FLAVONOIDY A JEJICH BIOLOGICKÉ PŮSOBENÍ

FLAVONOIDY A JEJICH BIOLOGICKÉ PŮSOBENÍ Karel Volf František Andrs klíčová slova: Flavonoidy deaktivace radikálů fyziologické působení kardiovaskulární, nádorové a neurodegenerativní nemoce 1

Zvýšený zájem o aplikaci flavonoidů velké skupiny přírodních látek v biologii a medicíně, je alespoň zčásti dán jejich známým zdravotním působením. Ing. František Andrs, zakladatel firmy JuWital a. s. je původcem myšlenky sepsání této práce. Společnost JuWital, s.r.o. zabývající se aplikací těchto vysoce účinných látek ve stravě pro léčení chorob, publikovala několik prací týkajících se přehledu vybraných specifických onemocnění ovlivněných flavonoidy. Nejnovější výzkumy odkryly v novém světle i některé účinky dávno používaných rostlin v lékařství (šalvěj, rozmarýn, ale i čaj a řada dalších) na různé nemoci s tím, že jde o specifické účinky antioxidantů nejčastěji flavonoidů obsažených v těchto rostlinách. Jako nesmírně důležité se ukázalo, že právě flavonoidy mohou napomáhat endogenním obranným antioxidantům v těle k deaktivaci vzniklých radikálů a zabránit tak poško-zení životně důležitých látek jako jsou bílkoviny, lipidy nebo DNK, s kterými radikály jinak reagují a ničí je. 0Ionty nebo molekuly mohou obsahovat atom s jedním nepárovým elektronem, což propůjčuje iontu nebo molekule osobité vlastnosti. Tak hovoříme o radikálech, o radikálových kationtech (+) nebo radikálových aniontech (-). U neutrální molekuly A vzniká přenosem jednoho elektronu na tuto molekulu radikálový anion A - odtržením elektronu od molekuly radikálový kation A +. Radikály jsou tedy charakterizovány lichým počtem vazebných elektronů. Výsledkem vzniku radikálů (např. UV zářením nebo jiným způsobem) je poškození zmíněných důležitých specifických látek. Antioxidanty, jako jsou flavonoidy nebo vitamíny C, E a další látky, deaktivují, zhášejí, neutralizují vzniklé radikály, a tím znemožňují jejich následný destrukční vliv na příslušný oxidovatelný substrát. Flavonoidy vedle toho, že mají přímý antioxidační účinek, ovlivňují tvorbu radikálů i nepřímo aktivací nebo deaktivací antioxidačních enzymů podílejících se na vzniku různých radikálů (superoxiddismutáza aj.). Zároveň působí na různé transdukční, signální cesty v buňce a ovlivňují tak např. extracelulární signál regulující kinázy nebo jiné transkripční faktory Je známo i fyziologické působení flavonoidů, jejich ovlivňování kardiovaskulárních chorob nebo nádorů, či jejich vliv na neurologické nemoce. Např. červené víno je považováno za účinný zdroj flavonoidů. Jeho pravidené užívání v malých dávkách by mohlo snížit kardiovaskulární choroby až o 40 % díky jeho antitrombotickým i antioxidačním vlastnostem. Rovněž konzumace ovoce, zeleniny nebo i čaje tj. látek s velkým množstvím flavonoidů, přispívají k poklesu kardiovaskulárních chorob. Současně příznivě ovlivňuje některé druhy nádorů ve smyslu jejich apoptózy nebo i vzniku. Flavonoidy, např. extrakt Gingko biloby, se rovněž mohou podílet na léčbě nebo i prevenci různých neurode-generativních onemocnění (Parkinsonova choroba, Alzheimerova choroba, Huntingtova choroba aj.) ve smyslu neuroprotektivní ochrany. To je dáno jednak díky jejich konvenčním antioxidačním schopnostem, tj. schopností reagovat přednostně s oxidačními činidly nebo (spíše) ovlivněním např. signální kaskády buňky, ovlivněním exprese genu a potlačením cest vedoucích k zániku neuronů. Ve sdělení jsou uváděny literární prameny týkající se působení flavonoidů po chemické i fyziologické stránce, dále jejich působení na enzymy ovlivňující reaktivní radikály. Ve sdělení jsou uváděny literární prameny týkající se působení flavonoidů po chemické i fyziologické stránce, dále jejich působení na enzymy ovlivňující reaktivní radikály. Současně je stručněji diskutován jejich vliv na kardiovaskulární choroby a peroxidaci lipidů, ovlivnění nádorových onemocnění i jejich vliv na neurodegenerativní choroby. Práce si klade za cíl stručně upozornit na důležitost uvedených aspektů. Vzhledem k tomu, že je popisováno využití flavonoidů v různých směrech, jsou u některých kapitol ve zkratce opakovány některé skutečnosti jinde uváděné šířeji. Je to proto, aby čtenář zajímající se jen o jeden obor aplikace flavonoidů nemusel vyhledávat pasáže z kapitol, jež jsou pro něj nezajímavé. Téměř exploze 2

