Ověření pravosti říje u dojnic pomocí testu OVUCHECK

Ověření pravosti říje u dojnic pomocí testu OVUCHECK H. Härtlová 1, P. Hering 2, Z. Vodková 1, B Kmochová 1, P. Slavík 1, R. Rajmon 1 1 ČZU FAPPZ v Praze, 2 Českomoravská společnost chovatelů, Hradišťko pod Medníkem Souhrn Cílem práce bylo zhodnotit možnosti praktického využití stanovení progesteronu v mléce semikvantitativním ELISA kitem Ovucheck Rapid Tube (Biovet, Austria). Byl sledován vliv doby odběru (před a po dojení), vliv skladování vzorků (12 hodin při 4 C) a vliv zamražení stabilizovaných vzorků na výsledky testu Ovucheck Rapid Tube. Spolehlivost semikvantitativního stájového progesteronového testu Ovucheck Rapid Tube byla ověřena kvantitativním stanovením metodou ELISA. Závěrem lze konstatovat, že Ovucheck Rapid Tube Test (Biovet, Austria) je vhodný pro odhad funkce žlutého tělíska vyšetřením poměrných vzorků po dojení přímo ve stáji. Vyšetření prováděná ze vzorků uložených v lednici a vyšetřených druhý den mohou být zatížena určitou chybou, která je důsledek nehomogennosti vzorků, i když jsou vzorky řádně protřepané. Vyšetření ze zamražených stabilizovaných mlék z důvodů problémů s homogenizací vzorků nelze doporučit. Klíčová slova: progesteron, mléko, ELISA Summary The aim was to evaluate the practical usefulness of the determination of progesterone in milk semiquantitative ELISA kit Ovucheck Rapid Tube (BIOVETA, Austria). The effect of time sampling (before and after milking), sample storage (12 hours at 4 C) and freezing stabilized samples was monitored by test Ovucheck Rapid Tube. Reliability of semiquantitative Ovucheck Rapid progesterone test tube was verified by quantitative ELISA kit. We can conclude that Ovucheck Rapid Tube Test (BIOVETA, Austria) is suitable for predicting the function of the corpus luteum examination from samples directly in the milking barn. The samples in the refrigerator stored and tested the next day may be burdened with an error which is due to inhomogenity of samples, even though the samples were well shaken. Examination of the frozen stabilized milk is not recommended because they have problem with the homogenization. Key words: progesterone, milk, ELISA Ovucheck Stránka 1

ÚVOD A LITERÁRNÍ PŘEHLED Včasná detekce říje (estru), stejně jako včasný nástup ovariální aktivity po porodu, zvyšují reprodukční výkonnost stáda a následně i efektivitu chovu mléčného skotu (Honparkhe et al., 2008; Thatcher et al., 2006) a to zejména tím, že se snižuje počet inseminací v nevhodnou dobu (Sakaguchi et al., 2004). Mimo klasického vizuálního zjišťování projevů říje existuje řada objektivních měřících systémů a metod, které mohou pomoci neinvazivní cestou zpřesnit detekci říje (např. měření teploty mléka a těla, radiotelemetrické měření vaginální teploty nebo využití pedometrů). Mezi metody, které nevyžadují elektronickou identifikaci a jsou vhodnými indikátory cyklických změn na vaječníku, zvláště u dojnic se slabými projevy říje, patří stanovení koncentrace progesteronu v mléce (Opsomer et al., 2000). Hormon progesteron je produktem zejména žlutého tělíska, které se vytváří po ovulaci folikulu. Je uvolňován do krve a dostává se i do ostatních sekretů, jako je mléko, sliny atd. Těsně po ovulaci je hladina progesteronu minimální. Pomalu se začíná zvyšovat až od 4. 6. dne cyklu. Maximální koncentrace dosahuje mezi 10. a 17. dnem estrálního cyklu. U nezabřezlých krav začne hladina progesteronu zprudka klesat po 18. nebo 19. dni. Říje obvykle nastává 21. den. Pokud je inseminace úspěšná, koncentrace progesteronu roste, nejvyšší hladina je mezi 18. a 21. dnem a může indikovat březost (Shearer, 2008). Při stanovení a interpretaci hodnot progesteronu v mléce je nutno brát v úvahu závislost obsahu tuku na stanovení koncentrace progesteronu v plném mléce. Koncentrace progesteronu v tuku je 50 100 x vyšší než v mléčné plazmě, což při nedokonalé homogenizaci může významně ovlivnit výsledky měření. Tomuto problému se lze vyhnout odstředěním mléka před vlastním vyšetřením (Waldmann et al., 1999). Koncentrace progesteronu v odtučněném mléce je detekován v rozmezí 0.2 12.5 ng. ml -1. Pro účely běžné praxe hodnota pod 0.4 ng.ml -1 odpovídá časné folikulární fázi, hodnota 0.4 1.0 ng.ml -1 znamená časnou nebo končící luteální fázi a hodnoty nad 1 ng.ml -1 indukují plnou luteální aktivitu (Prakash et al., 1988). K exaktnímu určování koncentrací progesteronu je možno použít velmi přesnou metodu RIA (radioimunoanalýzy) a méně náročnou metodu EIA (enzymoimunoanalýza) (Mitchell et al., 2004). Isobe et al. (2004) uvádí, že současné EIA progesteronové testy jsou spolehlivou a prakticky použitelnou metodou pro stanovení progesteronu v mléce, pomocí které je u vysokoprodukčních dojnic možné omezit výskyt tiché říje při první ovulaci, respektive s jejich pomocí je možné první tichou říji zachytit a tím zlepšit reprodukci v chovu. Tyto kvantitativní metody jsou však nákladné, vyžadují dobré laboratorní zázemí dbát zásad Ovucheck Stránka 2

