Bioremediace ftalátů, endogenních disruptorů

Bioremediace ftalátů, endogenních disruptorů Ondřej Šnajdar, Jitka Dostálková, Jiří Mikeš, Miroslav Minařík EPS, s.r.o., V Pastouškách 205, 686 04 Kunovice e-mail: eps@epssro.cz ABSTRAKT Látky nazývané endokrinní disruptory sdružují různé chemické látky, přírodní i syntetické hormony, součásti rostlin, pesticidy, látky používané při výrobě plastických hmot, další průmyslově využívané látky a odpady. Některé z nich jsou velmi perzistentní, jiné se naopak rozkládají rychle a mohou proto působit jen po omezenou dobu, zato ale v kritickém období vývoje. Tyto kontaminanty interagují s endokrinním systémem a mohou vyvolat různé nepříznivé biologické interakce, zejména s hormony. Mezi tyto polutanty se řadí i ftaláty (estery kyseliny ftalové). Pro své výjimečné vlastnosti jsou v mnoha odvětvích nepostradatelné a mnohdy i nenahraditelné, ale i přesto si musíme být stále vědomi zátěže, kterou představují nejen pro životní prostředí. V této souvislosti se naše společnost zabývala možností bioremediace kontaminovaných matric a jejím výsledkem je technologie EPSftaláty, která je použitelná k dekontaminaci zemin, vod v provedení in situ i ex situ. Technologie spočívá v přípravě inokula a aplikaci alochtonních mikroorganismů degradujících kontaminant. Tato technologie byla úspěšně aplikována na reálné lokalitě na území České republiky při bioremediaci saturované zóny, kde dominantním polutantem byl bis-(2-diethylhexyl)ftalát. 1 ÚVOD Ftaláty jsou alifatické nebo aromatické estery kyseliny ftalové. Tyto látky jsou pro své neocenitelné vlastnosti v mnoha odvětvích nepostradatelné a jsou v současnosti vyráběny v poměrně velkých množstvích. Ftaláty jsou v dnešní době používány především jako plastifikátory při produkci PVC (Feng a kol. 2004). V poslední době jsou tyto látky také předmětem intenzivního studia a to hlavně ve smyslu jejich bioremediace v různých typech prostředí za odlišných geochemických podmínek (Liang a kol. 2008). Právě bioremediace pomocí mikroorganismů hraje při odstraňování ftalátů z životního prostředí hlavní roli. Obecné principy bioremediace ftalátů lze popsat takto: s rostoucí délkou postranního řetězce dochází ke snížení biodegradability (Xia a kol. 2004), anaerobní degradace ftalátů je několikanásobně pomalejší než aerobní degradace (Staples a kol. 1997), primární biologický rozklad ftalátů se řídí kinetikou prvního řádu (Gavala a kol. 2003), vysoká koncentrace ftalátů nebo jejich metabolitů inhibují jejich vlastní biodegradaci (Liang a kol. 2008). Mikroorganismy, u nichž byla prokázána schopnost degradace ftalátů, patří např. Sphingomonas (α-proteobacteria), Comamonas (β-proteobacteria), Pseudomonas (γ- Proteobacteria), Arthrobacter a Rhodococcus sp. Nicméně ve velké většině případů jsou

