SOUÈASNÉ MOŽNOSTI HODNOCENÍ EJAKULÁTU PSÙ

SOUÈASNÉ MOŽNOSTI HODNOCENÍ EJAKULÁTU PSÙ CURRENT OPTIONS IN EVALUATION OF DOG EJACULATE JIØÍ ŠICHTAØ 1, ONDØEJ ŠIMONÍK 1, ADÉLA DOKOUPILOVÁ 2, IVONA SVOBODOVÁ 2 1 Katedra veterinárních disciplín, Fakulta agrobiologie, potravinových a pøírodních zdrojù, ÈZU 2 Katedra obecné zootechniky a etologie, Fakulta agrobiologie, potravinových a pøírodních zdrojù, ÈZU SOUHRN V souèasné dobì je v ÈR stále více poptávaná asistovaná reprodukce psù. Zatímco u fen se jedná pøedevším o provedení inseminace, u psù je to odbìr a zhodnocení ejakulátu, pøípadnì výroba krátkodobì èi dlouhodobì konzervované inseminaèní dávky. Hodnocením ejakulátu je zaruèeno využívání pouze kvalitních, tj. fertilních psù v reprodukci. V podmínkách veterinární praxe ÈR lze doporuèit rùzné metody hodnocení, avšak je nutné zdùraznit, že u psù prozatím neexistují jasnì stanovená kritéria kvality ejakulátu. Základními laboratorními postupy by mìlo být zhodnocení objemu a barvy ejakulátu. Dále by mìla být stanovena koncentrace, motilita a morfologie spermií. Pokud bude chtít veterinární lékaø rozšíøit tyto základní metody hodnocení, lze doporuèit hodnocení funkèního stavu spermií pomocí HOS-testu èi stanovení pomìru živých a mrtvých spermií v ejakulátu. Klíèová slova: pes, ejakulát, motilita, morfologie, HOS-test, živé/mrtvé spermie SUMMARY Currently there is increasing demand for an assisted reproduction in dogs. While in bitches it concerns of insemination in males of dogs it consisted in collection and evaluation of ejaculate, eventually production of short- or long-term preserved insemination dose. The evaluation of ejaculate guarantees using only high-quality, i.e. fertile dogs in reproduction. It is possible to recommend various methods of ejaculate evaluation in veterinary practise in the Czech Republic, however it is necessary to emphasize that there are no strictly determined criteria of ejaculate quality, yet. The basic laboratory procedure should involve evaluation of volume and colour of ejaculate. Further, the concentration, motility and morphology of sperms should be determined. If a veterinarian would like to extend these basic methods of evaluation it is possible to recommend evaluation of functional status of sperms using HOS-test or assessment of dead and live sperm ratio. Key words: dog, ejaculate, motility, morphology, HOS-test, dead/live sperms Úvod Dùvodù k zhodnocení ejakulátu psù mùže být nìkolik. Obecnì se dá øíci, že se kvalita ejakulátu zjišśuje na úrovni inseminace èi krytí, konzervace ejakulátu a z diagnostických dùvodù (Kutzler, 2005). Ejakulát psù lze hodnotit makroskopicky, mikroskopicky, a to objektivnì nebo subjektivnì. Každá metoda má svá pro a proti a pøi její volbì je zapotøebí zvážit metodické možnosti každé laboratoøe. Výsledky hodnocení ejakulátu se vztahují pøedevším k predikci schopnosti fertilizace a nejèastìji se hodnotí objem, barva a vzhled, ph, koncentrace spermií, motilita a morfologie. Existují i složitìjší vyšetøovací metody, jako je napøíklad sledování integrity bunìèné membrány (Karger et al., 2014), posuzování potenciálu pøežitelnosti spermií (Hermansson a Forsberg, 2006), hodnocení kapacitace (Petrunkina et al., 2004), akrozomu (Veznik et al., 2003), integrity DNA (Garcia-Macias et al., 2006) a mitochondrií spermií (Gravance et al., 2001). Do veterinární andrologické praxe se etablovaly pøedevším prvnì zmínìné metody, ovšem je nutné dodat, že u psù doposud neexistují jasnì stanovená kritéria kvality ejakulátu (Barber, 2010). Odbìr semene je prvním krokem ke zjištìní jeho kvality a kvantity a proces samotný by mìl být proveden tak, aby se maximálnì zachovaly fertilizaèní schopnosti ejakulátu. Proto je nezbytné pøipravit vše potøebné ještì pøed vlastním odbìrem ejakulátu. Jedná se pøedevším o sbìrnou nádobu, lubrikaèní gel, mikroskop, podložní a krycí sklíèka, pipetu, chemikálie a další potøebné laboratorní vybavení (Barber, 2010). Pes ejakuluje ve tøech frakcích (tab. 1). První frakce (pøedspermiová) je pùvodem 210

