ÚSTAV FYZIKÁLNÍ BIOLOGIE JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH PŘIHLÁŠKA STUDENTSKÉHO PROJEKTU Projekt Název projektu: Vyuţití molekulárních metod při biosystematickém studiu skupiny Sorbus aria (L.) Crantz agg. v NP Podyjí a NP Thayatal Uchazeč Hlavní řešitel Příjmení, jméno, tituly: Lepší Martin, ing. E-mail:lepsi@seznam.cz Tel.: 387929307 Studium v doktorském studijním programu zahájeno dne: 1. 3. 2010 Pracoviště/místo studia Fakulta (VŠ ústav): Přírodovědecká fakulta Jihočeské univerzity Katedra (ústav, pracoviště): Katedra botaniky, Branišovská 31, 370 05, České Budějovice Školitel: Ing. Milan Štech, Ph.D Vedoucí projektu Příjmení, jméno, tituly: Ing. Milan Štech, Ph.D E-mail: stech@prf.jcu.cz Tel.: 387772373 Pracoviště Fakulta (VŠ ústav): Přírodovědecká fakulta Jihočeské univerzity Katedra (ústav, pracoviště): Katedra botaniky, Branišovská 31, 370 05, České Budějovice Celkové náklady na řešení projektu Náklady nebo výdaje na pořízení hmotného a nehmotného majetku: 0 Další provozní náklady nebo výdaje: 40 000,- Doplňkové náklady nebo výdaje: 10 000,- Celkem Kč: 50 000,- V Českých Budějovicích dne 20. 5. 2011 Podpis uchazeče:...
Zdůvodnění návrhu projektu Stav řešení problematiky projektu (max. 2 stránky): Je odhadováno, ţe více neţ 50 % druhů krytosemenných rostlin má polyploidní počet chromosómů (Soltis & Soltis 2000). Studium a porozumění procesům vedoucím ke vzniku polyploidů má proto značný význam pro pochopení obecných evolučních mechanismů u rostlin. Vhodnou modelovou skupinou ke studiu speciačních principů je ve střední Evropě evolučně progresivní rod Sorbus, charakterizovaný velkým počtem polyploidních druhů různého evolučního stáří, značnou diverzitou reprodukčních strategií a aktuálně probíhající speciací (Rich et al. 2010). V Evropě je rod reprezentován pěti základními sexuálními druhy (Sorbus aria s. l., S. aucuparia, S. torminalis, S. chamaemespilus, S. domestica), které jsou vzájemně dobře morfologicky vyhraněné a proto často řazené do samostatných podrodů (Campbell et al. 2007). Mají zpravidla diploidní počet chromosomů (2n=34) a jejich areály zaujímají rozsáhlá území. Dále jsou rozlišovány hybridogenní, polyploidní druhy vznikající mezidruhovou hybridizací mezi skupinami Sorbus aria s. l. a S. aucuparia, S. torminalis nebo S. chamaemespilus (S. domestica se hybridizace neúčastní). Tyto druhy se zpravidla rozmnoţují apomikticky a mají obvykle omezený areál (často lokální endemity). Vyznačují se nízkou genetickou a morfologickou variabilitou a jsou vzájemně morfologicky odlišitelní na základě minuciézních, ale stálých znaků (Kutzelnigg 1995, Meyer et al. 2005). Třetí skupinou rozlišovaných taxonů jsou zástupci skupiny S. aria s. l., kteří hrají díky časté hybridizaci s dalšími diploidními zástupci jiných podrodů, ale také uvnitř skupiny klíčovou roli pro pokračující speciaci rodu Sorbus (Chester et al. 2007). Do jisté míry se u nich kombinují vlastnosti obou výše uvedených skupin tj. typem rozmnoţování je obligátní nebo fakultativní apomixie, její zástupci mohou mít velmi úzké, ale i široké areály (Kárpáti 1960, Rich et al. 2010). Skupina S. aria s. l. ve střední Evropě V poslední době je ve střední Evropě věnována značná pozornost