PŘÍPRAVA BIOAKTIVNÍCH POVLAKŮ METODOU SOL-GEL A MĚŘENÍ VYBRANÝCH VLASTNOSTÍ Návody pro laboratorní práce oboru: Biomateriály pro medicínské využití Vedoucí práce: Ing. Diana Horkavcová PhD., místnost: A07b, tel.: 4175 TEORETICKÝ ÚVOD 1. Biomateriály v medicíně Biomateriály se v medicíně využívají za účelem zlepšení kvality a délky života. Biomateriál je definovaný jako substrát anebo kombinace substrátů používaných pro implantaci nebo zabudování do živého systému na účelem doplnění nebo nahrazení funkce živých tkání nebo orgánů. Úspěšnost biomateriálů nebo implantátů je vysoce závislá na třech hlavních faktorech: vlastnosti a biokompatibilita implantátu, zdravotní stav příjemce a způsobilosti operatéra, který provedl implantaci. Rozdělení biomateriálů podle použitého materiálu: a) polymery: nylon, silikon, polyester b) kovy: titan a jeho slitiny, Co-Cr slitiny, zlato, antikorozní ocel c) keramika: hlinitanová a zirkoničitá keramika, hydroxyapatit d) kompozity: uhlík-uhlík, dráty nebo vlákny zesílené kostní cementy Rozdělení biomateriálů podle interakce v živém organizmu: a) inertní: mechanická vazba s tkanivem: kovy, Al 2 O 3 a ZrO 2 keramika b) bioaktivní: chemická vazba s tkanivem: hydroxyapatit, sklo, sklo-keramika c) resorbovatelné: rozpustný v organizmu: β-tcp Požadavky pro materiály implantované do zátěžových míst: a) biokompatibilita: materiál musí být netoxický, nekarcinogenní, nealergický b) odolnost: materiál nesmí podléhat degradaci, deformaci a musí odolávat tělním tekutinám c) funkční schopnost: materiál musí plnit mechanickou funkci tkaniva, které nahrazuje
2. Tvorba bioaktivních povlaků metodou sol-gel technikou dip-coating. Kombinací kovového, keramického příp. skleněného substrátu s bioaktivním povlakem, se využijí výhody obou komponentů. Nejpoužívanější metody tvorby aktivních povlaků jsou plazmové, plamenové, laserové, magnetronové, elektroforézní a elektrolytické nanášení a sol-gel povlakování. Každá z metod má své výhody a nevýhody. Pomocí metody sol-gel, technikami ponořením (dip-coating), rotací (spin-coating) nebo sprejováním (spray-coating) je možné připravit velmi tenké vrstvy. Princip metody spočívá v připravení požadovaného solu, který se pomocí jednotlivých technik nanese na substrát, vysuší a vypálí. Prekurzory pro přípravu solů jsou většinou alkoxidy kovů nebo polokovů, na kterých jsou navázány různé ligandy. Nejčastější látkou pro přípravu křemičitých solů je tetraethoxysilan (TEOS, Si-(O-CH 2 CH 3 ) 4 ) a pro titaničité soly tetra-nbutylorthotitanát (TiBu, Ti-(O-CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 ) 4 ). Alkoxidy jsou smíchány s organickým rozpouštědlem (nejčastěji etanolem), vodou a dalšími látkami, které vhodně modifikují výsledné vlastnosti (bioaktivitu, antibakteriální účinek, barvu, chemickou odolnost). Nejdůležitějšími typy reakcí, které proběhnou v průběhu přeměny roztoku na sol a gel jsou hydrolýza alkoxidů (1), kondenzace alkoholů (2) a vody (3): M(OR) 4 + H 2 O M(OR) 3 OH + ROH (1) (OR) 3 M - OR + HO - M(OR) 3 (OR) 3 M - O - M(OR) 3 + ROH (2) (OR) 3 M - OH + HO - M(OR) 3 (OR) 3 M - O - M(OR) 3 + H 2 O (3) Nejčastěji používanou sol-gel technikou je dip-coating, při které je substrát konstantní rychlostí ponořen do solu, kde dochází k vytvoření vazeb mezi substrátem a molekulami solu. Po krátké prodlevě následuje vytahování substrátu ze solu, kde vrstva přichází do kontaktu se vzduchem, a odpařují se přebytečná rozpouštědla. Obrázek 1: Tvorba povlaků metodou sol-gel technikou dip-coating
3. Měření adheze povlaků testem lepicí pásky Důležitou vlastností připravených bioaktivních vrstev je jejich adheze k substrátu. Adheze je přilnavost způsobená adhezními silami mezi molekulami povrchových vrstev dotýkajících se ploch. Základním znakem většiny běžně používaných metod pro stanovení přilnavosti je, že se jimi nestanoví číselná hodnota, ale určí povlaky s přilnavostí vyhovující anebo nevyhovující pro konkrétní účely. Nejčastěji používané metody měření adheze: a) vrypová zkouška (scratch test) b) zkouška tahem (pull test) c) test lepicí páskou (tape test) Princip měření adheze lepicí páskou (technika B) spočívá ve vytvoření série vrypů do povlaku řezákem ve tvaru mřížka, nalepení lepicí pásky na oblast vrypů, zatížení a následném odlepení pásky pod uhlem 180 (2a). Adheze se hodnotí vizuálně, porovnáním s klasifikační stupnicí (2b). lepicí páska povlak substrát Klasifikace 5B 4B 3B 2B 1B 0B Odloupnutá nad 0 5 5-15 15-35 35-65 plocha (%) 65 Povrch mřížky Obrázek 2: Odtržení lepicí pásky a klasifikační stupnice testu lepicí páskou 4. Měření antibakteriálního účinku povlaků vůči Escherichia coli Pro testování antibakteriálního účinku se využívá řada mikroorganizmů, hlavně gramnegativní Escherichia coli (E. coli) a gram-pozitivní Staphylococcus aureus (S. aureus). Potažený substrát je v interakci s fyziologickým roztokem s přesně danou koncentrací bakterií a po stanovené době se vizuálně (na Petriho misce s agarem) nebo spektrofotometricky (zakalení suspenze) vyhodnocuje množství přeživších kolonií bakterií.