Souèasné možnosti hodnocení ejakulátu psù Tab. 1: Hlavní charakteristiky tøí frakcí ejakulátu u psù (Zdroj: England et al., 1990). Charakteristika 1. frakce 2. frakce 3. frakce Objem (ml) 0,1 2 ( 0,33) 0,1 3 ( 1,17) 1,2 až > 20 Barva èirá až matná šedobílá, bílá, mléènì bílá èirá Konzistence vodnatá mléèná vodnatá ph ( ) 6,37 6,1 7,2 Doba trvání (s) 5 90 ( 13,5) 5 300 ( 52,4) 60 1200 ( 365,5) prostatická. Druhá frakce pochází z ocasu nadvarlete, má bílé zbarvení a je bohatá na spermie (Kustritz, 2007). Následnì dochází k ejakulaci tøetí frakce. Ta se skládá z prostatické tekutiny a je za normálních podmínek èirá. Právì na poslední frakci je podle Kutzler (2005) potøeba se více zamìøit u psù, u kterých se vyskytují abnormality pøedkožky, hematurie, krev v ejakulátu nebo jakýkoliv jiný náznak onemocnìní prostaty. Obecnì se pro hodnocení kvality ejakulátu používá pouze druhá frakce, pokud je ale z nìjakého dùvodu potøeba odebrat všechny tøi frakce, Barber (2010) doporuèuje odebrat každou zvlášś. Manipulace se vzorkem Spermie jsou køehké a náchylné k poškození. Pøi odbìru a manipulaci je velmi dùležité vyhýbat se vystavování obzvláštì dvìma typùm poškození toxickými chemikáliemi a náhlými teplotními zmìnami (Barber, 2010). Jak uvádí Kutzler (2005), ejakulát by mìl být uchováván v rozmezí mezi tìlesnou (37 C) a pokojovou teplotou (20 C), jakožto preventivní opatøení proti poškození spermií, a Barber (2010) dodává, že by mìl být takovýmto podmínkám vystavován maximálnì jednu až dvì hodiny. Pokud je požadována delší doba uskladnìní, je vhodné rozøedit ejakulát ochranným a výživným médiem a pomalu jej ochlazovat na teplotu 4 5 C. Aspekty hodnocení ejakulátu u psù Hodnocením ejakulátu se provìøuje pøedevším schopnost fertilizace. Ve vìtšinì veterinárních ordinací se nejèastìji hodnotí objem, barva, vzhled a ph ejakulátu, dále pak koncentrace, pohyblivost a morfologie spermií. Pro spermie psù není vytvoøen standard, ale ejakulát je možné hodnotit na základì kritérií stanovených Svìtovou zdravotnickou organizací (WHO) pro muže. Objem Objem spermatu není u psù indikátorem jeho kvality, nicménì jeho mìøení je dùležité pøi výpoètu celkového poètu spermií v získaném vzorku (Barber, 2010). Objem ejakulátu mùže být hodnocen v kalibrovaném kuželu používaném pro odbìr a závisí hlavnì na velikosti psa (u psa < 20 kg ž. hm. èiní objem ejakulátu 1 22,5 ml, u psa > 20 kg ž. hm. je to 2 45 ml), na velikosti prostaty, na stáøí psa, na frekvenci odbìru semene a na úrovni erotizace (Dubiel, 2004). Také se mùže lišit podle toho, kolik vzorku je odebráno z první, druhé a tøetí frakce (Kustritz, 2010). Pokles objemu ejakulátu se objevuje v pøípadì mírné prostatické hyperplazie, prostatických cyst, zánìtlivých lézí prostaty a varlat, zánìtu nadvarlat, chámovodu a moèové trubice a pøi výskytu slabého libida (Payan-Carreira et al., 2010). Barva a vzhled Barva celého ejakulátu závisí na odebraném objemu tøetí frakce, na koncentraci spermií v mililitru a na pøítomnosti nezárodeèných bunìk (Payan-Carreira et al., 2010). Zakalení vzorku se bìžnì hodnotí na stupnici od 0 do 5, kde vzorek hodnocený èíslem 5 je nejménì prùsvitný, zbarvený jako mléko (Barber, 2010). Normální barva zdravého ejakulátu je mléènì bílá (Kustritz, 2010). Zakalené èi mléènì zbarvené vzorky témìø vždy obsahují spermie, ale musí být vždy mikroskopicky kontrolovány, jelikož u psù s azoospermií je ve spermatu nadmìrné množství tukových kapének, což zpùsobuje vzhled zdravého semene. Prùhledný vzorek neobsahuje žádné spermie. Žluté zbarvení ejakulátu indikuje kontaminaci moèí a napøíklad u lidí se vyskytuje v pøípadì onemocnìní žloutenkou èi po požití nìkterých vitaminù. Hnìdé zbarvení indikuje pøítomnost staré krve a èervené zbarvení pøítomnost èerstvé krve. Nejbìžnìjšími pøíèinami hemospermie u psù jsou prostatická onemocnìní (Barber, 2010). Zelená barva ejakulátu indikuje infekci (Kustritz, 2010). ph Pøínos hodnocení ph ejakulátu je sporný. Hodnoty ph nezøedìného psího semene se pohybují mezi 6,4 až 6,8 (Barber, 2010). Hodnota ph se mùže mìnit v pøípadì výskytu onemocnìní prostaty nebo pokud je vzorek kontaminován moèí. Zmìna ph ovlivòuje životnost a motilitu spermií. Mùže být zpùsobena použitím pøílišného množství lubrikaèního gelu a nevhodného èištìní èi dezinfekce výbavy pro odbìr ejakulátu (Barber, 2010). Podle Kustritz (2007) zatím ale nebyly publikovány žádné údaje srovnávající techniky analyzující ph nebo pøesnìjší popis klinicky namìøených hodnot ph semene psù. Koncentrace spermií Celkový poèet spermií v ejakulátu je násobek jeho koncentrace a objemu a závisí na velikosti varlat (Barber, 2010). Obecnou smìrnicí pro celkový poèet spermií v ejakulátu je množství 10 milionù spermií na 1 libru (0,454 kg) živé hmotnosti zvíøete (England, 1990). U psù by mìla být koncentrace spermií v kvalitním ejakulátu vyšší 211