tranzitním taxonům vznikajícím hybridizací mezi S. aria s. l. a zástupci jiných podrodů (např. Kovanda 1996a, Májovský et al. 1998, Meyer et al. 2005, Lepší et al. 2009), např. v ČR bylo rozlišeno 11 polyploidních druhů, které jsou (sub-)endemity našeho státu (Kubát et al. 2002, Lepší et al. 2008, 2009). Avšak podrobnému biosystematickému studiu evolučně klíčové skupiny S. aria s. l. se doposud nikdo nevěnoval. V současnosti akceptovaný taxonomický koncept (Kovanda 1992, Májovský 1992, Kutzelnigg 1995, Meyer et al. 2005) vychází z monografie maďarských jeřábů (Kárpáti 1960), která rozlišuje tři základní taxony (S. aria s. str., S. umbellata, S. graeca). Ty jsou retikulárně spojené morfologicky přechodnými a lokálně rozšířenými tzv. vedlejšími taxony. Práce je zaloţena pouze na observační zkušenosti autora bez vyuţití jiných analytických nástrojů (morfometrika, karyologie, cytometrie, molekulární metody atp.) a je víceméně lokálně zaměřena (tj. přesah mimo území Maďarska obzvláště západním směrem je pouze okrajový). Nedostatek i zcela bazálních znalostí o zástupcích skupiny S. aria s. l. je i v ČR. Skupině se doposud u nás nikdo blíţe nevěnoval a veškeré známé skutečnosti vycházejí pouze z floristických zkušeností jednotlivých autorů. Místem s největší diverzitou skupiny v ČR je NP Podyjí odkud jsou (stejně jako z celé ČR) udávány tyto taxony: S. aria s. str., S. danubialis, S. graeca a S. subdanubialis (Kubát et al. 2002, Šefl 2007).
Dvouletý pilotní terénní a cytologický průzkum S. aria s. l. na území NP Podyjí a Thayatal provedený ţadatelem tohoto grantu a jeho spolupracovníky (P. Vít, UK Praha; P. Lepší, CHKO Blanský les) prokázal řadu nesrovnalostí, vyvolal mnoţství otázek a potřebu podrobné biosystematické revize celé skupiny za pouţití moderních metod. Bylo zjištěno, ţe informace o ploidii jednotlivých taxonů jsou fragmentární, protichůdné, pouţívaná nomenklatura je často provizorní, chorologické znalosti velmi hrubé a často mylné. Prakticky nic není známo o genetické a cytologické variabilitě či reprodukčních systémech jednotlivých taxonů. Variabilita S. aria agg. v NP Podyjí a NP Thayatal Vlastní pilotní výzkum naznačuje, ţe diverzita a morfologická a cytologická variabilita S. aria agg. v NP Podyjí a Thayatal je značná. Stanovením DNA ploidního stupně průtokovou cytometrií byly zatím zjištěny 3 morfologicky vzájemně odlišné triploidní populace, 1 tetraploidní populace, tetraploidní populace S. danubialis, a diploidní populace S. aria s.str. Ostatní z území udávané taxony (S. graeca, S. subdanubilis) nebyly zatím potvrzeny a nelze je morfologicky ztotoţnit s výše uvedenými polyploidními populacemi. Dále bylo detekováno několik morfologicky unikátních polyploidních jedinců, které nelze přiřadit ani k jedné z výše uvedených populací a které mohou být produktem aktuálně probíhající hybridizace. Navrhovaný biosystematický výzkum S. aria agg. povede k bliţšímu prozkoumání části evolučně významné a taxonomicky kritické skupiny S. aria s. l. (např. můţe přinést rozlišení nových taxonů). Biosystematické studium takto evolučně progresivního agregátu taxonů můţe navíc významně přispět k pochopení obecných speciačních mechanismů rostlin. Poznání variability a speciačních mechanismů zkoumané skupiny je rovněţ ţádoucí z pohledu ochrany národního resp. evropského genofondu, neboť bez bliţšího poznání jednotlivých taxonů není prakticky moţné zajistit jejich legislativní ochranu popř. účinně chránit recentně probíhající evoluční procesy. Stanovení badatelských cílů, metody a způsob řešení (max. 2 stránky): Cíle: 1. Jaká je molekulární variabilita detekovaných cytotypů S. aria s.l. v NP Podyjí a NP Thayatal? 