3. Biotechnologie v chovu prasat 1. Úvod Biotechnologie v chovu hospodářských zvířat jsou programové postupy využívající genetických znalostí a mají za cíl zvýšení užitkovosti. Tyto programy se rovněž týkají chovu prasat. Pro jejich stále zlepšování je nutno - porozumět teorii, - porozumět způsobům funkčnosti tradičních genetických programů, - vymezit cíle šlechtění včetně - nalezení nejlepších plemen/linií, - určení optimálního systému křížení (využití heteróze, meziplemenných rozdílů), - určení intenzity selekce (pokrok uvnitř plemen/linií). Chov prasat v Evropě je charakterizován - omezeným počtem plemen, které lze využít (nelze pak zabránit inbreedingu, mající za následek sníženou genetickou proměnlivost a ibrední depresi), - typem křížení (3liniové, s F 1 hybridními z mateřských plemen selektovaných na reprodukci a výkrmnost, resp. otcovských linií selektovaných pouze na produkční znaky), - typem používaného šlechtění - Evropského (firemní hybridi určené pro typickou pyramidální strukturu chovu, jejichž šlechtění dle jednotlivých linií probíhá v nukleech a kříženci těchto jsou prodáváni do UCH), - Dánského (jakýkoliv farmář je napojen na centrální testační stanici, ve které testuje svá prasata a na základě jejich PH určuje zda zvíře je plemenné/užitkové). U obou typů však existuje genetická ztráta, neb v UCH se genetický pokrok získaný ve šlechtění (nukley) v plné míře nikdy neobjevuje. Výši genetického pokroku plemene ovlivňuje - výše genetické proměnlivosti dané vlastnosti, - přesnost a intenzita selekce, - generační interval, - heritabilita, - imbreeding (je nutno jej udržet rozumné úrovni). Z hlediska výše šlechtitelského cíle možno metody biotechnologií dělit na ty, které jej - ovlivňují (transgenní zvířata), - neovlivňují (sxování/seperace spermií). 2. Šlechtitelské cíle v chovu prasat zahrnují hlavní znaky - produkce, jako růst, konverzi a jatečnou hodnotu, - reprodukce, jako velikost vrhu, ap.. V praktickém šlechtění je úsilí zaměřeno na predikci hlavních užitkových znaků. Uplatňuje se víceznaková selekce, jejíž tlak je cca z - 20-50 % na znaky adaptability, (končetiny, dlouhověkost, konstituce), - minima na znaky málo známé, - zbytek na znaky užitkové. Hlavní nedostatek pokroku jsou neznalost - celkové fyziologie prasat, - interakcí hlavní užitkové vlastnosti x vedlejší vlastnosti, - genetických a fyziologických změn způsobených selekcí.
3. Biotechnologické postupy s ohledem na jejich zařazení budou hrát doplňující roli ve šlechtitelských programech, nicméně mnohé z nich podstatně změní šlechtitelské metody a postupy. Biotechnologie ve šlechtění prasat. Technologie Použití v ŠCH Použití v UCH Separace spermií Sexování embryí Embryotransfer - do ŠCH Změna poměru pohlaví a tlaku na pohlaví. Záměrné křížení. Zkrácení generačního intervalu. Produkce rodičovských zvířat žádoucího pohlaví. Produkce užitkových zvířat požadovaného pohlaví. Beznákazové zavedení ŠCH, SPF chovy (MN). - do UCH Oddělení šlechtitelských cílů pro reprodukci a produkci. Oddělení šlechtitelských cílů pro Klonování embryí reprodukci a produkci. Měření znaků na poražených klonech. Užití monofaktoriálních znaků Účinná detekce a selekce Transgeneze Selekce - podle markerů, Genomika - v časném věku, - podle rodokmenové hodnoty bez monitoringu užitkovosti. Výkrmová prasata pouze z genotypem masných plemen. Zavedení sesterských ŠCH. Lepší prevence nemocí v pyramidě. Zvýšení uniformity produktu. Odlišnost trhů. 3.1. Separace spermií je možno uskutečňovat od 90.let a je vytvořeno několik způsobů, které jsou založeny na - rozdílnosti DNA X/Y chromozomu, což se uplatňuje při průtokovém cytometrickém třídění semene (výrazně mění poměr 1:1, je jen pro experimenty díky extrémně nízké produkci tříděného ejakulátu, což při in vitro pokusech stačí), - proteinovém rozdílu membrán X/Y chromozomů (magnetické částice nesoucí monoklonální protilátku budou základem separace odlišného proteinu). Separace spermií pro produkci rodičovských populací je komerčně velmi zajímavý, neb řeší - produkci žádaného pohlaví u mateřských/otcovských populací, - problém výskytu kančího pachu (Evropa), - zpřesnění, rozdělení a zvýšení selekčního tlaku pro jednotlivé pohlaví, - poměr pohlaví ve vrhu. 3.2. Embryotransfer je rutinně využíván především u skotu. Embrya jsou získávána díky - superovulaci (další rozvoj metody je limitován), - kultivaci oocytů in vivo a jejich in vitro dozráváním+oplozením ( recipientka). U prasat je situace komplikovanější, neb - in vivo získání embryí je možné jen s vyjmutím dělohy, - není zcela jasné, kolik embryí možno takto získat (alternativa = odběr oocytů z poražených ), - nechirurgický transfer embryí, technicky proveditelný, se v praxi se nepoužívá díky nulovému vlivu na velikost vrhu, - se počítá s embryotransferem ve větší míře pouze v selekčních programech na úrovni nukleových chovů (zkrácení generačního intervalu, zvýšení očekávaného genetického pokroku některých vlastností, odběr a kumulace embryí před pubertou, možnost pracovat s menší četností mateřských a otcovských linií, menší výskyt imbreedingu), - není jasné, zda komplikovaný postup produkce embryí bude technologií použitelnou v praxi díky ceně.
