznamů, včetně analýz velmi významných pro onkologii (prognostické faktory a jejich sumární statistika, analýza přežití, apod. ) Vývoj v roce 2003 se na tyto atributy zaměřil a výsledkem je software BREAST, která je v současné podobě využitelný nejen pro časově náročné výzkumné studie, ale i pro průběžný sběr klinických dat přímo v nemocničním provozu. 9
i) Vývoj software: komunikační funkce Software byl doplněn o rozsáhlé importní funkce umožňující přijímání dat z nemocničního informačního systému (parametricky dostupné výsledky laboratorních a jiných vyšetření, datumy kontrol, apod.). První dávka takto automatizovaných importů byla vyzkoušena již na pilotních datech ze studie o neoadjuvanci karcinomu prsu. Systém je nastaven pro automatizované přijímání těchto dat i ve velkém rozsahu. Importovaná data takto mohou být do SW BREAST získávána prakticky bez zásahu obsluhujícího personálu a jsou přímo začleněna do univerzálního datového modelu tedy přes datumy vyšetření jednoznačně přiřazena určité fázi léčby. Importovaná data tak nabývají nové informační hodnoty a mohou být přes fáze léčby i agregována a analyzována (viz dále). ii) Vývoj software: databázové nástroje Elektronický záznam pacienta byl v plné podobě v SW vyvinut již v dřívějších etapách, v roce 2003 byly databázové nástroje zásadně rozšířeny z důvodu komunikace se záznamy z hlášení zdravotním pojišťovnám. Byly doplněny potřebné číselníky výkonů a tyto dále překódovány tak, aby vyhovovaly potřebám hodnocení onkologické péče (viz blíže níže popsaný modul nákladových analýz). SW BREAST je v současné verzi schopen plně pracovat i s hlášeními pro zdravotní pojišťovny a má pro tento účel vyvinut i samostatný modul analýz. iii) Vývoj software: analytické nástroje Vývoj analytických nástrojů software je v zásadě otevřený a reaguje i na požadavky vyplývající z konkrétních analýz. V roce 2003 byly v software vyvinuty následující nové a významné analytické nástroje: - Interaktivní prohlížeč pro klinická data. Univerzální data browser zpřístupňující každý parametr v databázi a respektující zásadní pravidla práce s onkologickými daty (hierarchie rizikových faktorů, rozlišení klinických stádií, histologické typy, apod.). Prohlížeč umožňuje sumární statistické analýzy pro spojité i kategoriální parametry a tyto analýzy nabízí i agregovaně přes klinická stádia a jiné diagnosticky významné faktory. Z prohlížeče je možné přímo vstoupit do popisné i srovnávací analýzy přežití. - Modul prezentačních nástrojů a analytických služeb. Tyto nástroje byly v roce 2003 rozšířeny především o možnost analýzy přežití všech pacientů v databázi nebo vybraného vzorku dle vstupních datových filtrů. Analýzu přežití je rovněž možné 10
stratifikovat podle diagnostických faktorů nebo jiných třídících kritérií. Byl připraven prezentační modul pro hodnocení kazuistiky pacienta a pro srovnání podstatných prvků v různých kazuistikách. Modul analytických nástrojů byl dále doplněn o analýzu léčebných odpovědí dosažených v různých fázích protinádorové terapie u vybrané skupiny pacientů a o sumární analýzu biomarkerů a rizikových faktorů. - Analyzátor záznamů pro zdravotní pojišťovny. Zcela nová komponenta software BREAST vytvořená v roce 2003 představuje samostatný nástroj importující plné záznamy z hlášení na zdravotní pojišťovny. Tyto záznamy jsou v software dále překódovány dvěma zásadními cestami: o Třídění dle fází diagnosticko léčebného procesu v podstatě představuje jednoznačné přiřazení záznamů o provedených výkonech a vyšetřeních k fázím vývoje pacienta. Bez tohoto kroku nemohou hlášení pro zdravotní pojišťovny poskytnout relevantní informace. o Třídění dle typu provedených výkonů a vyšetření. Za tímto účelem byly v roce 2003 překódovány všechny číselníkové položky výkonů pro zdravotní pojišťovny a byl jim přiřazen kód identifikující jejich postavení z hlediska onkologické péče (viz přiložená tabulka). Tím vznikla nová informační kvalita umožňující identifikovat nákladovost onkologické péče ve vztahu k strategii aplikované léčby a k fázi vývoje pacienta. Lze předpokládat, že tyto analýzy jsou v rámci ČR zcela pilotním pokusem o propojení ceny a kvality onkologické péče, tedy záznamů z hlášení plátcům zdravotní péče s klinickými daty ve formě vyhovující standardům onkologické péče. Software BREAST ve stávající verzi dokáže agregovat provedené výkony a vyšetření a sumarizovat jejich cenu i podle fází vývoje pacienta, případně tato data korelovat s významnými cílovými parametry léčby, například s přežitím. 11
