Laboratorní úlohy Výukový materiál vznikl za finanční podpory Fondu rozvoje vysokých škol v rámci řešení projektu č. 1377/2013 Vytvoření demonstračních úloh sloužících k inovaci předmětu Aplikace elektromigračních technik.
OBSAH Úvod...2 Separace směsi proteinů pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy (PAGE)...3 Separace směsi anorganických kationtů a aniontů pomocí kapilární zónové elektroforézy s využitím nepřímé UV detekce...9 Separace směsi neutrálních látek pomocí micelární elektrokinetické chromatografie... 15 1
Úvod Elektromigrační metody jsou separačními metodami, které umožňují separaci, detekci a následnou kvalitativní a kvantitativní analýzu látek nesoucích elektrický náboj. Princip separace spočívá v rozdílech rychlosti migrace nabitých částic (např. iontů, nabitých komplexů, iontových asociátů) v elektrickém poli, které umožňuje průchod elektrického proudu (přenos tohoto náboje). Elektromigrační metody jsou spolu s metodami chromatografickými řazeny mezi nejvyužívanější separační techniky, které mohou být uskutečněny jak v analytickém, tak preparativním provedení 1. Tab. 1 Srovnání kapilárních a plošných elektromigračních metod 1 Kapilární elektroforéza Separace probíhá v kapiláře (vnitřní průměr 25 až 100 µm) Napětí vkládané mezi elektrody 0 30 kv Separace malých iontů i makromolekul Složitější instrumentace, lepší účinnost separace, snadná detekce, automatizace Plošná elektroforéza Separace probíhá v gelu nebo na papíře Napětí vkládané mezi elektrody 0 200 V Separace pouze makromolekul Jednoduchá instrumentace, nízká účinnost, nutnost off-line detekce Obr. 1 Instrumentace - kapilární elektroforéza Obr. 2 Instrumentace plošná elektroforéza 1 Maier V.: Přednášky k předmětu, PřF UP v Olomouci, 2011. 2
Separace směsi proteinů pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy (PAGE) Úkol: Pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy rozseparujte směs tří proteinů (lysozym, alfa-laktalbumin, BSA). 1. Teoretická část: Proteiny Proteiny (bílkoviny) patří do skupiny biopolymerů, které jsou složeny převážně z dvaceti druhů α-aminokyselin. Tyto aminokyseliny jsou spojeny peptidovými vazbami a jejich relativní molekulová hmotnost je 10 3-10 6. Proteiny plní v organismu rozličné funkce, např. transportní, stavební, katalytickou, regulační, ochranou, obranou a zajišťují pohyb. Lysozym je enzym, který je obsažený v slzách, slinách, hlenu, krevní plazmě, mateřském mléce, ve vaječném bílku atd. Má silné antibakteriální účinky, které se projevují schopností narušovat vazbu peptidoglykanu v buněčné stěně a následně způsobit lyzi buňky. Alfa-laktalbumin se nachází v lidském mléce a hraje zásadní roli při vstřebávání vápníku do těla. Je součástí enzymu laktososyntetáza, který se podílí na tvorbě laktózy. BSA (bovine serum albumin, hovězí sérový albumin) slouží v krvi jako nosič hydrofobních látek. Díky jeho vysoké koncentraci v krvi se zároveň uplatňuje jako pufrační činidlo a napomáhá tak udržovat stabilní ph krve. Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) Gelová elektroforéza poskytuje informace o molekulové hmotnosti a náboji proteinů, o podjednotkách struktury proteinů a především o čistotě připravených proteinů. Metoda je rychlá, jednoduchá, vykazuje vysokou opakovatelnost a nejvyšší rozlišení ze všech metod dostupných pro separaci proteinů. Nejběžnější použití gelové elektroforézy je kvalitativní analýza směsi proteinů a nukleových kyselin. Nejznámější a nejvíce využívanou technikou je sodium dodecyl sulfát polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS-PAGE). Metoda poskytuje snadný způsob, jak odhadnout počet polypeptidů ve vzorku, a tím posoudit složitost vzorků nebo čistotu přípravy. SDS-PAGE je zvláště užitečná pro monitorování frakcí získaných během chromatografie nebo dalšího čištění. SDS je aniontový detergent, který solubilizuje a denaturuje proteiny 3
a dodává proteinům negativní náboj. Téměř všechny proteiny vážou SDS ve stejném poměru, a to asi 1,4 g SDS na 1g proteinu. Obr. 3 Sodium dodecyl sulfát (SDS) Nejdříve jsou proteiny tepelně denaturovány ve vzorkovém pufru, který obsahuje SDS, tudíž je zachována pouze primární struktura proteinů. Obr. 4 Zahřívání proteinů s SDS Denaturované proteiny mají stejný záporný náboj daný vazbou SDS a vláknitý tvar a tedy jejich migrace závisí pouze na jejich molekulové hmotnosti. Po nanesení vzorku (proteinu) na gel a umístění gelu do elektrického pole dochází k migraci proteinů ke kladně nabité elektrodě (anodě). Menší proteiny se pohybují rychleji a tím dochází k jejich separaci podle velikosti (princip molekulového síta). 4
Obr. 4 Schéma princip SDS PAGE separace proteinů Detekce separovaných proteinů se provádí kolorimetricky nebo fluorescenčním barvením. Proteiny, posttranslačně modifikovány např. fosforylací nebo glykosilací, mohou být spolehlivě stanoveny několika postupy založenými na fluorescenci. V našem případě provedeme detekci pomocí barviva Coomassie blue, které se zafixuje na protein v gelu. Po odbarvení zůstane na gelu barva pouze v místech, kde se navázala na fixovaný protein. 2. Praktická část 2.1. Přístroje a pomůcky Zařízení pro gelovou elektroforézu vertikální provedení, analytické váhy, ph metr s kombinovanou skleněnou elektrodou, elektromagnetická míchačka, termoblok, elektromagnetické míchadlo, odměrné baňky, plastové nádobky, nádoby na vybarvovací a odbarvovací roztok, rukavice, lopatka na gel, hřebínek, navažovací lodičky, špachtle, pipety, eppendorfky. 5
2.2. Chemikálie Standardy proteinů (lysozym, alfa-laktalbumin, BSA), TRIS, kyselina chlorovodíková, SDS, glycerol, β-merkaptoethanol, glycin, akrylamid, persíran amonný, TEMED, bromfenolová modř, deionizovaná voda, Coomassie Blue, ethanol, kalibrační roztoky pro kalibraci ph metru. 2.3. Pracovní postup Příprava elektrolytů Podle následující tabulky se připraví potřebné elektrolyty. Elektrolyt potřebný pro přípravu vzorku (V = 10 ml) 250 mm TRIS 240 mm HCl 10 % SDS, 30 % glycerol 5 % β-merkaptoethanol 0,02 % bromfenolová modř Tab. 2 Příprava elektrolytů Separační elektrolyt (V = 250 ml) 250 mm TRIS 1,9 M glycin 1 % SDS Elektrolyt potřebný pro přípravu separačního gelu (V = 20 ml) 1,5 M TRIS 250 mm HCl Příprava gelu Podle tabulky č. 3 (viz níže) se připraví separační gel. Skla (1 mm) se spolu se spacery umístí do stojanu sloužícího pro nalití vzorků. Následně se gel pomalu nalije (pomocí pipety) mezi připravená skla (pozn. pozor, aby v gelu nevznikaly bubliny). Do gelu se vloží hřebínek, pomocí něhož se v gelu vytvoří jamky sloužící jako prostor pro nadávkování vzorku. Vyčká se na polymerizaci gelu. Po polymerizaci gelu se opatrně vyndá hřebínek a jamky se propláchnou deionizovanou vodou. Skla s vytvořeným gelem se upevní do aparatury pro gelovou elektroforézu. 6
Tab. 3 Složení směsi separačního gelu Separační gel (10 %) (V = 10 ml) 3,35 ml 30 % akrylamidu* 2,5 ml 1,5 M TRIS (ph = 8,8) 100 µl 10 % persíran amonný 100 µl 10 % SDS 4 µl TEMEDu 3,95 ml deionizované vody *jedná se o neurotoxickou látku je potřeba pracovat v rukavicích a se zvýšenou opatrností Příprava vzorku Odpipetuje se 50 µl standardních roztoků proteinů a směsi proteinů, ke každému vzorku se přidá 9,5 µl elektrolytu připraveného pro přípravu vzorku. Vzorky se umístí na 5 minut do termobloku vyhřátého na teplotu 95 C. Následně se vzorky ochladí. Příprava vybarvovacího a odbarvovacího roztoku Podle tabulky č. 4 se připraví vybarvovací a odbarvovací roztok. Tab. 4 Složení roztoků potřebných pro detekci Vybarvovací roztok 0,23 % Coomassie blue 3,9 % trichloroctové kyseliny 6 % kyseliny octové 17 % methanolu Odbarvovací roztok 20 % ethanolu 10 % kyseliny octové Analýza pomocí gelové elektroforézy (SDS-PAGE) Pomocí pipety se nanese 20 µl každého vzorku do jednotlivých jamek vytvořených v separačním gelu. Vana se naplní separačním elektrolytem a uzavře se. Následně se připojí elektrody a vloží se napětí (50 V). Analýza se ukončí v momentě, kdy se barvivo (bromfenolová modř) přiblíží k okraji (konci) gelu. Poté se gel vloží do připraveného vybarvujícího roztoku a následně do roztoku odbarvovacího. Vyhodnotí se získaná data (porovnají se skvrny jednotlivých proteinů se skvrnami v jejich směsi). 7
3. Otázky 1. Vyjmenujte základní rozdíly (výhody, nevýhody) mezi kapilární a plošnou elektroforézou. 2. Vysvětlete obecný princip gelové elektroforézy. 3. Jaké látky je možno separovat pomocí plošné gelové elektroforézy? Odpověď zdůvodněte. 4. Popište rozdíl mezi nativní gelovou elektroforézou a SDS gelovou elektroforézou. 5. Uveďte příklad detekce analytů po separaci pomocí gelové elektroforézy. 6. Uveďte, jaké typy gelů jsou používány pro gelovou elektroforézu. 4. Literatura 1. Šťulík K.: Analytické separační metody. Karolinum, Praha 2004. 2. Hage D.S., Carr J.D.: Analytical Chemistry and Quantitative Analysis, Prentice Hall, New Jersey 2011. 3. Miller F.P., a kol.: Gel Electrophoresis, Alphascript publishing, Mauritius 2010. 4. Hawcroft D.M.: Electrophoresis, The Basics, IRL Press, Oxford 1997. 5. B.D. Hames: Gel Electrophoresis of Proteins, A Practical Approach, IRL Press, Oxford 1990. 6. Kurien B.T., Scofield R.H.: Protein Electrophoresis, Methods and Protocols, Humana Press, New York 2012. 7. Davey J., Lord M., Essential Cell Biology, Vol. 1: Cell Structure, A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford 2003. 8
Separace směsi anorganických kationtů a aniontů pomocí kapilární zónové elektroforézy s využitím nepřímé UV detekce Úkol: Pomocí kapilární zónové elektroforézy s nepřímou UV detekcí proveďte separaci anorganických kationtů a aniontů (Ca 2+, Mg 2+, Na +, SO 4 2-, Cl - ). 1. Teoretická část: Kapilární zónová elektroforéza Kapilární zónová elektroforéza (CZE) je nejjednodušším módem kapilární elektroforézy, který je založen na separaci iontů v prostředí základního elektrolytu, a to na základě jejich rozdílných elektroforetických mobilit. Hlavní výhodou CZE je vysoká separační účinnost, krátká doba analýzy a malá spotřeba vzorku, elektrolytů a rozpouštědel. CZE je možno použít na simultánní separaci anorganických i organických iontů. Z pohledu aplikovatelnosti metody může být CZE využita v různých odvětvích, kterými jsou například analýza potravin, environmentální, farmaceutická a klinická analýza. Obr. 5 Schéma instrumentace pro kapilární elektroforézu Detekce V kapilární elektroforéze je nejčastěji používán spektrofotometrický detektor, který je založen na principu absorpce UV nebo Vis záření. Tento detektor je tedy vhodný pouze pro 9
