Metody výzkumu patofyziologie volných radikálů. Milan Číž

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Metody výzkumu patofyziologie volných radikálů. Milan Číž"

Antonín Říha
před 5 lety
Počet zobrazení:

1 Metody výzkumu patofyziologie volných radikálů Milan Číž 1

2 Metody detekce Chemiluminiscence Spektrofotometrie NBT-test redukce cytochromu C Elektronová spinová resonance Elektrochemie stanovení spotřeby kyslíku detekce NO Fluorimetrie (průtoková cytometrie) 2

3 Metody stanovení: volných radikálů aktivity zdrojů volných radikálů antioxidační aktivity biologických vzorků jednotlivých antioxidantů poškození biologických makromolekul 3

4 Spektrofotometrie superoxidový aniont: cytochrom C assay Princip metody je založen na redukci oxidovaného (Fe3+) cyt C superoxidovým aniontem na Fe2+ cyt C 550 nm NBT test: NBT je silný redoxní indikátor, který po redukci RKM tvoří nerozpustný diformazan, 605 nm nespecifický oxid dusnatý: Griessova reakce (nitrity, nitráty), detekční limit 100 nm, 548 nm. 4

5 Elektronová spinová resonance ESR (EPR) je spektroskopická metoda, která se zabývá mikrovlnnými přechody mezi energetickými stavy nepárových elektronů se spinem a orbitálním momentem hybnosti. 5

6 Elektrochemie oxid dusnatý: selektivní elektroda pro NO ostatní RKM stanovení spotřeby kyslíku 6

7 Průtoková cytometrie povrchové antigeny: MAb značené různými fluorescenčními značkami tvorba RMK neutrofily a makrofágy: Dichlorodihydrofluorescein diacetate peroxid vodíku, peroxynitrit Dihydrorhodamine peroxid vodíku, peroxynitrit Dihydroethidium bromide superoxidový anion. oxid dusnatý: 1,2-diaminoanthroquinone buněčný cyklus, buněčná viabilita: propidium iodide 7

8 Dichlorodihydrofluorescein diacetát Detekce H 2 O 2 ale i dalších intracelulárních oxidantů včetně oxidů dusíku Výhody shodná vlnová délka s fluoresceinem používána nejdelší dobu (od roku 1983) Nevýhody unikání z buněk nelze fixovat vysoká citlivost vůči světlu toxicita nezbytná aktivita esteráz 8

9 Dichlorodihydrofluorescein diacetát 9

10 Dihydrorhodamin Detekce H 2 O 2 ale i dalších intracelulárních oxidantů včetně oxidů dusíku Výhody až 10x vyšší citlivost oproti DCFH-DA stabilita - možnost fixace Nevýhody nespecifická detekce oxidantů závislost na mitochondriálním membránovém potenciálu? 10

11 Dihydrorhodamin 11

12 Dihydroethidium bromid Detekce O 2 - Výhody dobrá specificita pro O 2 - stabilita - možnost fixace Nevýhody HE katalyzuje dismutaci O 2 - toxický nelze použít současně s PI 12

13 Dihydroethidium bromid 13

14 Metody stanovení: volných radikálů aktivity zdrojů volných radikálů antioxidační aktivity biologických vzorků jednotlivých antioxidantů poškození biologických makromolekul 14

15 Luminometrické metody Luminofory jsou oxidovány RMK. Při návratu do základního energetického stavu emitují fotony. Jejich detekce je možná pomocí luminometrů nebo scintilačních spektrofotometrů. Nejčastěji používané luminofory: - Luminol - Lucigenin - Izoluminol - Pholasin 15

16 Luminometrické metody aktivita MPO: bromid-dependentní chemiluminiscence v přítomnosti vzorku a peroxidu vodíku buněčná proliferace a cytotoxicita: luciferin-luciferáza 16

17 Oxidativní vzplanutí fagocytů NADPH + H + NADPH oxidáza NADP + O 2 - O 2 luminol + oxidant (O - 2, H 2 O 2, OH ) -aminoftalát + N 2 + světlo (425 nm) 17