1.3. Analýza vícečetných malignit Vedoucí projektu : MUDr. H. Vítová V roce 2003 byla původní databáze vícečetných malignit (VM) rozšířena o zhruba 100 nových pacientů z let 1996-2002. Data celého souboru byla aktualizována o přírůstek nových následných malignit a úmrtí a validována k 30.6.2003. Naše původní závěry jsme revidovali. Výsledky celoplošné analýzy výskytu VM (ANOVA, Kaplan - Meierova metoda) jsou použitelné v sekundární a terciární prevenci v praxi. Z našeho hlediska je žádoucí i nadále zachovat registr onkologických onemocnění, a navíc získat možnost propojení s dětským registrem. Bude tak možno lépe sledovat vlivy prostředí na lidský genom. Po validaci souboru nemocných s VM jsme zjistili, že pro další výzkum a klinické sledování je velmi vhodné neopomíjet histologii jednotlivých participujících nádorů, případně zjištěné genové mutace. Nezjistili jsme významně zvýšené riziko následných nádorů v souvislosti s aplikací taxanů. U participujících kožních nádorů ze skupiny C44 (dle MKN 10) je v dalším vývoji choroby žádoucí brát v úvahu histologický nález, staging, lokalizaci na těle, zejména jejich vznik v mladším věku. Uvedené závěry budou podrobně uvedeny v tč. rozpracovaných publikacích Vítová a kol. : Multiple malignacies in the Czech Republic a Vícečetné malignity u pacientů MOÚ Brno. Problematiku kvality života jsme zatím studovali z cca 100 chorobopisů pacientů s více než 2 přítomnými nádory. U přežívajících pacientů v remisi onkologického onemocnění jsou limitujícími faktory : anxieta, obavy o sociální zajištění, zvýšená únavnost, dušnost, tělesné mutilace např. lymfedém, kolostomie - výpadové jevy, 2x suicidium. Formou řízeného pohovoru jsme dosud v rámci pilotní studie vyšetřili 10 pacientů s VM s participující hemoblastózou, 20 kontrol s jednou hemoblastózou a 20 zdravých osob pro srovnání životního stylu a probandy vnímané kvality života. Současně vedená zdravotnická dokumentace není a ani nemůže být z tohoto aspektu zdrojem vyčerpávajících informací. Předpokládáme, že po rozšíření této studie na další nejčastější nádorové kombinace (žije cca 500 pacientů s VM z našeho souboru) a statistickém vyhodnocení bude možno předat zkušenosti onkologické veřejnosti i terénním pracovníkům ke zkvalitnění přístupu k onkologicky nemocným. 12
Publikace a přednášky : 1. Vítová V., Vítová H., Navrátilová M., Pecen L. : Otázka kouření u pacientů s vícečetnými malignitami, VII. ostravské dny podpůrné terapie v onkologii, duben 2003, sborník str. 132. 2. Vítová V., Pecen L., Vítová H., Navrátilová M., Foretová L. : Vícečetné malignity včasný záchyt následné malignity, Edukační sborník XXVII. brněnské onkologické dny, květen 2003, str. 44-46. 3. Vítová V.: Některé rizikové faktory u vícečetných malignit. Klinická onkologie 16., str. 9 1/2003. 4. Vítová V.: Genetické změny u některých mnohočetných malignit. Klinická onkologie 16, str 77, 2/2003. 5. Vítová V. : Úloha chemoterapie a radioterapie při vývoji vícečetných malignit. Klinická onkologie 16, str. 159 160, 3/2003. 6. Vítová V., Vítová H., Navrátilová M., Pecen L. : Otázka kouření u pacientů s vícečetnými malignitami, VII. ostravské dny podpůrné terapie v onkologii, duben 2003. 7. Vítová V., Pecen L., Vítová H., Navrátilová M., Foretová L. : Vícečetné malignity včasný záchyt následné malignity. Edukační sborník XXVII. brněnské onkologické dny, květen 2003. 13
1.4. Helicobacter pylori v patogeneze karcinomu žaludku. Vedoucí projektu : MUDr. M.Šachlová,CSc. Z rozboru dat Národního onkologického registru ČR vyplývá, že karcinom žaludku poklesl za třicet let v incidenci na polovinu, v mortalitě skoro na třetinu. Kromě změn ve výživě se jako vysvětlení tohoto trendu nabízí také spoluúčast eradikace Helicobactera pylori jako promotora žaludeční kancerogeneze. Také proto je studium role Helicobactera pylori v patogeneze žaludečního karcinomu vysoce aktuální právě v podmínkách ČR, neboť primární onkoprevence skýtá kromě boje proti kouření jen málo oblastí skutečně efektivních zásahů. Objev HP výrazně změnil dosavadní pohled na patogenezi vředové choroby, gastritidy a do značné míry i karcinomu a lymfomu žaludku. Na základě řady studií vyhlásila International Agency for Research on Cancer v roce 1994 Helicobacter pylori za kancerogen 1. třídy. K narušení přirozených cytoprotektivních mechanismů vedou proteolytické enzymy, schopné degradovat žaludeční hlen. Kmeny HP podle schopnosti produkovat cytotoxiny můžeme rozdělit na skupinu produkující vakuolizační toxin Vac A a protein vázaný na cytotoxin Cag A, souhrnně označenou jako skupinu I a na skupinu neprodukující cytotoxiny jako kmeny II. Jsou přesvědčivé doklady o tom, že kmeny typu I mají dominantní úlohu při rozvoji zánětu. Bylo prokázáno, že až 70% všech kmenů HP je Cag A pozitivních. Cílem