látky absorbující v této oblasti. V případě, že látka neabsorbuje v UV oblasti, je možné použít nepřímou UV detekci. Nevýhodou nepřímé UV detekce je horší citlivost (v porovnání s detekcí přímou). V případě nepřímé UV detekce je do základního elektrolytu přidán ion (mající stejné znaménko jako separované ionty tzv. koint), který absorpci poskytuje. Přítomnost neabsorbujícího iontu se poté v záznamu projeví jako negativní pík (dojde ke snížení absorpce). Analýza anorganických iontů pomocí CE Kapilární elektroforéza je metodou vhodnou pro stanovení vybraných iontů, kterými jsou Ca 2+, Mg 2+, Na +, SO 2-4 a Cl -. Pro simultánní stanovení anorganických kationtů a aniontů je nutné do základního elektrolytu přidat jak látku potřebnou pro separaci aniontů (vhodný absorbující anion), tak látku potřebnou pro separaci kationtů (vhodný absorbující kation). Na Obr. 6 je znázorněna analýza směsi obsahující šest anorganických iontů, která byla naměřena pomocí kapilární zónové elektroforézy s nepřímou UV detekcí. Podle migračního času můžeme usuzovat kvalitu, plocha píku udává množství látky ve vzorku. Obr. 6 Elektroforegram zobrazující separaci směsi anorganických iontů využití kapilární zónové elektroforézy s nepřímou UV detekcí 10
2. Praktická část 2.1. Přístroje a pomůcky Kapilární elektroforéza Agilent HP 3D CE s UV detektorem, vypalovač detekčního okna, ultrazvuk, ph metr se skleněnou kombinovanou elektrodou, analytické váhy, elektromagnetická míchačka, třepačka, elektromagnetické míchadlo, křemenná kapilára, řezátko na kapiláry, pravítko, odměrné baňky, kádinky, plastové nádobky, stříkačkové filtry (0,45 µm), injekční stříkačky, eppendorfky, špachtle. 2.2. Chemikálie Standardy iontů, α-hydroxyisomáselná kyselina, imidazol, 1,3,6-naftalentrisulfonová kyselina, 18-crown-6-ether, tetramethylammonium hydroxid, hydroxid sodný, deionizovaná voda, destilovaná voda, kalibrační roztoky pro kalibraci ph metru. 2.3. Pracovní postup Příprava separační kapiláry Pomocí řezátka se uřízne kapilára o potřebné délce (viz Tab. 5), pomocí vypalovače detekčních oken (popř. pomocí zapalovače či seškrábáním) se v místě detekce odstraní vrstva polyimidu (vzdálenost odpovídá efektivní délce kapiláry). Detekční okno se opatrně omyje methanolem a vysuší. Na kapiláru se umístí interface a vloží se do kazety (viz Obr. 7) a následně do přístroje. Před prvním měřením se kapilára důkladně promyje (podmínky viz Tab. 5). Obr. 7 Kazeta pro umístění separační kapiláry 11