než 300 milionù/ejakulát (Kustritz, 2010). Nicménì tato hodnota je ovlivnìna velikostí plemene (Lindeforsberg, 1991), vìkem a sexuální aktivitou psa (Amann, 1986). Poèet spermií se snižuje s frekvencí odbìrù, což je pravdìpodobnì zpùsobeno ubýváním zásob v nadvarlatech. Pes mùže ejakulovat oligospermický (snížený poèet spermií v ejakulátu) èi aspermický (absence spermií v ejakulátu) vzorek z dùvodu úzkostlivých stavù èi pocitù bolesti (Barber, 2010). Pokud není u odbìru psa pøítomna háravá fena, mùže být koncentrace v ejakulátu také nižší (Payan- -Carreira et al., 2010). Oligospermický a aspermatický ejakulát se tudíž mùže vyskytnout i u psa bez poruchy spermiogeneze. V takovém pøípadì by mìl být vzorek vyšetøen na koncentraci alkalické fosfatázy (Frenette et al., 1986), aby se odebírající ujistil, že byl odebrán kompletní ejakulát. Nejpoužívanìjším zpùsobem urèování koncentrace spermií je poèítání spermií pomocí mikroskopu hematocytometrickou metodou. Tato technika sice zabírá nejvíce èasu, ale je nejpøesnìjší ze všech metod mìøících poèet spermií v ejakulátu a je považována za zlatý standard (Kustritz, 2007). Pro urèení koncentrace spermií lze také využít automatizované systémy, jako je napø. spektrofotometr, prùtoková cytometrie nebo poèítaèem øízená analýza spermií (CASA computer assisted sperm anaylysis) (Rijsselaere et al., 2005). Motilita spermií Aèkoliv je motilita pouze jedním z nìkolika dùležitých indikátorù fertility spermií, zaèala se hodnotit jako první a i nadále patøí mezi nejvyužívanìjší hodnocené parametry (Martinez, 2004). Motilita je vyjadøována procentuálním zastoupením motilních nebo progresivnì motilních spermií ve vzorku (Johnston et al., 2001), dále charakteristikou pohybu a rychlostí pohybu spermií (Pena et al., 2006). Navíc poèet progresivnì motilních spermií obvykle úzce koreluje s poètem spermií, které jsou morfologicky v poøádku (Agarwal a Said, 2003; Ellington et al., 1993). U zdravého psa se v kvalitním ejakulátu vyskytuje 70 90 % motilních spermií (Iguer-ouada a Verstegen, 2001), ale tato hodnota mùže být nižší po delší sexuální abstinenci psa. Motilita mùže být narušena vystavením vzorku teplotnímu šoku, kontaminací vodou, moèí, krví a lubrikaèními gely a výskytem infekèního onemocnìní (Payan-Carreira et al., 2010). Dále bývá ovlivnìna délkou sexuální abstinence. U psù, kteøí neejakuovali delší dobu, se èasto vyskytuje snížená pohyblivost pøi první ejakulaci, nicménì pøi druhé, následující brzy po první, jsou již pohybové schopnosti spermií mnohem lepší (Barber 2010). Na druhou stranu Boucher et al. (1958) a England (1999) nepozorovali vliv frekvence odbìrù na motilitu. Urèitý vliv na poèet motilních spermií mùže mít i vìk psa, protože napø. u lidí byl zaznamenán pokles procentuálního zastoupení motilních spermií o 0,25 % za rok u mužù starších 45 let (Pasqualotto et al., 2005). Jak již bylo øeèeno, jedním z èinitelù, který znaènì ovlivòuje motilitu spermií, je teplota. Optimální teplota pro zjišśování této základní vlastnosti se ve vìdeckých publikacích ponìkud liší. Bartlet (1962) nebo Threlfall (2003) uvádìjí, že motilita je u psího ejakulátu lépe zachována, pokud je vzorek uchováván pøi laboratorní teplotì (tj. 22 25 C). Na druhou stranu Rigau et al. (2001) uvádí jako ideální teplotu 37 C, zatímco Payan- Carreira (2010) se ve své publikaci zmiòuje o teplotì 39 C. Obecnì lze øíci, že pøi hodnocení motility by se mìl vzorek udržovat ve stálé teplotì bez náhlých zmìn teplot (Kustritz, 2007) a mikroskop nemusí být vybaven vyhøívací destièkou, pokud je analýza provedena za 1 2 minuty po nakápnutí vzorku na sklíèko, protože v jiném pøípadì dojde ke