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST: 1. Příprava solu: Roztok I: do plastové nádoby se za stálého míchání pipetuje 10 ml TEOSu (plastovou pipetou), 30 ml etanolu, 2 ml destilované vody a 2 ml 1mol.l -1 kyseliny dusičné (HNO 3 ). Roztok II: v plastové kádince se rozpustí 1g dusičnanu stříbrného (AgNO 3 ) ve 3 ml destilované vody. Roztok II se přelije do roztoku I a nechá se 30 min. míchat při laboratorní teplotě. 2. Úprava substrátů: Čtyři mikroskopická podložní skla se umyjí detergentem z obou stran a opláchnou se tekoucí vodou, destilovanou vodou, etanolem a nechají se sušit v sušárně při teplotě 60 C po dobu 15 min. 3. Nanášení solu: Před potahováním se do solu přidá 6g Monetitu (CaHPO 4 ). Pomocí potahovacího zařízení se za stálého míchání substrát ponoří do solu o rychlosti 20 cm/min., nechá se v solu po dobu 30s a rychlostí 6 cm/min. se vytáhne ven. 4. Sušení a výpal potažených substrátů: Sušení potažených substrátů probíhá při teplotě 60 C po dobu 30 min. a výpal při teplotě 500 C po dobu 1 hod. 5. Měření antibakteriálního účinku povlaků vůči E. coli: Do sterilní zkumavky se na začátku pipetuje 4 ml fyziologického roztoku (NaCl = 9 g/l) a 1ml roztoku s E. coli. Po zamíchání se zakalení suspenze měří na denzitometru a výslední objem suspenze se upraví buď fyziologickým roztokem, nebo roztokem s E. coli tak, aby hodnota na přístroji byla 1 McFarland (koncentrace přibližně 10 8 cell/ml). Jednotkovým ředěním se připraví dvě testovací suspenze s koncentrací 10 4 cell/ml do kterých se samostatně ponoří dva potažené substráty. Doba interakce bude u jednoho 30 min. a u druhého 1 hodina, při laboratorní teplotě. Po ukončení expozice se potažené substráty zlikvidují a 100µl z každé suspenze, plus referenční (srovnávací suspenze která nebyla v kontaktu se substrátem), se rozetře do Petriho misek s agarem a nechají se inkubovat v biologickém termostatu při teplotě
36.5 C. Po ukončení inkubace se misky nafotí a spočítá se množství přeživších kolonií bakterií. 6. Měření adheze povlaků: Do třetího potaženého substrátu se udělají řezákem vrypy tvaru mřížka (6 x 6). Na oblast vrypů se nalepí lepicí páska Permacell 99. Po krátkém zatížení (60s) se páska odtrhne a oblast vrypů se vyhodnotí vizuálně pomocí optického mikroskopu a porovná se s klasifikační stupnicí. Čtvrtý neporušený potažený substrát se vyhodnotí optickou mikroskopií jako referenční vzorek. ZÁVĚR Cílem práce je příprava křemičitých sol-gel vrstev s obsahem fosforečnanu vápenatého a stříbra technikou dip-coating na skleněných substrátech a měření jejich adheze testem lepicí pásky a antibakteriálního účinku vůči E. coli. LITERATURA: 1. Park Joon, Lakes S. Roderic: Biomaterials: An introduction, Vydáno: New York: Springer, 2007 2. Bhat V. Sujata: Biomaterials, Vydáno: Pangbourne: Alpha SC. Int., 2002 3. Ratner D. Buddy: Biomaterials science: An introduction to materials in medicine, Vydáno: Amsterdam: Elsevier, 2004 4. Shackelford F. James: Bioceramics, Edice: Advanced Ceramics, Volume 1, Vydáno: Amsterdam: Gordon and Beach, 1999 5. Brinker C. Jeffrey, Scherer W. George: Sol-gel science: The physics and chemistry of sol-gel processing, Vydáno: Boston: Academic press, 1990 6. ASTM D 3359-02: Standard test methods for measuring adhesion by tape test 7. Raffi M., Hussain F., Bhatti T.M., Akhter J., Hameed A., Hasan M.M.: J. Mater Sci Tech 24, 192 (2008) 8. Chaloupka K., Malam Y., Seifalian A.M.: Trends in Biotech 28, 580 (2010) 9. Buckley J.J., Lee A.F., Olivi L., Wilson K.: J. Mater Chem 20, 8056 (2010) 10. Bi Y., Ouyang S., Umezawa N., Cao J., Ye J.: J. Am Chem Soc 133, 6490 (2011)