Stabilita [MIC] Příprava reagencií Pracovní promývací roztok [WASH] Vzorky Zmrazujte a rozmrazujte pouze jednou. Pracovní postup

Transkript

1 DHEA-S ELISA test pro kvantitativní stanovení dehydroepiandrosteronsulfátu v lidském séru nebo plazmě Obj. číslo: testů kompletní souprava Účel použití Dehydroepiandrosteron (DHEA) je hlavní C 19 adrenalinový steroidní hormon vylučovaný kůrou nadledvinek. Většina DHEA v séru je přítomna ve formě sulfátu DHEA-S a vázána na albumin. DHEA-S je důležitý indikátor produkce androgenu v kůře nadledvinek, je významně zapojen do procesu androgeneze. Slabý androgen DHEA-S, z hlediska biologické aktivity, je přeměněn na mnohem silnější testosteron a estrogeny v periferních tkáních. DHEA-S hraje důležitou roli pro fetoplacentální jednotku. V případě podezření na retardaci růstu plodu je doporučen funkční test DHEA-S. Stanovení DHEA-S ve spojení s kortisolem poskytuje možnost diferenciální diagnózy adrenokortikální funkce, jelikož oba steroidy produkuje kůra nadledvinek, ale v různých zónách. Koncentrace DHEA-S v séru je dále v přímém vztahu k 17-ketosteroidům moči, jelikož v důsledku své vyšší koncentrace je DHEA-S citlivější indikátor pro rutinní stanovení adrenálních androgenů. Vyhodnocení DHEA-S v séru je indikováno při diagnóze adrenální hyperplasie (Cushingův syndrom, Adrenogenitální syndrom), hirsutismu a virilizujících adreanálních nádorů 1. Princip - kompetitivní EIA - Test DHEA-S ELISA je založen na kompetitivní interakci DHEA-S a hormon-enzymového konjugátu o omezený počet imobilizovaných (králičích) protilátek proti DHEA-S. Množství vázaného hormon-enzymového konjugátu je tedy nepřímo úměrné koncentraci DHEA-S ve vzorku. Po inkubaci vzorku a hormon-enzymového konjugátu v jamce je nenavázaný konjugát odstraněn promytím. Po přidání substrátového roztoku vzniká modré zbarvení, které se po zastavení reakce zastavovacím roztokem mění na žluté. Intenzita barev je nepřímo úměrná množství DHEA-S ve vzorku. Absorbance kalibrátorů a vzorků je stanovena ELISA spektrofotometrem (HUMAREADER). Koncentrace neznámých vzorků je interpolována z křivky odezvy na dávku vytvořené pomocí sérových kalibrátorů o známých koncentracích DHEA-S. Obsah soupravy [MIC] 12 Mikrotitrační destičky (v jednodestičkovém držáku) 8-jamkové ulamovatelné řádky, potažené anti-dhea-s protilátkami (myšími) [CAL] A - G Kalibrátory (bile víčko) 7x1.0mlPřipraveno k použití, v lidském séru DHEA-S - koncentrace: 0 (A), 0,1 (B), 0,5 (C), 1,0 (D), 2,5 (E), 5,0 (F) a 10 (G) mg/ml [CON] 25 ml Enzymový konjugát (bílé víčko) připraveno k použití ph 7.3 ± 0.1 DHEA-S-HRP konjugát BSA 0.4 % TRIS/MOPS buffer 0.05 mol/l NaCl 0.1 mol/l [WS] 30 ml Promývací roztok (černé víčko) Koncentrát pro asi 1200 ml ph 7.3 ± 0.1 Trisem pufrovaná sůl 3 mmol/l TWEEN % [SUB] 14 ml Substrátový roztok (žluté víčko) ph 3,5 4,0 Připravené k použití 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) 0,26 g/l Peroxid vodíku 0,015% Acetátový pufr 0.05 mol/l DMSO < 5 % [STOP]14 ml Ukončovací roztok (červené víčko) Kyselina sírová 0.5 mol/l 1 Lepící páska Konzervanty: Celková koncentrace <0,7% Bezpečnostní poznámky