původních prácí v současné době, které se týkají ovlivnění některých druhů onemocnění flavonoidy, polyfenoly, vedla k rozšíření původního sdělení z let kolem roku 2007 o některé nové aspekty působení flavonoidů. Práce si klade za cíl stručně upozornit na důležitost uvedených aspektů. Vzhledem k tomu, že je popisováno využití flavonoidů v různých směrech, jsou u některých kapitol ve zkratce opakovány některé skutečnosti jinde uváděné šířeji. Je to proto, aby čtenář zajímající se jen o jeden obor aplikace flavonoidů nemusel vyhledávat pasáže z kapitol, jež jsou pro něj nezajímavé. Téměř exploze původních prácí v současné době, které se týkají ovlivnění některých druhů onemocnění flavonoidy, polyfenoly, vedla k rozšíření původního sdělení z let kolem roku 2007 o některé nové aspekty působení flavonoidů. Autor touto cestou děkuje několika odborníkům, kteří přečetli jednotlivé kapitoly nebo celou práci, za kritické poznámky a připomínky. Jedná se o dr. Hálovou CSc. a dr. A. Kasala DrSc. z ČAV, dr. J. Nedvěda z onkologického oddělení nemocnice Kladno, doc. dr. J. Bašteckého CSc. z psychiatrické základny Ústavu pro doškolování lékařů Praha, dr. V. Hanuše DrSc. z ČAV, doc. ing. Z. Zlocha CSc. z LFKU Plzeň, prof. dr. J. Klinota DrSc. z Přírodovědecké fakulty UK, pana J. Pajskra za úpravu podkladů a především zemřelého dr. Ž. Procházku CSc. z ČAV, který dlouho pracoval v oblasti biologie a chemie přírodních látek a bez kterého by toto orientační upozornění na některé biologické aspekty flavonoidů, nevzniklo. Autor je zavázán pracovníkům Lékařské knihovny Praha a knihovny I Lékařské fakulty v Praze za pomoc při vyhledávání příslušné literatury, stejně jako pracovníkům společnosti JuWital za pomoc a pochopení. (Práce neprošla jazykovou kontrolou) Praha 2014 - červen 2015 Autor 3

Obsah. I. UVOD : Obrazová část Chemie a antioxidační účinek flavonoidů. - 6 II. Flavonoidy a ovlivnění antioxidačního enzymového systému.... 67 III. Výskyt a fyziologická účinnost flavonoidů..... 73 IV. Flavonoidy jako deaktivátory lipidové peroxidace-jejich kardiovaskulární působení 107 V. Flavonoidy a zhoubné nádory...... 177 VI. Radikálová teorie stáří; nutriční a jiné faktory při stáří; flavonoidy a neurodegenerativní choroby... 242 VII. Dodatky....... 309 4

JEDNOTLIVÉ FLAVONOIDNÍ TŘÍDY (OBRÁZKY : PODLE CROZIER, A. JAGANATH, I.CLIFORT. M,N. NATURAL PRODUCT REPORTS VOL. 26 ČIS 8 2009 S. 965-1096) 5

I. ÚVOD : OBRAZOVÁ ČÁST - CHEMIE A ANTIOXIDAČNÍ ÚČINEK FLAVONOIDŮ Přírodní antioxidanty z potravy (například flavonoidy) mohou chránit tkáně lidského těla od nemocí způsobených útokem reaktivních radikálů na důležité molekuly (lipidy, RNK, bílkoviny) a zabraňovat tak jejich oxidačnímu poškození. Flavonoidy (bioflavonoidy) tvoří rozsáhlou skupinu přírodních látek derivátů difenylpropanu nebo látek odvozených od fenylchromanu. Mají dva substituované benzenové kruhy A, B a pyranový kruh C kondenzovaný s kruhem A. Další klasifikace je založena na stupni oxidace pyranového kruhu. V přírodě jsou flavonoidy většinou vázány na různé cukry za tvorby flavonoidních glykosidů často v poloze 3 (viz obr.), tj. vázány na řadu cukrů glukózu, rhamnózu nebo celou řadu jiných cukrů. Tvorba těchto glykosidů- konjugátů, je závislá na světle (chemicky je glykosid acetal tvořený OH skupinou cukrů a OH skupinou flavonoidů). Cukr je někdy dále acylován kyselinami benzoovou, malonovou, gallovou (obr. viz dále) i jinými. Lze tedy říci, že jde o v přírodě se vyskytující velmi pestré molekuly různého uspořádání. Přitom přítomnost cukrů - glykosidy a OH skupin na jádře (OH skupiny jsou často v poloze 3 -, 4 -, nebo 5 -, nebo 7) zvyšuje rozpustnost ve vodě. Přítomnost methylových (nebo jiných) skupin na jádře naopak rozpustnost ve vodě snižuje. (Přitom obecně, čím více je sloučenina lipofinější tím snáze prochází lipidovou membránou). Jde o stovky a stovky individuálních látky s vysokou diversibilitou, které se liší hydroxylací methoxylací a glykosidací ( počtem navázaných cukrů) i když počet základních strukturních tříd je poměrně malý. Flavonoidní sloučeniny se dělí na : flavanoly (V přírodě velmi časté flavan - 3- oly, se nalézají ve velkém množství v čerstvých listech čaje, především v zeleném (nefermentovaném) čaji,kde jsou vůbec nejdominantnější z řady přítomných polyfenolů. V čaji je přítomný především epigallokatechin-3 -O- gallát a epikatechin-3- O - gallát a menší množství i ostatních katechínů. /S fermentací čaje se obsah gallátových flavan-3- olů ovšem snižuje až o 90%. Přitom v černém čaji jsou hlavní fenolovou složkou ve vodě rozpustné vysokomolekulární thearubiginy. / Další z flavan - 3 - olů, katechin a jeho izomer epikatechin mají dvě chirální centra na C-2 a C-3 takže existují celkem čtyři izomery. Ty mohou být hydroxylovány na kruhu B za tvorby gallokatechinů, nebo esterifikovány s kyselinou gallovou /gallokatechin, epigallokatechin, nebo zmíněný epikatechin-3-o-gallát a epigallokatechin-3-o - gallát/. Rozdíly v chirární struktůře se projevují v 3-D struktuře molekuly. Tato skutečnost pak má za následek rozdílné vazebné vlastnosti při interakcích např. typu enzym - substrát, receptor- ligand, nebo podobně. Přitom stereochemicky čistý (-)- epikatechin a (+) - katechin jsou vysoce biologicky účinné protože jsou po peronální aplikaci rychle vstřebávány - zvláště (-) - epikatechin (!). Jsou v přírodě značně rozšířeny oproti izomerním (+)- epikatechinu a (-)- katechinu. Ovšem při úpravě v potravinářství (-)- je biologicky účinný epikatechin epimerizován, je málo akumulován v plazmě a exkrece jeho metabolitů v moči je velmi malá. Flavanoly ( flavan- 3-oly) monomery ( +) - katechin, (-)- epikatechin, (-)- katechin, (+) - epikatechin, (+)- gallokatechin, (-)- epigallokatechin, (-)- epikatechin- 3-0 gallát, (-) +epigallokatechin-3-o- gallát. ( v přírodě obvyklá forma) (+) - katechin (-) - epikatechin (oba dobře vstřebatelné ) 6

