MASARYKOVA UNIVERZITA

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE ODDĚLENÍ GENETIKY A MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE MOLEKULÁRNĚ CÍLENÁ TERAPIE MALIGNÍHO MELANOMU BAKALÁŘSKÁ PRÁCE KATEŘINA GROWKOVÁ Vedoucí práce: Mgr. Stjepan Uldrijan, CSc. Brno 2013

Bibliografický záznam Autor: Kateřina Growková Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Molekulárně cílená terapie maligního melanomu Experimentální biologie Molekulární biologie a genetika Mgr. Stjepan Uldrijan, CSc. Akademický rok: 2012/2013 Počet stran: 42 Klíčová slova: Maligní melanom, cílená terapie, signální dráha kinázy ERK, signální dráha PI3K/AKT

Bibliographic entry Author: Kateřina Growková Masaryk University Faculty of Science Department of Experimental Biology Title of Thesis: Degree Program: Field of Study: Supervisor: Molecular targeted therapy of malignant melanoma Experimental Biology Molecular Biology and Genetics Mgr. Stjepan Uldrijan, CSc. Academic Year: 2012/2013 Number of Pages: 42 Keywords: Malignant melanoma, targeted therapy, EKR signaling pathway, PI3K/AKT signaling pathway

Abstrakt Maligní melanom je nádorové onemocnění, jehož incidence v posledních desetiletích celosvětově několikanásobně narostla. Přestože časná stádia onemocnění jsou většinou úspěšně léčena chirurgicky, pokročilá metastazující stádia jsou vůči současným terapeutickým postupům obvykle rezistentní. Tato práce shrnuje dosavadní poznatky o změnách nastávajících v průběhu vývoje maligního melanomu na molekulární úrovni, které by mohly sloužit jako možné cíle pro terapii. Abstract Malignant melanoma is a type of cancer the incidence of which has increased several times worldwide in the last decades. Although the early stages of the disease are successfully cured surgically, the advanced metastatic stages are often resistant to current therapy. This thesis summarizes the existing knowledge about the changes during the development of malignant melanoma at the molecular level which could serve as possible targets for therapy.

Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala svému školiteli Mgr. Stjepanu Uldrijanovi, CSc. za odborné rady a čas při zpracování bakalářské práce. Rovněž děkuji Amandine Verlande, M.Sc. za pomoc při řešení zadané problematiky.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. V Brně dne 13.5.2013 podpis

OBSAH 1. ÚVOD... 10 2. VÝVOJ MALIGNÍHO MELANOMU... 11 3. OBECNÉ ZNAKY RAKOVINNÝCH BUNĚK DLE HANAHANA A WEINBERGA. 13 4. MOLEKULÁRNÍ ZMĚNY PŘI VZNIKU A VÝVOJI MELANOMU... 18 4.1 Změny signální dráhy MAPK... 18 4.1.1 Protein RAS... 19 4.1.2 Protein RAF... 20 4.1.3 Receptorová tyrosin kináza c-kit... 20 4.2 Aktivace signální dráhy PI3K/AKT... 21 4.3 Aktivace mtor... 22 4.4 Transkripční faktor MITF... 23 4.5 Aktivace transkripčního faktoru NF-κB... 23 4.6 Zvýšená produkce antiapoptotických proteinů rodiny Bcl-2... 24 4.7 Ztráta lokusu CDKN2A... 26 5. TERAPIE MELANOMU... 28 5.1 Standardní terapie... 28 5.2 Experimentální cílená terapie... 29 5.2.1 Inhibitory BRAF... 29 5.2.1.1 Sorafenib... 30 5.2.1.2 Vemurafenib... 30 5.2.2 Inhibitory PI3K/AKT... 31 5.2.2.1 LY294002... 31 5.2.2.2 Rapamycin... 31 5.2.3 Inhibitory IKK (transkripční faktor NF-κB)... 31 5.2.3.1 Kurkumin... 32 5.2.3.2 Selektivní inhibitory NF-κB... 32 5.2.4 Bortezomib (PS-341)... 32 5.2.5 Využití nanotechnologie k transportu látek... 33 6. ZÁVĚR... 34 7. LITERATURA... 35

1. ÚVOD Definice NCI (National Cancer Institute) uvádí melanom jako formu rakoviny, která vzniká z melanocytů, tj. pigmentových buněk kůže nebo jiných tkání, jako je např. oko. Přesto, že podíl melanomu na všech typech nádorů kůže činí méně než 3 %, je zodpovědný až za 75 % všech úmrtí spojených s rakovinou kůže (American Cancer Society, 2008). Ústav zdravotnických informací a statistiky České republiky uvádí vzestup incidence melanomu v ČR mezi lety 1970-2009 u žen z 3,3 na 18,2 na sto tisíc obyvatel a u mužů z 3,2 na 21,7 na sto tisíc obyvatel. Celosvětově se uvádí u žen nárůst z 4,2 na 11,0 na sto tisíc obyvatel a u mužů z 4,3 na 13,7 na sto tisíc obyvatel. Mezi rizikové faktory pro vznik melanomu patří vystavování se slunečnímu záření, množství melaninu v kůži a různé dědičné faktory. Raná stádia melanomu jsou léčena především chirurgicky. Hlavní příčinou vysoké mortality onemocnění je však pozdní diagnóza, s ní související vznik vzdálených metastáz a silná chemorezistence těchto pokročilých metastazujících stádií choroby. Navzdory hlubšímu porozumění molekulární podstaty melanomu stále neexistuje efektivní léčba. Tato bakalářská práce shrnuje současné znalosti o nejčastějších změnách na molekulární úrovni probíhajících v nádorových buňkách obecně a speciálně u maligního melanomu a poznatky o mechanismech, kterými tyto změny působí na růst a přežití nádorových buněk. Druhá část práce popisuje terapii, a to jak standardní, k níž se řadí chirurgická léčba, chemoterapie, imunoterapie a radioterapie, tak experimentálně cílenou, která se zaměřuje na inhibici signálních drah, které jsou v melanomu deregulovány mutacemi a jejichž aktivita je nezbytná pro růst melanomu. 10