2 Nepolykejte reagencie. Zabraňte potřísnění očí, kůže a sliznic. Se všemi vzorky a [CAL] zacházejte jako s materiálem potenciálně infekčním. [CAL] byly kontrolovány na úrovni dárců na přítomnost protilátek proti HCV a HIV-1/2 a HBsAg s negativním výsledkem. Používejte ochranné oblečení a jednorázové rukavice dle zásad správné laboratorní praxe. Všechny materiály, kontaminované vzorky pacientů nebo [CAL], musí být inaktivovány schválenými postupy (autoklávování nebo chemické ošetření) v souladu s příslušnými předpisy. [STOP] dráždí oči, kůži a sliznice. Při kontaktu pečlivě omývejte velkým množstvím vody a konzultujte s lékařem. Stabilita Při skladování při teplotě 2 8 C jsou reagencie stabilní do data exspirace uvedeného na jednotlivých štítcích. Po otevření musí být reagencie uloženy při teplotě 2 8 C a použity během 60 dnů (viz Poznámky). [MIC] - uzavřeno v hliníkovém obalu se sušidlem - před otevřením musí mít pokojovou teplotu - nepoužité: vraťte se sušidlem zpět do obalu a skladujte při 2-8 C. Destičky skladované tímto způsobe lze použít do 60 dnů (viz poznámka). Nedotýkejte se horního okraje ani vnitřku jamek prsty! Příprava reagencií Zahřejte před použitím všechny reagencie na pokojovou teplotu (15-25 C). Nepoužívané reagencie by měly být skladovány vždy při 2-8 C Pracovní promývací roztok [WASH] -zřeďte [WS] 1200 ml čerstvé deionizované vody do vhodné nádoby. Lahvičku roztokem několikrát propláchnete. - Stabilita: 2 týdny při C Vzorky Sérum nebo EDTA plasma Nepoužívejte vysoce lipemické a hemolyzované vzorky a vzorky obsahující azid sodný. Vzorky je možné skladovat při 2-8 C 3 dny nebo 30 dní při -20 C. Zmrazujte a rozmrazujte pouze jednou. Rozmražené vzorky musí být homogenizovány. Odstraňte částice centrifugací nebo filtrací. Pracovní postup Dodržujte postup přesně! Poznámky k postupu P1: Nemíchejte složky s jinými čísly šarží. Nezaměňujte víčka lahviček (nebezpečí kontaminace). Nepoužívejte reagencie po jejich datu exspirace. P2: Nepoužívejte reagencie, které mohou být kontaminovány nebo vypadají či páchnou jinak než je obvyklé. P3: Zaznamenávejte pečlivě vzorky a kontroly do formuláře dodávaného s kitem P4: [MIC] vyberte požadovaný počet stripů (řádek) destičky a řádně upevněte v držáku. P5: Nechte probíhat reakce kontrol, [CAL] a vzorků duplicitně (od každého dvě). Pipetujte kontroly a vzorky i [CAL] přímo na dno mikrojamek. P6: Vždy přidávejte reagencie v tomtéž pořadí, abyste minimalizovali rozdíly v reakčním čase mezi jamkami. Toto je důležité pro reprodukovatelné výsledky. Pipetování vzorků by nemělo překročit 10 minut. Jinak pipetujte kalibrační křivku v naznačených polohách v poločase série. Jestli se používá více než jedna destička, opakujte dávce odpovídající (kalibrační) křivku pro každou destičku. P7: Odstraňte vzduchové bubliny před inkubací a odečítání absorbance. P8: [SUB] inkubujte ve tmě. [SUB] iniciuje kinetickou reakci, která je zakončena přidáním [STOP]. P9: [MIC] jemně kývejte s destičkou sekund po každém pipetovacím kroku, abyste důkladně promíchali obsah jamek, aniž vylijete roztoky. Je-li to možné, míchejte na automatické míchačce. Promývací procedura Promývací procedura je kritická. Nedostatečné promytí sníží přesnost nebo falešně zvýší absorbanci. W1: Odstraňte lepící pásku, vylijte obsah jamek a přidejte [WASH] do každé jamky, po 30 sekundách navlhčování vylijte a opakujte promytí. W2: V případě automatického promývání začněte s [WASH] a promyjte stripy 3x.. Ujistěte se, že promývač úplně plní všechny jamky a účinně vylívá obsah po 30 sekundách (zbývající kapalina po vylití v jamce< 15ml). W3: Po promytí odstraňte zbývající kapalinu buničinou s destičky obrácené vzhůru nohama. Pipetovací schéma Reagencie a vzorky musí mít před použitím pokojovou teplotu Krok 1 Jamka [µl] A1...F2 G2... [CAL] A-G; dvakrát Vzorky, Kontroly; dvakrát [CON] Promíchejte

