Masarykova univerzita Lékařská fakulta

Masarykova univerzita Lékařská fakulta Aktivační mutace v EGFR genu u pacientů s nemalobuněčným plicním karcinomem - NSCLC a význam jejich stanovení pro cílenou léčbu inhibitory tyrozinkináz. Bakalářská práce Obor - zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Magdalena Uvírová Autor: Pavlína Chodurová Brno, duben 2013

Jméno a příjmení autora: Pavlína Chodurová Název bakalářské práce: Aktivační mutace v EGFR genu u pacientů s nemalobuněčným plicním karcinomem - NSCLC a význam jejich stanovení pro cílenou léčbu inhibitory tyrozinkináz. Pracoviště: Laboratoř molekulární patologie a genetiky, CGB laboratoř a.s. Ostrava, Laboratoř cytogenetiky, CGB laboratoř a.s. Ostrava Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Magdalena Uvírová Rok obhajoby bakalářské práce: 2013 Souhrn: Plicní karcinom je z hlediska mortality celosvětově nejčastějším onkologickým onemocněním. V této práci se zabývám vznikem plicního karcinomu, moţností včasné, přesné diagnostiky a účinné terapie. V současnosti je známo několik genů, jejichţ mutace, a to díky změněné vnímavosti k nově vyvinutým léčivům, ovlivňují progresi nemalobuněčného karcinomu plic (NSCLC). Zaobírám se významem molekulárně genetického a cytogenetického stanovení těchto mutací. Především mutací EGFR genu a fúzního EML 4 ALK genu jakoţto prognostického a prediktivního faktoru cíleného léčebného reţimu. Nádory, nesoucí tyto změny, jsou vnímavé k inhibitorům tyrozinkinázové fosforylace v intracelulární oblasti EGFR, které účinně sniţují proliferaci nádorových buněk, blokují růst tumoru. Tím dochází ke stabilizaci nádoru, zlepšení kvality a délky ţivota. Klíčová slova: karcinom plic, NSCLC, EGFR gen, ALK gen, K ras onkogen Souhlasím, aby tato práce byla půjčována ke studijním účelům a citována dle platných norem.

Prohlašuji, ţe jsem tuto bakalářskou práci vypracovala samostatně pod odborným vedením RNDr. Magdaleny Uvírové. V seznamu pouţité literatury jsou uvedeny všechny literární a elektronické zdroje. V Brně dne 22. dubna 2013 (podpis autora)

Poděkování: Mé upřímné poděkování patří RNDr. Magdaleně Uvírové za odborné vedení, cenné rady, připomínky, ochotu a čas, který mi věnovala při zpracovávání tohoto tématu. Rovněţ děkuji RNDr. Davidu Konvalinkovi z Laboratoře molekulární patologie a genetiky a Mgr. Janě Ţmolíkové z Laboratoře cytogenetiky CGB laboratoře a.s. Ostrava, za odborný a vřelý přístup při absolvování praktické části, za věcné připomínky a poskytnutí dat. V neposlední řadě patří poděkování moji rodině za podporu během studia.