2. Koreluje morfologická variabilita s genetickou variabilitou? 3. Koreluje cytologická variabilita s genetickou variabilitou? 4. Jsou jednotlivé vylišené cytotypy geneticky vnitřně homogenní? Metody: Molekulární analýzy Ke stanovení genetické variability bude vyuţita metoda zjišťování polymorfismu mikrosatelitů (Scribner & Pears 2000). Budou vyuţity primery vyvinuté pro rod Sorbus (Mss1, Mss5, Mss6, Ms6g, Ms14) a Malus (CH02D11, CH01H10) (podrobnosti viz Lepší et al. 2008, 2009). Analýza polymorfismu mikrosatelitů se osvědčila v podobně zaměřených pracích (Lepší et al. 2008). Cytogeogeografie a reprodukční systémy DNA ploidní stupeň a velikost genomu bude stanovován z čerstvých listů pomocí PI a DAPI průtokové cytometrie. Jako interní standard bude pouţita Bellis perenis L. (3,38 pg; Schönswetter et al. 2007). Aby byly eliminovány komplikace způsobené přítomností sekundárních metabolitů bude pouţita modifikovaná metodika podle Doleţel et al. (2008). Metodické podrobnosti lze nalézt v práci Lepší et al. (2008). Typ reprodukčních systémů bude
stanovován rovněţ průtokovou cytometrií na základě poměru ploidní úrovně embrya a endospermu semen podle metodiky Matzk et al. (2000). Geometrické morfometrické analýzy Morfologická variabilita tvaru listů bude analyzována pomocí metody Fourierovi aproximace (Kuhl & Giardina 1982), která je součástí softwarového balíku SHAPE 1.2 (Iwata & Ukai 2000). Detaily metodiky jsou uvedeny v práci Lepší et al. (2009). Mnohorozměrné morfometrické analýzy Kvantitativní znaky na vegetativních a generativních orgánech budou vybrány podle publikovaných determinačních klíčů a vlastních zkušeností (detaily viz Lepší et al. 2008). Data budou analyzována pomocí procedur CANDISC a DISCRIM, které jsou součástí softwarového balíku SAS (verse 9.1; SAS Institute, Cary, NC, USA). Metodika analýz bude následovat práci Klecka (1980). Detaily metodiky viz Lepší et al. (2008). Literatura: Campbell C. S. R. C. Evans R. C., Morgan D. R., Dickinson T. A., Arsenault M. P. (2007): Phylogeny of subtribe Pyrinae (formerly the Maloideae, Rosaceae): Limited resolution of a complex evolutionary history. Pl. Syst. Evol. 266: 119 145. Chester M., Cowan R. S., Fay M. F., Rich T. C. G. (2007): Parentage of endemic Sorbus L. (Rosaceae) species in the British Isles: evidence from plastid DNA. Botanical Journal of the Linnean Society 154: 291 304. Doleţel J., Greilhuber J. & Suda J. (2008): Estimation of nuclear DNA content in plants using flow cytometry. Nature Protoc. 2: 2233 2244. Iwata H. & Ukai Y. (2002): SHAPE: a computer program package for quantitative evaluation of biological shapes based on elliptic Fourier descriptors. J. Hered. 93: 384 385. Kárpáti Z. (1960): Die Sorbus Arten Ungarns und der angrenzenden Gebiete. Feddes Repert. 