Zájmem biotechnologií v produkci zvířat, je - předvídání sledovaných znaků, - možnost prevence chorob/zlepšení welfare. Hypotetický příklad využití zvýšení reprodukce embryotransferem pomocí prasat Taihu Taihu ML (A,B) jsou zvlášť selektována v nukleech na četnost vrhu ( + 0,3 NS/vrh a rok) Evropské linie OL (C,D) jsou specielně šlechtěna na vysoký podíl libové svaloviny A x B C x D 100% čínské Klonování, sexování, příjemkyně Embryotransfer kryokonzervace embryí (+ 5-6 NS/vrh a rok) Výkrm (CxD) 3.3. Klonování Klon je organismus vzniklý nepohlavním rozmnožováním a je geneticky zcela identickou kopií svého rodiče. Jako klon je též označována populace klonů. Cílená tvorba klonů člověkem se nazývá klonování. Tato činnost hraje důležitou úlohu v zemědělství a biotechnologických oborech. Lze konstatovat, že klonování vyšších rostlin je jednodušší a rozšířenější než klonování živočichů. Pokud jde o živočichy, pak zvířata typu Dolly, kdy jádro buňky bylo odebráno z tělesné buňky a vpraveno do vajíčka jiné ovce, čímž byla vytvořena jakási umělá zygota, nejsou vlastně čistým klonem, neb - veškeré geny přenášené mimojaderně pocházejí totiž od náhradní matky (jejich podíl na celkové dědičnosti ovšem není příliš velký), - vzhledem k tomu, že i tělesné buňky podléhají mutacím, existuje určitá pravděpodobnost, že naklonovaný jedinec vykazuje oproti většině buněk svého původce jednu/několik mutací. Uvnitř každé tělesné buňky existuje program, v němž je zakódována stavba celého organismu. Klonování probíhá tak, že se tento program vloží do vajíčka, z něhož se předtím odstraní jádro obsahující genetickou informaci. Program se spustí znovu od začátku a vytváří nového jedince. Nový tvor je v podstatě identickou kopií organismu, z jehož těla byla buňka odebrána. Současné metody klonování živočichů zahrnují přenos jader z moruly embrya do neoplodněných oocytů, z kterých byly odstraněny chromozomy ve stádiu metafáze II.