OBSAH: 1 ÚVOD... 10 2 OBECNÁ ČÁST... 11 2.1 ANATOMIE PLIC... 11 2.2 HISTOLOGIE PLIC... 13 2.3 NÁDORY PLIC... 15 2.3.1 Nezhoubný - benigní nádor... 15 2.3.1.1 Chondrohamartom... 15 2.3.2 Zhoubný - maligní nádor... 15 2.3.2.1 Nemalobuňecný karcinom - NSCLC... 16 2.3.2.1.1 Dlaţdicobuněčný karcinom... 16 2.3.2.1.2 Adenokarcinom... 16 2.3.2.1.3 Velkobuňěčný karcinom... 16 2.3.2.2 Malobuněčný (neuroendokrinní) karcinom - SCLC... 17 2.3.2.3 Smíšené nádory... 17 2.3.2.3.1 Smíšené dlaţdicobuněčné karcinomy a adenokarcinomy... 17 2.3.2.3.2 Smíšené dláţdicobuněčné karcinomy a malobuněčné karcinomy... 17 2.4 KARCINOM PLIC... 19 2.4.1 Epidemiologie karcinomu plic... 19 2.4.2 Vznik a vývoj... 19 2.4.1.1 Mutace genu EGFR u NSCLC... 20 2.4.1.2 Fúzní gen EML 4 - ALK u NSCLC... 21 2.4.1.3 Bodová mutace K - ras onkogenu... 22 2.4.1.4 Ostatní mutace u NSCLC... 23 2.4.3 Symptomatologie, šíření karcinomu a metastázy... 24 2.5 DIAGNOSTIKA KARCINOMU PLIC... 26 2.5.1 Histologické vyšetření... 26 2.5.1.1 Materiál a způsoby odběru... 27 2.5.2 Cytologické vyšetření... 28 2.5.2.1 Materiál a způsoby odběru... 28

2.5.2.3 Výhody a nevýhody cytologie... 29 2.5.3 Molekulárně genetická a cytogenetická diagnostika... 29 2.5.3.1 Materiál a způsob odběru... 30 2.5.3.2 Molekulárně genetické vyšetření... 30 2.5.3.3 Cytogenetické vyšetření... 31 2.5.4 Prognóza a prediktivní faktory... 31 2.6 TERAPIE... 32 2.6.1 Chirurgická léčba... 32 2.6.2 Radioterapie... 32 2.6.3 Lokální léčba s vyuţitím laseru... 33 2.6.4 Chemoterapie... 33 2.6.5 Cílená léčba... 34 2.6.5.1 Cílená léčba inhibitory tyrozinkináz... 34 2.6.5.1.1 Gefitinib... 35 2.6.5.1.2 Erlotinib... 35 2.6.5.1.3 Rezistence na EGFR TKI... 36 2.6.5.1.4 Crizotinib... 36 3 SPECIÁLNÍ ČÁST... 37 3.1 RT - PCR metoda... 37 3.1.1 PCR... 37 3.1.2 Real Time PCR... 38 3.1.2.1 Přístroje a pomůcky... 39 3.1.2.2 Materiál a reagencie... 40 3.1.2.3 Příprava činidel... 40 3.1.2.4 Klinický materiál... 40 3.1.2.4.1 Deparafinizace FFPET... 41 3.1.2.4.2 Izolace DNA... 41 3.1.2.4.3 Kvantifikace DNA... 42 3.1.2.4.4 Amplifikace a detekce DNA... 42 3.2 FISH metoda... 47

3.2.1 Přístroje a pomůcky... 48 3.2.2 Materiál a reagencie... 48 3.2.3 Příprava roztoků... 49 3.2.4 Klinický materiál... 50 3.2.4.1 Příprava parafinového řezu... 50 3.2.4.2 Odmytí nenavázané sondy... 51 3.2.4.3 Barvení preparátu... 51 3.2.4.4 Skladování a vyhodnocení preparátu... 51 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... 54 5 STUDIE... 65 5.1 Mutace genu EGFR u pacientů s pokročilým NSCLC... 65 6 DISKUZE... 66 7 ZÁVĚR... 67 8 SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY... 68 9 SEZNAM PŘÍLOH... 72

SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK ALK anaplastic lymphoma kinase AKT 1 onkogen BRAF protoonkogen B - Raf CCD change couplet device, zařízení s vázanými náboji, pro snímání obrazu C MET proto - onkogen CTTNB1 beta catenin gen DAPI 4', 6 diamidino 2 - phenylindole, fluorescenční barvivo DNA deoxyribonukleová kyselina EGFR epidermal growth factor receptor, receptor pro epidermální růstový faktor EML 4 echinoderm microtubule associated protein like 4 EML 4 ALK fúzní gen ERB epidermal growth factor receptor, receptor pro epidermální růstový faktor FFPE formalínem fixované parafinové bločky FISH fluorescence in situ hybridization FRET fluorescence resonance energy transfer, detektor RT - PCR HER 1, 2, 3,4 lidský receptor pro epidermální růstový faktor 1, 2, 3, 4 HCl hydrochloric acid, kyselina chlorovodíková IHC imunohistochemie K ras kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog MEK human mitogen activated protein kinase NRAS proto - onkogen NSCLC nemalobuněčný karcinom plic (non small cell lung cancer) PCR polymerase chain reaction, polymerázová řetězová reakce PIK3CA phosphoinositide 3 - Kinase, catalytic, alpha polypeptide, onkogen p53 tumor protein RT PCR real time polymerase chain reaction, polymerázová řetězová reakce v realném čase SCLC malobuněčný (neuroendokrinní) karcinom (small - cell lung cancor)

TK TKI TNM TPA VATS tyrozin kináza inhibitory tyrozin kináz nodes and metastases classification tkáňový polypeptidový antigen video - assistedthoracicsurgery

1 ÚVOD Karcinom plic před nástupem kouření cigaret nebyl příliš znám. Do roku 1761 nebyl označen ani jako vzácná choroba. Aţ v roce 1810 byly popsány různé aspekty onemocnění. V roce 1912 bylo na celém světě v lékařské literatuře popisováno pouze 374 případu. V současnosti představuje karcinom plic civilizační chorobu s celosvětově vysokou incidencí a nejvyšší mortalitou ze všech zhoubných nádorů. Jde o skupinu velice heterogenních karcinomů. Obecná část práce je věnována anatomickému, histologickému popisu plic, vzniku plicní léze a z molekulárně - genetického hlediska mutacím vybraných genů, především EGFR genu s frekvencí výskytu u kavkazské populace 5 10 %, fúznímu EML 4 ALK genu, který se vyskytuje u 2 7 % pacientů a mutace K ras onkogenu u 15 20 % pacientů s horší prognózou přeţití. Nemalobuněčný karcinomu plic (NSCLC) představuje 70-80 % všech plicních nádorů. Asi u 46 % pacientů s NSCLC se nevyskytuje ţádná somatická mutace. V této práci jsou popsány také různé terapeutické postupy. S vyuţitím molekulárně genetických a cytogenetických vyšetření umoţňujících detekci aktivační mutace EGFR genu a fúzního EML 4 ALK genu. Dochází k selekci pacientů k cílené léčbě inhibitory tyrozinkináz EGFR. Především delece v 19 exonu a bodová mutace v 21 exonu (L858R) v EGFR genu jsou prediktorem dobré odpovědi na léčbu. V CGB laboratoři a.s. Ostrava se podařilo rutinní zavedení těchto vyšetření pro Moravskoslezský kraj. Velice důleţitá je kvalitní mezioborová spolupráce mezi pneumology, patology a molekulárními genetiky. Patolog při stanovení diagnózy NSCLC z histologie či cytologie, neprodleně odesílá reprezentativní vzorek z bioptického materiálu ve formě parafínového bloku, případně označí na skle cytologického preparátu maligní buňky. 10