Příprava základního elektrolytu Připraví se základní elektrolyt (100 ml) o následujícím složení 15 mm α-hydroxyisomáselná kyselina, 6 mm imidazol, 3 mm 1,3,6-naftalentrisulfonová kyselina a 4 mm 18-crown-6-ether v deionizované vodě. Pomocí tetramethylammonium hydroxidu se upraví ph na hodnotu 6,5. Vytvořený základní elektrolyt se přefiltruje přes stříkačkový filtr s velikostí pórů 0,45 µm. Příprava standardů Připraví se základní roztoky iontů (Ca 2+, Mg 2+, Na +, SO 2-4 a Cl - ) mající koncentraci 1 mg/ml (V = 1 ml). Ředěním základních roztoků se připraví směs iontů o koncentraci každého iontu 0,1 mg/ml. Pro přípravu základních roztoků a jejich ředění se použije deionizovaná voda. Připravená směs se použije pro analýzu pomocí CZE s nepřímou UV detekcí. CZE separace (nepřímá UV detekce) Připraví se sada viálek, obsahujících: 1 M NaOH deionizovanou vodu základní elektrolyt (3x) vzorek směs iontů 5x (z důvodu spikování vzorku) prázdná viálka sloužící jako odpad Podle pokynů vedoucího cvičení se provede nastavení přístroje a separačních podmínek (viz Tab. 5). Tab. 5 Separační podmínky pro analýzu anorganických iontů Separační napětí Polarita Vlnová délka Dávkování Základní elektrolyt 30 kv kladná 210 nm 50 mbar/5s 15 mm α-hydroxyisomáselná kyselina 6 mm imidazol 3 mm 1,3,6-naftalentrisulfonová kyselina 4 mm 18-crown-6-ether ph = 6,5 (adjustováno pomocí 12
tetramethylammonium hydroxidu) Efektivní délka kapiláry 40,0 cm Celková délka kapiláry 48,5 cm Vnitřní průměr kapiláry 50 µm Teplota 25 C Promývání kapiláry před 1. měřením Promývání kapiláry mezi jednotlivými měřeními 1 M NaOH (20 minut), deionizovaná voda (20 minut), základní elektrolyt (15 minut) 1 M NaOH (1 minutu), deionizovaná voda (1 minutu), základní elektrolyt (3 minuty) Nejprve se proměří slepý vzorek (deionizovaná voda). Následně se provede analýza směsi iontů (c = 100 µg/ml) analýzu je potřeba provádět minimálně 3 x. Identifikace jednotlivých píků v elektroforegramu se provede spikováním k analyzované směsi se postupně přidají studované kationty a anionty a provedou se analýzy spikovaných směsí. Získaná data se vyhodnotí a slovně okomentují. 3. Otázky 1. Vyjmenujte jednotlivé módy kapilární elektroforézy. 2. Z jakého důvodu byla pro stanovení anorganických iontů použita nepřímá UV detekce? 3. Je možné pomocí kapilární zónové elektroforézy provést analýzu neutrálních látek? Odpověď zdůvodněte. 4. Jaký jiný typ detektoru by mohl být použit pro detekci anorganických iontů ve spojení s kapilární elektroforézou? 5. Bylo by možné anorganické kationty a anionty stanovit pomocí kapilární izotachoforézy? Byla by popř. možná simultánní analýza kationtů a aniontů? 4. Literatura 1. Šťulík K.: Analytické separační metody. Karolinum, Praha 2004. 2. Baker D.R.: Capillary electrophoresis: Techniques in analytical chemistry, John Wiley and Sons Ltd, New York 1995. 3. He Z.: Capillary Electrophoresis: Fundamentals, Techniques and Applications, Nova Science Publishers, New York 2012. 13
4. Altria K.D., Capillary Electrophoresis Guidebook: Principles, Operation, and Applications. Humana Press Inc., New Jersey 1996. 5. Marina L.M., Ríos A., Valcárcel M.: Analysis and Detection by Capillary Electrophoresis, CAC Series, Elsevier, Amsterdam 2005. 6. Hopper K.G. a kol.: A novel method for analysis of explosives residue by simultaneous detection of anions and cations via capillary zone electrophoresis, Talanta 67 (2007) 304-312. 14
Separace směsi neutrálních látek pomocí micelární elektrokinetické chromatografie Úkol: Pomocí micelární elektrokinetické chromatografie ve spojení s UV detekcí proveďte separaci léčiv (nilutamid, flutamid). 1. Teoretická část: Micelární elektrokinetická chromatografie Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) je jedním z módů kapilární elektroforézy. MEKC je metodou kombinující separační mechanismus kapilární zónové elektroforézy (CZE) a chromatografie. Hlavními výhodami této metody jsou vysoká účinnost separace, rychlá analýza a malá spotřeba vzorku, elektrolytu a rozpouštědel. Jedná se o metodu, kterou je možno použít pro separaci nabitých i neutrálních látek (např. na rozdíl od CZE). Instrumentace potřebná k MEKC separaci je shodná s instrumentací používající se pro separaci pomocí CZE. Separační pufr obsahuje látku (např. tenzid) schopnou vytvářet micely (po překročení kritické micelární koncentrace). Dělení látek v MEKC probíhá tedy na základě jejich rozdílné distribuce mezi vodnou a micelární fází. Nejvíce používaným tenzidem v MEKC je aniontový tenzid dodecyl sulfát sodný (SDS). Mechanismus separace MEKC (pro neutrální látky) při použití aniontového tenzidu je zobrazen na Obr. 8. Obr. 8 Mechanismus separace MEKC při použití aniontového tenzidu 15
Detekce Nejčastěji využívaným detektorem ve spojení s CE je detektor spektrofotometrický. Tento detektor je založen na principu absorpce záření v oblasti vlnových délek od 190 do 800 nm. Jedná se o detektor, který umožňuje on-line detekci (v místě detekce je na separační kapiláře odstraněna vrstva polyimidu). Absorbance, která udává množství pohlceného světla měřenou látkou, je závislá na koncentraci měřené látky, tloušťce absorbující vrstvy a na hodnotě molárního absorpčního koeficientu, který je pro danou látku konstantou. Na Obr. 9 je znázorněna analýza směsi obsahující šest neutrálních látek, která byla naměřena pomocí MEKC s UV detekcí. Podle migračního času můžeme usuzovat kvalitu, plocha píku udává množství látky ve vzorku. Obr. 9 Elektroforegram zobrazující separaci směsi neutrálních látek využití micelární elektrokinetické chromatografie s UV detekcí Nilutamid, flutamid Nilutamid a flutamid jsou nesteroidní antiandrogeny, které se využívají na léčbu pokročilých stádií karcinomu prostaty. Chemické struktury těchto látek jsou zobrazeny na Obr. 10. Vzhledem k tomu, že se jedná o látky, které jsou v běžně používaných elektrolytech (ph 2 až 12) látkami nenabitými, není možné provést jejich separaci při použití kapilární zónové elektroforézy. Z tohoto důvodu bude k jejich separaci použita MEKC. 16
nilutamid flutamid Obr. 10 Chemické struktury nilutamidu a flutamidu 2. Praktická část 2.1. Přístroje a pomůcky Kapilární elektroforéza Agilent HP 3D CE s UV detektorem, vypalovač detekčního okna, ultrazvuk, ph metr se skleněnou kombinovanou elektrodou, analytické váhy, elektromagnetická míchačka, elektromagnetické míchadlo, křemenná kapilára, řezátko na kapiláry, pravítko, odměrné baňky, kádinky, plastové nádobky, stříkačkové filtry (0,45 µm), injekční stříkačky, eppendorfky, špachtle. 2.2. Chemikálie Kyselina boritá, hydroxid sodný, deionizovaná voda, destilovaná voda, dodecyl sulfát sodný, standardy léčiv (nilutamid, flutamid), methanol, kalibrační roztoky pro kalibraci ph metru. 2.3. Pracovní postup Příprava separační kapiláry Uřízne se kapilára (pomocí řezátka) o potřebné délce (viz Tab. 6) a pomocí vypalovače detekčních oken (popř. pomocí zapalovače či seškrábáním) se v místě detekce odstraní vrstva polyimidu (vzdálenost odpovídá efektivní délce kapiláry). Detekční okno se opatrně omyje methanolem a vysuší. Na kapiláru se umístí interface a vloží se do kazety (viz Obr. 7) a následně do přístroje. Před prvním měřením se kapilára důkladně promyje (podmínky viz Tab. 6). 17