(-)- katechin (+)- epikatechin ( v přírodě méně obvyklé formy) enancioméry - tj - dvě molekuly které se navzájem nekryjí, : (+) - katechin a (-) - katechin, stereoizomery : (cis) (-) - epikatechin a (trans) (+)- katechin s ohledem na dvě chirární centra na C -2 a C- 3) (+) -gallokatechin (-)- epigallokatechin (-)- epikatechin- 3-O gallát (-)-epigallokatechin-3-o- gallát Stereochemická projekce pro flavan - 3- ol diastomery, epigallokatechin gallát, EGCG (PODLE A. CROZIER ET AL : NATURAL PRODUCT REPORTS VOL 26 (8) AUGUST 2009 S. 965-1096). ( Stereochemická konfigurace a struktura třetí dimenze významě ovlivňuje vstřebání a metabolizmus flavanolů u člověka. Např. (-)- epikatechin je jediný stereoisomér s významnou vasodilatační aktivitou). (Flavan - 3 -ol monomery- (viz dále) jsou během zpracování vína, kakaa a černého čaje, šíroce modifikovány na theafiliny a thearubiginy) 7

flavonoly ( Jsou v přrodě nejvíce rozšířené a to především jako O - glykosidy. Jsou často substituované v poloze 3 - C - kruhu, ale i v jiných polohách - 5,7, 4 3 5.. Je to např. kvercetin, myricetin, isorhamnetin, kaempferol. Bohatým zdrojem flavonolů je např. žlutá a červená cibule, kde je přítomen hlavně kvercetín, nejvíce jako kvercetin 4 - O - glukosid a kvercetin 3,4 - O - diglukosid /červená cibule obsahuje také anthokyaníny/. Tak např. konzumace smažené cibule - 270g dobrovolníky, vedla během hodiny (T max) k přítomnosti poměrně vysokého množství kvercetinových metabolitů, glukuronidů a sulfátů v plazmě. Bohatým zdrojem flavonolů jsou i rajská jablíčka, ve slupkách i v listech. Ty obsahují hojně kvercetin-o-rutinosid. Flavonoly jsou obsažebny i v brokollicie, špenátu, chmelu, jablkách - především ve formě flavonolových, např kvercetínových, konjugátů s mnoha různými cukry. Ovšem jejich množství se mění podle podnebí. (Zvláště zajímavý je typický, velmi rozšířený rostliný flavonol kvercetin, který má četné farmakologické vlastnosti - protizánětlivé, antioxidační, protinádorové, stejně jako uplatnění při nemocech stáří. Má ovšem špatnou rozpustnost nízkou" bioavaibilitu" - tj. rychlost a vstřebané množství pro působení v cílovém místě, má špatnou permeabilitu a je nestabilní. Zlepšení těchto vlastností např. jeho zahrnutím v komplexu s jinými látkami, nebo aplikací jako nanočástice aj.kvercetin může řadit mezi přední terapeutika proti nemocem člověka- viz dále).) Uplatnění v terapii našel ovšem zváště kvercetin-3 -O-rutinosid, rutin ( v listech pohanky) při lečbě nadměrné velikosti kapilár a u některých nemocí. ( Dražé askorutin je rutin a kys askorbová) Flavonoly: ( Glykosidické formy kvercetinu a některé flavonoidní a polyfenolové sloučeniny). Kaempferol, R 1=H, R 2=OH, R 3=H. Kvercetin, R 1=OH, R 2 =OH,R 3=H. Myricetin,R 1= OH, R 2 =OH, R 3 = OH. Isorhamnetin, R 1=OCH 3, R 2=OH, R 3=H. kvercetin-4 - O-glukosid kvercetin-3,4 - O-diglukosid kvercetin -3-O-rhamnosid kvercetin-3 - O-xylosid kvercetin-3 -O-rutinosid ( rutín) kvercetin-3 - O- arabinosid 8

Kvercetin-3-O- arabinonofuranosid kvercetin-3-o- glukosid kvercetin- 3 -O - sulfát Isorhamnetin - 3 -O - glukuronid flavony ( Nejsou oxidovány na C - 3. Jde o apigenin, luteolin - celer, petržel a dále polymethoxylované flavony, tangeretin, nobiletin které jsou obsažené v citrusových plodech a v oranžádových šťávách. Flavony jsou přítomny v rostlinách hlavně ve formě svých 7- O - glykosidů, ale nejsou příliš rozšířeny). Flavony Apigenin R 1 = H R 2=OH Luteolin R 1 = OH R 2= OH Polymethoxylované flavony,tangeretin R 1 = H R 2 = OCH 3 nobiletin R 1 =OCH 3 R 2 = OCH 3 - ( nacházejí se výlučně v citrusových plodech, stejně jako scutellarein a sinensetin),) scutellarein sinensetin flavanony ( s neplanární strukturou s chirárním centrem na C -2. jsou nejvíce přítomné v citrusovém ovoci. Je to naringenin ( 5,7, 4 - trihydroxyflavanon) hesperetin ( 4 - methoxy,3, 5,7, trihydroxyflavon) v pomeranči a eriodyctol ( 5,7, 3 4 tetrahydroxyflavanon) v citronech. V plodech jsou flavanony obecně glykosylovány disacharidami v poloze 7- rutinosou nebo neohesperidosou, např. 9