estery kyseliny ftalové degradovány smíšenými mikrobiálními populacemi, typicky přítomnými v prostředí (Gu a kol. 2005). Tento příspěvek se zabývá vývinem bioremediační technologie (EPS-ftaláty) založené na biodegradaci polutantů ze skupiny endogenních disruptorů, konkrétně ftalátů pomocí bakteriálního kmene Rhodococcus erythropolis. Na reálné lokalitě na území České republiky byl realizován in situ pilotní test za účelem ověření účinnosti této technologie. Prioritním kontaminantem byl DEHP (di-ethylhexyl-phthalate) v podzemní vodě dosahující koncentrace jednotek mg/l. 2 METODIKA 2.1 Vývoj bioremediační technologie 2.1.1 Screening vhodných kmenů V průběhu vývoje technologie proběhl screening kmenů z vlastní laboratorní sbírky mikroorganismů. Dále byla provedena izolace autochtonních kmenů nacházejících se přímo na kontaminované lokalitě. Cílem těchto snah bylo sestavení takového bioaugmentačního mikrobiálního konsorcia, které by bylo schopno úspěšné technologické aplikace in situ či ex situ. Jednotlivé kmeny byly kultivovány za použití různých růstových médií a zdrojů uhlíku a energie. Kmeny byly testovány jak jednotlivě, tak ve směsích o 2 5 taxonech. Pro další laboratorní testy byly vybrány zástupci aerobních mikroorganismů schválených pro použití ve volném prostředí, jimiž disponuje společnost EPS, s.r.o. a v jejímž rámci byla tato metoda biologického rozkladu vyvinuta a legislativně ošetřena. Pro kultivace těchto kmenů byly použity dodané vzorky vody z reálné lokality kontaminované di-butylftalátem a di-noktylftalátem. Tyto látky mohou být využity degradující mikroflórou jako jediný zdroje uhlíku a energie v koncentracích přirozeně se vyskytujících v dodaných vzorcích. 2.1.2 Testování vlastních bioremediačních variant V rámci projektu byla provedena série testů dle stanovených kritérií. Testy proběhly v následujícím uspořádání: 1. Slepý pokus 2. Biostimulace 3. Bioaugmentace 4. Biostimulace + Bioaugmentace 5. Bioaugmentace + přídavek PAL (Reoclean 0,1 ml/l) 6. Biostimulace + Bioaugmentace + přídavek PAL (Reoclean) V rámci testování byl u vzorků zemin sledován počet heterotrofních a degradujících mikroorganismů a byla sledována respirační aktivita vzorků.

Počet heterotrofních mikroorganismů Na specifickou kultivační půdu (PCA) byl rozetřen určený objem zkušebního vzorku nebo výchozí suspenze. Stupeň ředění je třeba volit tak, aby výsledný počet kolonií na jedné plotně byl 15 až 300. Naočkované plotny byly inkubovány aerobně při 20 25 C po dobu 48 hodin. Z počtu kolonií získaných na vybraných plotnách byl stanoven počet mikroorganismů v mililitru vzorku. Počet degradujících mikroorganismů Na specifickou kultivační půdu byl rozetřen určený objem zkušebního vzorku nebo výchozí suspenze. Pro stanovení degradujících mikroorganismů byl použit agar M-63 obsahující vybraný uhlíkatý zdroj (např. DMP, DEP), který sloužil jako jediný zdroj uhlíku a energie pro růst sledovaných mikroorganismů. Stupeň ředění byl zvolen tak, aby výsledný počet kolonií na jedné plotně byl 15 až 300. Naočkované plotny byly inkubovány aerobně při 20 25 C po dobu 8 10 dnů. Z počtu kolonií získaných na vybraných plotnách byl stanoven počet mikroorganismů v mililitru vzorku. Respirační aktivita Sterilní láhve Duran o objemu 1 litr byly asepticky naplněny vzorkem kontaminované podzemní vody do desetiny svého objemu. Poté byla vložena sterilní zkumavka s 20 ml 1 M roztoku hydroxidu sodného a láhev byla vzduchotěsně uzavřena. Experiment probíhal po dobu 42 dní, během nichž byl do roztoku hydroxidu sodného jímán metabolickou aktivitou uvolněný oxid uhličitý. Vyhodnocení testu spočívalo v titračním stanovení zachyceného oxidu uhličitého přepočteného na upravený studovaný vzorek za daný časový interval. V suspenzi byl poté kultivačním vyšetřením na agarových plotnách stanoven počet heterotrofních a degradujících mikroorganismů a byly zjištěny aktuální koncentrace ftalátů. 2.2 Pilotní ověření technologie Technologie EPS-ftaláty využívá nejen dominantní bakteriální kmen Rhodococcus erythropolis, ale také synergické kombinace sanačních metod zahrnující sanační čerpání, promývání, air sparging a podporovanou bioremediaci během níž jsou do horninového prostředí injektovány roztoky základních nutrientů (N a P). V nesaturované zóně byla sledována koncentrace respiračních plynů CO 2 a O 2 na třech respiračních sondách (průměr ½, hloubka 1,7 m, perforace 1,6 1,7 m, přístrojem Anagas CD98 do ustálení hodnot). Dvě sondy byly umístěny v bioremediačním poli, jedna sonda byla umístěna mimo sanovanou oblast k monitoringu pozadí. Vzhledem ke specifičnosti a nedostatku primárního kontaminantu bylo nutné vytvořit modifikovanou metodiku přípravy a monitoringu kvality připravovaného inokula. Tyto kroky byly provedeny v laboratořích EPS. Jejich cílem bylo nalézt náhradní C-zdroj pro přípravu inokula v laboratorním a technickém stupni a vytvořit modifikovanou metodiku stanovení počtu degradujících mikroorganismů.

3 VÝSLEDKY A DISKUZE 3.1 Vývoj bioremediační technologie 3.1.1 Screening vhodných kmenů V první fázi experimentů byla sledována reprodukční aktivita autochtonní a alochtonní mikroflóry. Cílem počátečního screeningu byl výběr vhodných mikrobiálních kmenů. Na základě výsledků testů a také v závislosti na kvalitě sanovaného kontaminantu byl vybrán konkrétní bakteriální kmen Rhodococcus erythropolis, který vykazoval schopnost využívat ftalát jako jediný zdroj uhlíku. Tento kmen byl nejprve testován na jednoduchém typu ftalátu DEP (diethylftalát). Následně byl proveden laboratorní test biodegradability ftalátů s delším uhlovodíkovým řetězcem DEHP a DBP. 0,45 0,40 0,35 DEP DMP OD 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 FtV1 FtV2 FtV3 F1 F2 F3 Variovorax paradoxus Ps.fluorescens 2115 Comamonas acidovorans Ps. fluorescens M71 Ps. fluorescens OLAG1 Ps. putida OASP3 Ps. veronii OS21 Ps. veronii BIL1 Acinetobacter sp.144 Ps. stutzeri AOX1 R.erythropolis CCM 8596 Saccharomyces cerevisiae Fusarium proliferatum Rhodotorula mucilaginosa Pseudomonas sp. 1K Ft 1 Ft 2 Ft 3 Ft 4 Ft 5 Ft 6 Ft 7 Obr. 1: Růstová aktivita vybraných kmenů (vyjádřená jako rozdíl mezi maximální naměřenou a počáteční optickou densitou populace) v přítomnosti DEP a DMP jako jediného zdroje uhlíku a energie.

3.1.2 Testování vlastních bioremediačních variant Výsledky laboratorních experimentů jsou přehledně uvedeny v následujících dvou tabulkách. Z tabulky 1 je zřejmé, že mikrobiální osídlení se pohybuje po celou dobu testů mezi řády 10 2 až 10 3 a příliš se nemění, což je u kontaminace typu ftaláty, které se vyskytují ve formě biodustupné pro mikroorganismy pouze v nízkých koncentracích, zcela normální. Tabulka 1: Respirační testy a počty mikroorganismů (stanovené jako množství heterotrofních a degradujících mikroorganismů v 1 ml vzorku) na počátku experimentů (0 dní), v polovině běhu experimentu (21 dní) a na jeho konci (42 dní). Exp. uspořádání č. (viz kap. 2.1.2) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 0 dní Heterotrof. CFU/ml 2,6x10 3 2,6x10 3 4,5x10 3 4,5x10 3 4,5x10 3 4,5x10 3 Degradující CFU/ml 1,8x10 2 1,8x10 2 3,0x10 2 3,0x10 2 3,0x10 2 3,0x10 2 Respirace (mg CO 2 / l 24 hod.) 86 - - - - - 21 dní Heterotrof. CFU/ml 1,1x10 3 2,1x10 3 7,8x10 2 6,4x10 3 8,1x10 3 1,2x10 3 Degradující CFU/ml 1,0x10 3 2,0x10 3 1,1x10 2 2,8x10 2 2,6x10 2 6,2x10 2 Respirace (mg CO 2 / 81 102 120 110 134 149 l 24 hod.) 42 dní Heterotrof. CFU/ml 1,0x10 3 1,1x10 3 8,4x10 3 4,2x10 2 6,7x10 2 8,1x10 3 Degradující CFU/ml 1,2x10 2 1,2x10 3 1,2x10 2 1,7x10 2 7,1x10 2 1,9x10 2 Respirace (mg CO 2 / l 24 hod.) 80 109 126 119 156 162 Respirační testy, které jsou odrazem biodegradační aktivity mikroorganismů, se pohybují mezi 80 162 mg CO 2 /l 24 hod. Počáteční hodnota respirace v čase 0 byla stanovena u dodaného vzorku vody na 86 mg CO 2 /l 24 hod. Tentýž vzorek bez jakýchkoliv úprav vykazoval po 3, resp. 6 týdnech kultivace za laboratorních podmínek pouze mírný pokles respirační aktivity. Vzorky u kterých byla provedena biostimulace vykázaly zvýšení respirace o cca 25 %. Bioaugmentace zajistila zvýšení respirace o 50 %, obdobného výsledku bylo dosaženo při kombinaci biostimulace s bioaugmentací. Pozitivně byla ovlivněna respirační aktivita také přídavkem povrchově aktivní látky a vůbec nejlepší výsledek byl získán při kombinaci biostimulace, bioaugmentace a působení PAL, kdy se hodnota respirační aktivity zvýšila dvojnásobně. Tyto výsledky zcela jednoznačně potvrzují fakt, že aktivním bioremediačním zásahem lze dosáhnout mnohem lepších výsledků biodegradace. Tyto závěry potvrzují i výsledky analytického stanovení uvedeného v tabulce 2. Z uvedených dat je zřejmé, že biodegradace ftalátů prokazatelně probíhá. Zvýšené množství din-buthylftalátu po 21 dnech je toho důkazem. Di-n-buthylftalát je totiž metabolickým meziproduktem druhého z testovaných ftalátů di-n-oktylftalátu a jeho přechodné zvýšení je tedy očekávatelným jevem. Po 6 týdnech je již tato látka prakticky odbourána.