2. VÝVOJ MALIGNÍHO MELANOMU Maligní melanom vzniká z melanocytů, buněk, které pocházejí z neurální lišty. Během embryonálního vývoje migrují jejich prekurzory, melanoblasty, do epidemis a vlasových folikulů, kde diferencují do vyzrálých dendritických již nemigrujících melanocytů (Bennett, 1993). Důležitou funkcí melanocytů je tvorba pigmentu melaninu jako odpověď na UV záření. Melanin je syntetizován v melanosomech, které migrují cytoplazmou k dendritickým výběžkům buňky, následně jsou pomocí exocytózy vyloučeny z buňky a fagocytovány okolními keratinocyty, což se navenek projevuje jako opálení kůže (Dahl a Guldberg, 2007). Rozdíl v barvě kůže je způsoben odlišnou funkcí melanocytů nikoliv jejich počtem, který je přibližně stejný u světlých i tmavých lidských ras a neliší se ani podle pohlaví (Miller a Mihm, 2006). Postupnou transformaci melanocytů v melanom doprovázejí histologické změny popsané Clarkovým modelem, který zahrnuje 5 stádií (Clark et al., 1984): 1) Benigní névus charakterizován zvyšujícím se počtem strukturně normálních melanocytů, tvořících shluky kolem bazální membrány. 2) Dysplastický névus buňky névu jsou atypické a mají náhodné a nesouvislé okraje. Může vzniknout buď z benigního névu nebo jako nová léze. 3) Fáze radiálního růstu buňky získávají schopnost proliferace intraepidermálně. Samostatné buňky nebo malé shluky mohou proniknout do papilární dermis. 4) Fáze vertikálního růstu schopnost buněk proniknout přes bazální membránu do dermis a podkožní tkáně. Buňky se mohou šířit do retikulární dermis či podkožního tuku. 5) Metastatický melanom šíření melanomových buněk do další částí kůže a zasažení jiných orgánů, kde jsou schopny proliferace a tvorby metastatických ohnisek. Rozhodujícím bodem ve vývoji onemocnění je přechod z fáze radiálního růstu do fáze vertikálního růstu, kdy dochází ke ztrátě kontroly keratinocytů nad dělením. Vývoj maligního melanomu však nemusí projít všemi stádii tohoto modelu. Například fázím radiálního a vertikálního růstu nemusí předcházet vývoj benigního či dysplastického névu (Miller a Mihm, 2006). Miller a Mihm se ve své práci z roku 2006 podrobně věnují vztahu histologických změn a mutací v genech ovlivňujících vznik maligního melanomu (Obr.1). Ve fázi benigního névu dochází k mutaci proteinu BRAF, která však samotná nestačí k transformaci pigmentových buněk v melanom. Během rozvoje dysplastického névu nastávají na 11

molekulární úrovni další změny ovlivňující buněčný růst, opravy DNA a náchylnost k buněčné smrti. Dochází k inaktivaci genu CDKN2A (Thompson et al., 2005), který kóduje dva nádorové supresory p16 INK4A a p14 ARF a ke ztrátě exprese nádorového supresoru PTEN (Li et al., 1997). Během fáze radiálního růstu je zvýšená aktivita kinázy AKT (Stahl et al., 2004). V průběhu progrese do fáze vertikálního růstu a především pak při růstu metastáz nastává ztráta exprese E-kadherinu, který zabezpečuje adhezi melanocytů a keratynocytů a zvýšení tvorby N-kadrehinu, který napomáhá adhezi mezenchymových buněk v dermis (Hsu et al., 1996). Ztráta CDKN2A Ztráta PTEN Ztráta E-kadherinu Tvorba N-kadherinu Mutace BRAF Aktivace AKT Melanocyt Benigní Dysplastický Fáze radiálního Fáze vertikálního névus névus růstu růstu Obrázek č.1: Vztah jednotlivých stádií Clarkova modelu a molekulárních změn v maligním melanomu (převzato a upraveno Takata et al., 2010). 12

3. OBECNÉ ZNAKY RAKOVINNÝCH BUNĚK DLE HANAHANA A WEINBERGA Přestože v různých typech tkání probíhá nádorová transformace s jistými odlišnostmi a s různou frekvencí jsou aktivovány a potlačovány různé signální dráhy, základní znaky rakovinných buněk jsou vždy stejné, což platí i pro melanom. Douglas Hanahan a Robert A. Weinberg vydali roku 2000 článek shrnující šest hlavních znaků charakterizujících nádorové buňky. V roce 2011 tuto práci aktualizovali a rozšířili (Obr.2). Mezi tyto znaky, jimiž se nádorové buňky liší od buněk nenádorových, patří: Nezávislost na vnějších růstových signálech Necitlivost k inhibičním signálům z vnějšího prostředí Změna v energetickém metabolismu buněk Odolnost vůči atakům imunitního systému Rezistence k programované buněčné smrti Neomezený replikační potenciál Nestabilita genomu a mutace Navození angiogeneze Zánětlivé reakce podporující růst nádoru Schopnost tvorby metastáz Obrázek č.2: Vlastnosti charakterizující nádorovou buňku (převzato a upraveno Hanahan a Weinberg, 2011). Nezávislost na vnějších růstových signálech. Růstové faktory se váží na povrchové receptory a prostřednictví intracelulárních signálních drah je informace přenesena do jádra buňky a ovlivňuje expresi genů důležitých pro regulaci buněčného cyklu. U normálních tkání jsou signální dráhy ovlivňující průchod buněčným cyklem přísně regulovány. U nádorových buněk naproti tomu dochází k jejich deregulaci. Existuje 13

několik způsobů, kterými buňka získává schopnost podporovat proliferaci nezávisle na signálech z vnějšího okolí. Buňky mohou samy začít produkovat růstové faktory, na které prostřednictvím receptorů odpovídají. Jedná se tedy o tzv. autokrinní stimulaci. Nebo těmito mitogenními faktory ovlivňují okolní buňky, čímž působí parakrinní stimulaci. Signalizace může být dále deregulovaná zvýšenou expresí povrchových receptorů nebo jejich strukturní změnou, čímž dochází k odpovědi i na malé množství růstového faktoru, za normálních okolností nedostačující k vyvolání odpovědi. Nedojde-li k aktivaci signálních drah regulujících proliferaci na úrovni receptoru, mohou být tyto dráhy aktivovány prostřednictvím mutací proteinů, které zajišťují přenos signálu do jádra buňky. U nádorových buněk byla popsána celá řada somatických mutací, které způsobují konstitutivní aktivaci signálních drah ovlivňující proliferaci buněk. Konkrétněji jsou tyto mutace zmíněny v následujících kapitolách. Necitlivost k inhibičním signálům z vnějšího prostředí. Antiproliferační signály, které zajišťují vnitřní rovnováhu a udržují buňky v G 0 fázi buněčného cyklu, působí prostřednictvím receptorů v buněčné membráně, které jsou napojeny na specifické intracelulární signální dráhy. U nádorových buněk dochází k mutaci v receptoru pro TGFβ, což činí buňku necitlivou k antiproliferačním účinkům tohoto proteinu. Tuto schopnost však může buňka získat například také ztrátou exprese nádorového supresoru Rb (retinoblastoma-associated protein). Rezistence k programované buněčné smrti. Apoptóza je klíčový mechanismus, který zabraňuje hromadění poškozených buněk v organismu. Tento mechanismus je bariérou, kterou musí buňka překonat, aby mutace umožňující nádorovou transformaci mohly být uchovány. Program buněčné smrti může být spuštěn buď prostřednictvím extracelulárních receptorů, nebo aktivací intracelulární proapoptických drah, které vedou k aktivaci kaspáz, což jsou proteázy nezbytné pro průběh apoptózy. Celá tato kaskádovitá reakce je regulována pro- a antiapoptickými proteiny. Nádorové buňky vyvinuly různé mechanismy, jak se vyhnou apoptóze. Mezi nejběžnější patří ztráta funkce nádorového supresoru p53 a zvýšená exprese antiapoptických proteinů rodiny Bcl-2. Neomezený replikační potenciál. Normální buňky jsou schopny projít jen omezeným počtem buněčných cyklů. Při každém cyklu replikace DNA totiž dojde ke zkracování 14