práce je zjistit výskyt kmenů Helicobactera pylori (HP) a zvláště kmenů produkujících cytotoxiny u pacientů s karcinomem žaludku a u kontrolní skupiny zdravých a nepříbuzných jedinců v České republice. V souboru je zahrnuto 65 pacientů s karcinomem žaludku, z toho 34 mužů s věkovým průměrem 59 let (v rozmezí 39-74 let), 31 žen s věkovým průměrem 56 (v rozmezí 26-85 let). V souboru je 24 osob starších 60 let, proto jsme zvlášť statisticky hodnotili celý soubor a zvlášť jsme vybrali ze souboru mladší 60 let. Inoperabilní nález byl u 9 pacientů. Výskyt karcinomu žaludku u dalších členů rodiny uvádělo 7 pacientů. V minulosti se 8 pacientů léčilo pro vředovou chorobu. Kontrolní skupina 35 osob je sestavena z 20 mužů a 15 žen. Jedná se o zcela zdravé osoby vyšetřované v rámci dárcovství krve a v rámci pravidelných preventivních prohlídek. Průměrný věk mužů je 42 let (v rozmezí 18-45 let), průměrný věk žen je 51 let (v rozmezí 18-55 let). 14
Pro serologické vyšetření jsme použili krevní sérum vyšetřovaných osob. Resekáty žaludku jsme znovu nehodnotili, ale pouze použili slovní popis histologického nálezu (pacienti byli operováni na různých pracovištích). 1. Stanovení protilátek proti H.pylori bylo provedeno metodou ELISA. Byla použita diagnostická souprava Anti H.Pylori, IgA,IgG a IgM Microptate ELISA firmy MONOBIND /USA/ s biotinylovaným celobuněčným antigenem. Souprava obsahuje 5 kalibrátorů s deklarovaným obsahem protilátek a umožňuje kvantitativní hodnocení výsledků v UI/ml. 2. Detekce invazivních antigenů 120 CagA a 87 Vac A H.pylori byla provedena metodou western-blot (WB)- Immunoblot H. pylori IgA,IgG firmy MIKROGEN (Německo). Metoda dovoluje stanovení jednotlivých antigenních determinant H.pylori. 3.Helicobacter pylori nebyl hodnocen v resekátech žaludku s tumorem. Fischerovým testem byl zhodnocen podíl pacientů s protilátkami proti cytotoxickým kmenům v příslušných srovnávaných skupinách. Na hladině významnosti p< 0,001 jsme prokázali statisticky významný rozdíl ve výskytu cytotoxických kmenů H.P. u pacientů s karcinomem žaludku oproti kontrolnímu souboru. Neprokázali jsme statisticky významný rozdíl podle lokalizace nebo histologického typu nádoru. U bezpříznakových příbuzných našich pacientů z 31 rodin žijících trvale s nimi kontaktu jsme zjistili invazivní kmeny u 56 osob oproti 20 osobám, kde agresivní cytotoxické kmeny nebyly zjištěny. Prokázali jsme vyšší prevalenci protilátek proti invazivním kmenůmhp u pacientů s karcinomem žaludku než u kontrolního souboru Neprokázali jsme statisticky významný rozdíl u pacientů s lokalizací nádoru v distální části žaludku než v proximální u pacientů s intestinálním typem karcinomu než u difuzního. Prokázali jsme převahu agresivních kmenů u bezpříznakových příbuzných žijících trvale v kontaktu s našimi pacienty. Náš soubor může být zatížen chybou malých čísel. Přesto se však zdá, že kmeny produkující cytotoxiny mají z hlediska patogeneze žaludečního karcinomu podstatný význam. V českém písemnictví, pokud víme, nebyl podobný soubor publikován. 15
Publikace a přednášky : 1. ŠACHLOVÁ, Milana, KAPIČKOVÁ, M. Výskyt agresivních kmenů H. pyroli u pacientů s karcinomem a lymfomem žaludku. 9. Moravsko-západoslovenské mikrobiologické dny, Brno, 5. - 7. 6. 2000. 2. ŠACHLOVÁ, Milana, KAPIČKOVÁ, M. Výskyt Cag A a Vac A pozitivních kmenů Helicobactera pylori u pacientů s karcinomem žaludku a u kontrolní skupiny. 24. Brněnské onkologické dny a 14. konference SZP, 24. - 26. 5. 2000. abstrakta, s. 210. 3. ŠACHLOVÁ, Milana, KAPIČKOVÁ, M. Výskyt Vac A a Cag A pozitivních kmenů Helicobactera pylori u pacientů s karcinomem žaludku a v jejich rodinách. 25. Brněnské onkologické dny a 15. Konference SZP, 30. 5. - 1. 6. 2001, edukační sborník, s. 254. 4. 4. KAPIČKOVÁ, M., ŠACHLOVÁ, Milana. Invazivní kmeny H. Pylori u onkologických pacientů a jejich rodinných příslušníků. 34. Dni klinickej mikrobiológie. Tatranská Lomnica, 3. - 5. 5. 2001, Správy klinickej mikrobiológie, s. 71 5. Šachlová M: Role kmenů HP v žaludeční kancerogenezi- Lékařské listy,příloha Zdravotnických novin 2003 16