snížení motility (Threlfall, 2003). Mìøení motility optickým mikroskopem Jednou z nejbìžnìjších metod používaných k analýze pohyblivosti spermií je vizuální hodnocení optickým mikroskopem s fázovým kontrastem pøi zvìtšení 10, 20 nebo 40 (Feldman a Nelson, 1996). Tato metoda odhadnutí poètu pohyblivých spermií je nejjednodušší, nejrychlejší a finanènì nejménì nároèná (Martinez, 2004), nicménì je velmi subjektivní a zatížená v mnoha pøípadech významnou systematickou chybou (Payan-Carreira et al., 2010). K hodnocení motility je potøeba nakápnout vzorek na èisté podložní sklíèko a vzorky s velmi vysokou koncentrací je lepší nejdøíve rozøedit zahøátým fyziologickým roztokem (Rigau et al., 2001). Zhodnotit by se mìlo nejménì 5 polí, pøièemž se posuzuje smìr a rychlost pohybu. Pøi rychlém pohybu není patrna zploštìlá èást hlavièky a spermie pøeplavou zorné pole pøímoèaøe za 2 3 s (Threlfall, 2003). Poèítaèová analýza spermatu (CASA) Pøi subjektivním mìøení motility ejakulátu svìtelným mikroskopem je u lidí i u zvíøat udávána variabilita výsledkù mìøení na stejných vzorcích zhruba 30 60 % (Verstegen et al., 2002). Aby se pøedešlo takovýmto nepøesnostem v mìøení, zaèaly se hledat jiné metody hodnocení motility spermií, které by hodnotily vzorky objektivnì. Výsledkem tohoto hledání bylo vyvinutí poèítaèové analýzy spermatu (CASA). CASA umožòuje získávat objektivní a velmi pøesné informace o pomìru pohyblivých bunìk v ejakulátu a kvalitì jejich pohybu (Martinez, 2004) a zobrazuje drobné zmìny v pohybu spermií, které nemohou být identifikovány obvyklými subjektivními metodami. Díky CASA mùže být velmi rychle (<1 min) individuálnì zanalyzováno najednou nìkolik tisíc spermií, což je pøi každodenním používání velmi praktické. Navíc informace získané díky CASA mohou být dùležité napøíklad pøi sledování vlivu podmínek životního prostøedí na kvalitu spermií a pro toxikologické studie. Jediným problémem tohoto zaøízení je relativnì vysoká poøizovací cena, potøebná standardizace (minimální velikost komùrek na podložním sklíèku, poèet snímkù za sekundu, doba trvání analýzy atd.) a ovìøování správnosti nastavení pøed každým použitím (nastavení CASA pro èerstvé semeno není optimální pro mìøení semene konzervovaného nebo dlouhodobì konzervovaného a naopak). Pøesnou standardizaci získaných hodnot pro motilitu a rychlost spermií u psù je však obtížné stanovit v dùsledku nedostateèné uniformity a používání rozdílných systémù CASA mezi laboratoøemi (Rijsselaere et al., 2012). 212

Souèasné možnosti hodnocení ejakulátu psù Parametry motility, které se vìtšinou pomocí CASA hodnotí u každého vzorku, jsou procento motilních spermií, prùmìrná rychlost na dráze (VAP, z ang. velocity average pathway) v μm/s, pøímoèará rychlost (VSL, z angl. velocity straight line) v μm/s, køivoèará rychlost (VCL, z angl. curvilinear velocity) v μm/s, amplituda laterálního vyboèení hlavièky spermie (ALH, z angl. amplitude of lateral head displacement) v μm, frekvence køížení (BCF, z angl. beat cross frequency), což je frekvence, ve které hlavièka spermie protíná prùmìrnou dráhu spermie udávaná v Hz, pøímost (STR, z angl. straightness), což je prùmìrná hodnota pomìru VSL/VAP uvádìná v procentech (podobnost bunìèné dráhy ke stoprocentní pøímce) a linearita (LIN, z angl. linearity), což je prùmìrná hodnota pomìru mezi VSL/VCL uvádìná v procentech (Iguer-ouada a Verstegen, 2001) (obr. 1). V dnešní dobì se ovšem èím dál více objevuje názor, že pouze hodnocení motility spermií v ejakulátu jako celku neposkytuje dostateèné informace o jeho kvalitì (Martinez-Pastor et al., 2005). Vìdecká komunita zabývající se hodnocením ejakulátu jak u lidí, tak u zvíøat se totiž shoduje na existenci subpopulací spermií. Bylo zjištìno, že se v ejakulátu nevyskytuje pouze homogenní populace spermií, kde vykazují spermie stejné chování, ale z heterogenních subpopulací, ve kterých mimo jiné vykazují spermie rùzné charaktery pohybu (Quintero-Moreno et al., 2003). Právì díky vyvinutí CASA systému lze tyto subpopulace hodnotit a získat tak mnohem pøesnìjší data k odhadu fertility psù (Pena et al., 2006). Mìøení motility prostøednictvím SQA Pøed pár lety byl pøedstaven nenákladný a