naringenin-7-o- rutinosid (narirutin), hesperetin- 7-0 rutinosid ( hesperidin) oba v citrusových slupkách a bez chuti. Vedle nich známe konjugáty s neohesperidosou tj naringenin-7-o- neohesperidosa (naringin) a hesperetin-7-o- neohesperidosa (neohesperidin - obsažený v grapefruitových slupkách) oba s intesívně hořkou chutí. Přitom větší část flavanonů je v pevné části ovoce a to více než v džusu ( v pomerančovém džusu okolo14-77mg/100 ml hesperidinu a narirutinu dohromady, v grapefruidovém džusu 17-76 mg/100ml naringeninových glykosidů). Denní příjem se v různých zemích pohybuje v množství mezi 2,7-78 mg (vztaženo na aglykon) hlavně v jižní Evropě- v pomerančích. Protože flavanony jsou absorbovány v tračníku kam musí dojít po aplikci, jejich maximální koncentrace v plazmě se dosahuje po 6 h. aplikace. Průměrná hodnota koncetrace v plazmě činíi 0,1μM až 1μM po příjmu 150 g pomerančů, nebo 500 ml pomerančového džusu. Maximální koncetrace dosáhla 0,47-0,6 μm po aplikaci 230 g pomerančů, nebo 550 ml pomerančového džusu (množství odpovídající 115 mg aglykonu). Podobné dosažené hodnoty se vyskytují u všech citrusových plodů. To naznačuje, že samotné plody, tj matrix plodů, neovlivňují jejich vstřebání a bioaktivitu- velikost a rychlost vstřebání a dostupnost na místě působení. Exrece v moči se pohybuje mezi 1,6-7% příjmu. V jiných případech- greitfrutový džus - se v moči exkretovalo 14-30% příjmuté dávky naringeninu (nebo - od nedetekovatelného množství- až na 59% příjmu).to naznačuje vysokou inviduální variabilitu flavanonové bioaktivity. Pomerančová šťáva příznivě působí na kardiovaskulární nemoce nebo některé nádory. Po aplikaci oranžád se objevují v moči fenolové kyseliny ( viz dále), především 3- hydroxyfenylhydrakrylová a 3-methoxy-4-hydroxyfenylhydrakrylová kyselina. To naznačuje, že např. asi nejvýznamější flavanon - hesperetín je deglukosidován za pomoci bakterií tlustého střeva a podléhá štěpení kruhu a katalýze). 3-hydroxyfenylakrylová kys 3-methoxy-4 hydroxyfenylakrylová kys (Hlavní fenolové kys.které vznikají po aplikaci hesperetínu (oranžád) po štěpení tračníkových bakterií a jsou vstřebávány - viz dále- fenolové kyseliny) Flavanony Naringenin-7-O-rutinosid R 1=H R 2=OH (narirutin) Hesperetin- 7-O-rutinosid R 1= OH R 2 =OCH 3 (hesperidin) anthokyanidiny (odpovědné za barvu kvěů a plodů - jsou přítomny např. v malinách, jahodách - pelargonidin, kyanidin v ostružinách/, malvidin, delfinidin. V přírodě se vyskytují vesměs vázané na cukry jako glykosidy - anthokyaniny / např. kyanidin-3- O- glukosidú - v ostružinách/. Přitom, např. ve víně, díky enzymatickým a chemickým transformacím může vznikat větší počet polyfenolů odvozených od anthokyanínů. Vedle toho, např.ostružiny, nebo řada jiných rostliných plodů obsahují stejné anthokyanidiny, ale vázané s různými cukry. To pak stěžuje zjištění jejich biologické účinnosti, 10

Anthokyanídíny Pelargonidin R 1 = H R 2 = H Kyanidin R 1 = OH R 2 = H Petunidin R 1 =OCH 3 R 2 = OH Malvidin R 1 =OCH 3 R 2 = OCH 3 ( extrakce anthokyanínů se provádí 80% metanolem, extrakce okyseleným metanolem - 1,2HCL při 75C o vede k jejich hydrolýze z oligomerních proanthokyanidínů tj k anthokyanidínům nebo jejich dimérům a trimerům prokyanínum) Malvidin-3-O- glukosid isoflavony (fytoestrogeny- genistein, daidzein jsou přítomné hlavně v soji a v luštěninách a to jako aglykony i glukosidy. Angrešt obsahuje 5,7 dimethoxyisoflavon. Isoflavony napodobují působení stereoidního hormonu estradiolu /estrogenů/ jeho vazbu na receptory buněk, díky podobné struktuře a potlačují růst nádorů prsu a prostaty. Při fermentaci soje dochází k hydrolýze glykosidů a k zvýšení množství aglykonů ve směsi. V tomto smyslu se jeví zajímavé zprávy, že hrubý exrakt soje obsahující vedle saponínů jen aglykony daidzeinu a genistinu. vyvolal po aplikaci několikanásobné zvýšení C max koncetrace isoflavonů v plazmě dobrovolníků ve srovnání s podávanou směsí odpovídající stejnému množství daidzeinu i genisteinu a aplikovanou ve formě glykosidů. To by mohlo znamenat, že saponíny mohou hrát úlohu při vstřebání. Isoflavony Genistein R= OH Daidzein R=H (6- hydroxydaidzein R 1 =H R 2 =OH R 3 =H 8- hydroxydaidzein R 1 =OH R 2 = H R 3 =H, 3 - hydroxydaidzein R 1 =H R 2 =H R 3 =OH 11