správné laboratorní praxe. Proto jsou hledány metody, které nemusejí být přísně kvantitativní, jsou rychlé, cenově dostupné a může je provádět chovatel sám. Jednou z nich je semikvantitativní progesteronový test Ovucheck Rapid Tube (Biovet, Austria). Cílem práce bylo zjistit vliv doby odběru (před a po dojení) na výsledek kvalitativní metody stanovení progesteronu v mléce kitem Ovucheck Rapid Tube, porovnání kvalitativního stanovení progesteronu v mléce Ovucheck Rapid Tube s kvantitativním stanovením metodou ELISA, vliv skladování vzorků (12 hodin při 4 C) na výsledek testu Ovucheck, zjistit vliv zamražení stabilizovaných vzorků na výsledky testu Ovucheck Rapid Tube a ověřit tak spolehlivost semikvantitativního stájového progesteronového testu Ovucheck Rapid Tube. MATERIÁL A METODIKA Do experimentu bylo zařazeno 66 krav (dojnic i jalovic) holštýnského plemene, ustájených na dvou farmách. Zvířata byla ustájena volně a krmena standardní směsnou krmnou dávkou. V době pokusu krávy nevykazovaly žádné vážné zdravotní problémy. Krávy byly dojeny dvakrát denně a poměrné vzorky byly odebírány při odpoledním dojení přímo na dojírně. Vzorky mléka byly dvakrát vyšetřeny kitem Ovucheck Rapid Tube a to ihned po odběru ve stáji a podruhé následující den. Ke kvantitativnímu stanovení byl použít EIA Progesterone bovine kit (Euro-Diagnostica, Netherlands). Schéma pokusu Ověření soupravy Ovucheck Rapid Tube (Biovet, Austria) bylo provedeno ve čtyřech pokusech. Cílem prvního pokusu bylo zjistit, zda má na výsledné stanovení progesteronu v mléce výše zmíněnou soupravou vliv doba odběru vzorku - před dojením a po dojení. Bylo porovnáno 37 poměrných vzorků čerstvého mléka před a po odpoledním dojení a to od 27 synchronizovaných dojnic 3 dny po inseminaci a 10 krav 3-6 měsíců březích. Odebrané vzorky mléka byly ihned po odběru ve stáji vyšetřeny testem Ovucheck Rapid Tube (Biovet, Austria). Cílem druhého experimentu bylo porovnat kvalitativní stanovení progesteronu v mléce testem Ovucheck Rapid Tube (Biovet, Austria) s kvantitativním stanovením metodou ELISA. Byly porovnány hodnoty 27 vzorků mléka od synchronizovaných dojnic 3 dny po inseminaci Ovucheck Stránka 3