Postup bisekce embrya Touto metodou - je umožněna produkce velkého množství geneticky identických jedinců, - bude možné přenášet jádra kmenových buněk k dozrání in vitro, přičemž tak bude možné produkovat potenciálně neomezené množství klonů (zdrojem oocytů mohou být zvířata z porážky), - se však stabilně vyššího účinku nedosahuje, neb - existuje značná genetická proměnlivost způsobená oocytovou mitochondriální DNA příjemce a jadernou DNA dárce, - je třeba další výzkum k pochopení příčin nízké úspěšnosti (nadějné jsou inkorporace embryonálních kmenových buněk). Ke klonování, resp. tvorbě jedince klonem lze užít - nezralé kmenové buňky (většinou - jsou univerzální a mohou po dozrání plnit různou funkci), Pro humánní medicínu je nejlepším rezervoárem kmenových buněk je po kostní dřeni pupečníková krev, kde kmenové buňky jsou dokonale totožné s organismem dárce. Ta se po porodu odebere z pupečníku před odloučením placenty do sáčku a skladuje 3-4 dny v pokojové teplotě a pak záleží na okolnosti, zda uchovat buňky pro vlastní/jinou potřebu (konzervace, transplantace). - plně dozrálé krevní buňky (samy o sobě nejsou schopny se množit - Dolly zřejmě nemusela být stvořena z kmenových, nýbrž ze zralých buněk), - zralé bílé krvinky (z 35 vs. 4% granulocytů/nezralých kmenových buněk vznikly blastocyty), - co nejméně zralé buňky (dokonce i zralé!). Je známo, že kmenové buňky v raném stádiu vývoje mohou dozrát/přeměnit se v jakýkoli typ buňky v těle. Získávají se z - nenarozeného embrya, které se vyvíjí nejméně 5 dní, kdy jej tvoří shluk asi stovky buněk, které se používají, čímž vznikající život končí (destrukce embrya), - embrya ve velmi rané fázi vývoje, kdy ze shluku nerozlišených buněk je odejmuta jedna a embryo se vyvíjí dál (kmenová buňka se dále rozmnožuje a tvoří linie, mající shodnou genetickou informaci s embryem/dítětem lze uchovat pro případné pozdější použití). Možnost klonování hospodářských zvířat/prasat přinese do sféry - šlechtění o možnost v kmenových chovech studovat znaky JH přímo na plemenných prasatech, čehož je možno dosáhnout též dělením embrya, o tvorbu speciálních otcovských/mateřských linií s vysokými parametry růstu/odchovaných selat, - užitkové o větší efektivnost prevence zdraví než je dosavadní v rámci pyramidální vertikály, o pružnější/rychlejší tvorbu žádoucích genotypů dle požadavků zpracovatelů/trhu. Pro populace klonování bude znamenat
- snížení genetické ztráty uvnitř šlechtitelské pyramidy při uplatnění nechirurgického přenosu embryí z ŠCH do UCH, - zvýšený inbreeding (bude v dalších generacích snižovat ΔG), - možnost zvýšení uniformity (40% proměnlivosti znaků = genotyp, 75% standardní odchylky průměru populace způsobují klonovaní jedinci stejného genotypu), Ačkoliv bylo v úvodu řečeno, že populace klonů je populace geneticky identických kopií, není to úplně pravdivé. Určitá genetická variabilita může vzniknout díky mutacím, za obvyklých okolností je ovšem minimální a bezvýznamná. Mění se to v případě, kdy základem pro klon se stává jedna nebo jen několik málo buněk (výsledkem je větší míra variability). Důležitým faktorem jsou též míra působení mutagenů a podmínky klonování. Obecně lze říci, že kombinací silně umělého klonování jednotlivých či několika málo buněk a užití mutagenů, lze i u teoreticky homogení populace klonů dosáhnout určité již významné variability. - vyšší náchylnost ke specifickým nemocem (díky velkému množství identických klonů), - nutnost testování vhodných kandidátů/jedinců s následným zmrazením identických embryí (mrazící techniky nejsou plně vyvinuty) s následným jejich množením (a zpracováváním in vitro), - problematiku etiky, ceny technologií. 3.4. Identifikace QTL Monofaktoriální znaky možno při znalosti genotypu snadno určit (případ testu DNA k identifikaci Hal). Takových je však několik, značených jako ETL. Pokud jde o genetické defekty, všeobecně nejsou kontrolovány jedním lokem. Detekce jednoduchého loku (identifikace odpovědného úseku DNA) je problematické. Doufá se, že identifikace genu na úrovni DNA a rozvoj testů pro tyto loky bude jednodušší po dokompletování mapy lidského/prasečího genomu (PiGMaP). Mapování genomu předpokládá objev markerů geneticky vysoce variabilních, dělících se na - minisatelity, - mikrosatelity (jsou stále objevovány ve velkém počtu a jsou náhodně rozmístěny v celém genotypu), Genotyp se zjišťuje - užitím PCR (polymerázové řetězové reakce), umožňující analýzu DNA sekvencí, - určením - variability markerů s ohledem na kvantitativní znaky, - nakupení/ rozmístění markerů v genomu, chovající se jako samostatný lokus (v jiných populací se však tak chovat nemusí, je toto závislé na selekci). Použití markerů v selekčních programech má za následek - kontinuitní tvorbu vazeb/rekombinací marker znak, - provádění retestů (zjištění mezimarkerových vazeb a rekombinací marker x QTL). Markery vykazující DNA-polymorfismus možno určovat bez ohledu na čas, pohlaví, čehož se využívá k - redukci volby měřitelných užitkových znaků při uplatnění MAS (marker assisted selection), - introgresi, tedy k možnému přenosu a hromadění žádoucích genů z jedné linie na další. U prasat je počet takových genů omezen, nicméně existují, jsou přenosné a jsou známy pro plodnost (četnost vrhu, časná puberta, znaky chování, příjem krmiva, apod.). - selekci vlastních sourozenců na užitkové znaky bez testů. Předností MAS je v - možnosti provádění selekce uvnitř rodin, - snižování inbreedingu (i při nulovém progresu je MAS pozitivní), - zkrácení generačního intervalu a zvýšení genetického zisku (v kombinaci jiných biotechnologií jako in vitro získávání/kultivace/oplodnění oocytů bez potřeby testu užitkovosti). 3.5. Transgeneze Přímá manipulace s DNA je - prostředkem změny genetické variability v rámci druhu (u prasat zatím problémová), - uskutečňována přímou aplikací DNA do jádra raného embrya, - nízce účinná, neb - cca 1% injektovaných embryí produkuje transgenní potomstvo, - není účinná kontrola míst, kde se DNA spojuje a tvoří kopie (což ovlivňuje expresi genu), Rozvoj kmenových buněk embrya u prasat je ovlivněn precisností genové manipulace. Tyto buňky mohou být kultivovány v laboratoři (jsou nediferencovány - mohou dát základ jakémukoli typu tkáně včetně zárodečné) a vkládány zpět do embrya.