proanthokyanidiny (často přítomné v lidské dietě, oligomery, nebo polymeryjsou tvořeny z (+)- katechinu a (-)- epikatechinu s vazbou mezi C-4 heterocyklu a C-6 nebo C-8 ( Jde o typ B prokyanidinů, typ A má ještě dodatečnou eterovou vazbu mezi C-2 a C- 7) Proanthokyanidiny se nazývají prokyanidíny, v případě, když jde o polymery tvořené výlučně z (-)- (epi)katechínu. Jsou obsažené v kakau, víně, ovoci aj. a jsou nejrozšířenější typem v rostlinách. Obsahují ( 3,5,7, 3, 4 ) pentahydroxylovou jednotku Přitom po aplikaci jsou v tenkém a tlustém střěvě depolymerisovány na monomerní nebo dimerní prokyanidiny.v plazmě jsou přítomny monomery hlavně jako konjugované metabolity ( viz dále).tak ( - )- epikatechin byl nalezený v plazmě jako 4, -O-methylepikatechin-7-D -glukuronid Mikroflora tračníku může štěpením kruhu modifikovat flavanoly, ( kvercetin) a prokyanidiny na fenolové kyseliny Proanthokyaniny mají malou biologickou aktivitu, protože jsou špatně vstřebány. A to nejen pro svojí velikost, ale i proto, že jsou ve značné části ireversibilitínně vázány k makromolekulám trávícího traktu. Proanthokyaníny (jejich dimery), býly zjištěny v krevní pasmě, nebo moči, Ovšem proanthokyanidiny pokud nejsou štěpeny mikroby střevního traktu na fenolové kyseliny a pak se v této formě vstřebávají v tračníku - nejsou tráveny a váží se na nerozpustné komplexy s bílkovinami a cukry potravy a jsou vylučovány fekáliemi. Proanthokyanidinové dimery Proanthokyanidinové trimery Typ B proanthokyanidinů, vazba C4 C8 Typ A proanthokanidinů vazba C4 C8 a dodatečná vazba mezi C2 a C 7 Typ B Typ A Proathokyanidin B 2 dimer- prokyanidin, tj s vazbou mezi (- ) - epkatechinovými jednotkami C 4 C 8 a dále proathokyanidin - A 2 dimer tj s další dodatečnou eterovou vazbu C 2 O7. Tvorbou prokyanidínových jednotek o vyšší molekulové váze tak vznikají oligomery. Proanthokyanidiny které se skládají výlučně z epikatechinové jednotky se nazývají prokyanidiny a jsou nejvíce rozšířené. 12

Thearubiginy v černém čaji vznikají po fermentaci-polymerní proathokyanidiny) ( vysokomolekulární polymery - thearubiginy- obsažené Theaflaviny R 1 =H R 2 =H ( nebo R 1= H, R 2 = gallát, nebo R 2= H, R 1 = gallát. nebo R 1, R 2 = gallát - zabarvení a jsou rozpustné v etyl acetátu) Theaflavin - 3,3 - digallát) ( Vznikají po fermentaci černého čaje, mají červené Méně často se vyskytují dihydroflavonoly, flavan- 3,4 dioly, biflavanoidy, neoflavony (kumariny, citrusové plody ), chalkony ( otevřený C flavonoidní kruh ) dihydrochalkony ( jablka a jablečné produkty), aurony a jejich isoderiváty. Některé jiné biologiky důležité polyfenoly kurkuma (curcumin) kys. rozmarinová 13

Fenolové kyseliny ( tj nikoliv flavonoidy ) se široce nacházejí v rostlinách, v ovoci, kde často doprovází flavonoidy ( polyfenoly) a liší se např. hydroxylací a methoxylací na aromatickém cyklu. Jsou v zásadě odvozeny od derivátů kys. hydroxybenzoové - (benzenové) (vzorec viz dále - odstavec" fenolové kyseliny") tak jako je např. kys gallová která je obsažena např. v černém čaj a jako součást tannínů, nebo jí strukturně podobná kys ellagová obsažená v jahodách a ovoci. Dále jde o deriváty kys. hydroxyskořicové. Obě jmenované kyseliny mají kyselý charakter díky přítomnosti karboxylové skupiny v molekule. Jejich antioxidační vlastnosti jsou důležité pro jejich stabilizační vlastnosti ovoce a obraný mechanismus v biologických systémech. (Asi polovina příjmu polyfenolových fytochemikálií v rostlinách jsou deriváty kys. hydroxyskořicové - jako je kys p- kumarová, kávová, ferulová sinapová, nebo kys. chlorogenová - poslední je např. obsažená ve vyšším množství v zrnech zelené kávy )( viz dále). Obě fenolové kyseliny (jejich deriváty) jsou v rostlinách (ale nikoliv vždy) především ve formě glykosidů, ( tj. jeden nebo dva cukry). ( Příklady fenolových kyselin a jejich derivátů malvidin- 3-( p- kumaroylglukosid), často přítomná fenolová kyselina, kys gallová (viz dále - Fenolové kyseliny) Flavonoidy a fenolové kyseliny se nacházejí v plodech, listech a květech mnoha rostlin (čaj, víno), v různém ovoci, zelenině, zrnech, stejně jako v koření (pepř, šalvěj aj.) kde mají řadu funkcí. Jako typické sloučeniny fenolového charakteru mohou být chelátory kovů, stejně jako deaktivátory volných radikálů. Jako účinné antioxidanty ruší řetězové reakce vzniklých volných radikálů. Mohou jako např. kvercetin nebo gallát epikatechinu a řada jiných,- především flavonoly, potlačovat peroxidaci lipidů v řadě biologických systémů jako jsou mitochondrie, mikrozomy, Mohou blokovat tvorbu toxické formy erytrocytů a podobně. Také jsou schopny (především) ovlivňovat modulovat in vivo aktivitu jednotlivých enzymů (cyklooxygenasy, lipoxygenasy, glutathionreduktasy aj), které jsou důležité v imunitním systému nebo v jiných oblastech (1) a ovlivnit i v malém množství, signální kinázy v buňce které jsou důležité pro její růst a apoptozu ( Tj pochod, při kterém se bunˇka scvrkne a rozpustí svůj obsah. Jde o nezhoubný normální pochod buněčné smrti ). Flavonoidy mohou tak zasahovat do různých extra nebo intracelulárních pochodů a tedy mohou být důležité i tímto způsobem, např. jako ochrana proti takovým druhům onemocnění jako jsou kardiovaskulární nebo jiné nemoce. Vykazují také protizánětlivý vliv, protinádorovou aktivitu, antitrombotický efekt, jsou účinné jako antivirové látky a jeví i řadu jiných vlastností (2). ( viz dále). Ovšem, jen velmi málo konzumovaných fenolů ( flavonoidů) zůstává po vstřebání nezměněno tak jak jsou obsaženy v rostlinách a většina je modifikována v tenkém nebo tlustém střevě (např. prokyanidiny, nebo jiné). Přitom přesná specifita např. lidských β- glukuronidás nebo sulfatás k flavonoidům a jíným konjugátům není známa a některé vytvořené flavonoidní glukuronidy mají vyšší aktivitu a biologickou účinnost než jiné.( viz dále, vstřebání) -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Sloučenina volné OH skupiny glykosidy (poloha) Flavonoly 14

