Přístrojové metody používané při rozborech mléka, jejich specifika a přesnost výsledků měření David Ledvina, Bentley Czech Větrný Jeníkov 20.3.2012
Metody pro rozbor mléka Metoda IR fotometrie Turbidimetrie Kolorimetrie FIA metoda Kryoskopie Luminometrie RIA metody Denzitometrie Cytometrie Impedance Přímé počítání Stanovení (angl.) F, P, L, TS, SnF, U, C, FFA F U U FPD MRL, HACCP MRL MRL SCC, IBC TBC TBC index (č.)
Referenční metody pro mléčné složky tuk Röse Gottlieb (Gerber) bílkovina Kjeldahl laktóza HPLC, polarimetrie sušina gravimetrie močovina kolorimetrie bod mrznutí kryoskopie T, B, L, S, M, BM
Chování záření ve vzorku (reflexe) (absorpce) (transmise) odraz pohlcení prostup dopad vzorek T, B, L, S, M
Fyzikální princip fotometrie Absorpce záření odpovídá rotačním a vibračním stavům molekul Lambertův-Beerův zákon A = log (Φ d /Φ v ) = a. l. c kde A absorbance Φ d dopadající svět. tok Φ v a l c vystupující svět. tok absorpční koeficient tlouštka vrstvy koncentrace T, B, L, S, M
Filtrová IR fotometrie zrcadlo vzorek zrcadlo zdroj filtry detektor kyveta konduktometr T, B, L, S, M, BM
Fourierova IR fotometrie IR zdroj 5 2 zrcadla: 1 4 pevná 5 polopropustné 6 pohyblivé 6 vzorek 4 1 detektor 3 T, B, L, S, M, BM, VMK
T, B, L, S, M, BM, VMK
T, B, L, S, M, BM, VMK
Kolorimetrie & FIA Přesné stanovení močoviny kombinace enzymatické metody, FIA a kolorimetrie 1. močovina rozštěpena ureázou na čpavek a oxid uhličitý 2. přidáno barvivo a aktivátor 3. kolorimetrické měření na 600 nm (transflektančně) 4. diferenční porovnání původního a vzniklého čpavku M
M
M
Enz. reaktor & impedance Přesné stanovení močoviny kombinace enzymatické metody a měření impedance 1. změna impedance je způsobována hromaděním produktů enzymové hydrolýzy močoviny 2. míra rychlosti změny impedance je přímo úměrná koncentraci močoviny 3. diferenční porovnání impedance trubice s aktivní a inaktivní ureázou M
M
M
Kryoskopie Stanovení bodu mrznutí mléka (= rovnováha mezi pevnou a kapalnou fází) 1895 Beckman (D), 1920 Hortvet (USA) podchlazení na 3 º C za míchání iniciace nárazem (nebo krystalem) odevzdání skupenské energie (= ohřev) měření teploty 3 různými módy (f, p, m) BM
Princip kryoskopie termistor míchadlo Ωmetr zkumavka chlazení čerpadlo rozlišení 0,0001 C BM
BM
Průtoková cytometrie původní použití v humánní medicíně 1991 uvedeno v oboru (Bentley Instruments Inc.) DNA buněk obarveno fluorescenčním barvivem, buňky ozářeny zeleným světlem emitují červené záření spočítáno a vytříděno podle velikosti (PHA pulsně šířková analýza) PSB, CPM
Princip cytometrie stabilní průtok 4 ml/min (laminární proudění) nízkovýkonný laser na pevné fázi detekce fluorescence fotonásobičem PSB, CPM
PSB
PSB
CPM
CPM
Přímé počítání kolonií vyšší rozlišení barevná kamera nastavení filtrů nastavení citlivosti přepočet na spirálu archivace snímků CPM
CPM
Kontrola správnosti měření kalibrace na sadě změřené referenčními hodnotami a následná kontrola sady nulování, kontrola slepým vzorkem kontrola/nastavení oficiálními standardy kontrola pilotními vzorky (i vlastními) kruhový test národní i mezinárodní průběžné srovnávací měření mezi přístroji i mezi jednotlivými laboratořemi vše
Parametry přístrojů rychlost / výkon měřicí rozsah rozlišení citlivost přesnost opakovatelnost reprodukovatelnost chyba z přenosu pracovní faktor vše
Ilustrační příklad kryoskopie rychlost / výkon < 30 vz/h měřicí rozsah 0 až 1,5 ºC rozlišení 0,0001 ºC citlivost n/a přesnost n/a opakovatelnost n/a reprodukovatelnost ± 0,002 ºC chyba z přenosu neměřitelná BM
Ilustrační příklad mléčné složky rychlost / výkon 500 vz/h měřicí rozsah 2 až 15 % rozlišení 0,01 % citlivost 0,01 % přesnost c v < 1 % opakovatelnost c v < 0,5 % reprodukovatelnost n/a chyba z přenosu < 1 % T, B, L, S, M
Ilustrační příklad počítač PSB rychlost / výkon 500 vz/h měřicí rozsah 0 až 10 M rozlišení 1 k citlivost n/a přesnost c v < 10 % (př.m.) opakovatelnost c v < 4 % (< 500k) reprodukovatelnost n/a chyba z přenosu < 1 % PSB
Ilustrační příklad počítač CPM rychlost / výkon < 50 vz/h měřicí rozsah 2 k až 10 M rozlišení 1 k citlivost < 1 k přesnost s y,x < 0,30 log opakovatelnost s r < 0,03 log ( 300k) reprodukovatelnost s R < 0,06 log ( 300k) chyba z přenosu < 1 % CPM
T c c v S y S x S r S R Vysvětlení statistických zkratek chyba z přenosu variační koeficient směrodatná odchylka referenčních hodnot směrodatná odchylka měření směrodatná odchylka opakovatelnosti směrodatná odchylka reprodukovatelnosti S d směrodatná odchylka průměrné chyby predikce S xy kovariance * ρ x,y S y,x koeficient korelace směrodatná reziduální chyba regrese * střední hodnota součinu odchylek veličin X,Y od jejich středních hodnot vše
Nejistoty měření kombinovaná nejistota u c jako výsledek: nejistoty typu A (z var. koeficientů měření) nejistoty typu B (přístroj: z opakovatelnosti, chyby z přenosu; reference: z kalibrace atd.) rozšířená nejistota u roz = 2 * u c (95% měření se nachází uvnitř uvedeného intervalu nejistoty měření) vše