Tabulka 2: Analytické stanovení ftalátů na počátku experimentů (0 dní), v polovině běhu experimentu (21 dní) a na jeho konci (42 dní). Exp. uspořádání č. (viz kap. 2.1.2) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 0 dní Di-n-buthylftalát (µg/l) 9,3 9,3 9,3 9,3 9,3 9,3 Di-n-oktylftalát (µg/l) 1500 1500 1500 1500 1500 1500 21 dní Di-n-buthylftalát (µg/l) 10,5 12,2 13,5 10,6 4,7 5,2 Di-n-oktylftalát (µg/l) <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 42 dní Di-n-buthylftalát (µg/l) < 2 < 2 < 2 < 2 < 2 < 2 Di-n-oktylftalát (µg/l) 832 16,1 59,8 30,9 16,8 18,5 U di-n-oktylftalátu je situace komplikovanější, neboť stanovení pravděpodobně dalo po 21 dnech falešně pozitivní výsledek o 100% degradaci této látky. Ze stanovení po 6 týdnech od počátku experimentu však vyplývá, že u neošetřeného vzorku vody bylo zdegradováno pouze necelých 50% původního množství di-n-oktylftalátu. U ostatních testovaných variant došlo k odbourání cca 96 až 99 % této látky. Tyto finální výsledky velmi dobře korespondují s metabolickou aktivitou zjištěnou pomocí respiračních testů. 3.2 Pilotní ověření technologie Náhradní C-zdroj příprava inokula Jako C-zdroj byl při přípravě inokula v laboratorních i terénních podmínkách používán ftalát přítomný v podzemní vodě z lokality. Jako doplněk byla do reaktorů přidávána sacharosa a PAL - přípravek REO 801. Vhodnost směsi byla ověřena kontrolou koncentrace HMO, DMO a kontrolou mikrobiologického složení společenstva. Bakterie Rhodococcus erythropolis tvořila 60% přítomných mikroorganismů. Na obrázku č. 2 je vidět průběh optické density (DO) a koncentrace DMO ve čtyřech laboratorních vzorcích inokula v čase t. Ve srovnání s maximem DO se vrchol koncentrace DMO opožďuje cca o 70 hodin. Z výsledků je patrné, že po aplikaci sacharozy a nutrientů dochází nejprve k očekávanému rozvoji populace HMO, zatímco u DMO k tomu dochází až s časovým odstupem cca 2-3 dnů. Dále byl na inokulu B1 proveden test s cílem pozorovat vliv rozdílného dávkování nutrientů a C-zdroje na rozvoj populace HMO. Při porovnání výsledků pro jednorázové a pro postupné dávkování směsi do inokula vyšlo nejlépe kontinuální dávkování, kdy v inokulu nastával plynulý nárůst koncentrace HMO viz obr. č. 3. Náhradní C- zdroj metodika stanovení DMO Při absenci C-zdroje (DEHP) pro mikrobiologické stanovení DMO ve vzorku byl tento druh analýz prováděn na miskách s půdami vyvařenými ze sterilní kontaminované vody z lokality (koncentrace DEHP 4890 µg/l, koncentrace DEHP je stabilní při procesu sterilizace). Na daném druhu media docházelo k nárůstům mikroorganismů inokula Rhodococcus