62: 71 331. Klecka W. R. (1980): Discriminant analysis. Sage University Papers, Series: Quantitative applications in the social sciences, no. 19, Sage Publications, Beverly Hills & London. Kovanda M. (1992): Sorbus L. In: Hejný S. & Slavík B. (eds), Květena České republiky [Flora of the Czech Republic] 3: 474 484, Academia, Praha. Kovanda M. (1996): New taxa of Sorbus from Bohemia (Czech Republic). Verhandlungen der Zoologisch-Botanischen Gesellschaft in Österreich 133: 319 345. Kubát K., Hrouda L., Chrtek J. jun., Kaplan Z., Kirschner J. & Štěpánek J. (eds) (2002): Klíč ke květeně České republiky [Key to the flora of the Czech Republic]. Academia, Praha. Kuhl F. P. & Giardina C. R. (1982): Elliptic Fourier features of a closed contour. Comp. Graphics Image Processing 18: 236 258. Kutzelnigg H. (1995): 19. Sorbus L. In: Conert H. J., Hamann U., Schultze-Motel W. & Wagenitz G. (eds), Gustav Hegi, Illustrierte Flora von Mitteleuropa, Ed. 2, Vol. IV/2B: 328 385, Blackwell Wissenschafts-Verlag, Berlin & Wien. Lepší M., Boublík K., Lepší P., Vít P. & Suda J. (2008): Sorbus milensis, a new hybridogenous species from northwestern Bohemia. Preslia 80: 229 244. Lepší M., Vít P., Lepší P., Boublík K. & Kolář F. (2009): Sorbus portae-bohemicae and Sorbus albensis, two new endemic apomictic species recognized based on a revision of Sorbus bohemica Preslia 81: 63 89.
Májovský J., Bernátová D., Obuch J., Topercer J (1998): Sorbus margittaiana, an endemic of Krivánska Fatra Mts. Biologia 53/1: 29 35 Májovský, J. (1992): Sorbus L. emend. Crantz. In: Bertová, L. (ed. ), Flóra Slovenska [Flora of Slovakia] 4/3: 401 446,. Veda, Bratislava. Matzk F., Meister A., Schubert I. (2000): An efficient screen for reproductive pathways using mature seeds of monocots and dicots. Plant J. 21: 97 108. Meyer N., Meierott L. & Angerer O. (2005): Beiträge zur Gattung Sorbus in Bayern. Ber. Bayer. Bot. Ges., Sonderband: 5 216. Rich T. C. G., Houston L., Robertson A. & Proctor M. C. F. (2010): Whitebeams, Rowans and Service Trees of Britain and Ireland. A monograph of British and Irish Sorbus L. B. S. B. I. Handbook No. 14. Botanical Society of the British Isles. London. Soltis P. S. & Soltis D. E. (2000): The role of genetic and genomic attributes in the succes of polyploids. Proceeding of the National Academy of Scientes of the USA 97:7051 7057. Schönswetter P., Suda J., Popp M., Weiss-Schneeweiss H. & Brochmann C. (2007): Circumpolar phylogeography of Juncus biglumis (Juncaceae) inferred from AFLP fingerprints, cpdna sequences, nuclear DNA content and chromosome numbers. Molecular Phylogenetics and Evolution 42(1): 92 103. Scribner K. T. & Pearce J. M. (2000): Microsatellites: Evolutionary and methodological background empirical applications at individual, population and phylogenetic levels. In: Barker A. J. (ed.), Molecular Methods in Ecology. Blackwell Sciences, Toronto. Šefl J. (2007): Jeřáby na Podyjí. Thayensia 7: 121 151. Harmonogram prací: Červen-září 2011 Sběr vzorků, průtoková cytometrie Říjen-listopad 2011 Molekulární analýzy, interpretace výsledků. Předpokládaný typ vědeckých výsledků projektu Výstupem projektu bude minimálně jedna publikace v impaktovaném časopise (Taxon, Preslia). Výsledky budou prezentovány