2 OBECNÁ ČÁST 2.1 ANATOMIE PLIC Plíce (řecky pneumon, latinsky pulmones) jsou s horními a dolními dýchacími cestami součástí dýchací soustavy, která zajišťuje výměnu plynů mezi krví a vnějším prostředím. Plíce jsou houbovitý párový orgán umístěný v pohrudniční dutině. Barva je v dětství růţová, v dospělosti černě - mramorovaná, coţ je způsobeno částečkami prachu. Jsou jemné a pruţné. Hmotnost závisí na náplni vzduchem, stupni prokrvení a na objemu tekutiny v intersticiálním vazivu plic. Průměrná hmotnost u muţe je 780 g a 640 g u ţeny. Jsou obalené tenkou blánou, poplicnicí (pleura pulmonalis), která srůstá s plicním vazivem. Na vnitřní straně hrudníku je pohrudnice (pleura parietalis), která vystýlá hrudní dutinu. Mezi poplicnicí a pohrudnicí je pohrudniční štěrbina, vyplněná serózní tekutinou. Je zde udrţován podtlak. Na kaţdé plíci uvádíme širokou bázi (basis pulmonis), nasedající na bránici, vypouklou plochu ţeberní a mezihrudní. Zde je plicní stopka pro cévy, nervy a průdušky. V přední části na levé plíci je větší zářez pro srdce. Nahoru směřuje plicní hrot (apex pulmonis). Na vnitřní ploše plic jsou otištěny orgány středohrudí, především srdce. (18) (23) (24) Plíce (obr.č.1) dělíme na plicní laloky (lobi pulmonis), pravá, je větší, rozdělena do tří laloků horní, střední a dolní. Hlavní (šikmý) interlobární zářez odděluje dolní lalok od obou zbývajících. Přídatný lalok (lobus accessorius) je zasunutý do prostoru mezi velkými ţílami a srdcem. Má jazýčkovitý tvar (lingula). Levá plíce má dva laloky horní a dolní, oddělené hlavní (šikmou) fissurou. Kaţdý lalok je rozdělen vazivovými přepáţkami, vycházející z poplicnice, na bronchopulmonální segmenty. Tyto jsou dále rozděleny na lalůčky, aciny pyramidového tvaru. (18) (24) Průdušky (bronchy) vstupují do plic v plicním hilu, zde se postupně větví, aţ na nejmenší průdušinky (bronchioly). Na konečné větévky navazují plicní sklípky (alveoli pulmonis), jsou to drobounké tenkostěnné vydutě. V obou plicích se nachází 350 400 milionů alveolů, s dýchací plochou 60 80 m 2. Stěnu alveolů tvoří buňky pneumocyty. (18) (24) Cévní zásobení - po vstupu do laloku se plicní tepénka (arteriola) dělí podélně bronchiálního větvení. Uţší větve přechází do kapilární sítě podél alveolární stěny. 11

Bronchiální tepny vycházejí z interkostálních arterií nebo z aorty a zásobují plicní tkáň. Nedosahují však aţ do laloků. Přivádí okysličenou krev a zásobují bronchiální stěnu, uzliny a intralobulární pojivovou tkáň. Bronchiální ţíly do úrovně velkých bronchů nejsou dobře ohraničeny, ústí do duté ţíly. (18) (23) (24) Mezi plicním a bronchiálním oběhem existují přemostění (anastomózy). Asi 25 % krve z bronchiálních arterií se vrací do pravé síně srdce cestou bronchiálních ţil a 75 % této krve jde ţílami plic do levé síně. (24) Lymfatické cévy odvádí přebytečnou tekutinu, která je filtrována do intersticiálního prostoru (+ 1 mm Hg) a tím brání plícnímu edému. (24) Dýchací svaly představuje soubor kosterních svalů. Nejdůleţitějším je bránice. Odděluje dutinu břišní od hrudní, má kopulovitý tvar, je 3-5 mm tlustá. V průběhu klidného dýchání klesá asi o 1,5 cm, při hlubokém nádechu aţ o 7 13 cm. Inervována je prostřednictvím bráničního nervu. Bránice odvádí 60-80 % práce potřebné k nádechu. Pohyby meziţeberních svalů zvedají ţebra a zvětšují tak objem hrudníku. Šikmé svaly se uplatňují při zvýšené intenzitě dýchání. Nádech (inspirium) je aktivní pohyb, výdech (expirium) pasivní. Kdy dochází k retrakci plic a hrudníku vlastní tíhovou sílou. Neúčastní se ji ţádné svaly. Při klidném dýchání (respiraci) se v plicních sklípcích vymění jedním vdechem a výdechem asi 0,5 litru vzduchu. V klidu se cyklus opakuje 14-18 krát za minutu. Dýchání je řízeno dýchacími centry v prodlouţené míše, je ovládáno vůlí. (18) (24) 1. chrupavka štítná (cartilago thyroidea) 2. chrupavka prstencová (cartilago cricoidea) 3. průdušnice (trachea) 4. jícen (oesophagus) 5. srdečnice (aorta) 6. cévní kmen plicnice (truncus pulmonalis) 7. průdušky (bronchi) 8. horní plicní lalok (lobus superior) 9. dolní plicní lalok (lobus inferior) 10. střední plicní lalok (lobus medius) Obr. č. 1: Anatomie plic (45) 12