P 2 : Genetika nádorové predispozice Koordinátorka programu : MUDr. L. Foretová 2.1. Genetické poradenství Vedoucí projektu : MUDr. Lenka Foretová, Spolpráce : MUDr. Marie Navrátilová, Dita Hanousková, Blanka Dvořáčková Projekt se věnoval dalšímu zkvalitnění genetického poradenství pro hereditární formy nádorů, přípravou edukačních materiálů a vytvořením databáze klinických údajů u geneticky testovaných probandů. V časopise Klinická onkologie č.1, 2003 byl publikován souhrnný dokument pracovního kolektivu odborníků Doporučené zásady péče o nemocné s nádory prsu a vaječníků a zdravé osoby se zárodečnými mutacemi genů BRCA1 nebo BRCA2, který je důležitým materiálem pro klinické pracovníky. Tento článek podává přehledně doporučení pro klinickou péči o vysoce rizikové pacienty s hereditární dispozicí ke karcinomu prsu a ovaria. Dokument vznikl na základě konsensu odborníků různých profesí, kterého bylo dosaženo po konzultačních jednáních. Byla rozvinuta spolupráce s lékaři jiných zaměření. Hereditární problematika nádorů byla přednášena praktickým lékařům na vzdělávacích akch IPVZ. Byla provedena informační akce. Všem praktickým lékařům na Moravě byly zaslány instrukce k vyhledávání hereditárních forem nádorů a odborné monografie popisující problematiku (Manuál prevence a časné detekce nádorových onemocnění). Pro pacienty byla provedena reedice brožury Dědičnost jako rizikový faktor pro vznik nádorů s revizí textu. Jedná se o důležitý edukační materiál, který poskytujeme dalším pracovištím. Proběhla příprava materiálu Standardní postupy pro diagnostiku BRCA1/2 mutací. Tyto materiály byly vypracovány, jsou součástí webových stránek www.uhkt.cz. Byla vytvořena databáze klinických dat, která nám umožní hodnotit klinické údaje u pacientů s hereditární etiologií onemocnění. 17
2. 2. Optimalizace laboratorních metod genetického testování Vedoucí projektu : Mgr. Miroslava Lukešová, Spolupráce : Mgr. Eva Macháčková PhD., MUDr. Lenka Foretová, Hana Pavlů, i) Detekce intragenových přestaveb V intronických sekvencích BRCA1 genu se vyskytují s nezvyklou četností Alu-repetitivní sekvence, které způsobují zvýšenou náchylnost k rozsáhlým intragenovým rekombinacím. V Holandsku představují intragenová přeskupení BRCA1 genu 1/3 všech detekovaných patogenních mutací u rodin s dědičným syndromem nádoru prsu/ovaria. Předpokládá se, že v ostatních zemích zodpovídají BRCA1 delece a duplikace asi za 5-10% všech BRCA1 mutací. Zda jsou přítomny intragenové přeskupení BRCA1 genu také v české populaci a jaký je jejich podíl není doposud nic známo. K detekci intragenových přeskupení využíváme metodu MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), což je nová metoda detekce neobvyklého počtu kopií jednotlivých exonů. Podstatou metody MLPA je multiplex PCR reakce, ve které je současně amplifikováno až 45 specifických sekvencí s využitím pouze jednoho páru PCR primerů. Separaci vzniklých amplifikačních produktů provádíme na ALF express II automatickém DNA sekvenátoru za využití software fragmentační analýzy. Relativní plocha vrcholů jednotlivých amplifikačních produktů nám po srovnání s výsledkem kontrolní reakce ukazuje relativní počet kopií cílové sekvence. V současné době jsme začali metodou MLPA testovat první pacienty s dědičnou formou karcinomu prsu/ovaria, u kterých nebyla nalezena mutace v kódující sekvenci BRCA1 a BRCA2 genů po vyšetření screeningovými metodami vycházejícími z PCR reakce. Také jsme oslovili zahraniční výzkumná centra s žádostí o zaslání vzorků DNA s pozitivně potvrzeným nálezem intragenového přeskupení BRCA1 genu, které bychom chtěli použít jako pozitivní kontrolu. V roce 2004 budeme testovat všechny rodiny s hereditární formou ca prsu a ovaria, u kterých nebyla dosud nalezena mutace v genech BRCA1/2. 18
2.3 : Ověření významnosti vybraných mutací genů nádorové predispozice Vedoucí projektu :MUDr. Lenka Foretová Spolupráce : Mgr. Eva Macháčková PhD., Hana Pavlů, Mgr. Miroslava Lukešová, MUDr. Marie Navrátilová, Blanka Dvořáčková, Dita Hanousková, Veronika Foltánová U mnoha testovaných žen nacházíme missense varianty v BRCA1/2 genech, které jsou označeny jako varianty neznámého významu (unknown variants). V BRCA1 genu jsme doposud detekovali 12 a v BRCA2 genu 11 variant neznámého významu. Ve většině případů se jedná o missense nukleotidové substituce, ve dvou případech potom o deleci a inzerci. Naším úkolem je srovnat četnosti výskytu těchto variant ve skupině pacientů s předpokládanou genetickou predispozicí ke karcinomu prsu a ovaria, a její četnosti v běžné, onemocněním nezatížené, populaci. Podařilo se nám kompletovat soubor padesáti žen starších 60-ti let, které tvoří naši kontrolní skupinu zdravých nepříbuzných jedinců bez výskytu sledovaného onemocnění v rodinné anamnéze. U těchto žen jsme prováděli odběr periferní krve, ze které jsme izolovali DNA. Doposud jsme vyšetřili polovinu žen z kontrolní skupiny na přítomnost všech 23 sekvenčních variant neznámého významu v genech BRCA1/2. Metodou heteroduplexní analýzy jsme detekovali fragmenty s aberantní mobilitou, které jsme následně sekvenovali na ALF express II automatickém DNA sekvenátoru. Jednu variantu neznámého významu v BRCA1 genu se nám už podařilo detekovat také v kontrolní skupině. Pokud se zkoumaná varianta vyskytuje v kontrolní skupině se stejnou četností jako u pacientů s předpokládanou genetickou predispozicí, je velmi nepravděpodobné, že by mohla mít vliv na vznik onemocnění. Na tomto výzkumu spolupracuje VŠ studentka molekulární biologie Veronika Foltánková, která v současné době provádí heteroduplexní analýzu u vzorků DNA druhé poloviny kontrolní skupiny. V roce 2004 dokončíme testování kontrolní skupiny a pokusíme se ji rozšířit o další zdravé ženy starší 60-ti let bez rodinné anamnézy a tím zpřesnit výsledky analýzy. 19