3 Inkubujte 60 min při C Promyjte 3 x jak je popsáno (viz W1 - W3) [WASH] Krok 2 [SUB] Inkubujte 15 min při C (viz P8) [STOP] Opatrně promíchejte. Změřte absorbanci at 450 nm hned, jakmile je to možné nebo během 30 min. po skončení reakce, za použití referenční vlnové délky nm (je-li to možné). Platnost testu Výsledky testu jsou platné, jsou-li splněna následující kritéria: 1) Maximální absorbance (kalibrátor A) O.D. max. 1,0 2) Analýzu je třeba provést na 3 úrovních: Koncentrace DHEA-S při 80 % O.D. max. = 0,03 0,21 mg/ml Koncentrace DHEA-S při 50 % O.D. max. = 0,20 1,2 mg/ml Koncentrace DHEA-S při 20 % O.D. max. = 1,58 5,5 mg/ml Výpočet Kalibrační křivka se používá k odečtení koncentrace DHEA-S v neznámých vzorcích. 1. Vyneste na milimetrový papír absorbance duplicitních kalibrátorů proti odpovídající koncentraci DHEA-S v mg/ml (nepočítejte z dvojic průměrnou hodnotu a vyneste obě hodnoty absorbance). 2. Vytvořte regresní přímku. Koncentraci DHEA-S v neznámém vzorku (S) zjistíte tak, že od hodnoty průměrné absorbance vzorku na svislé ose vedete přímku až protne křivku, tomuto bodu odpovídá na horizontální ose příslušná koncentrace (v mg/ml). Pro ilustraci viz obrázek. Interpretace výsledků DHEA-S nevykazuje kvůli svému pomalému metabolismu žádné změny během dne nebo ze dne na den. Hodnoty DHEA-S jsou vysoké při narození, rychle klesají během dětství, postupně stoupají neustále během předpubertálního období a dosahují úrovně dospělých osob krátce po pubertě. Stárnutí (po třetí dekádě) má za následek snižování hodnot DHEA-S u obou pohlaví. Hodnoty u mužů jsou vyšší než u žen (2). Těhotné ženy vykazují snížení počátečních hodnot o asi 50% vlivem čištění placentou. Zvýšené hodnoty DHEA-S jsou ukazatelem adrenální hyperplasie a nádoru nadledvinek, ale také adrenálního hirsutismu. Androgenismus u žen způsobený polycystickými vaječníky může být indikován hodnotami 3-7 mg/ml. Podezření na rakovinu u žen je, když jsou hodnoty > 7 mg/l. Stanovení DHEA-S a testosteronu poskytuje příležitost k rozlišení nádorů produkujících androgen od ostatních nemocí testováním séra z vaječníků a kůry nadledvinek 3. Samotné stanovení hodnoty DHEA-S není postačující pro diagnózu patologických stavů. Musí být interpretováno ve spojení s jinými klinickými projevy a diagnostickými (hormonálními) parametry. Očekávané hodnoty Normální ženy 4 : premenopausa těhotenství postmenopausa Normální muži 4 : Novorozenci (obě pohlaví) 4 Děti (5) 1 5 roků 6 11 roků roků konverzní koeficient: 1 mg/ml = 2,6 mmol/l Hladina DHEA-S 0,8 3,9 mg/ml 0,2 1,2 mg/ml 0,1 0,6 mg/ml 1,0 4,2 mg/ml 1,7 3,6 mg/ml < 0,3 mg/ml 0,1 1,5 mg/ml 0,3 5,5 mg/ml

4 Každá laboratoř by si měla stanovit své vlastní očekávané hodnoty vzhledem k používaným přístrojům, metodám odběru krve a testovacím technikám obecně v této laboratoři užívaným. Parametry testu Test ELISA DHEA-S firmy Human má analytickou citlivost 0,01 0,03 mg/ml vzorku. Vzorky s koncentrací DHEA-S nad 10 mg/ml musí být zředěny (1 + 9) kalibrátorem A (0 mg/ml) a znovu analyzovány. Výsledek násobte 10. Typické údaje o parametrech procesu můžete nalézt v Ověřovací zprávě dostupné na nebo Poznámka Součásti soupravy jsou i po otevření stabilní do data exspirace. Jejich kontaminace ovšem přímo souvisí s počtem otevření lahviček. Proto je z důvodu bezpečnosti, stanoven 60denní limit pro používání po prvním použití. Opatrná manipulace dle zásad správné laboratorní praxe (*) poskytuje možnost používat reagencie i po uplynutí 60 dnů. Reagencie musí vždy splnit kritéria kontroly kvality! (* To zahrnuje: Uzavírat lahvičky správnými zátkami a těsně je dotahovat / množství reagencií potřebné pro analýzu odebrat z velkých balení, mohou-li tyto reagencie přijít do styku s kontaminujícími látkami (např. séry pacientů) / reagencie co nejdřív vracet do chladničky (2 8 C). Literatura 1. Miller, W.L. and Tyrell, J.B., The adrenal cortex. In: Endocrinology and metabolism. (Feling, F., et al, ed.) N.Y.: McGraw-Hill, (1995) 2. Orentreich, N. et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 59, (1984) 3. Moltz, L. et al, Fertil Steril 42, (1984) 4. Orth, D.N. et al, Williams textbook of endocrinology, /Wilson, I.D. and Foster, D.W. eds.) Philadelphia: Saunders, 579 (1985) 5. Meites, S., Pediatric clinical chemistry, Reference (normal) values, Washington ACCC Press (1989) Human Gesellschaft für Biochemica und Diagnostica mbh Max-Planck-Ring 21 - D Wiesbaden - Germany Telefon: Telefax: human@human.de

5 EL-DHEA INF GB