lehce ovladatelný pøístroj k hodnocení èerstvého a kryokonzervovaného psího spermatu, tzv. analyzátor kvality spermatu (z angl. Sperm Quality Analyzer, SQA) (Iguer-Ouada a Verstegen, 2001; Rijsselaere et al., 2002). Toto poloautomatické zaøízení detekuje variace v optické hustotì svìtelného paprsku procházejícího kapilární trubièkou s pohyblivými spermiemi. Svìtloèivné buòky zaznamenávají kolísání v optické hustotì a pøevádìjí tuto informaci digitálnì prostøednictvím matematických algoritmù na numerický výsledek nazývaný index pohyblivosti spermií (z angl. sperm motility index, SMI). Výsledky obdržené použitím SQA jsou srovnatelné s výsledky získanými prostøednictvím Obr. 1: Schematické pøedstavení rùzných rychlostních parametrù mìøené CASA systémem, kde VSL = pøímoèará rychlost, VAP = prùmìrná rychlost na dráze, VCL = køivoèará rychlost, ALH = amplituda laterálního vyboèení hlavièky spermie. CASA (Iguer-Ouada a Verstegen, 2001) a optickým mikroskopem (Rijsselaere et al., 2002). Morfologie Pøi morfologickém hodnocení je individuálnì zkoumán tvar a struktura spermií. Posuzována je velikost a tvar hlavièky, støední èást a bièík spermie (Barber, 2010). Nejdùležitìjším zjišśovaným parametrem je procentuální zastoupení morfologicky normálních spermií (MNS) ve vzorku ejakulátu (Kustritz, 2007). Procento MNS v ejakulátu psù by mìlo být vyšší než 70 % (Kustritz, 2010), pokud klesne pod 60 %, fertilita psù je prùkaznì snížena (Oettle, 1993). Procento MNS není u psù ovlivnìno frekvencí odbìru (England, 1999), ale je možné, že urèitou roli ve výskytu morfologicky abnormálních spermií mùže hrát vyšší vìk, napø. u lidí klesá procento MNS po 45. roku života (Pasqualotto et al., 2005). Morfologické defekty spermií jsou tradiènì klasifikovány jako primární (pùvod tìchto zmìn je abnormální spermatogeneze) a sekundární (vznikají pøi abnormalitách zrání spermií, ejakulaci a pøi pøípravì preparátù). Podrobnìji popisuje jednotlivé abnormality tabulka 2. Primární defekty spermií psù, o kterých je známo, že interferují s dobrou fertilitou, jsou proximální kapky (Morton a Bruce, 1989) a defekty krèku nebo støední èásti spermie (Plummer et al., 1987). Tab. 2: Hlavní morfologické defekty spermií u psù (Zdroj: Payan-Carreira et al., 2010). Èást spermie Primární defekty Sekundární defekty Hlavièka makrocefalus, mikrocefalus, dvojitá, zahnutá, vroubkovaná hlavièka volné, zakøivené, oteklé akrozomy, odtržené akrozomy Krèek zesílený, odlehlé spojení Støední èást zesílená, ztenèená, stoèená, zauzlená, zdvojená zahnutá støední èást, cizí materiál obklopující støední èást, proximální, støedové a distální kapky Bièík slabý, dvojitý, trojitý stoèený, ovinutý, zauzlovaný, pøehnutý, oddìlený 213

Mikroskopické hodnocení morfologie spermií Morfologie spermií mùže být hodnocena pomocí mikroskopu s fázovým kontrastem nebo pomocí mikroskopu s procházejícím svìtlem, kdy je zapotøebí spermie obarvit, což bude zøejmì èastìjší postup pøípravy preparátu pro hodnocení morfologických abnormalit ve veterinárních ordinacích v ÈR. Pro barvení spermií lze využít komerèních pøípravkù, napø. DiffQuick (Kustritz, 2007), nebo lze pøipravit vlastní barvicí roztoky (Vìžník et al., 2004). Je zapotøebí si ale uvìdomit, že ve srovnání s fázovì kontrastním mikroskopem zvyšuje hodnocení pomocí barvicích technik výskyt akrozomálních defektù nebo defektù hlavièky, støední èásti a bièíku. To mùže být zpùsobeno zmìnou osmolarity nebo ph použitých barviv (Kustritz, 2007). Mikroskopické hodnocení spermií by mìlo být provádìno minimálnì u 200 spermií, s použitím imerzního oleje a objektivu se zvìtšením 100 (Oettle, 1993). Poèítaèem øízená analýza morfologie spermií Kromì manuálních subjektivních zpùsobù hodnocení morfologie spermií existují i poèítaèové systémy, které mohou hodnotit morfologii bunìk objektivnì. Pro tento úèel lze využít pøedevším systém CASA (Rijsselaere et al., 2004), dále pak napøíklad SASMO (Veznik et al., 2001) nebo SQA IIc (Prinosilova et al., 2005). Využití automatizovaných systémù pøi hodnocení morfologie není však rutinnì využíváno, pøièemž primárním dùvodem mùže být vysoká poøizovací cena (Feitsma et al., 2011). Mnohem dùležitìjší je ovšem fakt, že