Publikace a přednášky : 1. Foretova L, Machackova E, Navratilova M, et al. BRCA1 and BRCA2 mutations in women with familial or early-onset breast/ovarian cancer in the Czech Republic. Submitted manuscript 2. Claes K, Poppe B, Machackova E, Coene I, Foretova L, De Paepe A and Messiaen L. 2003. Differentiating pathogenic mutations from polymorphic alterations in the splice sites of BRCA1 and BRCA2. Genes Chromosomes Cancer 37:314-320. 3. Trkova M., Foretova L., Kodet R., Hedvicakova P., Sedlacek P. A Li-Fraumeni syndrome family with retained heterozygosity for germline TP53 mutation in tumors. Cancer Genetics and Cytogenetics, 145, 2003 p. 60-64. 4. Bartoňková H., Foretová L., Helmichová E a kol. Doporučené zásady péče o nemocné s nádory prsu a vaječníků a zdravé osoby se zárodečnými mutace genů BRCA1 nebo BRCA2. (The recommendation of care for patients with breast and ovarian cancer and healthy individuals with germline mutations in BRCA1/2 genes). Klinická onkologie, 2003, roč. 16, č. 1, s. 28-34 5. Svobodník A., Abrahámová J., Foretová L., Dušek L.: Rizikové faktory vzniku karcinomu prsu. In Abrahámová J., Dušek. L., a kol. Možnosti včasného záchytu rakoviny prsu. Grada 2003. S. 41-53. ISBN80-247-0499-4. 6. Foretová L., Navrátilová M., Hanousková D., Pavlů H., Lukešová M.Genetické vyšetření v prevenci nádorů. Onkologie pro praktické lékaře. Postgraduální medicína, příloha. 6/2003, roč. 5. S. 4-9. 7. Navrátilová M., Hrubá M., Foretová L.: Dědičná forma nádorů vaječníků a prsu. Úloha genů BRCA1/2 a jejich klinické testování. Gynekolog, č.3, 2003 8. Krutílková V., Trková M., Kodet R., Sumerauer D., Nekolná M., Seemanová E., Vodvářka P., Foretová L., Goetz P., Sedláček Z. Syndrom Li-Fraumeni. Čs pediatrie 9/2003, roč. 58,s.552-555. 20
9. Foretova L., Navratilova M., Hanouskova D., Pavlu M., Lukesova M.., Kalabova R., Petrakova D., Valik D. Hereditary Breast and Ovarian Cancer-Genetic Counseling and Testing Approach in the Czech Republic. XIX. International Genetics Congress. Melbourne. Australia 6.-11.7.03. Poster. Abstract book p. 287. 10. Foretová L., Navrátilová M., Hrubá M., Pavlů H., Lukešová M., Palácová M., Petráková K. Genetické testování a zásady péče o nosičky mutace v BRCA1/2 genech v ČR. 8. Celostátna pracovná konferencia SEKCAMA SOS SLS. Bratislava 25.4.03 11. Szabo C., Coutanson C., Durocher F., Barjhoux L., Foretova L., Lubinski J., Bressac de Paillerets B., Lasset C., Lenoir G., Couch F., Stoppa-Lyonnet D., Sinilnikova O., Simard J., Goldgar D., and Breast Cancer Linkage Consortium. Contribution of CHEK2 1100delC to familial breast cancer. BCLC conference. Madrid 2.-4.6.2003 12. P.Plevová, A. Křepelová, M.Papežová, E. Sedláková, R. Čuřík, L. Foretová, J. Palas, J. Novotný, J.Nieslanik, Z. Kolář. : Immunohistochemical detection of the hmlh1 and hmsh2 proteins in hereditary and sporadic colon cancer. ECCO 12 (the European Cancer Conference), 21.-25.9.2003 Copenhagen, Dánsko. European Journal of Cancer 2003;1(5) Suppl.:S88. ISSN 1359-6349. Abstakt. 13. Foretová L., Navrátilová M., Pavlů H., Lukešová M., Hanousková D., Dvořáčková B., Petráková K., Bartoňková H. Pravděpodobnost nálezu patogenní mutace v genech BRCA1/2 dle typu rodinné anamnézy. 7. Mammologické symposium. Praha. 21.11.03 14. Foretová L. Genetické vyšetření v onkologii-jak poradí praktický lékař? Kurz onkologické prevence v ordinaci praktického lékaře. IPVZ Praha. 4.10.03 15. Foretová L. Význam testování genu BRCA1 a BRCA2 pro prevenci a časnou diagnostiku nádorů ovaria a prsu. Onkogynekologie, Brno. 2.10.03 16. Foretová L. Genetické poradenství v onkologii a jeho specifika. Sjezd lékařské genetiky. Plzeň, 16.-18.9.03 17. Foretová L. Neznámé varianty v genech BRCA1 a BRCA2 a ovařování jejich významnosti. Sjezd lékařské genetiky. Plzeň, 16.-18.9.03 21