První transgen byl u prasat proveden v roce 1985, další se týkají - konstrukce strukturních genů podporují produkci růstových hormonů (vědomosti o regulaci růstu apod. jsou stále nejasné), - regulace exprese přenesených genů (nenapodobuje účinek růstových hormonů), - studia - genová regulace fyziologických procesů (není zcela jasná, proto je těžké vybrat gen/geny VJH k přenosu), - které geny použít a jak je regulovat pro požadovaný efekt, - využití GMO ve šlechtění (vývoj GMO vyžaduje dlouhodobé testy, jejichž časové období vyrovnává nadřazenost nad ΔG získaným normálně v nukleech. Tato nadřazenost však rychle mizí s aplikací užitkového křížení, což možno minimalizovat užitím zpětného křížení GMO v nukleech), - možné kombinace transgeneze s klonováním embryí (stačí jedinec pro získání klonů a následné prověření modifikovaných klonů dle poptávky trhu). 4. Využití biotechnologií Z hlediska biotechnologií se pro UCH prasat v budoucnu nejvíce z moderních technik jeví separace spermií, klonování embryí a mapování genomu. Tyto metody efektivně rozšiřují ΔG v UCH, přičemž při - klonování embryí zvyšuji nadřazenost zvířat určených ke křížení, - separaci spermií nevznikají vedlejší produkty. Obě technologie ovlivňují efektivitu selekčních programů zvláště při aplikaci MAS. Pokud jde o transfer embryí, ten bez klonování přináší efekt pouze v nukleech, nikoliv v komerční sféře, pročež tato technologie je v Evropě otázkou daleké budoucnosti. K sexování nutno uvést, že pro aplikaci této metody nutno pochopit důkladněji základy časného růstu a rozvoje spermie/embrya a lepší pochopení exprese genů v tomto období. Výzkum klonování embryí se vždy rovněž bude týkat buněčných interakcí, funkcí jader a mitochondriálních genů a jejich možnými interakcemi. Při mapování genomu prasat nutno objevit funkce jednotlivých genů, jejich asociaci s variabilitou kvantitativních znaků. Je zřejmé, že mnoho mezimarkerových/znakových vazeb je/bude predikováno/detekováno na podkladě empirických vazeb, jejich biologická podstata však zůstane většinou nejasná (mnohé genetické markery se používají v selekčních programech bez znalostí jejich biologických funkcí). Rovněž je otázkou, zda lokace funkčních genů a jejich vazba s užitkovými znaky podléhá změnám. Pro klonování/sexování zůstávají tedy otázky dořešení - rozvoje nových biotechnologických technik (kultivace/implantace) při současných znalostech, - optimalizace technik, - a určení hlavních limit problému aplikace technik (interakce), - pochopení funkčnosti organismu z genetického hlediska (růst, reprodukce, imunita, hormony a jejich interakce). 5. Souhrn Rozvoj a aplikace nových technologií (separace spermií, embryotransfer, klonování embryí, identifikace QTL genovými markery, transgeneze) ve šlechtění prasat je slibné. Programy kombinující fyziologické procesy s vazbami markerů/genů s kvantitativními znaky mohou poskytnout nutná pochopení celkové funkčnosti organismu. Z ekonomického hlediska se v chovech prasat vyplatí - separace spermií (redukce ceny produkce žádoucího pohlaví), - klonování embryí (redukce ceny k zmnožení specializovaných otcovských/mateřských genotypů + zrychlení šíření ΔG včetně efektivnější prevence onemocnění), - mapování genomu včetně určení QTL vazeb s kvantitativními znaky (urychlení genetické změny pomocí selekce sourozenců a zvířat v nízkém věku podpora intogrese z jiných populací). Tyto metody však nebudou hlavní, budou doplňovat technologie používané v současnosti.