kvercetin 3, 5, 7, 3 ', 4 ' ' morin 3, 5, 7, 3 ', 4 ', 5 myricetin 3, 5, 7, 3 ', 4 ', 5 ' rutin 5, 7, 3 ', 4 ' 3-rut kaempferol 3, 5, 7, 4 Flavony luteolin 5, 7, 3 ', 4 ' luteolin-4 glukosid 5, 7, 3 ' 4 ' gluk apigenin 5, 7, 4 ' chrysin 5, 7 luteolin-3 ', 7 diglukosid 5, 4 ' 3 ', 7 - diglukos. Flavanony taxifolin naringenin 3, 5, 7, 3 ', 4 ' 5, 7, 4 ' hesperetin 3, 5, 7, 3 ' 4'-OMe hesperidin 3, 5, 3 ' 4'O-Me 7-rut narirutin 5, 4 ' 5-rut Anthokyanidiny delfinidin cyanidin apigenidin 3, 5, 7, 3 ', 4 ', 5 ' 3, 5, 7, 3 ', 4 ' 5, 7, 4 ' peonidin 3, 5, 7, 4 ' 3 ' -OMe malvidin 3, 5, 7, 4 ' 3 ', 5 -di OMe pelargonidin 3, 5, 7, 4 ' keracyanin 5, 7, 3 ', 4 ' 3 - rut ideain 5, 7, 3, ' 4 ' 3 - gal oenin 5, 7, 4 ' 3 ', 5 ' -di-ome 3 -gluk Isoflavony genistein 5, 7, 4 ' genistin 5, 4 ' 7--glyk daidzein 7, 4 ' 15

daidzin 4 ' 7- O-glyk biochanin A 5, 7 4 ' - OMe formononetin 7 4 ' - OMe Flavan- 3-oly epikatechin gallat epigallokatechin gallát epigallokatechin epikatechin katechin theaflavin theaflavin-3- monogallát theaflavin-3 ' - monogallát theaflavin-, 3 ' - digallát 3, 5, 7, 3 ', 4 ', 3 ', 4 '', 5 '' 3, 5, 7, 3 ', 4 ', 5 ', 3 '', 4 '', 5 '' 3, 5, 7, 3 ', 4 ', 5 ' 3, 5, 7, 3 ', 4 ' 3, 5, 7, 3 ', 4 ' dimer dimer dimer dimer Základní chemické pochody, oxidace a redukce, probíhají současně. Vždy se jedná o přenos elektronů mezi dvěma látkami podle velikosti jejich vzájemného oxidačně-redukčního potenciálu, tj. podle tlaku elektronů v nich, podle množství elektronů ve vnější elektronové slupce molekuly a snahy ke stabilnímu uspořádání elektronů. Má-li jedna látka (substrát) vůči jiné charakter oxidačního činidla, pak ji oxiduje odnímá jí elektrony (je elektrofilním činidlem) a sama se redukuje; má-li charakter redukčního činidla vůči jiné (je nukleofilním činidlem), pak ji redukuje odevzdává jí elektrony a sama je ztrácí, tj. oxiduje se. Tyto reakce probíhají z hlediska lidského ve velmi krátkém, ale reálném čase jedna stamilióntina až jedna desetimilióntina sekundy. Při elektrontransportních řetězcích v biochemii stojí vždy na začátku donor elektronů, látka o vysokém elektronovém tlaku, o relativně vysoké negativní hodnotě standardního redox potenciálu E o. Elektron odtransportovaný donorem (dárcem atomem nebo molekulou) je zachycen akceptorem, tj. látkou o nižším elektronovém tlaku a vyšší afinitě k elektronu než má donor. Akceptor má v tomto případě charakter, jak už bylo řečeno, elektrofilního činidla, které poutá, ochotně přijímá elektrony a dostává se do redukovaného stavu, protože je elektron deficitní. Primární akceptor může předat elektron dalšímu akceptoru atd. Pojmy elektronový tlak, a afinita ve vztahu k elektronům jen opisují elektrický potenciál, redox potenciál příslušného systému, příslušné látky jsou mírou obsahu volné energie. 16