na konferencích (Konference ČBS 2011, Konference systematických doktorandů 2011). Výsledky s regionálním dopadem budou publikovány ve Zprávách České botanické společnosti. Dalším výstupem bude zpracování rodu Sorbus do monografie Květena ČR, Academia. Hlavní závěry budou popularizovány v časopisech Ţiva nebo Vesmír popř. Lesnická práce. Hlavní řešitel (maximálně 30 řádek) Vzdělání a kvalifikace: 1995 1998, Technická ekologie, Fakulta elektrotechnická ZU v Plzni, bakalářská práce Zhodnocení jakosti vody Úhlavy pro vodárenské účely 1998 2000, Revitalizace krajiny, Fakulta ţivotního prostředí UJEP v Ústí nad Labem, diplomová práce Určení vztahu mezi věkem a impedancí u smrku (Picea abies) přístrojem Mervit ;
Od roku 2000, botanik Jihočeského muzea, výzkumná činnost: taxonomie apomiktických komplexů (Rubus, Sorbus), regionální fytogeografie (flóra Novohradských hor). Publikace: autor či spoluautor ca 60 odborných článku, kapitol v kompendiích, či krátkých zpráv např.: Lepší M., Boublík K., Lepší P., Vít P. & Suda J., 2008: Sorbus milensis, a new hybridogenous species from northwestern Bohemia. Preslia 80: 229 244. Lepší M. & Lepší P., 2009: Rubus silvae-norticae, a new species from Bohemia, Austria and Bavaria and the significance of brambles for regional migrations and phytogeography. Preslia 81: 43 62. Lepší M., Vít P., Lepší P., Boublík K. & Kolář F., 2009: Sorbus portae-bohemicae and Sorbus albensis, two new endemic apomictic species recognized based on a revision of Sorbus bohemica Preslia 81: (63 89). Vedoucí projektu (maximálně 30 řádek) příjmení, jméno, tituly: Štech, Milan, Ph.D e-mail, tel.: stech@prf.jcu.cz, 387772373 pracoviště: Katedra botaniky Přírodovědecké fakulty Jihočeské univerzity odborná charakteristika, výběr z publikační a grantové činnosti: Řešená problematika: systematika a fytogeografie cévnatých rostlin, mikrospeciační procesy a hybridizace Vybrané publikace za posledních 5 let: Košnar J., Košnar J., Herbstová M., Macek P., Rejmánková E. & Štech M. (2010): Natural hybridization in tropical spikerushes of Eleocharis subgenus Limnochloa (Cyperaceae): Evidence from morphology and DNA markers. American Journal of Botany 97:1229 1240. Loureiro J., Trávníček P., Rauchová J., Urfus T., Vít P., Štech M., Castro S. & Suda J. (2010): The use of flow cytometry in the biosystematics, ecology and population biology of homoploid plants. Preslia 82: 3 21. Kolář F., Štech M., Trávníček P., Rauchová J., Urfus T., Vít P., Kubešová M. & Suda J. (2009): Towards resolving the Knautia arvensis agg. (Dipsacaceae) puzzle: primary and secondary contact zones and ploidy segregation at landscape and microgeographic scales. Annals of Botany 103: 963 974, 2009.
Požadované finanční prostředky Výdaje a náklady na pořízení hmotného a nehmotného majetku (max. 50000Kč) Drobný hmotný a nehmotný majetek 0,- Spotřební materiál 40 000,- Náklady na publikace (max. 2000Kč): 0,- Doplňkové náklady nebo výdaje: 10 000,- Požadované finanční prostředky celkem: 50000,- Slovní zdůvodnění a rozpis finančních prostředků 1. Molekulární analýzy PCR, (přesráţení, ROX, gely a plastik - 150 kč/vzorek; fragmentační analýza 150kč/vzorek) 91 vzorků cekem 27 500,- 2. Nákup 5 párů značených primerů 12 500,-