a 14 mlék březích dojnic. Vzorky byly transportovány v chlazené nádobě, skladovány při 4 C a následující den (po 12 hodinách) vyšetřeny kitem Ovucheck Rapid Tube a zároveň ELISA Progesterone bovine kit (Euro-Diagnostica, Netherlands). Cílem třetího sledování bylo zjistit, zda je výsledek testu Ovucheck Rapid Tube (Biovet, Austria) ovlivňován skladováním vzorků (12 hodin při 4 C). Bylo vyšetřeno 37 poměrných vzorků mléka, od 27 synchronizovaných dojnic 3 dny po inseminaci a 10 krav 3-6 měsíců březích, ihned po odběru ve stáji a následující den (po 12 hodinovém skladování při 4 C) byl pokus zopakován. Cílem posledního sledování bylo zjistit vliv zamražení stabilizovaných vzorků na výsledky testu Ovucheck Rapid Tube (Biovet, Austria) porovnáním s výsledky EIA testu. Bylo vyšetřeno 24 zmrazených poměrných vzorků mléka, stabilizovaných dvojchromanem draselným, od krav 3. - 9. den po inseminaci. Před vyšetřením byly zmrazené vzorky vytemperovány na pokojovou teplotu, řádně promíchány a analyzovány setem Ovucheck Rapid Tube (Biovet, Austria) a EIA metodou Progesterone bovine kit (Euro-Diagnostica, Netherlands). Metody: Principem metody Bovine Milk Progesterone Test Kit Ovucheck Rapid Tube (Biovet, Austria) je indikace koncentrace progesteronu změnou barvy, která je srovnávána se standardem. Tmavší zbarvení než standard představuje nízkou hladinu progesteronu a světlejší zbarvení naopak vysokou hladinu progesteronu. Před začátkem testování musí být sada s komponenty zahřáta na pokojovou teplotu (asi 30 min). Stejně tak i vzorky mléka. Každá chemikálie v setu musí být řádně promíchaná. Pro kvantitativní stanovení progesteronu v mléce krav byla použita EIA metoda (Euro- Diagnostica, Netherlands). Metoda je určena ke stanovení progesteronu v mléčné plazmě, která je získána po inkubaci vzorku mléka po dobu 50 minut ve vodní lázni o teplotě 45 C a následném odstředění v chlazené centrifuze (20 minut, +4 C, 2000 x g. min -1 ) je odstraněn mléčný tuk. Metoda je založena na principu kompetice značeného a neznačeného antigenu k definovanému množství protilátky vázaného na pevnou fázi (Prakash et al., 1988). Statistické zpracování Ovucheck Stránka 4

Výsledky byly statisticky vyhodnoceny pomocí Wilcoxonova testu, který je neparametrickou obdobou párového t - testu. Byla stanovena nulová diference W=0 (statisticky zanedbatelný rozdíl mezi jednotlivými měřeními). VÝSLEDKY A DISKUSE Při ověřováni vlivu doby odběru vzorků na stanovení progesteronu jsme zjistili, že doba odběru nemá na výsledek vliv. Mezi odběry před dojením a po dojení byla 97% shoda (n = 37). Toto zjištění je významné zejména pro organizaci práce při testování pomocí Ovucheck Rapid Tube (Biovet, Austria). Porovnáním výsledků obsahu progesteronu v mléce stanovených kitem Ovucheck Rapid Tube a kvantitativní metodou EIA jsme zjistili vysokou shodu obou testů (95%) (Tabulka 1). Všech 28 mlék kvantitativně hodnocených EIA setem jako vzorky s nízkým obsahem progesteronu (tzn. krávy ve folikulární fázi), odpovídaly nízkým hodnotám progesteronu i při vyšetření Ovucheck Rapid Tube testem - měly tmavší barvu než standard. Ze 14 mlék s vysokým obsahem progesteronu (březí), stanoveno kvatitativní metodou EIA, bylo 12 mlék setem Ovucheck Rapid Tube hodnoceno jako mléka s vysokým obsahem progesteronu tj. mělo světlejší barvu než standard. Dva vzorky byly hodnoceny jako dubiózní tj. barva byla stejná jako standard. Zde mohla sehrát určitou roli homogenita vzorku, protože je známo, že obsah tuku významně ovlivňuje množství stanoveného progesteronu v mléce (Waldmann et al., 1999). Tabulka 1 Porovnání kvalitativního stanovení progesteronu Ovucheck Rapid Tube s kvantitativním stanovením metodou ELISA. Mléko odebrané po dojení a vyhodnocené po 12 hodinách ELISA progesterone test Ovucheck Rapid Tube 0,091-0,388 ng/ml 1,143-2,663 ng/ml Tmavý * Dubiózní Světlý* < 0,4 ng/ml 28 0 28 0 0 >1,0 ng/ml 0 14 0 2 12 n 42 42 % určených 100,00% 95,24% *Tmavá barva = nízký obsah progesteronu *Světlá barva = vysoký obsah progesteronu Ovucheck Stránka 5

Při ověřování vlivu skladování (12 hodin při 4 C) vzorků mléka na detekci progesteronu testem Ovucheck Rapid Tube bylo zjištěno, že mezi výsledky z předchozího dne a skladovanými vzorky byl rozdíl 6,3 % (Tabulka 2). Kvalitativní znaky byly též statisticky vyhodnoceny pomocí Wilcoxonova testu a byla stanovena nulová diference (W=0), což znamená statisticky zanedbatelný rozdíl mezi jednotlivými měřeními Tabulka 2 Vliv skladování vzorků (12 hodin při 4 C) na výsledek testu. Ovucheck Rapid Tube v den odběru Ovucheck Rapid Tube 12 hodin po odběru Tmavý * Dubiózní Světlý* Tmavý * Dubiózní Světlý* n 35 1 12 32 4 12 n 48 48 % shody 100,00% 93,75% Stanovením progesteronu ze zamražených stabilizovaných vzorků testem Ovucheck Rapid Tube (Biovet, Austria) a kvantitativní metodou EIA bylo zjištěno, že se pouze 30% vzorků shodovalo (Tabulka 3). Tato chyba byla nejspíše důsledkem obtížné homogenizace rozmraženého mléka, která způsobí nerovnoměrné zastoupení tuku ve vzorku odebraném pro vyšetření, na což poukazuje i Waldmann et al. (1999) Vzhledem k tomu, že koncentrace progesteronu je obsahem tuku bezprostředně ovlivněna je nutné brát tuto skutečnost na zřetel. Tabulka 3 Porovnání shodnosti výsledků stanovení koncentrace progesteronu v mléce metodou Ovucheck Rapid Tube a kvantitativní EIA metodou. Mléko vyšetření po rozmražení metodou Ovucheck Rapid Tube a kvantitativní EIA ELISA progesterone test Ovucheck Rapid Tube Počet vzorků < 0,4 ng.ml -1 >1,0 ng.ml -1 Tmavý * Dubiózní Světlý* n 1 23 7 1 16 n 24 24 % shodně určených ze všech 29,17 ZÁVĚR Ovucheck Rapid Tube Test (Biovet, Austria) je vhodný pro odhad funkce žlutého tělíska přímo ve stáji. Ovucheck Stránka 6

Vyšetření vzorků mléka je vhodné provádět z poměrných vzorků po dojení, kdy je menší nebezpečí nehomogenních vzorků. Vyšetření prováděná ze vzorků uložených v lednici druhý den mohou být zatížena určitou chybou, která je důsledek nehomogennosti vzorků, i když jsou vzorky řádně protřepané. Vyšetření ze zamražených stabilizovaných mlék z důvodů problémů s homogenizací vzorků nelze doporučit. Poděkování: Tato práce byla realizována za podpory grantu MSM 604 607 0901. Seznam literatury HONPARKHE, M et al., J. Dairy Sci, 70, 12, 1327-1331. 2008. ISOBE, N et al., Deutsche Tierarzt. Wochensch., 11, 1, 35 38, 0341-6593, 2004. MITCHELL, JS et al., J. Dairy Sci., 87, 2846-2867, 2004. OPSOMER, G et al., Elsevier Sci. Inc., 53, 841-857, 2000. PRAKASH, BS et al., Anim. Repr. Sci., 16, 225-235, 1988. SAKAGUCHI M et al, J. Dairy Sci., 87, 7, 2114-2121, 2004. SHEARER, JK, University of Florida, IFAS Extension, DS 57, 1-4, 2008. THATCHER, WW, et al. Theriogenol, 65, 30-44, 2006. WALDMANN, A, et al., Anim. Reprod. Sci., 56, 79 91. 1999. MVDr. Helena Härtlová, CSc. ČZU, FAPPZ, katedra veterinárních disciplin Ing. Pavel Hering Českomoravská společnost chovatelů, Hradišťko pod Medníkem Ing. Zuzana Vodková, Ph.D. Bc. Barbora Kmochová MVDR. Petr Slavík, Ph.D. Doc. MVDr. Radko Rajmon, Ph.D. ČZU, FAPPZ, katedra veterinárních disciplin Hartlova@af.czu.cz Ovucheck Stránka 7