18. Foretová L., Navrátilová M., Pavlů H., Hanousková D., Lukešová M. BRCA1/2 a další kandidátní geny v etiologii hereditárních forem nádorů prsu/ovaria. VIII. Onkogenetický den. Praha 11.6.03 19. Foretová L., Lukešová M., Macháčková E. Správná laboratorní praxe pro BRCA1/2 diagnostiku. 7. Celostátní konference DNA diagnostiky, buňěčné a genové terapie. Praha 12.12.03 20. Navrátilová M., Hanousková D., Lukešová m., Pavlů H., Foretová L.: Péče o zdravé ženy a muže s potvrzenou mutací BRCA1/2. 7. Ostravské dny podpůrné léčby v onkologii. 21. Plevová P., Křepelová A., Papežová M., Sedláková E., Čuřík R., Foretová L., Navrátilová M., Palas J., Novotný, Nieslanik J., Vodvářka P., Horáček J., Kolář Z. Exprese proteinů hmlh1 a hmsh2 v nádorech kolorekta a její klinický význam. 7. Ostravské dny podpůrné péče v onkologii. 25-26.4. 2003, Ostrava. Sborník abstrakt s. 67. 22. Plevová P., Křepelová A., Papežová M., Sedláková E., Čuřík R., Foretová L., Navrátilová M., Palas J., Novotný J., Zapletalová J., Nieslanik J., Dvořáčková J, Utíkal Z., Horáček J., Kolář Z. Hereditární nepolypózní kolorektální karcinom význam imunohistochemické detekce proteinů hmlh1 a hmsh2 při jeho diagnóze. XXVII. Brněnské onkologické dny. 22.-24.5.2003, Brno. Edukační sborník s. 98-99. 23. Foretová L., Navrátilová M., Hanousková D., Křepelová A. Diagnostika hereditární formy nádoru kolorekta-význam pro terapii a prevenci. IX. Pařízkův den. Nový Jičín. 28.2.03 24. Foretová L. Genetické vyšetření v mammologii-diagnostika hereditárních forem nádorů prsu. Seminář. Hranice. 17.4.03 25. Foretová L. Dědičné formy nádoru prsu/ovaria. Klinická genetika-onkogenetika, IPVZ Praha. 16.4.03 22
P 3 : Úloha antionkogenů v maligní přeměně buňky Koordinátorka programu : RNDr. J. Šmardová, CSc. 3.1. Funkční analýza nádorového supresoru p53 Vedoucí projektu : RNDr. J. Šmardová, CSc. A. Analýza p53 u dlaždicobuněčných nádorů hlavy a krku (HNSCC). Projekt je zcela dokončen, rukopis s výsledky byl přijat k publikaci v Oncology Reports. Akumulace proteinu p53 byla zjištěna u 66 % případů (33/50) imunohistochemicky a u 55,1 % případů (27/49) imunoblotingem. Přítomnost mutace byla funkčním testem detekována u 72 % případů (36/50). Šest ze 36 mutací p53 (16,7 %) zachycených metodou FASAY bylo teplotně senzitivních. Ve dvou případech byly jednoznačě detekovány dvě nezávislé bodové mutace. Nebyla nalezena korelace mezi aberací p53 a celkovým přežitím pacientů. B. Analýza p53 u nádorů pankreatu. Projekt byl dokončen, výsledky publikovány v České a slovenské gastroenterologii a hepatologii. Celkem bylo analyzováno 30 vzorků 22 pacientů, z toho 7 vzorků normální tkáně, 11 vzorků chronické pankreatitidy, 1 serózní cystadenom, 2 karcinomy ostrůvkových buněk pankreatu, 7 duktálních adenokarcinomů, jako vedlejší nález byl analyzován 1 intestinální adenokarcinom. Mutace p53 byla nalezena v jednom vzorku adenokarcinomu a ve vzorku intestinálního adenokarcinomu. C. Analýza teplotně senzitivních muatntů p53. Vytvořili jsme soubor celkem 17 ts p53 mutantů, z nichž 12 bylo sekvenováno; určením přesné sekvence DNA byl soubor zmenšen zatím na 15 různých ts mutantů p53. Byl analyzován jejich fenotyp (fenotyp kvasinkových kolonií exprimujících danou variantu p53) a byla určena přesná hodnota jejich teplotní závislosti. U tří mutantů byla testována jejich schopnost reaktivace amifostinem. Výsledky byla prezentovány jako součást publikací v International Journal of Oncology, Oncology Reports a samostatně formou plakátových sdělení. D. Funkční analýza p53 ve 150 vzorcích nádorové tkáně vybraných typů nádorů. Analýza všech vzorků byla dokončena. Analyzovali jsme celkem 16 případů nádoru děložního čípku (nebyla zachycena žádná mutace p53), 18 případů nádoru dělohy (zachyceny 2 mutace 11,1 %), 58 případů nádoru prsu (24 mutací 41,4 % - z toho 2 mutace byly teplotně senzitivní), 47 nádorů ovaria (32 mutací 68,1 % - z toho 1 mutace 23
byla teplotně senzitivní), 3 případy nádoru vulvy (nebyla zachycena mutace), 1 případ karcinomu žaludku (muatce p53), 1 případ sarkomu těla (bez mutace) a 1 trofoblast (bez mutace p53). Výsledky byly zatím prezentovány formou přednášky, budou dále zpracovány a výhledově publikovány (dr. Vojtěšek, dr. Nenutil). E. Funkční analýza p53 u maligních melanomů a nádorů ovária. Byla dokončena analýza p53 u 22 buněčných linií odvozených z maligního melanomu. Nalezeno bylo 5 mutací p53, z toho 3 byly teplotně/chladově senzitivní. Tyto výsledky budou součástí publikace, která bude připravena v 1. polovině roku 2004 (prof. Kovařík, dr. Boudný). Dále bylo analyzováno 8 vzorků odebraných z normální tkáně dělohy (mutace p53 nebyla zachycena) a 4 případy maligního melanomu (mutace p53 nebyla nalezena). Publikace a přenášky : 1. Šmardová J., Pavlová Š., Koukalová H.: Determination of optimal conditions for analysis of p53 status in leukemic cells using FASAY. Pathology Oncology Research 8, No.4, 245-251, 2002 2. Pavlová Š, Mayer J., Koukalová H., Šmardová J.: High frequency of temperature-sensitive mutations of p53 tumor suppressor in acute myeloid leukemia revealed by functional assay in yeast. Int.J.Oncol. 