18 Oxidativní vzplanutí fagocytů 18

19 Oxidativní vzplanutí fagocytů Aktivátory fagocytů Místo působení osponizované částice (OZP) povrchové receptory fmlp povrchové receptory PMA proteinkináza C vápníkový ionofor A23187 Ca 2+ PKC 19

20 Intra- a extracelulární tvorba RMKD SOD, kataláza, křenová peroxidáza, azid sodný luminol vs. isoluminol Streptococcus mutans 20

21 Intra- a extracelulární tvorba RMKD 100 Rat PMNLs + non-opsonized S. mutans CL (RLU) Control SOD/CAT Čas (min) 21

22 Intra- a extracelulární tvorba RMKD 250 Rat PMNLs + opsonized S. mutans CL (RLU) SOD/CAT Control Čas (min) 22

23 Intra- a extracelulární tvorba RMKD 23

24 Intra- a extracelulární tvorba RMKD 24

25 Intra- a extracelulární tvorba RMKD 25

26 Intra- a extracelulární tvorba RMKD 26

27 Rozlišení mezi RMK a RMD antioxidanty NO donory (sodium nitropruside, SIN-1) analogy L-argininu (L-NMMA, L-NAME, L- NNA) 27

28 Metody stanovení: volných radikálů aktivity zdrojů volných radikálů antioxidační aktivity biologických vzorků jednotlivých antioxidantů poškození biologických makromolekul 28

29 Systémy generující RMKD xanthin/xanthin oxidáza peroxid vodíku + ionty přech.kovů O 2 - OH peroxid vodíku H 2 O 2 ABAP ROO SIN-1 ONOO - buněčné systémy (fagocyty) 29

30 Metoda TRAP Total (peroxyl) Radical-trapping Antioxidative Parameter stanovení celkové antioxidační kapacity ve vodě rozpustných antioxidantů referenční vzorek: trolox 30

31 Metoda TRAP 2,2 -azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride 2,2 -azobis(2-methylpropionamide) dihydrochloride 31

32 Metoda TRAP v lipidové fázi 2,2 -azobis(2,4-dimethylvaleronitrile) 32

33 Metoda TRAP RN == NR N 2 + 2R * R 2, další reakce 2O 2 2RO 2 * peroxylový radikál 33

34 Metoda TRAP CL Přidání vzorku 50% peak 1/2 peak-time Čas 34

35 Metoda TRAP CL [mv] 4 3 backgr abap trolox Čas [min] 35

36 Metody stanovení: volných radikálů aktivity zdrojů volných radikálů antioxidační aktivity biologických tekutin jednotlivých antioxidantů poškození biologických makromolekul 36

37 Spektrofotometrie jednotlivé antioxidanty: kyselina močová kyselina askorbová albumin bilirubin Metody stanovení oxidativního stresu 37

38 Metody stanovení: volných radikálů aktivity zdrojů volných radikálů antioxidační aktivity biologických tekutin jednotlivých antioxidantů poškození biologických makromolekul 38

39 Poškození biologických makromolekul Lipidová peroxidace Stanovení konjugovaných dienů pomocí CL Stanovení MDA spektrofotometricky, HPLC Stanovení 4-hydroxynonenalu (spektrometrie, GC-MS) 39

40 Poškození biologických makromolekul Oxidativní poškození bílkovin Stanovení karbonylových skupin proteinů (HPLC, spektrometrie) Stanovení proteinových hydroperoxidů 40

41 Poškození biologických makromolekul Oxidativní poškození DNA Stanovení 8-hydroxy-deoxy-guanosinu (8-OHdG) -HPLC, GC-MS 41

Podobné dokumenty

1 Metody stanovení antioxidantů

1 Metody stanovení antioxidantů Antioxidanty nazýváme látky schopné i v relativně nízkých koncentracích konkurovat ostatním potenciálně oxidovatelným substrátům, a tím oddálit či zcela inhibovat jejich