ISSR (Inter simple sequence repeat) Jiří Košnar

Transkript

1 ISSR (Inter simple sequence repeat) Jiří Košnar Přírodovědecká fakulta Jihočeské univerzity v Č. Budějovicích

2 HISTORIE relativně nová metoda: Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. (1994): Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics, 20: studie prokázala aplikovatelnost metody jak pro vzorky rostliny (soja, kukuřice, rajče, Arabidopsis), tak pro vzorky živočichů (hmyz, obratlovci) nejdříve využívána zejména pro genotypifikaci a identifikaci kultivarů zemědělských plodin pro svoji relativní nenáročnost se metoda rozšířila i do dalších oborů, v botanice první studie patrně Wolfe (1998) v současné době poměrně hojně využívaná metoda

3 PRINCIP METODY arbitrární primery komplementární k sekvenci mikrosatelitů (SSR), délka ca bp (GACA) 4, GA 4 (CT),GA 4 (YT)... při PCR použit obvykle 1 primer: nasedá na komplementární SSR motivy, a amplifikuje úseky mezi dvěma protilehlými SSR motivy, umístěnými na řetězci v opačném směru SSR jen u eukaryot, převážně v jádře (cpdna málo) variabilita generována mutacemi SSR motivu, nebo v jeho okolí (anchored primery), nebo indely v lokusech amplifikovaných daným primerem ISSR markery jsou hypervariabilní jaderný marker, hodnocený jako dominantní

4 1) PCR VLASTNÍ PROVEDENÍ - výběr a optimalizace primerů: na jednu studii obvykle použito (variabilních) ISSR lokusů, generovaných 3-10 primery - reakce o obejmu ul jsou dostačující - nutno provést 2 nezávislé opakování každého primeru pro každý vzorek 2) vizualizace na gelu: agaróza, PAA, nebo efektivněji pomocí fragmentační analýzy (FISSR-PCR) možné modifikace metody (ne příliš rozšířené): - remplifikace: produkt PCR amplifikace použit na další amplifikaci - kombinace 2 ISSR primerů na 1 PCR, nebo kombinace ISSR a RAPD primeru (R-ISSR)

5 ELFO čím větší, tím lepší - gely o délce aspoň 15 cm, hřebeny na jamky 6x1 mm, výška gelu ca 3 mm - radši malé napětí (80V), nechat migrovat 4-8 h - barvení gelů optimálně post-staining pro vyšší kvalitu a senzitivitu gelu (SybrGreen, GelRed, EtBr,...) Cycler výhodný je 3 blokový (možno pouštět zároveň více různých programů na 1 přístroji, pro optimalizaci primerů)

6 HODNOCENÍ stejné jako u jiných dominantních markerů (RAPD, AFLP) PCoA, cluster analysis... pro jednotlivé vzorky se vytvoří binární matice, bandy skórovány jako 0/1 skórovat pouze jasné lokusy, jako prezence (1) se hodnotí band přítomný na obou opakování PCR; intenzita bandů nehraje roli (dominantní marker)

7 HODNOCENÍ ? ? ? ? manuální skórování většinou se skórují bandy 200 bp až 3 kb u delších fragmentů nejistota s homologií

8 VÝHODY hypervariabilní marker, použitelý i na populačně-genetické studie, detekci klonů výhody oproti ostatním známým hypervariabilním markerům: není třeba žádná znalost genomu zkoumaného organismu (x SSR); primery jsou arbitrární, univerzální (možno testovat na jakýkoli organismus) metoda není náročná na kvalitu a množství použité DNA (x AFLP, RAPD); pokud pracujeme s problematickým materiálem, mnohdy jediný použitelný hypervariabilní marker slušná reprodukovatelnost metody (delší primery než u RAPD) relativně nižší cena (x AFLP, SSR), malé požadavky na přístrojové vybavení (stačí centrifuga, cycler, dostatečně velká ELFO)