konců chromozomů, které DNA polymeráza nedokáže účinně doreplikovat a chromozomy postupně ztrácí své telomery. Funkcí telomer je ochrana konců chromozomů, před jejich spojováním mechanismy, které zajišťují opravy poškozené DNA. Jakmile dojde k jejich zkrácení na kritickou úroveň, chromozomy začnou fúzovat, dojde k nenávratným změnám karyotypu a buňky vstupují do apoptózy nebo podléhají senescenci, tedy permanentnímu opuštění buněčného cyklu. Senescence nastává zejména při intracelulární akumulaci růstových supresorů p16 a p21. Avšak nádorové buňky jsou vůči senescenci i apoptóze odolné. Zaručuje jim to zejména aktivita telomerázy, speciální DNA polymerázy, která na konce chromozomů přidává telomerické sekvence DNA. Navození angiogeneze. Nádor, stejně jako jakákoliv jiná tkáň, si potřebuje zajistit přívod živin a odvod metabolitů, k čemuž slouží cévní systém. Angiogeneze, novotvorba krevních kapilár, je proces probíhající pouze v embryonálním období, při poranění nebo při menstruačním cyklu. Avšak během růstu nádoru dochází k reaktivaci angiogeneze (Hanahan a Folkman, 1996). Angiogeneze je regulována zejména pomocí stimulátoru VEGF-A (vascular endothelial growth factor-a) a inhibitoru TSP-1 (trombospondin-1). Exprese genu VEGF může být zvýšená buď hypoxií, tedy nedostatkem kyslíku v tkáni, nebo aktivací onkogenů (Ferrara, 2010). Dříve se předpokládalo, že obnovení angiogeneze souvisí především s makroskopickými nádory. Novější data (Raica et al., 2009) však ukazují, že angiogeneze přispívá také tvorbě mikroskopických lézí. Schopnost tvorby metastáz. Jedná se o vícestupňový proces invaze a tvorby metastáz, který je charakterizován řadou biologických změn. Prvním krokem je lokální invaze, následuje průnik nádorových buněk do přilehlých krevních a lymfatických cév, transport nádorových buněk cévami, únik buněk z cév do vzdálených tkání, tvorba mikrometastáz, finální adaptace buněk na cizí mikroprostředí a růst mikrometastatických lézí v makroskopický nádor (Fidler, 2003). Tvorba metastáz nezávisí pouze na změnách nádorových buněk, výraznou roli hraje také mikroprostředí okolních tkání (Hugo et al., 2007). Primární nádory navíc mohou uvolňovat supresorové faktory, které udržují mikrometastázy v latentním stavu i po desetiletí. Následně i přes chirurgické odstranění primárního tumoru, může po určité době dojít ke tvorbě sekundárních nádorů (Barkan et al., 2010). Nádory mohou tvořit 15

metastázy nejen vycestováním nádorových buněk primárních nádorů, ale i návratem již vycestovaných buněk zpět na místo primárního nádoru (Kim et al., 2009). Změna v energetickém metabolismu buněk. Normální buňky za aerobních podmínek zpracovávají glukózu procesem glykolýzy, kdy ji v cytoplazmě odbourávají na pyruvát. Ten je následně oxidativní fosforylací v mitochondriích štěpen na oxid uhličitý. Za anaerobních podmínek dochází k aktivaci anaerobní glykolýzy, kdy pouze velmi malé množství pyruvátu je dále zpracováno v mitochondriích a k osmnáctkrát menší tvorbě ATP. Avšak nádorové buňky mají přeprogramovaný metabolismus glukózy a dokonce i v aerobních podmínkách upřednostňují glykolýzu. Tomuto jevu se říká Warburgův efekt (Warburg, 1930). Přesto, že se nádorové buňky musí vyrovnat s několikanásobně menším ziskem energie, zvýšená glykolýza umožňuje využití glykolytických meziproduktů v rozmanitých biosyntetických drahách. Warburgův efekt tedy přispívá k syntéze různých biologických makromolekul a organel, což podporuje růst buněk a buněčné dělení (Vander Heiden et al., 2009). Zvýšený příjem glukózy pro glykolýzu zajišťuje nadprodukci glukózových přenašečů GLUT1, které zvyšují import glukózy do cytoplazmy. S touto změnou nádorového metabolismu souvisí aktivace onkogenů, např. Ras a Myc, a mutace nádorových supresorů, např. p53 (Jones a Thompson, 2009). Odolnost vůči atakům imunitního systému. Buňky imunitního systému hrají důležitou roli v potlačení rozvoje a růstu nádoru. Avšak nádorové buňky jsou, zatím nepříliš objasněným způsobem, schopny vyhnout se odhalení a destrukci imunitním systémem. Jeden z možných mechanismů je popsán ve studii Yang et al. z roku 2010, která ukazuje schopnost nádorových buněk ochromit produkcí TGF-β cytotoxické T- lymfocyty a NK buňky. Překonání ochranných barier a získání těchto charakteristických znaků je nádorové buňce umožněno díky dvěma vlastnostem. První je rozvoj nestability genomu a akumulace mutací v nádorové buňce. Buňka se stává více senzitivní k mutagenům a dochází k mutacím v genech, které ovlivňují opravu DNA (Negrini et al., 2010). Tyto geny, tzv. caretakers of genome (Kinzler a Vogelstein, 1997) zajišťují detekci poškozené DNA, aktivaci opravných mechanismů 16

a inaktivaci nebo zachycení mutagenů ještě před poškozením DNA (Hanahan a Weinberg, 2011). Druhá vlastnost umožňující překonání barier je spojena s přítomností zánětlivé reakce v maligních stádiích vývoje nádoru. Již delší dobu jsou buňky imunitního systému pozorovány v oblastech nádorů (Dvořák, 1986). Dříve byl zánět považován za imunitní odpověď těla na nádor, které se tak pokoušelo nádor odstranit. Dnes máme důkazy, že zánět přispívá k rozvoji nádoru dodáváním bioaktivních molekul do mikroprostředí nádoru. Zahrnuje faktory, které podporují proliferaci, faktory omezující buněčnou smrt, enzymy umožňující angiogenezi a tvorbu metastáz (DeNardo et al., 2010; Grivennikov et al., 2010; Qian a Pollard, 2010; Karnoub a Weinberg, 2006-2007). Všechny nádory, včetně maligního melanomu, během svého vývoje získají všechny tyto vlastnosti, avšak v různém pořadí a různými mechanismy. U různých druhů rakovinných buněk tak obvykle dochází k odlišným mutacím v odlišných buněčných signálních drahách. K získání dané vlastnosti je někdy zapotřebí nahromadění několika mutací, jindy jediná mutace vede k získání hned několika vlastností současně. 17

4. MOLEKULÁRNÍ ZMĚNY PŘI VZNIKU A VÝVOJI MELANOMU Pro nalezení vhodné terapie tohoto nádorového onemocnění je důležité charakterizovat změny, ke kterým dochází v buňkách melanomu a určit mechanismy, které tyto změny umožňují. Mutace probíhající při nádorové transformaci ve velké míře ovlivňují regulaci buněčného cyklu. Správný průchod jednotlivými fázemi buněčného cyklu je přísně regulován specifickými signály a je kontrolován v tzv. kontrolních bodech. Kontrolní body umožňují zástavu cyklu, pokud nejsou splněny všechny podmínky pro jeho bezpečné pokračování, což může být například ukončení replikace a opravy poškozené DNA. Důležitými regulátory cyklu jsou cykliny a cyklin dependentní kinázy (CDK). Fosforylační aktivita CDK, která závisí na přítomnosti cyklinů, dále reguluje aktivitu proteinů podílejících se na průchodu daným kontrolním bodem. U nádorových buněk dochází k deregulaci těchto kontrolních mechanismů v důsledku mutací v genech kódující cykliny nebo CDK, nebo v genech kódujících proteiny, které odpovídají na komplexy cyklin/cdk nebo regulují množství komplexů cyklin/cdk. Existují dvě základní skupiny genů, které jsou u nádorových buněk nejčastěji mutovány. První jsou tzv. proto-onkogeny, které kódují proteiny, jenž se účastní přenosu různých signálů v buňce, a regulují buněčný cyklus. Při nádorové transformaci se přísně regulované proto-onkogeny mění na onkogeny a aktivně podporují buněčný cyklus. Příkladem jsou Myc, Ras, Src či HER2. Druhou skupinou jsou nádorové supresorové geny, které zabraňují množení poškozených buněk nebo se podílí na opravách poškozené DNA, čímž zabraňují akumulaci mutací v buňkách. V mutantním stavu při vzniku rakoviny však tyto geny selhávají ve své funkci. Mezi proteiny kódované nádorovými supresory patří například p53, p16 a Rb. 4.1 Změny signální dráhy MAPK Informace o přítomnosti růstových faktorů jsou signální kaskádou přenášeny ze specifických receptorů na cytoplazmatické membráně do jádra buňky, kde ovlivňují expresi proteinů, které řídí buněčný cyklus. Přenos signálu z povrchu buňky do jádra může být zprostředkován signální drahou MAPK (mitogen-activated protein kinase), která je ve všech typech zhoubných nádorů častým cílem mutací. Prvním aktivovaným enzymem této dráhy je receptorová tyrosin kináza (RTK). Navázání signální molekuly na receptor způsobí spojení 18

dvou receptorových molekul v membráně, které tak utvoří dimer. Tento kontakt stimuluje kinázovou aktivitu receptorů a dojde k jejich vzájemné fosforylaci. Prostřednictvím adaptorových proteinů vede aktivace RTK k aktivaci signálního proteinu RAS, který se nachází na vnitřní straně cytoplazmatické membrány. Protein RAS prochází dvěma konformačními stavy, aktivním s navázaným GTP a neaktivním s GDP. Protein RAS v aktivním stavu aktivuje kinázu RAF, prostřednictvím které dojde k aktivaci signální dráhy, přičemž poslední proteinkináza kaskády fosforyluje transkripční faktory jež spouští expresi určitých genů. Dochází tedy k přenosu signálu z povrchu buňky do jádra. Mutací genu pro protein RAS dochází k jeho hyperaktivaci s důsledkem nekontrolovaného dělení, což přispívá ke vzniku malignit (Alberts et al., 2004). MAPK je serin-treoninová kináza regulující intracelulární signální dráhy ovlivňující klíčové buněčné mechanismy jako jsou dělení, diferenciace, smrt a transformace buněk. Každá signální dráha MAPK obsahuje nejméně tří složky. MAP3K (kináza-kinázy- MAPkinázy), konkrétně RAF (rapidly accelerated fibrosarcoma), ASK1 (apoptosis signalregulating kinase 1) nebo MLK3 (mixed-lineage kinase), která fosforylací aktivuje MAP2K (kinázu MAPkinázy), například MEK, MKK3/6, MKK4/7, která dále fosforyluje cílovou MAPK. Takto aktivovaná MAPK fosforyluje různé další proteiny zahrující například transkripční faktory a tím vyvolává specifickou buněčnou odpověď (Kim a Choi, 2009). Do rodiny cílových MAPK patří ERK (extracellular signal-regulated kinase), JNK (c-jun NH 2 - terminal kinese) neboli SAPK (angl. stress-activated protein kinese) a p38. Jedna z nejčastěji deregulovaných signálních dráh MAPK v buňkách maligního melanomu je dráha kinázy ERK (Obr.3). U normálních buněk je signální kaskáda aktivována vazbou mitogenu, neboli růstového faktoru, hormonu či neurotransmiteru na receptor tyrosin kinázy (RTK). Aktivací RTK se poté spouští celá signální dráha. 4.1.1 Protein RAS Jednou z mutací signální dráhy kinázy ERK ovlivňující vznik melanomu je mutace proteinů rodiny RAS. Do této rodiny patří tři odlišné typy proteinu: NRAS (Neuroblastoma RAS), KRAS (Kirsten RAS) a HRAS (Harvey RAS). Jedná se o rodinu malých proteinů s vazebným místem pro guanosintrifosfát (GTP), které je aktivována extracelulárními faktory, Při mutaci proteinu RAS dojde k narušení jeho GTPázové aktivity, a protein získá konstitutivní aktivitu, je tedy schopen vyvolat odpověď i bez přítomnosti ligandu (Inamdar et al., 2010). Důsledkem je tak neustálá aktivace proteinu RAS a jim ovlivňovaných drah. 19

Zvýšená exprese proteinu RAS potlačuje funkci nádorových supresorů p53, p16 INK4A a p14 ARF. U melanomu se nejčastější objevuje mutace proteinu NRAS. Brose et al. uvádí výskyt kolem 15-20 % všech melanomů. Z 90 % se jedná o substituci glutaminu na kodonu 61 za leucin (Davies et al., 2002). Mutace KRAS a HRAS se v melanomu, na rozdíl od jiných typů malignit, objevují jen zřídka. 4.1.2 Protein RAF Proteiny RAF jsou serin/treoninové kinázy. Jedná se o tři příbuzné proteiny ARAF, BRAF a CRAF, které jsou po aktivaci proteinem RAS, navázány na plazmatickou membránu a fosforylují ostatní složky dráhy kinázy ERK. U melanomu se nejčastěji setkáváme s mutacemi v proteinu BRAF, a to asi v 70 % všech případů (Davies et al., 2002). Přesto, že bylo identifikováno více než 65 odlišných bodových mutací ve více než 30 kodonech proteinu BRAF, asi v 90 % se v nádorech vyskytuje jednonukleotidová záměna thyminu za adenin v pozici 1799, tedy substituce valinu za glutamovou kyselinu v kodonu 600 (V600E). (Catalogue of somatic mutation in cancer, 2013; Davies et al., 2002). Druhá nejčastější mutace proteinu BRAF je způsobena záměnou v pozici 1798/99 z GT na AA, tedy V600K a vyskytuje se u starších pacientů nebo u pacientů s DNA poškozenou chronickou expozicí slunečnímu záření (Menzies et al., 2012). Třetí nejčastější mutace BRAF V600R je rozšířenější u mužů a dochází u ní k záměně GT za AG ve stejném místě (Catalogue of somatic mutation in cancer, 2013; Lovly et al., 2012). Mutace BRAF způsobují silnou aktivaci kinázy ERK, což vede k proliferaci melanocytů a klonální expanzi a objevují se jak v primárních nádorech, tak v metastazujícím melanomu a dokonce i v benigním névu. Což naznačuje, že sama o sobě není tato mutace dostačující k úplné transformaci normálních melanocytů v melanom (Pollock et al., 2003). 4.1.3 Receptorová tyrosin kináza c-kit U melanomových buněk dochází k mutacím také v receptorových tyrosin kinázách, a to zejména v proteinu KIT. Mutace aktivující c-kit je nejčastější u lézí v oblastech těla, které jsou málo vystaveny UV záření, jako jsou akrální (dlaně, chodidla) a mukózní (střevo, reprodukční orgány) melanom (Curtin et al., 2006). U těchto typů melanomu byly mimo jiné objeveny změny v počtu kopií DNA v oblasti 4q12 (Curtin et al., 2005), kde se vyskytuje právě gen pro c-kit. 20

Obrázek č.3: Přenos signálu z povrchu buňky do jádra prostřednictvím signálních drah kináz ERK a PI3K. Na receptorovou tyrosin kinázu (RTK) se naváže růstový faktor, dojde k aktivaci proteinu RAS a dalších efektorových kináz. Cílová MAPkináza ERK ovlivňuje transkripci genů, které způsobují maligní transformaci buňky (převzato a upraveno Inamdar et al., 2010). 4.2 Aktivace signální dráhy PI3K/AKT Aktivace receptorových tyrosin kináz se podílí nejen na spuštění dráhy kinázy ERK, ale aktivuje také dráhu PI3K/AKT (Obr.4). PI3K (fosfatidylinositol-3-kináza) přeměňuje membránový lipid PIP 2 (fosfatidylinositol-4,5-bisfosfát) na intracelulárního druhého posla PIP3 (fosfatidylinositol-3,4,5-trifosfát). Toto vede aktivaci serin/treoninové kinázy AKT, která reguluje řadu faktorů ovlivňujících buněčnou proliferaci a přežívání. Existují tři izoformy AKT kinázy: AKT1, 2 a 3. Přestože v jiných typech rakoviny hrají důležitou roli AKT1 a 2, u melanomu je za dominantní považována AKT3 (Stahl et al., 2004) Důležitou roli v této signální dráze hraje nádorový supresor PTEN (phosphatase and tensin homologue), který inhibuje PI3K/AKT dráhu. Somatická mutace genu kódujícího tento protein, který se nachází v oblasti 10q23 (Li et al., 1997), se u melanomu vyskytuje s četností 10-30 % (Davies a Samuels, 2010) a vede k nadměrné aktivaci PI3K/AKT signální dráhy. Hladina PIP 3 je regulována buď pomocí aktivity protein kinázy PI3K nebo pomocí nádorového supresoru PTEN, který defosforyluje inositolový kruh v pozici 3 (Meahama a 21

Dixon, 1998). Velmi často dochází ke kombinaci mutace proteinu BRAF a ztrátě funkce nádorového supresoru PTEN, a tím k silné aktivaci dráhy PI3K/AKT (Dankort et al., 2009). 4.3 Aktivace mtor S dráhami kinázy ERK a PI3K/AKT úzce souvisí aktivita kinázy mtor (mammalian target of rapamycin), která řídí buněčnou proliferaci a růst. Protein RAS a PI3K stimulují mtor a tím podporují růst nádorových buněk. Existují dva odlišné komplexy mtor, první obsahuje protein raptor (mtorc1), druhý zase protein rictor (mtorc2). Zatímco mtorc1 je silně inhibován rapamycinem, mtorc2 na rapamycin nereaguje (Sarbassov et al., 2004). Obrázek č.4: Přenos signálu z povrchu buňky do jádra prostřednictvím signální dráhy PI3K/AKT. Receptorová tyrosin kináza po vazbě růstového faktoru aktivuje prostřednictvím proteinu RAS kinázu PI3K, která fosforyluje PIP2 na PIP3, což aktivuje kinázu AKT. Nádorový supresor PTEN je inhibitorem této reakce (převzato a upraveno Krycer, et al. 2010). 22

4.4 Transkripční faktor MITF Výše zmíněné signální dráhy ovlivňují funkci transkripčních faktorů, jako je například MITF (microphthalmia-associated transcription factor) se strukturou helix-smyčka-helix a leucinový zip. Řídí vývoj a diferenciaci melanocytů a podílí se také na regulaci jejich buněčného cyklu. Velmi vysoká exprese proteinů MITF podporuje diferenciaci buněk, naopak při velmi nízké hladině dochází k apoptóze. Melanomové buňky sice vykazují nižší hladinu proteinů MITF než zdravé melanocyty, přesto i v nich musí být udržováno optimální množství proteinů MITF, aby byla umožňována jejich proliferace (Wellbrock a Marais, 2005). Wellbrock et al. roku 2008 dokázali, že optimální hladina exprese transkripčního faktoru MITF v melanomu je regulována mutantním proteinem BRAF. BRAF nejprve prostřednictvím kinázy ERK fosforyluje protein MITF, který je následně degradován a jeho hladina v buňce klesá. Současně prostřednictvím transkripčního faktoru BRN2 expresi proteinu MITF stimuluje. Díky této dvojité regulaci mutantním proteinem BRAF je ustálená optimální hladina pro proliferaci buněk. 4.5 Aktivace transkripčního faktoru NF-κB Dalším důležitým transkripčním faktorem je NF-κB, tedy komplex proteinů, které společně regulují geny zahrnuté ve velkém množství důležitých signálních drah. Tento proteinový komplex obsahuje vazebné místo pro DNA a současně pro vazbu specifického inhibitoru IκB. Ten je na NF-κB navázán, pokud je NF-κB neaktivní. IκB je regulován komplexem inhibitorů (IKK), který se skládá z IKKα, IKKβ, IKKγ neboli NEMO a ELKS. Dojde-li k aktivaci inhibičního komplexu IKK prostřednictvím různých podnětů (TNF, zánětlivé cytokiny, virová nebo bakteriální infekce, oxidativní činitelé, UV záření nebo osmotický šok), nastává fosforylace a následná degradace proteinu IκB pomocí mechanismu proteozomální degradace (Ghost and Karin, 2002). Volný, neinhibovaný NF-κB tak může prostoupit do jádra a působit zde jako transkripční faktor genů řídících imunitní a zánětlivou odpověď, buněčný růst a apoptózu (Karin and Ben-Neriah, 2000). Konstitutivní aktivace tohoto transkripčního faktoru vyvolává protizánětlivou odpověď. Dále působí jako důležitý anti-apoptický faktor tím, že podporuje transkripci anti-apoptických proteinů a potlačuje aktivitu apoptotických kaspáz. V neposlední řadě podporuje buněčný růst zvýšenou tvorbou cyklinu D1 (Madona et al., 2012). U melanomu byla prokázána zvýšená exprese v jádře u dysplastického névu a melanomových buněk v porovnání se zdravými melanocyty (McNulty et al., 2004). Studie 23

Liu et al., 2002 ukazuje, že mutace proteinu BRAF v buňkách melanomu má za následek zvýšenou degradaci IKK, tedy zvýšenou aktivitu NF-κB v jádře. 4.6 Zvýšená produkce antiapoptotických proteinů rodiny Bcl-2 Apoptóza je jednou z forem programované buněčné smrti a rezistence k apoptóze přispívá k rozvoji nádorů a současně zvyšuje rezistenci nádorových buněk ke konvenční chemoterapii a radioterapii. Klíčové faktory řídící apoptózu jsou enzymy kaspázy (z angl. caspase: cysteinyl aspartate-specific protease), které můžeme rozdělit na iniciátorové a efektorové. Existují dvě hlavní signální dráhy spouštějící apoptózu, tzv. vnitřní (mitochondriální) a vnější apoptotická dráha (Obr.5). Vnitřní apoptotická dráha je aktivována řadou stresových faktorů, např. radiací, cytotoxickými léčivy nebo odstraněním růstových faktorů. To vede k permeabilizaci membrány mitochondrií a uvolnění cytochromu c a proteinu Smac/DIABLO z membránového prostoru do cytoplazmy. Cytochrom c spolu s Apaf1 (apoptosis preteaseactivated factor 1) a inaktivní iniciátorovou prokaspázou 9 tvoří multiproteinový komplex apoptosom. Zde dochází k aktivaci kaspázy 9 a následnou kaskádou se aktivují jednotlivé kaspázy 3, 6, 7 a dochází k charakteristickým morfologickým a biochemickým změnám, které jsou spojeny s apoptózou. Vnější apoptotická dráha je aktivována nezávisle na mitochondriích vazbou ligandů, jako jsou Fas a TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-including ligand) na specifické receptory buněčného povrchu (tzv. receptory smrti). Aktivace receptorů pak vede k přímému spuštění kaskády reakcí přes iniciátorou kaspázu 8. Aktivace vnější signální dráhy může následně spustit i vnitřní dráhu apoptózy (Kang a Reynolds, 2009). Doposud bylo identifikováno 25 členů proteinové rodiny Bcl-2 (B-cell lymphoma-2). Jedná se o pro- a anti-apoptické proteiny, které se nachází v mitochondriích, hladkém endoplazmatickém retikulu a perinukleárním prostoru. Pro proteiny této rodiny je charakteristická přítomnost krátkých sekvenčních motivů, tzv. Bcl-2 homologních (BH) domén a jsou rozděleny do tří podskupin podle strukturních a funkčních charakteristik. Do anti-apoptotické podskupiny patří proteiny Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1, Bfl1/A-1 a Bcl-B, které obsahují čtyři homologní domény. Jednu až tři homologní domény obsahuje podskupina pro-apoptických proteinů multidomain proteins, do které patří Bax, Bak a Bok. Poslední podskupina BH3-only zahrnuje Bim, Bad, Bid, Noxa a Puma pro-apoptotické proteiny a jak sám název napovídá má pouze BH3 doménu (Packham a Stevenson, 2005). 24

Proapoptotické proteiny rodiny Bcl-2 zvyšují propustnost mitochondriální membrány a tím umožňují navození apoptózy. Pro mechanismus jejich působení existují dvě odlišné teorie, tzv. přímá a nepřímá aktivace. Pro-apoptické proteiny Bad, Bik a Noxa, patřící do podskupiny BH3-only, inhibují anti-apoptotické proteiny Bcl-2 a uvolňují je z vazby na proapoptotické proteiny Bax a Bak. Pak dochází k oligomerizaci proteinů Bax/Bak, cytochrom c je uvolněn do cytoplazmy a následuje aktivace kaskády vedoucí k apoptóze. Tento mechanismus je společný pro obě teorie. Odlišnost těchto dvou teorií zpočívá v tom, že při přímé aktivaci se pro-apoptotických proteinů podskupiny BH3-only, Bim a Bid váží přímo na Bax/Bak a dochází k jejich oligomerizaci (Letai et al., 2002), naopak nepřímá teorie přímou aktivaci apoptózy vazbou proteinů BH3-only na proteiny Bax/Bak zpochybňuje (Willis et al., 2007). U melanomu dochází ke zvýšení exprese těchto antiapoptických proteinů rodiny Bcl- 2. Snižuje se tak odpověď na apoptotické signály, díky čemuž se melanom může stát rezistentní vůči chemoterapii. Léčiva Hypoxie Steroidy Odstranění růstových faktorů UV APOPTÓZA Obrázek č.5: Apoptotická dráha regulovaná proteiny rodiny Bcl-2. (1) Vnitřní apoptotická dráha je spuštěna stresovými faktory. (2) Vnější apoptotická dráha aktivovaná vazbou Fas ligandu nebo TRAIL aktivuje kaspázu 8. (3) Proteiny podskupiny BH3-only (Bim, Bid, Bad, Noxa a Puma) uvolňují anti-apoptotické proteiny Bcl-2 z vazby s Bax a Bak. (4) Proteiny Bax a Bak oligomerizují, čímž se mitochondriální membrána stává propustnou. (5) Cytochrom c a 25

protein Smac/Diablo jsou uvolněny do cytoplazmy a spolu s Apaf-1 a prokaspázou 9 tvoří komplex apoptosom, který následně aktivuje kaspázu 9. (6) Kaspáza 9 aktivuje kaspázu 3 a spustí tak kaskádu reakcí vedoucí k apoptóze (převzato a upraveno Kang a Reynolds, 2009). 4.7 Ztráta lokusu CDKN2A U rodin s genetickou predispozicí k rozvoji maligního melanomu je až ve 40 % nalézána mutace v zárodečné linií lokusu CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A) (Goldstein et al., 2006). Lokus CDKN2A se nachází na chromozomu 9 v pozici 9p21 (Kamb et al., 1994) a kóduje dva nádorové supresorové proteiny, které jsou překládány v odlišných čtecích rámcích (Obr.6). Prvním je p16 INK4A protein, který zastavuje díky své schopnosti inhibovat CDK buněčný cyklus v G1-S kontrolním bodě (Pollock a Trent, 2000). Pro průchod tímto kontrolním bodem jsou podstatné dva kroky, vazba cyklinu D na CDK4 a CDK6 a následná vazba cyklinu A nebo E na CDK2. Komplexy cyklin/cdk fosforylují protein Rb (retinoblastom), který je tím uvolněn z vazby na transkripční faktor E2F a dojde k postupu buněčného cyklu z G1 fáze do fáze S. Protein p16 INK4A je inhibitorem CDK4 a CDK6 a způsobuje tak zástavu cyklu. Naopak nepřítomnosti p16 INK4A v buňkách nádoru vede ke zvýšení aktivity buněčného cyklu. Při alternativním sestřihu transkriptu genu CDKN2A je exprimován protein p14 ARF, který se účastní regulace hladiny p53. V normální zdravé buňce se protein MDM2 (mouse double minute 2) váže na transkripčně aktivační doménu p53. MDM2 zprostředkuje ubikvitinaci p53, který je následně degradován v proteazomu 26S. Při poškození DNA dojde k vazbě proteinu p14 ARF na MDM2, čímž je inhibována jeho ubikvitin ligázová aktivita vůči p53, který se tak hromadí a způsobuje buď zástavu buněčného cyklu a opravu poškozené DNA nebo spustí apoptózu. Při mutaci genu CDKN2A v nádorové buňce, dochází k nepřítomnosti proteinu p14 ARF, snižuje se hladina p53 a buněčná odpověď na poškozenou DNA je oslabena (Miller a Mihm, 2006). 26

Obrázek č.6: Lokus CDKN2A kóduje dva nádorové supresory p16 INK4A a p14 ARF. p14 ARF je inhibitorem degradace p53 a způsobuje tak zástavu buněčného cyklu v G2-M kontrolním bodě nebo apoptózu. p16 INK4A inhibuje vazbu cyklinu D na CDK4 a 6 a iniciuje zástavu buněčného cyklu v G1-S kontrolním bodě (převzato a upraveno Miller a Mihm, 2006). 27

5. TERAPIE MELANOMU Léčba maligního melanomu se liší podle stádia choroby. Raná stádia melanomu jsou léčena především jejich chirurgickým odstraněním. Kompletní chirurgické odstranění časných stadií dosahuje až 95% úspěšnosti (Balch et al., 2004). Naneštěstí melanomové léze mohou zůstat po dlouhou dobu nedetekovatelné a melanom se může rozvinout do metastatických stádií bez zřejmě detekovatelného primárního ložiska (Soengas a Low, 2003). Metastázy se zřídka rozšiřují do jednoho místa, většinou zasahují větší počet orgánů, jako jsou mozek, plíce, játra a kosti (Balch et al., 2004). Navzdory stále novým poznatkům a možnostem léčby existuje jen málo látek, které by klinickou studií úspěšně prošly do pozdějších fází, a proto výsledky léčby metastazujícího melanomu nejsou doposud příliš uspokojivé. Základem vědeckých prací, které se ve velké míře zaměřují na preklinické studie, je inhibice signálních drah, které se podílejí na nádorové transformaci melanocytů. Pomocí specifického inhibitoru jedné konkrétní dráhy je možné ji zablokovat, avšak buňka si může najít náhradní cestu, jak se adaptovat na nové podmínky. Základem vhodné terapie by proto měly být takové kombinace jednotlivých inhibitorů, aby byly inhibovány všechny klíčové dráhy současně. 5.1 Standardní terapie Ke standardní terapii melanomu patří v první řadě chirurgická léčba, dále chemoterapie, imunoterapie a radioterapie. Stále častěji se využívá také kombinované léčby pomocí imuno a chemoterapeutic tzv. biochemoterapie. Jak již bylo zmíněno, primární léze jsou ve většině případů úspěšně odstraněny chirurgicky. Avšak u pacientů s pokročilejším stádiem melanomu je po chirurgickém odstranění nádoru vyšší riziko opětovného výskytu. Proto se využívá pomocné neboli adjuvantní terapie. Chemoterapie je léčba pomocí cytostatik, která zasahují především rychle se dělící buňky a zabraňují jim v dalším dělení. Přestože pro nádorové buňky je rychlý růst charakteristický, cytostatiky bývají zasaženy také zdravé buňky organismu. Melanom však bývá vůči chemoterapii často rezistentní. Pro chemoterapii pokročilých stádií melanomu se nejčastěji využívá dacarbazin (DTIC), který vykazuje 15 až 20% klinickou odpověď. Dalšími chemoterapeutiky, u kterých byla pozorovaná odpověď, jsou například analog dakarbazinu temozolomid, paclitaxel, carmustin (BCNU) nebo cisplatina. V léčbě metastatického maligního melanomu byla testovaná také kombinovaná terapie. Kombinace dakarbazinu spolu s cytostatiky cisplatinou, bischloroetylnitrosoureou a tamoxifenem a spolu s cisplatinou a 28

vinblastinem naznačila slibné výsledky v první a druhé fázi klinických testů, kde vykazovala odpověď kolem 40 %, avšak ve třetí fázi testování selhala v porovnání s monoterapii dacarbazinem (Atallah a Flaherty, 2005). Imunoterapie je založena na stimulaci imunitního systému pacienta, aby efektivněji rozpoznal a zničil nádorové buňky. Jako adjuvantní terapie je využíván interferon-α-2b (IFNα2b). Výsledky léčby INF- α-2b u pacientů po chirurgickém odstranění melanomu vykazují trvalé snížené riziko opětovného výskytu nádoru pouze při užití vysoké dávky, přičemž dochází k vedlejším účinkům, jako je horečka, nevolnost, zvracení, únava, bolest svalů či neuropsychiatrické symptomy včetně deprese. Nebyl však prokázán přímý efekt léčby INF- α- 2b na mortalitu spojenou s výskytem melanomu (Hauschild et al., 2008). Další látky používáme v terapii melanomu jako imunoterapeutika jsou interleukin-2 (IL-2) neboli aldesleukin a ipilimumab. Ipilimumab je lidská monoklonální protilátka, která blokuje antigen 4 cytotoxických T-lymfocytů (CTLA-4). CTLA-4 je vystaven na povrchu cytotoxických a pomocných T-lymfocytů a inhibuje jejich aktivitu. Během klinických studií byl prokázán výskyt závažných vedlejších účinků, kdy u některých pacientů došlo až k fatální autoimunitní reakci (Wolchok et al., 2010). Příkladem možné kombinované biochemoterapie je již zmíněná monoklonální protilátka ipilimumab, která byla testována spolu s cytostatikem dacarbazinem. Kombinovaná léčba zvýšila délku přežití oproti monoterapii dacarbazinem, avšak stále se vyskytují vedlejší účinky spojené s užíváním ipilimumabu (Robert et al., 2011). V případě paliativní léčby u mozkových, míšních či kostních metastáz se využívá radioterapie, která efektivně zmírňuje negativní projevy rakoviny (Atallah a Flaherty, 2005). 5.2 Experimentální cílená terapie V současnosti léčba rakoviny směřuje k cílené terapii, tedy k inhibici drah, které jsou v nádorové buňce deregulovány mutacemi. Ideální cíl terapie je takový, který je absolutně nezbytný pro přežití nádorové buňky, ale ne pro zdravou buňku. Proto je velmi podstatná identifikace signální drah klíčových pro růst melanomu, které se tak stávají cílem pro terapii. 5.2.1 Inhibitory BRAF Jak bylo již zmíněno, mutace V600E proteinu BRAF je nejběžnější mutací vyskytující se v melanomu. Studie Hingorami et al. z roku 2003 dokazují pokles buněčné proliferace, pokles invaze melanomu a navození buněčné smrti po vypnutí mutantního V600E BRAF 29

prostřednictvím sirna. Díky tomu je BRAF považován za významný cíl pro terapii melanomu. Více či méně selektivní inhibitory proteinu BRAF testované v posledních letech jsou zejména sorafenib (BAY 43-9006), vemurafenib (PLX 4032) a dabrafenib (GSK2118436). 5.2.1.1 Sorafenib Sorafenib (BAY 43-9006) byl původně navrhnut jako inhibitor CRAF, studie však dokazují, že jde o multikinázový inhibitor, který potlačuje také aktivitu divokého typu BRAF i mutantní BRAF V600E. Dále vykazuje významnou inhibici některých receptorových tyrosin kináz, které ovlivňují neovaskularizaci a proliferaci. Jedná se například o receptor vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGFR), receptor růstového faktoru krevních destiček β (PDGFR- β) či receptorovou tyrosin kinázu c-kit (Wilhelm et al., 2004). Strukturou je sorafenib biarylová modifikovaná molekula močoviny, která soupeří s ATP o vazebné místo na kináze RAF (Lyons et al., 2001). Vazbou sorafenibu na kinázu RAF dochází ke stabilizaci inaktivního stavu kinázy. Sorafenib je dobře tolerovaný při maximální dávce 400-600 mg dvakrát denně (Strumberg, 2005). Mezi nejčastější vedlejší účinky patří syndrom palmoplantární dysestezie (HFSR, označovaný rovněž jako syndrom dlaní a chodidel), vyrážka a průjem (Flaherty et al., 2008). Nicméně tyto nepříznivé účinky jsou považovaný za nepříliš silné a snadno zvládnutelné. Preklinické studie dokazují, že sorafenib zcela inhibuje fosforylaci kinázy MEK (Karasarides et al., 2004) a téměř úplně potlačuje také fosforylaci kinázy ERK (Wilhelm et al., 2004). V klinických studiích byl sorafenib testován jako monoterapie i v kombinaci s cytostatiky dakarbazinem, paclitaxelem nebo cisplatinou. 5.2.1.2 Vemurafenib Vemurafenib, další z testovaných inhibitorů, nese označení PLX 4032 (nebo také RO5185426) a jedná se o látku schválenou pro léčbu pozdních stádií nebo chirurgicky neodstranitelných lézí melanomu (National Cancer Institute at the National Institutes of Healh). Chová se jako vysoce specifický inhibitor, který potlačuje aktivační fosforylaci ERK u mutantního BRAF V600E/K. Naopak u melanomových buněk s divokým typem BRAF dochází k aktivaci signální dráhy kinázy ERK prostřednictvím aktivace CRAF (Halaban et al., 2010). Tato studie také potvrzuje, že pomocí vemurafenibu nejsou v melanomových buňkách významně ovlivněny žádné jiné signální dráhy. Co se klinických studií týká, vemurafenib 30