Příprava základního elektrolytu Připraví se základní elektrolyt (100 ml) potřebné množství kyseliny borité (c = 50 mm) se naváží, kvantitativně převede do odměrné baňky a doplní deionizovanou vodou po rysku. Pomocí hydroxidu sodného se upraví ph na hodnotu 9,0. Do plastové nádobky se naváží potřebné množství SDS (c = 50 mm; V = 50 ml) a rozpustí se ve vytvořeném pufru. Základní elektrolyt se přefiltruje přes stříkačkový filtr s velikostí pórů 0,45 µm. Příprava standardů Připraví se roztok nilutamidu a flutamidu o koncentraci 1 mg/ml v methanolu (V = 1 ml). Ředěním se připraví směs standardů o koncentraci každého analytu 50 µg/ml (ředí se deionizovanou vodou) tato směs se použije pro analýzu pomocí MEKC-UV. MEKC-UV analýza Připraví se sada viálek, do kterých se napipetuje: 1 M NaOH, deionizovaná voda, základní elektrolyt (3x), vzorek směs nilutamidu a flutamidu (2x). Podle pokynů vedoucího cvičení se provede nastavení přístroje a separačních podmínek (viz Tab. 6). Tab. 6 Separační podmínky MEKC-UV analýzy Separační napětí 20 kv Polarita kladná Vlnová délka 200 nm Dávkování 50 mbar/5s Základní elektrolyt 50 mm borát sodný, ph = 9,0 50 mm SDS Efektivní délka kapiláry 40,0 cm Celková délka kapiláry 48,5 cm Vnitřní průměr kapiláry 50 µm Teplota 25 C Promývání kapiláry před 1. měřením Promývání kapiláry mezi jednotlivými měřeními 1 M NaOH (20 minut), deionizovaná voda (20 minut), základní elektrolyt (15 minut) 1 M NaOH (1 minutu), deionizovaná voda (1 minutu), základní elektrolyt (3 minuty) 18
V první řadě se proměří slepý vzorek (deionizovaná voda), následně se provede analýza směsi standardů (c = 50 µg/ml) analýzu je potřeba provádět minimálně 3 x. Identifikace jednotlivých píků se provede spikováním k analyzované směsi se přidá přídavek nilutamidu a následně flutamidu. Získaná data se vyhodnotí a slovně okomentují. 3. Otázky 1. Vysvětlete základní princip micelární elektrokinetické chromatografie. 2. Vysvětlete princip vzniku elektroosmotického toku. 3. Uveďte, jaké typy detektorů je možné použít ve spojení s kapilární elektroforézou. 4. Kterými dalšími metodami by mohla být provedena separace nilutamidu a flutamidu? 5. Bylo by možné pro separaci neutrálních látek použít MEKC s využitím kationtového či neiontového tenzidu? Odpověď zdůvodněte. 4. Literatura 1. Šťulík K.: Analytické separační metody, Karolinum, Praha 2004. 2. Baker D.R.: Capillary Electrophoresis: Techniques in Analytical Chemistry, John Wiley and Sons Ltd, New York 1995. 3. He Z.: Capillary Electrophoresis: Fundamentals, Techniques and Applications, Nova Science Publishers, New York 2012. 4. Phillips T.M., Kalish H.: Clinical Application of Capillary Electrophoresis, Methods and Protocols, Humana Press, New York 2013. 5. Altria K.D., Capillary Electrophoresis Guidebook: Principles, Operation, and Applications. Humana Press Inc., New Jersey 1996. 6. Znaleziona a kol.: MEKC Determination of Nilutamide in Human Serum Using Sweeping in High Salt Sample Matrix, Chromatografia 74 (2011) 151-155. 7. Marina L.M., Ríos A., Valcárcel M.: Analysis and Detection by Capillary Electrophoresis, CAC Series, Elsevier, Amsterdam 2005. 19