23, No. 1, 121-131, 2003 3. Szkanderová S., Vávrová J., Řezáčová M., Vokurková D., Pavlová Š., Šmardová J., Stulík J.: Gamma irradiation results in phosphorylation of p53 at serine-392 in human T-lymphocyte leukaemia cell line MOLT-4. Folia Biologica 49 (2003) 191-196 4. Vagunda V., Šmardová J., Vagundová M., Jandáková E., Žaloudík J., Koukalová H.: Correlations of breast carcinoma biomarkers and p53 tested by FASAY and Immunohistochemistry. Pathology Research and Practice 199 (2003) v tisku 5. Šmardová J., Kšicová K., Binková H., Krpenský A., Pavlová Š., Rottenberg J., Koukalová H.: Analysis of tumor suppressor p53 status in head and neck squamous cell carcinoma. Oncology Reports přijato do tisku 24
6. Šmardová J., Pavlová Š., Dítě P., Pazourková M., Růžička M., Kroupová I., Hermanová M., Vagundová M.: Funkční analýza nádorového supresoru p53 v normální a nádorové tkáni pankreatu a v tkáni postižené chronickou pankreatitidou. Čes. a Slov. Gastroent. a Hepatol. 57, No. 5, 175-183, 2003 7. Šmardová J.: Vůdčí gen p53. Klinická onkologie 16, No. 5, 238-239, 2003 8. Pavlová Š., Mayer J., Koukalová H., Šmardová J.: Funkční analýza nádorového supresoru p53 u akutní myeloidní leukémie. XXVII. Brněnské onkologické dny, 22.-24. května 2003, Brno 9. Binková H., Šmardová J., Kšicová K., Krpenský A., Rottenberg J.: Nádorový supresor p53 u nádorů hlavy a krku. XXVII. Brněnské onkologické dny, 22.-24. května 2003, Brno 10. Pavlová Š, Mayer J., Koukalová H., Šmardová J.: High frequency of temperaturesensitive mutations of p53 tumor suppressor in acute myeloid leukemia revealed by functional assay in yeast. Functional consequences of TP53 mutations: Characterization of common and rare p53 mutants and relevance to human cancer., IARC, Lyon, Francie30.6.-3.7.2003 11. Pavlová Š., Kšicová K., Šmardová J.: Detection and analysis of temperature-sensitive mutants of tumor suppressor p53. XVII. Biologické dny, Brno, 19.-20.11.2003 12. Nenutil R., Pavlová Š., Šmardová J., Hanzelková Z., Vojtěšek B.: Možnosti imunohistochemické detekce funkčního stavu p53 v nádorech. 30. sjezd českých patologů, 23.-24.5.2003, Brno 13. Šmardová J.: Funkční analýza nádorového supresoru p53 u AML. Seminář katedry molekulární biologie JČU v Českých Budějovicích, 11.11.2003 25
3.2. Transkripční koaktivátory CBP a p300 Vedoucí projektu : RNDr.J.Šmardová, CSc. A. Analýza buněk BM2CBP. Byla dokončena, výsledky byly publikovány v Journal of Hemotherapy and Stem Cell Research a CMLS. B. Analýza buněk BM2p300. Byla dokončena kontrola exprese p300 v buňkách BM2, a to na úrovni RNA (dot bloty) a proteinů (imunobloting). Byly stanoveny růstové křivky a porovnány s růstovými křivkami buněk BM2 a BM2CBP. Byla provedena analýza buněčného cyklu buněk BM2p300, a to po působení TPA, TSA a bez induktorů; byl analyzován fenotyp buněk BM2p300, a to po indukci exprese p300 pomocí zinečnatých iontů a po působení TPA a TSA. Byla stanovena hladina proteinů Myb a Mim-1 a exprese a rozložení proteinu vimentin v buňkách BM2p300, a to po indukci diferenciace pomocí TPA a TSA. Dílčí výsledky byly zatím publikovány formou plakátového sdělení. Publikace a přednášky : 1. Nemajerová A., Šmarda J., Jurdic P., Kubala L., Souček K., Šmardová J.: Trichostatin A suppresses transformation by the v-myb oncogene in BM2 cells. J.Hemotherapy and Stem Cell Res. 12, No.2, 225-236, 2003 2. Zahrádková E., Ševčíková S., Souček K., Šmardová J., Šmarda J.: c-fos but not v-fos protein induces programmed cell death of v-myb-transformed monoblasts. CMLS v tisku 3. Zahradníčková. E., Souček, K., Ševčíková, S., Šmardová, J., Šmarda, J. c-fos but not v-fos protein induces programmed cell death of v-myb-transformed monoblasts. The 11th Euroconference on Apoptosis, Ghent, Belgium, 25.10. - 28.10. 2003 4. Šmarda J., Zahradníčková E., Konečná H., Zdráhal Z., Šmardová J.: Zrání monoblastů BM2 je doprovázeno zvýšenou expresí vimentinu, VII. Pracovní setkání biochemiků a molekulárních biologů, Brno, 29.1.2003 26