vykazuje částečnou odpověď až u 56 % pacientů s mutací BRAF V600E (Flaherty et al., 2009). 5.2.2 Inhibitory PI3K/AKT Inhibitory signální dráhy PI3K/AKT lze rozdělit do několika kategorií. PI3K inhibitory, dvojité inhibitory PI3K/mTOR, inhibitory AKT, inhibitory mtorc1 a dvojité inhibitory mtorc1/mtorc2. Inhibitory se dále liší afinitou k jednotlivým izoformám těchto proteinů. Například izoforma AKT3 je u melanomu převládající nad AKT1 a AKT2, což z ní činí selektivní cíl pro terapii (Stahl et al., 2004). 5.2.2.1 LY294002 LY294002 je inhibitorem PI3K, inaktivuje podjednotky této kinázy p110α, p110δ a p110β. Důsledkem je inhibice buněčné proliferace a indukce apoptózy. Inhibitor vyvolává zástavu buněčného cyklu v G1 fázi. V současné době probíhají fáze 1 klinických studií. 5.2.2.2 Rapamycin Rapamycin neboli sirolimus je inhibitorem mtorc1. Monoterapie pomocí tohoto inhibitoru nevykazuje dostatečnou aktivitu, což dokazuje také studie O Reilly et al., 2006, která poukazuje na existenci zpětné vazby v této signální dráze. Prostřednictvím stimulace receptoru pro izulínový růstový faktor 1 (IGF-1) se aktivuje dráha PI3K/AKT/mTOR, která způsobuje mimo jiné zpětné snížení exprese růstových faktorů pro zmíněné inzulínové receptory a tím dochází ke zpětné vazbě a inhibici dráhy PI3K/AKT/mTOR. Inhibice mtor v nádoru prostřednictvím rapamycinu, zvyšuje expresi substrátu inzulínového receptoru 1 (IRS-1), ruší tak zpětnou vazbu a dochází k aktivaci dráhy PI3K/AKT/mTOR. Naopak cílenou inhibicí receptoru (IRS-1) dochází ke zrušení aktivace AKT způsobené rapamycinem a nádorové buňky se stávají citlivější na inhibitory komplexu mtor. Z toho vyplývá, že kombinovaná inhibice, která jednak potlačuje funkci mtor a také zabraňuje aktivaci AKT se jeví jako slibná možnost terapie melanomu. 5.2.3 Inhibitory IKK (transkripční faktor NF-κB) Rozmanitost dějů závislých na transkripčním faktoru NF-κB je určitou nevýhodou v terapii. Inhibice NF-κB může vést buď ke zhoršení migrace přirozených zabíječů (NK 31

buněk), nebo ke snížení koncentrace tumor infiltrujících lymfocytů (TIL) a dendritických buněk ve vyvíjejícím se nádoru. Tyto děje mohou mít za následek poškození imunitní odpovědi proti nádoru. (Madona et al., 2012) 5.2.3.1 Kurkumin Kurkumin, přesněji diferuloylmetan, je extrakt z oddenku rostliny Curcuma longa. Biologické účinky kurkuminu jsou velmi početné a jsou sledovány již po dlouhou dobu. Jedná se zejména o antioxidantní, protizánětlivé, anti-proliferační a pro-apoptické účinky, které jsou způsobeny snížením hladiny některým transkripčních faktorů (např.: NF- κb), receptorů růstových faktorů a signálních proteinů (např.: COX1 a cyklin D). Jedním z hlavních mechanismů protirakovinných účinků curcuminu je inhibice degradace proteinu IκB, a tím inhibice celé dráhy NF-κB. (Aggarwal et al., 2003) Preklinické studie in vitro i in vivo ukazují na nárůst apoptózy a inhibici buněčného růstu a přežívání (Bill et al., 2009). Dokonce bylo prokázáno omezení metastatického potenciálu melanomových buněk, prostřednictvím inhibice matrixmetalloproteinázy-2 (MMP-2), která reguluje pohyblivost buněk a tvorbu metastáz (Banerji et al., 2004). 5.2.3.2 Selektivní inhibitory NF-κB Mezi specifické inhibitory se slibným výsledky v preklinických studiích patří například NBD peptid, který zabraňuje vazbě NEMO s IKKα a β. Ianaro et al., 2009 dokázali, že NDB účinně blokuje tuto vazbu a inhibuje tak vazbu NF-κB na DNA až o 80%. Na otestování v klinických studiích však tento specifický inhibitor stále čeká. 5.2.4 Bortezomib (PS-341) Bortezomid je inhibitorem proteazomu, inhibuje tak degradaci celé řady proteinů mezi něž patří např. protein p53 a protein IκB, inhibitor transkripčního faktoru NF-κB. Tento inhibitor byl testován na melanomových buňkách in vitro v kombinaci s chemoterapeutikem temozolomidem a výsledky ukazují výraznou inhibici buněčného růstu. Následná studie in vivo na myších modelech ukazuje v kombinaci s temozolomidem úplný ústup nádorů již po třicetidenní léčbě. (Amiri et al., 2004) Nespecifičnost borezomibu a jeho široké spektrum působení však vedly v klinických testech k negativním vedlejším účinkům, například nevolnosti, zvracení, průjemu, neuropatii a vyrážce (Su et al., 2010). 32

5.2.5 Využití nanotechnologie k transportu látek Nejdůležitějším krokem k úspěšné léčbě melanomu je nejen identifikace vhodných inhibitorů, ale také jejich dopravení do nádoru s minimálními toxickými účinky pro pacienta. Nanotechnologie poskytuje možnost obalení terapeutik, čímž lze docílit prodloužení doby cirkulace v těle, zvýšení absorpce látky, překonání bariery retikulo-endoteliálního systému a minimalizace toxicity pro pacienta. Pomocí nanočástic lze přenášet více látek najednou, čímž lze docílit regulace více signálních drah a následného synergického efektu. Nanotechnologie objevila pro nádorovou terapii široké spektrum doručovacích systémů, mezi které patří polymerní nanočástice, nanoslupky z křemíku a zlata, dedrimery, nanočástice na bázi uhlíku a liposomy. Liposomy byly testovány například při dopravování cisplatiny na místo nádoru a výsledky ukazují až dvěstěkrát vyšší účinnost přenosu (Hwang et al., 2007). Nanočástice se mohou uplatňovat také při přenosu sirna, která specificky inhibuje cílové geny, nicméně v organismu je velmi rychle degradována prostřednictvím RNA nukleáz. Liposom chrání RNA před degradací a prostřednictvím vazby na protilátku či protein na svém povrchu může být dopraven na místo určení do nádoru (Tran et al., 2009). Přestože využití nanotechnologií pro léčbu melanomu je zatím v začátcích, nanočástice by se v budoucnu mohly stát průlomem v terapii melanomu, díky možnosti účinnějšího současného zasáhnutí mnoha klíčových signálních drah. 33