Obr. podle (3) Redox potenciál systému je potenciál, který získáme, když do roztoku obsahujícího stejnou koncentraci oxidované a redukované formy určitého redox systému např. Fe 2+ /Fe 3+ vnoříme platinovou elektrodu a změříme elektromotorickou sílu článku vytvořeného z této elektrody a srovnávací elektrody tedy elektrický potenciál napětí ve voltech nebo milivoltech. Je to tedy míra ochoty určitého systému, určitého redox páru odevzdávat své elektrony, tj. působit jako redukční činidlo (donor elektronů) nebo je přijímat, tj. působit jako oxidační činidlo (akceptor elektronů). Tedy látka s vysokým elektronovým tlakem má vysoký negativní potenciál (E o-), tj. vysokou tendenci odevzdávat elektrony, redukovat jinou látku, snadno se oxidovat a zbavit se sama elektronů. Látka s vysokou afinitou k elektronům má naopak vysoce pozitivní potenciál (E o+) a snadno se redukuje, přijímá elektrony. Tak např. smísíme-li dva oxidoredukční systémy, redox páry, za standardních podmínek E o (E o je standardní oxidoredukční potenciál při ph7 a stejné koncentraci aktivitě oxidované a redukované formy jako např. systém nikotinamidadenindinukleotid NAD + / NADH, kdy E o = - 0,32 a systém ethanol/acetaldehyd, kdy E o = - 0,2, bude se první systém oxidovat, tj. odevzdávat elektrony a vodík (NADH je silným donorem elektronů) za vzniku NAD + (NADH NAD + + H + +2 e - ) a druhý systém se bude redukovat. Reakce bude tedy probíhat tím směrem, aby systém, redox pár, s relativně negativnějším oxidoredukčním potenciálem, tj. vyšší snahou odevzdávat elektrony, svoji koncentraci snižoval a systém s vyšší snahou přijmout elektrony s relativně pozitivnějším oxidoredukčním potenciálem svoji koncentraci zvyšoval. Hodnoty E o (při konstantních podmínkách koncentrace a ph) s negativnějšími nebo pozitivnějšími potenciály určují tedy směr toku elektronu od jednoho negativnějšího systému k druhému, relativně pozitivnějšímu systému. Elektrontransportní řetězec je tedy řadou za sebou zapojených redox systémů probíhajících od nejvíce negativního redox systému až k nejvíce pozitivnímu redox systému, přičemž při každém přechodu k nižšímu, tj. více elektropozitivnějšímu systému, elektron ztrácí část svého energického náboje (3). Standardní redox potenciál některých systémů: E 0 při ph7 redox systém E o volt glutathion - SH/ glutathion -SS - 0,34 NADH+H/ NAD + - 0,32 kys. jablečná/ oxaloctová - 0,10 cytochrom c fero/ feri + 0,26 Systémy s negativnějšími redox potenciály E 0 snadno odštěpují ektrony, snadno redukují. 17

Například: hydroxylový radikál s redukčním potenciálem 2310 mv (viz tabulka) může abstrahovat vodík z proteinů - oxidovat je, to je z těch, které mají redukční potenciál menší, než 1000 mv. Proteinový, nebo aminokyselinový radikál může abstrahovat vodík z jiných aminokyselin, které mají nižší, menší redox potenciál a tak je oxidovat. Nebo, tryptofanový radikál s redukčním potenciálem 1020 mv může oxidovat abstrahovat vodík z tyrosinu s redox potenciálem 930 mv. Tyrosinový radikál může oxidovat cystein, tj. - abstrahovat, odnímat vodík z cysteinu, který má redox potenciál 730 mv. Proteinové hydroperoxidy jsou snadno dekompozitovány na alkoxylové radikály např. v přítomností přechodových iontů (viz dále). Standardní redox potenciál (mv) O 2, H + / HO 2. O 2 /O 2. _ - 460-330 H 2O 2, H + / H 2O, HO. - 320 2. _, 2H + / H 2O 2 940 ROO., H + / ROOH 1000 HO 2., H + / H 2O 2 106033 RO., H + / ROH 1600 HO., H + / H 2O 2310 Standardní redox potenciály některých kyslíkatých radikálů (podle 70) Antioxidační aktivita některých flavonoidů vůči TROLOXU (mm) Epikatechin gallát 4,9, epigallokatechin gallát 4,8, kvercetin 4,7, delfinidin 4,44, kyanidin 4,4, epigallokatechin 3,8, myricetin 3,1, kyselina gallová 3,1, katechin 2,4, rutin 2,4, apigenin 2,35, luteolin 2,1, malvidin 2,06. Trolox je ve vodě rozpustný analog vitaminu E (viz dále). Srovnatelné hodnoty redox potenciálů různých systémů můžeme dostat jen tehdy, měříme-li tyto redox potenciály za standardních podmínek, tj. při stejném ph a stejné koncentraci. Při posuzování celkového redox potenciálu konkrétního systému je nutno ovšem vzít v úvahu i otázku koncentrace jeho redukované a oxidované formy a hodnoty ph. Je-li rozdíl redox potenciálů úměrný změně volné energie - Gibbsově energii (tj. energii, kterou lze ze soustavy uvolnit, aby konala určitou práci), pak ovšem celkové množství volné energie nezávisí jen na vlastnostech látky, ale i na její koncentraci, resp. poměru koncentrací Red/ Ox. Je-li oxidovaná složka redox systému přítomna ve větší koncentraci než redukovaná forma, pak obsah volné energie musí být jiný než při převaze red formy. Hodnota redox potenciálu různých redox systémů se mění při změně poměru množství ox- a red- formy. 18