5. Nemajerová A., Šmarda J., Zatloukalová J., Šmardová J.: Differential effects of transcription coactivators CBP and p300 on v-mab transformed monoblasts. XVII. Biologické dny, Brno, 19.-20.11.2003 P 4 : Prediktivní onkologie Koordinátor programu : MUDr. V. Vagunda 4.1 Studium mechanismů indukce apoptózy. Vedoucí projektu : Mgr. M.A.Sheard,CSc. Spolupráce: Mgr. L. Dubská. Práce na projektu o mechanismu indukce apoptózy pokračovala v několika směrech. 1. Byla definována role proteinu p53 při regulaci exprese a funkce death receptoru CD95 jak konstitutivní tak indukované gama zářením u buněk karcinomu. Výsledky poskytly přímý důkaz toho, že protein p53 je klíčovým regulátorem exprese receptoru CD95 jeho funkce při zprostředkování apoptózy u buněk karcinomu. Z práce také vyplynulo, že funkční efekt zvýšené exprese CD95 indukované poškozením DNA je zásadně ovlivněn typem buňky. Práce byla zveřejněna v časopise Cancer Research. V rámci objasnění úlohy p53 při regulaci apoptózy zprostředkované death receptory pokračujeme studiem funkčního efektu poškození DNA chemoterapeutiky a gama zářením na indukci apoptózy prostřednictvím receptoru TRAILu. 2. V rámci projektu hodnocení sérových hladin fragmentů cytokeratinu 18 a 19 vznikajících během apoptózy epiteliálních buněk byl vypracován podrobný protokol reflektující kinetiku indukce apoptózy ve zvoleném modelovém systému celotělové expozice UV-záření a byl sestaven vzorek dobrovolníků vhodných pro studii. Práce bude pokračovat detekcí fragmentů cytokeratinu metodou M30 ELISA a korelací výsledků s již zavedenými metodami detekce TPS (fragmenty cytokeratinu 18) a CYFRA 21-1 (fragmenty cytokeratinu 19). Výsledky přispějí ke zjištění, zda je možné zachytit expozici UV-záření pomocí detekce apoptotických markerů v lidském séru, a k rozšíření poznatků o nádorových markerech TPS a CYFRA 21-1. 27
3. Dále jsme sledovali zda a jakým mechanismem ovlivňuje monoklonální protilátka Herceptin, používaná pro léčbu mammárních karcinomů se zvýšenou expresí povrchového receptoru Her-2, apoptózu indukovanou ligandem TRAIL. Přes původní očekávaní vyplývající z obecně anti-apoptotické funkce receptoru Her-2, získané výsledky jasně ukazují, že inhibice funkce tohoto receptoru pomocí Herceptinu vede k potlačení schopnosti ligandu TRAIL indukovat apoptózu u některých buněk prsního karcinomu. Na základě těchto zjištění byl dále zkoumán mechanismus tohoto efektu prostřednictvím studia MAPK a Akt kinázových drah a detekce pro- a anti-apoptotických proteinů u Herceptinem ošetřených buněk. Dílčí výsledky týkající se tohoto projektu byly zatím zveřejněny ve formě plakátových sdělení. Publikace a přednášky: 1. Sheard MA, Uldrijan S, Vojtesek B: Role of p53 in Regulating Costutive and X- Radiation-Inducible CD95 Expression and Function in Carcinoma Cells. Cancer Research 63:7176-84, 2003. 2. Dubská L, Sheard MA: Apoptóza zprostředkovaná death receptory: Úloha FasL a TRAIL při smrti maligních buněk. Klinická onkologie 16:257-264, 2003. 3. Dubská L, Jamborová K., Sheard MA: Downregulation of Her-2 by Herceptin decreases TRAIL-induced apoptosis in breast cancer cells. Journal of Applied Biomedicine 1:S7, 2003. (Abstrakt) 4. Dubska L, Sheard MA: Reduced Akt Activity Corellates with Protection of Breast Cancer Cells from TRAIL-induced Apoptosis. Fourth International Conference on Mechanisms of Cell Death and Disease, Mexico, Nov 14-17, 2003. (Poster) 5. Dubská L: Apoptózy indukovaná receptory TRAILu. Seminář o buňkách a lidech, Bratislava, 7.10. 2003. (Přednáška) 28
4.2: Metody detekce a predikce apoptózy Vedoucí projektu: MUDr.Václav Vagunda 1. Byla dokončena přehledná publikace o morfologických metodách detekce apoptózy (AP) a biomarkerech asociovaných s AP u maligních nádorů (odesláno do tisku v minulém roce obsah práce viz.zpráva za r. 2002). Publikace : Pavlovský, Z., Vagunda, V.: Apoptóza - vybrané metody detekce apoptózy a asociovaných regulačních faktorů na tkáňových řezech z nádorového materiálu. Čes.-slov. Patol., 39, 2003, s. 6-10. 2. Byla dopracována původní vědecká práce o problematice apoptózy u mammárního karcinomu s komplexním vyhodnocením prognosticko-prediktivních faktorů s důrazem na p53, Bcl-2 a proliferaci (odesláno do tisku koncem minulého roku obsah práce viz.zpráva za r. 2002). Publikace : Vagunda, V., Šmardová, J., Vagundová, M., Jandáková, E., Žaloudík, J., Koukalová, H.: Correlations of breast carcinoma biomarkers and p53 tested by FASAY and immunohistochemistry. Pathology Research and Practice, 2003, vol. 199, (v tisku) 3. Byla dokončena retrospektivní studie na souboru B lymfomů pro vyhodnocení prognosticko-prediktivního významu apoptózy a asociovaných biomarkerů, zejména s ohledem na p53 a Bcl-2. Kromě podrobného hodnocení p53 imunohistochemie s více protilátkami, bylo cílem provést detailní statistické vyhodnocení korelací i podrobnou multivariační prognostickou analýzu s doplněnými klinickými daty. Protein p53 byl na soubou 54 lymfomů vyhodnocen protilátkami DO1 a DO11, následně DO7. Protilátky DO1 a DO11 prokázaly akumulaci proteinu p53 pouze v 15% 29