erythropolis. Další zkoušené náhrady C-zdroje - jednodušší ftaláty (DEP) nedosahovaly požadovaných výsledků. Obr. 2: Průběh DO a koncentrace DMO v inokulu Obr. 3: Průběh koncentrace HMO v inokulu při testu způsobu dávkování nutrietů a C-zdroje

4 ZÁVĚR V průběhu vývoje a ověřování technologie proběhl screening kmenů z vlastní laboratorní sbírky mikroorganismů a izolace alochtonních kmenů nacházejících se přímo na kontaminované lokalitě. Na základě výsledků testů a také v závislosti na kvalitě sanovaného kontaminantu byl vybrán konkrétní bakteriální kmen Rhodococcus erythropolis, který vykazoval schopnost využívat ftalát jako jediný zdroj uhlíku. V druhé části experimentů bylo provedeno testování vlastních bioremediačních variant. Optimální je použití bioaugmentace a přídavku PAL (uspořádání č. 5) a bioaugmentace + biostimulace s přídavkem PAL (uspořádání č. 6). Zde je možné vysledovat jak nejvyšší respirační aktivitu, tak i rychlý postup biodegradace významný pokles koncentrace je zaznamenán u obou typů testovaných ftalátů. Počet mikroorganismů zůstával v průběhu pokusu prakticky neměnný (počet heterotrofních a degradujících, kultivovatelných mikroorganismů hodnocený jako počet kolonie tvořících jednotek, CFU - se pohybuje v rozmezí jednoho řádu), z čehož vyplývají i prakticky nedetekovatelné změny v měřené optické densitě vzorků V rámci pilotního testu bioremediační technologie EPS-ftaláty na reálné lokalitě bylo řešeno široké spektrum dílčích laboratorních i terénních úkonů, které vedly k ověření funkčnosti a účinnosti bioremediační technologie. V rámci prací byla vytvořena metodika přípravy a monitoringu inokula. V rámci realizovaných prací byla ověřena schopnost kmene Rhodococcus erythropolis rozkládat DEHP. V průběhu bioremediace byly v prostředí navozeny vhodné podmínky pro průběh aktivní bioremediace (dodávka terminálního akceptoru elektronů kyslík, dodávka nutrientů a aplikace alochtonních mikroorganismů Rhodococcus erythropolis). Tyto práce vedly k výraznému rozvoji mikrobiologické populace v sanovaném prostoru, jak bylo potvrzeno několika nepřímými parametry bioremediace nárůstem koncentrace HMO, DMO a respiračními testy. 5 LITERATURA (1) FENG, Z., CUI, K.Y., LI, X.D., FU, J.A., SHENG, G.Y. (2004) Biodegradation kinetics of phthalate esters by Pseudomonas fluoresences FS1. Process Biochem 39:1125 1129 (2) GAVALA, H.N., ALATRISTE-MONDRAGON, F., IRANPOUR, R., AHRING, B.K. (2003) Biodegradation of phthalate esters during the mesophilic anaerobic digestion of sludge. Chemosphere 52:673 682 (3) GU, J.D., LI, J., WANG, Y. (2005) Biochemical pathway and degradation of phthalate ester isomers by bacteria.water Sci Technol 52:241 248 (4) LIANG, D. W., ZHANG, T., FANG H. P., HE J. (2008) Phthalates biodegradation in the environment Appl Microbiol Biotechnol (2008) 80:183 198 DOI 10.1007/s00253-008- 1548-5

(5) STAPLES CA, PETERSON DR, PARKERTON TF, ADAMS WJ (1997) The environmental fate of phthalate esters: a literature review. Chemosphere 35:667 749 (6) XIA F, ZHENG PZQ, FENG X (2004) Relationship between quantitative structure and biodegradability for phthalic acid ester compounds. J Zhejiang Univ (Agri Life Sci) 30:141 146