Např. u reakce: H 2 + kys. oxaloctová kys. jablečná (probíhající v přítomnosti katalyzátoru za takového rovnovážného stavu, při kterém je přítomna ve velkém přebytku red- forma kys. jablečná) redox potenciál systému oxaloctová/jablečná (nebo podobně ox- formy/ red- formy jakéhokoliv systému) je vyjádřen rovnicí: E' = E o+(rt/ nf) ln (kys. oxaloctová/ jablečná) (RT/F) ln (H + ) (n = počet elektronů v reakci) Redox potenciál tohoto systému je tedy složen ze tří faktorů: faktor E o charakterizuje látku, tj. její vlastnosti, a je dán strukturou, polohou a počtem funkčních skupin, např. OH a z toho vyplývající polaritou lipofilitou v daném místě oxidačního stresu,( viz dále) resp. i dalšími činiteli, dále faktorem, který udává poměr množství oxido-vané a redukované formy látky a třetím faktorem, který udává jeho závislost na ph. Tyto skutečnosti ilustrované na příkladu klasické biochemie, ale které platí obecně, mimo jiné vysvětlují, proč v reálných podmínkách biologického prostředí může antioxidant (např. flavonoid) působit obráceně jako prooxidant, za tvorby radikálů, které atakují např. DNK nebo jiné sloučeniny a proč je vždy nutno reálnou situaci posuzovat podle konkrétních podmínek v místě oxidačního stresu (viz obr.). Poznamenáváme, že většinou jde o dvouelektronové přechody u flavonoidů někdy o jednoelektronový přechod přičemž výměna elektronů je spjata prakticky vždy s přenosem protonů. Jednoelektronové přeměny vedou k volným radikálům, které se vyznačují jen jedním nepárovým elektronem. Jsou jen ve výjimečných případech stabilní (např. mnohé semichinony). Celkově- antioxidační potenciál flavonoidních molekul je vyšší (na molární bázi) než potenciál známých nutričních antioxidantů - vitamin C, E nebo jiných.. Formální znázornění oxidace některých flavonoidů s katecholovou strukturou (dvě o OH skupiny na kruhu B, např. kvercetin): Nejprve nastává odštěpení protonu (nezachyceno), poté odštěpení jednoho elektronu, tj. donace jednoho elektronu např. k radikálovámu kationtu - za vzniku semichinonu, a další odštěpení protonu a elektronu za vzniku chinonů,( které se tak stávají elektrofily a mohou in vivo zasahovat do signálních cest buňky - viz dále). Antioxidační aktivita je dána velikostí redukčního potenciálu (viz dále). Vzniklé chinony mohou potenciálně vytvářet dimery. Jde o reverzibilní systém; látky se liší počtem elektronů a vodíku (28) (viz mechanizmus antioxidačního působení 3,4 -OH katechinů). Diagram znázorńující vybalancování redukovaná forma flavonoidy a jiné dietární fenoly oxidovaná forma ( vybalancování, antioxidant- pro oxidant). Redukovaná forma flavonoidů má charakter antioxidantů reduktantů, odevzdává elektrony, redukuje. Oxidovaná forma má charakter 19

oxidantů má pro-oxidační aktivitu (může např. abstrahovat vodík mezi 2 dvojnými vazbami u nenasycených mastných kyselin). Flavonoidy s fenolovým jádrem oxidací poskytují fenoxylový radikál, flavonoidy s katecholovým jádrem oxidací poskytují chinon nebo semichinon. Znovu je nutno zdůraznit, že jde o reverzibilní systém a chinonová forma flavonoidů abstrakcí vodíku poskytuje zpět redukovanou flavonoidní formu (viz dále). Chinonové intermediáty s elektrofilnim charakterem se mohou vázat na bílkoviny, DNK apod. Schéma oxidace (red a ox forma) některých flavonoidů R 1 R 2 = OH= kvercetin (Katechin a plně oxidovaný o - chinonový produkt) Reakce je vratná!! (viz dále) Volné radikály jsou převážně ne však vždy nestabilní částice (atomy, molekuly), které mají ve svém vnějším molekulovém orbitalu slupce alespoň jeden nepárový elektron (mají lichý počet vazebných elektronů), což má za následek, že díky přítomnosti tohoto nepárovaného elektronu a vytvořeného elektromagnetického pole jsou vysoce reaktivní. Mohou buť donovat, nebo akceptovat elektron od ostatních molekul, proto slouží jako reduktanty, nebo oxidanty. Vznikají z molekuly ve dvojici radikálovou disociací jednoduché vazby např. fotolyticky nebo pyrolyticky nebo při přenosu elektronu z neutrální molekuly A na jinou. Při odebrání, úbytku, elektronu u této neutrální molekuly vzniká ionisovaný molekulový kation (oxidace) A +. Jestliže neutrální molekula akceptuje elektron, vzniká z ní molekulární anion A - (redukce): A - e +_/ A/ - e A + ). -------------------- ----------------------- ---------------------------- -- ----- ------ ------ --------- ------------ ----------- -- ---- -- ---- --- ---- - ---- --- ----- ---- --------- -- ---- --------- ------- ---------- ------ ------------ radikálový anion neutrální molekula radikálový kation Mohou vznikat kdekoliv v přírodě a zdá se, mohou být přítomny obecně řečeno v mnoha reakcích souvisících s přenosem elektronů elektronů (3). Energie UV záření slunce nedostačuje ke štěpení vody, ale může štěpit O-O kovalentní vazby v peroxidu za vniku 2 OH. Gama paprsky mohou například štěpit vodu v těle za vzniku škodlivých OH radikálů. Nebo v biologických tkáních mohou být např. superoxidové radikály vytvářeny adicí jednoho elektronu k molekule kyslíku O 2 + e- O. 2 - a i jinak. Obecně jsou vysoce 20