9 NEVÝHODY nutnost optimalizace pro daný studovaný organismus (časově náročná, nutné počítat s náklady na testovací PCR, popř. ještě investice do nákupu primerů pro začátek stačí tak 20 primerů) obvykle nižší variabilita než AFLP (ale srovnatelná nebo vyšší než RAPD) některé studie zpochybnily míru reprodukovatelnosti metody - amplifikace ISSR markerů i ze vzorků bakterií, které v genomu nemají SSR motivy; většina publikovaných studií ale považuje metodu za spolehlivou až velmi spolehlivou (robustnější než RAPD) dominantní charakter markeru (pro běžné aplikace není příliš velký problém, snad jen populační genetika - problematické stanovení frekvence alel; ostatně kromě SSR jsou i všechny ostatní hypervariabilní DNA markery dominantní)

10 OPTIMALIZACE předběžný výběr vhodných primerů dostatečně variabilních, poskytujících + - spolehlivý a dobře reprodukovatelný banding pattern: počáteční PCR screening ca 20 primerů na menším počtu odlišných vzorků - z nich výběr potenciálně použitelných primerů (slabá reakce a smear) (nadějný primer, optimalizovat)

11 OPTIMALIZACE optimalizace PCR pro vybrané nadějné primery - pro každý materiál nutno postupovat individuálně (prakticky každá publikovaná práce použila specifický PCR protokol) možností optimalizace PCR velmi mnoho, obvykle směřují ke zvýšení specifity nasedání primeru, nejčastěji se používá: optimalizace teploty annealingu specifická pro daný primer, lze vycházet z Tm = 4(G+C)+2(A+T); většinou v rozmezí ca C, ca o 2 8 C vyšší než Tm (x některé studie používají jednotnou teplotu pro všechny primery, často i relativně nízkou, < Tm, např. 45 C) touchdown protokol optimalizace koncentrace MgCl 2 v PCR směsi přidávání látek zvyšujících specifitu PCR (DMSO, formamid, TMA oxalát) optimalizace koncentrace DNA, množství Taq polymerázy jednotlivé studie se ale také liší počtem cyklů PCR (35-45), délkou jednotlivých kroků PCR cyklu...

12 OPTIMALIZACE vliv teploty annealingu: radši používat vyšší teploty v kombinaci s touchdown protokolem (primer CAGC(AC) 4, Tm = 56 C) 59 C, touchdown 62 C, touchdown (příliš mnoho slabých bandů) (lépe skórovatelný banding pattern)

13 APLIKACE ISSR použitelné na prakticky všechny taxonomické a populační studie výhodné pro detekci hybridů (např. Wolfe 1998) biparentálně přenášený jaderný marker: - u hybridů detekován aditivní pattern bandů - nebo stanovení alel typických pro rodičovské druhy, a statistika jejich výskytu u hybridních jedinců patrně ale nemusí být vhodné na fylogenetické studie vyšších taxonomických úrovních (rychlá evoluce SSR)

14 Děkuji za pozornost. Chunjiang Y., Zhanwang Y., Fanna K., Suowei W., Bin W. (2005): R-ISSR as a New Tool for Genomic Fingerprinting, Mapping, and Gene Tagging. - Plant Molecular Biology Reporter 23: ( Hassel K., Gunnarsson U. (2003): The use of inter simple sequence repeats (ISSR) in bryophyte population studies. - Lindbergia 28: Nagaraju J., Kathirvel M., Subbaiah E.V., Muthulakshmi M., Kumar L.D. (2002): FISSR-PCR: a simple and sensitive assay for highthroughput genotyping and genetic mapping. - Molecular and Cellular Probes 16: Nagaoka T., Ogihara Y. (1997): Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers. - Theor. Appl. Genet. 94: Reddy M.P., Sarla N., Siddiq E.A. (2002): Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding. - Euphytica 128: Weising K., Atkinson R.G., Gardner R.C. (1995): Genomic fingerprinting by microsatellite-primed PCR: a critical evaluation. - PCR Methods Appl., 4: ( Weisner I., Weisnerová D. (2003): Insertion of a reamplification round into the ISSR-PCR protocol gives new flax fingerprinting patterns. - Cell Mol Biol Lett. 8: Wolfe A.D. (2005): ISSR techniques for evolutionary biology. - Methods Enzymol., 395: Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. (1994): Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)- anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics, 20: