Progesteron ELISA test pro kvantitativní stanovení progesteronu v lidském séru nebo plazmě

Transkript

1 Progesteron ELISA test pro kvantitativní stanovení progesteronu v lidském séru nebo plazmě Obj. číslo: testů kompletní souprava Účel použití Progesteron (pregn-4-ene-3, 20-dion) je steroidní hormon (C 21 )s molekulovou hmotností 314,5 Da. Je to nejdůležitější hormon (progestogen), produkovaný u netěhotných žen žlutým tělískem, během těhotenství placentou. Menším zdrojem jsou u mužů varlata a u obou pohlaví kůra nadledvinek. Progesteron během menstruačního cyklu reguluje, společně s estrogeny (estradiol), pomocné orgány. Kromě toho působí při přípravě endometria pro implantaci blastocyty a při udržování těhotenství. Progesteron cirkuluje v krvi vázán na vázající globuliny (CBG, SHBG) a albumin. Vázáno je asi 90-98% cirkulujícího hormonu, o zbývající části, volném progesteronu, se předpokládá, že je aktivní steroid. Hladina progesteronu v krvi se mění v širokém rozsahu v závislosti na fázi menstruačního cyklu a kopíruje aktivitu ovariálního folikulu a žlutého tělíska.. Proto je stanovení progesteronu klinicky důležité pro potvrzení ovulace a normální funkce žlutého tělíska u netěhotných žen 1. Abnormální vylučování progesteronu 2,3,4,5 se může projevit při premenstruální tenzi, luteální nedostatečnosti, dysmenorrhoe a nepravidelném odlučováním endometria. Princip - Kompetitivní EIA - Test Progesteron ELISA je založen na kompetitivní interakci progesteronu a hormon-enzymového konjugátu o omezený počet imobilizovaných (králičích) monoklonálních protilátek proti progesteronu. Množství vázaného hormonenzymového konjugátu je tedy nepřímo úměrné koncentraci progesteronu ve vzorku. Po inkubaci vzorku a hormon-enzymového konjugátu v jamce je nenavázaný konjugát odstraněn promytím. Po přidání substrátového roztoku se vyvine modré zbarvení, které se po zastavení reakce ukončovacím roztokem mění na žluté. Intenzita barev je nepřímo úměrná množství progesteronu ve vzorku. Absorbance kalibrátorů a vzorků je stanovena s využitím mikrodestičkového ELISA spektrofotometru (HUMAREADER). Koncentrace neznámých vzorků je interpolována z kalibrační křivky za využití kalibrátorů séra o známých koncentracích progesteronu. Obsah soupravy [MIC] 12 Mikrotitrační destičky (v jednodestičkovém držáku) 8-jamkové ulamovatelné řádky, potažené antiprogesteronovými protilátkami (myší) [CAL] A - G Kalibrátory (bile víčko) 7x1.0mlPřipraveno k použití, v lidském séru Progesteron koncentrace: 0 (A), 0,3 (B), 1,25 (C), 2,5 (D), 5,0 (E), 15,0 (F) a 40,0 (G) ng/ml [CON] 25 ml Enzymový konjugát (bílé víčko) připraveno k použití, červené ph 6.9 ± 0.2 Progesteron-HRP konjugát BSA 0.5 % TRIS/MOPS buffer 0.05 mol/l NaCl 0.1 mol/l [WS] 30 ml Promývací roztok (černé víčko) Koncentrát pro asi 1200 ml ph 7.3 ± 0.1 Trisem pufrovaná sůl 3 mmol/l TWEEN % [SUB] 25 ml Substrátový roztok (žluté víčko) ph Připravené k použití 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) 0,26 g/l Peroxid vodíku 0,015% Acetátový pufr 0.05 mol/l DMSO < 5 % [STOP]14 ml Ukončovací roztok (červené víčko) Kyselina sírová 0.5 mol/l 1 Lepící páska Konzervanty: Celková koncentrace <0,7% Bezpečnostní poznámky Nepolykejte reagencie. Zabraňte potřísnění očí, kůže a sliznic. Se všemi vzorky a [CAL] zacházejte jako s materiálem potenciálně infekčním. [CAL] byly kontrolovány na úrovni dárců na přítomnost protilátek proti HCV a HIV-1/2 a HBsAg s negativním výsledkem. Používejte ochranné oblečení a jednorázové rukavice dle zásad správné laboratorní praxe. Všechny materiály, kontaminované vzorky pacientů nebo [CAL], musí být inaktivovány schválenými postupy (autoklávování nebo chemické ošetření) v souladu s příslušnými předpisy. [STOP] dráždí oči, kůži a sliznice. Při kontaktu pečlivě omývejte velkým množstvím vody a konzultujte s lékařem.

2 Stabilita Při skladování při teplotě 2 8 C jsou reagencie stabilní do data exspirace uvedeného na jednotlivých štítcích. Po otevření musí být reagencie uloženy při teplotě 2 8 C a použity během 60 dnů (viz Poznámky). [MIC] - uzavřeno v hliníkovém obalu se sušidlem - před otevřením musí mít pokojovou teplotu - nepoužité: vraťte se sušidlem zpět do obalu a skladujte při 2-8 C. Destičky skladované tímto způsobe lze použít do 60 dnů (viz poznámka). Nedotýkejte se horního okraje ani vnitřku jamek prsty! Příprava reagencií Zahřejte před použitím všechny reagencie na pokojovou teplotu (15-25 C). Nepoužívané reagencie by měly být skladovány vždy při 2-8 C Pracovní promývací roztok [WASH] -zřeďte [WS] 1200 ml čerstvé deionizované vody do vhodné nádoby. Lahvičku roztokem několikrát propláchnete. - Stabilita: 2 týdny při C Vzorky Sérum nebo EDTA plasma Nepoužívejte vysoce lipemické a hemolyzované vzorky a vzorky obsahující azid sodný. Vzorky je možné skladovat při 2-8 C 3 dny nebo 30 dní při -20 C. Zmrazujte a rozmrazujte pouze jednou. Rozmražené vzorky musí být homogenizovány. Odstraňte částice centrifugací nebo filtrací. Pracovní postup Dodržujte postup přesně! Poznámky k postupu P1: Nemíchejte složky s jinými čísly šarží. Nezaměňujte víčka lahviček (nebezpečí kontaminace). Nepoužívejte reagencie po jejich datu exspirace. P2: Nepoužívejte reagencie, které mohou být kontaminovány nebo vypadají či páchnou jinak než je obvyklé. P3: Zaznamenávejte pečlivě vzorky a kontroly do formuláře dodávaného s kitem P4: [MIC] vyberte požadovaný počet stripů (řádek) destičky a řádně upevněte v držáku. P5: Nechte probíhat reakce kontrol, [CAL] a vzorků duplicitně (od každého dvě). Pipetujte kontroly a vzorky i [CAL] přímo na dno mikrojamek. P6: Vždy přidávejte reagencie v tomtéž pořadí, abyste minimalizovali rozdíly v reakčním čase mezi jamkami. Toto je důležité pro reprodukovatelné výsledky. Pipetování vzorků by nemělo překročit 10 minut. Jinak pipetujte kalibrační křivku v naznačených polohách v poločase série. Jestli se používá více než jedna destička, opakujte dávce odpovídající (kalibrační) křivku pro každou destičku. P7: Odstraňte vzduchové bubliny před inkubací a odečítání absorbance. P8: [SUB] inkubujte ve tmě. [SUB] iniciuje kinetickou reakci, která je zakončena přidáním [STOP]. P9: [MIC] jemně kývejte s destičkou sekund po každém pipetovacím kroku, abyste důkladně promíchali obsah jamek, aniž vylijete roztoky. Je-li to možné, míchejte na automatické míchačce. Promývací procedura Promývací procedura je kritická. Nedostatečné promytí sníží přesnost nebo falešně zvýší absorbanci. W1: Odstraňte lepící pásku, vylijte obsah jamek a přidejte [WASH] do každé jamky, po 30 sekundách navlhčování vylijte a opakujte promytí. W2: V případě automatického promývání začněte s [WASH] a promyjte stripy 3x.. Ujistěte se, že promývač úplně plní všechny jamky a účinně vylívá obsah po 30 sekundách (zbývající kapalina po vylití v jamce< 15ml). W3: Po promytí odstraňte zbývající kapalinu buničinou s destičky obrácené vzhůru nohama. Pipetovací schéma Reagencie a vzorky musí mít před použitím pokojovou teplotu Krok 1 Jamka [µl] A1...F2 G2... [CAL] A-G; dvakrát Vzorky, Kontroly; dvakrát [CON] Promíchejte a přikryjte [MIC] lepící páskou. Inkubujte 60 min při C Promyjte 3 x jak je popsáno (viz W1 - W3) [WASH] Krok 2 [SUB] Inkubujte 15 min při C (viz P8) [STOP] Opatrně promíchejte. Změřte absorbanci at 450 nm hned, jakmile je to možné nebo během 30 min. po skončení reakce, za použití

3 referenční vlnové délky nm (je-li to možné). Platnost testu Výsledky testu jsou platné, jsou-li splněna následující kritéria: 1) Maximální absorbance (kalibrátor A) O.D. max. 1,0 2) Analyzuje se na třech úrovních: Koncentrace progesteronu při 80 % O.D. max. = 0,17 0,5 ng/ml Koncentrace progesteronu při 50 % O.D. max. = 0,82 3,8 ng/ml Koncentrace progesteronu při 20 % O.D. max. = 8,0 28,0 ng/ml Výpočet Kalibrační křivka se používá k odečtení koncentrace progesteronu v neznámých vzorcích. 1. Vyneste na milimetrový papír absorbance duplicitních kalibrátorů proti odpovídající koncentraci progesteronu v ng/ml (nepočítejte z dvojic průměrnou hodnotu a vyneste obě hodnoty absorbance). 2. Vytvořte regresní přímku. 3. Koncentraci progesteronu v neznámém vzorku (S) zjistíte tak, že od hodnoty průměrné absorbance vzorku na svislé ose vedete přímku až protne křivku, tomuto bodu odpovídá na horizontální ose příslušná koncentrace (v ng/ml). Pro ilustraci viz obrázek. Interpretace výsledků Koncentrace progesteronu se u konkrétní osoby mohou měnit ze dne na den nebo dokonce i z hodiny na hodinu. Proto pro správnou interpretaci výsledků je doporučeno v případě gynekologických poruch nebo abnormálních těhotenství udělat sérii měření. Progesteron má termogenní účinek a zvyšuje bazální teplotu. Interpretace hodnot progesteronu bude proto snadnější v kontextu s křivkou bazální teploty. Rozsahy progesteronu se mění od méně než 1 ng/ml ve folikulární fázi do okolo ng/ml v luteální fázi (viz Očekávané hodnoty). Maximálních úrovní je dosaženo 6-8 dní po ovulaci a zvýšených po 4-6 dnů. Na původní nízkou úroveň se koncentrace vrátí 1-2 dny před počátkem menstruace. Během těhotenství se koncentrace progesteronu produkovaného placentou neustále zvyšuje až na špičkovou hodnotu 200 ng/ml. Stanovení hodnoty progesteronu samotné není postačující pro diagnózu patologických stavů. Musí být použito ve spojení s jinými klinickými projevy a diagnostickými (hormonálními) parametry. Očekávané hodnoty Normální ženy: folikulární fáze luteální fáze menopausa Normální muži: konverzní koeficient: 1 ng/ml = 3,18 nmol/l Hladina progesteronu 0,2 1,4 ng/ml 4-25 ng/ml 0,1 1 ng/ml 0,1-1 ng/ml Každá laboratoř by si měla stanovit své vlastní očekávané hodnoty vzhledem k používaným přístrojům, metodám odběru krve a testovacím technikám obecně v této laboratoři užívaným. Parametry testu Test ELISA Progesteron firmy Human má analytickou citlivost 0,03 0,07 ng/ml vzorku. Vzorky s koncentrací progesteronu nad 40 ng/ml musí být zředěny (1 + 9) kalibrátorem A (0 ng/ml) a znovu analyzovány. Výsledek násobte 10. Typické údaje o parametrech testu můžete nalézt ve Verification Report dostupném na nebo Poznámka Výrobky jsou i po otevření stabilní do data exspirace. Jejich kontaminace ovšem přímo souvisí s počtem otevření lahviček. Proto je z důvodu bezpečnosti stanoven 60denní limit pro používání po prvním použití. Opatrná manipulace dle zásad správné laboratorní práce (*) poskytuje možnost používat reagencie i po uplynutí 60 dnů. Reagencie musí vždy splnit kritéria kontroly kvality! (* To zahrnuje: Uzavírat lahvičky správnými zátkami a těsně je dotahovat / množství reagencií potřebné pro analýzu odebrat z velkých balení, mohou-li tyto reagencie přijít do styku s kontaminujícími látkami (např. séry pacientů) / reagencie co nejdřív vracet do chladničky (2 8 C). Human Gesellschaft für Biochemica und Diagnostica mbh Max-Planck-Ring 21 - D Wiesbaden - Germany Telefon: Telefax: human@human.de

4 Literatura 1. Israel, R. et al, Am. J-Obstet. Gynecol 112, 1043 (1971) 2. Soules, M.R. et al, Fertil. Steril. 36, 55 (1981) 3. Maganlielly, P.D. et al, Fertil. Steril. 36, 55 (1981) 4. Hahlin, M. et al, Hum. Reprod. 5, (1990) 5. Buck, R.H. et al, Fertil. Steril. 50, (1988)

5 EL-PROG INF GB