automatická analýza je èasovì nároèná (Cross a Meizel, 1989; Dahlbom et al., 1997), prozatím nelze detekovat støední èást bièíku (Bjorndahl et al., 2010), výsledky jsou pøi porovnání mezi jednotlivými studiemi variabilní z dùvodu nastavení systémù (Hu et al., 2013) a výsledek je znaènì ovlivnìn zpùsobem pøípravy vzorku (Amann a Waberski, 2014). Dále byla zjištìna velká variabilita ve výsledcích hodnotících morfologii spermií u jednotlivých psù, a dokonce i ejakulátù od stejného psa (Nunez-Martinez et al., 2006). Metody hodnocení funkèního stavu spermií Standardní hodnocení reprodukèního potenciálu ejakulátu obvykle zahrnuje hodnocení parametrù spermií, jako je koncentrace, motilita a morfologie. Jelikož tyto vlastnosti ne úplnì pokaždé korelují s fertilitou in vivo, mùže být hodnota jejich výsledkù vylepšena spojením s hodnocením funkèních vlastností spermií (Mastromonaco et al., 2002). K hodnocení funkèních vlastností spermií lze ve veterinární praxi použít pøedevším hypoosmotický test (HOS-test) (Karger et al., 2014) a hodnocení živých a mrtvých spermií (Vìžník et al., 2004). Ve vìdeckých laboratoøích lze pak provést i mnohem nároènìjší testy, jako napøíklad vyšetøování struktury chromatinu spermií, ovìøování schopnosti spermií navázat se na zonu pellucidu, zkoušení penetrace do oocytu a in vitro fertilizaci nebo testování interakce spermie vejcovod (Rijsselaere et al., 2005). Hypoosmotický test HOS-test je jednoduchý, levný a lehce aplikovatelný test na hodnocení funkèního stavu membrány spermie (Kumidiaka, 1993), a tudíž ho lze rutinnì využívat i ve veterinárních ordinacích. Existuje pomìrnì hodnì studií popisujících využití HOS-testu u psù (Karger et al., 2014), ovšem doposud není znám žádný standardní protokol nebo vìrohodné referenèní hodnoty. Navíc není doposud možné u psù interpretovat diagnostickou hodnotu HOS-testu pro predikci fertility (Karger et al., 2014). Nicménì i pøes výše zmínìné nedostatky se HOS-test používá. Tento test je založen na pøedpokladu, že pokud má spermie neporušenou funkènost membrány, a transport vody pøes membránu tudíž probíhá fyziologicky, projeví se schopnost bièíku spermie zkroutit se a nabobtnat (Jeyendran et al., 1984). Detaily pøípravy vzorku pro HOS-test se v jednotlivých publikacích liší, nicménì obecnì lze øíci, že sestává z pøidání 10 μl semene do 100 μl hypoosmotického roztoku sacharózy, následuje 30 min inkubace pøi 37 C a hodnocení minimálnì 100 spermií pøi použití objektivu 100 zvìtšujícího. Výsledek udává procentuální zastoupení spermií se zkrouceným bièíkem. Živé/mrtvé spermie Posouzení procenta živých a mrtvých spermií vychází z pøedpokladu, že do mrtvé spermie, u které byla narušena integrita plazmatické membrány, pronikne barvivo. Pro hodnocení spermií psù se ve veterinární praxi nejèastìji využívá kombinace barviv eosin a nigrosin (Kustritz, 2007). Proto je procento bunìk obarvených eosinem považováno za množství mrtvých bunìk a kvalitní psí ejakulát obsahuje maximálnì 30 % mrtvých spermií (Payan-Carreira et al., 2010). Nutno však dodat, že ve vìdeckých laboratoøích zabývajících se veterinární andrologií se již tento zpùsob barvení nepoužívá, protože pozornost se pøesouvá k fluorescenèním barvivùm (Pena et al., 2006). Závìr Pro hodnocení ejakulátu psù existuje pomìrnì hodnì metod, které lze využívat ve veterinárních ordinacích. Pokud si majitel pøeje vyšetøit ejakulát psa, u každého odebraného vzorku by mìly být zhodnoceny pøedevším objem, barva, koncentrace, motilita a morfologie spermií. Výsledek hodnocení ovlivòuje metodický postup a správná interpretace nálezu. Samotné hodnoty se pak liší, pokud jde o èerstvý èi konzervovaný ejakulát. Nutno dodat, že doposud neexistují jasnì stanovená kritéria kvality ejakulátu psù. Podìkování: Tato práce vznikla za podpory grantu Ministerstva vnitra Èeské republiky (VG20132015133). Ing. Jiøí Šichtaø, Ph.D. Katedra veterinárních disciplín, FAPPZ, ÈZU Kamýcká 129 165 21 Praha 6-Suchdol e-mail: sichtar@af.czu.cz 214

Souèasné možnosti hodnocení ejakulátu psù Literatura Agarwal A, Said TM. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Human Reproduction Update 9(4):331 45, 2003. Amann RP. Reproductive physiology and endocrinology of the dog. In: Morrow DA (ed). Current therapy in theriogenology. 2nd edition. W.B. Saunders Comp., Philadelphia 1986:523 38. Amann RP, Waberski D. Computer-assisted sperm analysis (casa): Capabilities and potential developments. Theriogenology 81(1):5 17, 2014. Barber, J. Canine semen collection and evaluation (Proceedings) [online]. dvm360.1. ledna 2010 [cit. 7-8-2014]. Dostupné z <http:// veterinarycalendar.dvm360.com/avhc/content/printcontentpopup. jsp?id=727 382>. Frenette G, Dube JY, Tremblay RR. Origin of alkaline-phosphatase of canine seminal plasma. Archives of Andrology 16(3):235 41, 1986. Garcia-Macias V, Martinez-Pastor F, Alvarez M, Julian Garde J, Anel E, Anel L, de Paz P. Assessment of chromatin status (scsa ) in epididymal and ejaculated sperm in iberian red deer, ram and domestic dog. Theriogenology 66(8):1921 30, 2006. Gravance CG, Garner DL, Miller MG, Berger T. Fluorescent probes and flow cytometry to assess rat sperm integrity and mitochondrial function. Reproductive Toxicology 15(1):5 10, 2001. Hermansson U, Forsberg CL. Freezing of stored, chilled dog spermatozoa. Theriogenology 65(3):584 93, 2006. Hu YA, Lu JC, Shao Y, Huang YF, Lu NQ. Comparison of the semen analysis results obtained from two branded computer-aided sperm analysis systems. Andrologia 45(5):315 18, 2013. Bartlett DJ. Studies on dog semen.1. Morphological characteristics. Journal of Reproduction and Fertility 3(2):173 76, 1962. Björndahl L, Mortimer D, Barratt CHLR, Castilla JA, Menkveld R, Alvarez JG, Haugen TB. A Practical Guide to Basic Laboratory Andrology. Cambridge University Press, Cambridge, 2010:348 s. Iguer-ouada M, Verstegen JP. Evaluation of the hamilton thorn computer-based automated system for dog semen analysis. Theriogenology 55(3):733 49, 2001. Iguer-Ouada M, Verstegen JP. Validation of the sperm quality analyzer (sqa) for dog sperm analysis. Theriogenology 55(5):1143 58, 2001. Boucher JH, Foote RH, Kirk RW. The evaluation of semen quality in the dog and the effects of frequency of ejaculation upon semen quality, libido, and depletion of sperm reserves. Cornell Vet 48:67 86, 1958. Jeyendran RS, Vanderven HH, Perezpelaez M, Crabo BG, Zaneveld LJD. Development of an assay to assess the functional integrity of the human-sperm membrane and its relationship to other semen characteristics. Journal of Reproduction and Fertility 70(1):219, 1984. Cross NL, Meizel S. Methods for evaluating the acrosomal status of mammalian sperm. Biology of Reproduction 41(4):635 41, 1989. Johnston SD, Kustritz MVR, Olson PNS. Canine and Feline Theriogenology. W.B. Saunders Company, Philadelphia 2001:287 306. Dahlbom M, Andersson M, Vierula M, Alanko M. Morphometry of normal and teratozoospermic canine sperm heads using an image analyzer: Work in progress. Theriogenology 48 (4):687 98, 1997. Dubiel A. Plan badania psa reproduktora w kierunku p³odności. (Andrological examination of the stud dog-in polish). In: Dubiel A (ed.). Rozdród psów. Wydawnictvo Akademii Rolniczej, Wroc³aw 2004:348 58. Ellington J, Scarlett J, Meyerswallen V, Mohammed HO, Surman V. Computer- assisted sperm analysis of canine spermatozoa motility measurements. Theriogenology 40 (4):725 33, 1993. England GCW. Semen quality in dogs and the influence of a short- -interval second ejaculation. Theriogenology 52(6):981 86, 1999. England GCW, Allen WE, Middleton DJ. An investigation into the origin of the 1st fraction of the canine ejaculate. Research in Veterinary Science 49(1):66 70, 1990. Feitsma H, Broekhuijse MLWJ, Gadella BM. Do casa systems satisfy consumers demands? A critical analysis. Reproduction in Domestic Animals 46:49 51, 2011. Feldman EC, Nelson EW. Canine and Feline Endocrinology and Reproduction. W.B. Saunders Company, Philadelphia 1996:568 75. Karger S, Arlt S, Haimerl P, Heuwieser W. A systematic review of studies performing the hypo-osmotic swelling test to evaluate the quality of canine spermatozoa. Reproduction in Domestic Animals 49(1):1 6, 2014. Kumidiaka J. Subjecting canine semen to the hypoosmotic test. Theriogenology 39 (6):1279 89, 1993. Kustritz MVR. Clinical Canine and Feline Reproduction: Evidence- -Base Answers. Wiley-Blackwell, Iowa 2010:246 49. Kustritz MVR. The value of canine semen evaluation for practitioners. Theriogenology 68(3):329 37, 2007. Kutzler MA. Semen collection in the dog. Theriogenology 64(3):747 54, 2005. Lindeforsberg C. Achieving canine pregnancy by using frozen or chilled extended semen. Veterinary Clinics of North America-Small Animal Practice 21(3):467 85, 1991. Martinez-Pastor F, Garcia-Macias V, Alvarez M, Herraez P, Anel L, de Paz P. Sperm subpopulations in iberian red deer epididymal sperm and their changes through the cryopreservation process. Biology of Reproduction 72(2):316 27, 2005. 215

Martinez AIP. Canine fresh and cryopreserved semen evaluation. Animal Reproduction Science 82(3):209 24, 2004. Mastromonaco GF, Hay MA, Goodrowe KL. The effects of oocyte storage and cumulus cell presence on canine zona penetration by domestic dog spermatozoa. Theriogenology 57(3):1123 34, 2002. Morton DB, Bruce SG. Semen evaluation, cryopreservation and factors relevant to the use of frozen-semen in dogs. Journal of Reproduction and Fertility 311 16, 1989. Oettle EE. Sperm morphology and fertility in the dog. Journal of Reproduction and Fertility 257 60, 1993. Pasqualotto FF, Sobreiro BP, Hallak J, Pasqualotto EB, Lucon AM. Sperm concentration and normal sperm morphology decrease and follicle-stimulating hormone level increases with age. Bju International 96 (7):1087 91, 2005. Payan-Carreira R, Miranda S, Nizanski S. Artificial insemination in dogs. In: Manafi M (ed). Artificial Insemination in Farm Animals. InTech, Rijeka 51 78, 2010. Pena FJ, Nunez-Martinez I, Moran JM. Semen technologies in dog breeding: An update. Reproduction in Domestic Animals 41:21 29, 2006. Quintero-Moreno A, Miro J, Rigau AT, Rodriguez-Gil JE. Identification of sperm subpopulations with specific motility characteristics in stallion ejaculates. Theriogenology 59(9):1973 90, 2003. Rigau T, Farre M, Ballester J, Mogas T, Pena A, Rodriguez-Gil JE. Effects of glucose and fructose on motility patterns of dog spermatozoa from fresh ejaculates. Theriogenology 56(5):801 15, 2001. Rijsselaere T, Van Soom A, Hoflack G, Maes D, de Kruif A. Automated sperm morphometry and morphology analysis of canine semen by the hamilton-thorne analyser. Theriogenology 62(7):1292 306, 2004. Rijsselaere T, Van Soom A, Maes D, de Kruif A. Use of the sperm quality analyzer (sqa ii-c) for the assessment of dog sperm quality. Reproduction in Domestic Animals 37(3):158 63, 2002. Rijsselaere T, Van Soom A, Maes D, Nizanski W. Computer-assisted sperm analysis in dogs and cats: An update after 20 years. Reproduction in Domestic Animals 47:204 07, 2012. Rijsselaere T, Van Soom A, Tanghe S, Coryn M, Maes D, de Kruif A. New techniques for the assessment of canine semen quality: A review. Theriogenology 64(3):706 19, 2005. Root Kustritz MV. The value of canine semen evaluation for practitioners. Theriogenology 68(3):329 37, 2007. Petrunkina AM, Simon K, Gunzel-Apel AR, Topfer-Petersen E. Kinetics of protein tyrosine phosphorylation in sperm selected by binding to homologous and heterologous oviductal explants: How specific is the regulation by the oviduct? Theriogenology 61(9):1617 34, 2004. Plummer JM, Watson PF, Allen WE. A spermatozoal midpiece abnormality associated with infertility in a llasa apso dog. Journal of Small Animal Practice 28(8):743 51, 1987. Prinosilova P, Veznik Z, Zajicova A, Svecova D. Using the sperm quality analyzer (sqa iic) to evaluate dog ejaculates. Veterinarni Medicina 50(5):195 204, 2005. Threlfall WR. Semen collection and evaluation. In: Kustritz MVR (ed). Small animal threiogenology. Elsevier Science, St. Louis 2003:97 123. Verstegen J, Iguer-Ouada M, Onclin K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology 57(1):149 79, 2002. Veznik Z, Matouskova O, Svecova D, Zajicova A. The use of the computer technology for the evaluation of the strict morphological sperm analysis. Veterinarni Medicina 46(2):35 40, 2001. Veznik Z, Svecova D, Zajicova A, Prinosilova P. Functional evaluation of dog ejaculates with priority given to the aspect of acrosome integrity. Veterinarni Medicina 48(8):221 28, 2003. 218