2.2 HISTOLOGIE PLIC Kaţdému laloku plic přísluší jedna větev hlavního bronchu, vznikající větvením průdušnice. V oblasti plícního hilu hlavní bronchy vstupují do plic. Hlavní bronchy (I.řádu) se dělí na tři vpravo a na dva lobární bronchy (II.řádu) vlevo. Ty se dále větví na deset vpravo a osm bronchů terciálních (III.řádu) vlevo. Ventilují bronchopulmonální segmenty. Segmenty mají tvar pyramid, vrcholy směřují k plícnímu hilu. Obsahují vlastní bronchiální strom, vlastní krevní oběh a inervaci. Odděleny jsou intersegmentálními vazivovými septy. (8) Terciální bronchy (segmentované) se postupně větví. Nejmenší z nich mají průměr okolo 1 mm - průdušinky (bronchioly). Poslední z nich bronchioly terminální vstupují do plicních lalůčků, větví se na bronchioly respirační. A ty se následně větví v několik alveolárních chodbiček a posléze se větví v alveolární váčky. (8) Alveolární chodbičky, váčky a alveoly přísluší k jednomu respiračnímu bronchiolu. (obr.č.2) Nazýváme je aciny, tvarem připomínají hrozny. Z velkého mnoţství acinů je sloţen kaţdý plicní lalůček (lobulus). (8) (10) Respirační bronchioly mají tvar tenkých trubiček. Stěna je sloţená z vrstvy kolagenního vaziva s větším obsahem elastických vláken a z buněk hladkého svalu z kruhovitě uspořádaných snopečků. Vnitřní stěna je vystlána nízkým kubickým aţ plochým jednovrstevnatým epitelem. V místě ztenčení se vyklenuje v alveoly. Zde probíhá výměna plynů (kyslík a oxid uhličitý). (7) (8) Alveoly naléhají těsně k sobě, jsou to polokulovité, tenkostěnné váčky, přecházející do alveolárních chodbiček a váčků. Stěna alveol je tvořena vazivovou blankou z retikulárních a elastických vláken s hustou pletení krevních vlásečnic. Buňky hladkého svalu obkruţují vchod do alveolů. Na vnitřní stěně jsou vystlány plochým jednovrstevnatým epitelem, nasedající na bazální membránu respirační epitel, který je sloţen z membránových a granulárních pneumocytů. Membránové pneumocyty (1. typu) tvoří plochou výstelku s dlouhými cytoplazmatickými výběţky, místy s granulárními pneumocyty (2. typu), které mají kubický tvar. Tyto v cytoplazmě obsahují granula se sekretem těchto buněk. Jsou zdrojem surfaktantu. Vykazují vysokou regenerační schopnost. Při poškození alveolární výstelky významně proliferují a diferencují se. (8) 13

Surfaktant pokrývá ploché pneumocyty v podobě tenkého filmu a významně sniţuje povrchové napětí. Brání smrštění alveolů s následným kolapsem. Je neustále obměňován, nutný pro výměnu plynů v alveolách. (8) Na vnitřní ploše a ve vazivové stěně alveolů se nalézají alveolární makrofágy. Mají za úkol fagocytovat částice prachu a sazí. Vzájemně sousedící alveoly jsou propojeny póry, slouţící k vyrovnání tlaku. (8) Obr. č. 2 : Plíce Respirační část plic - bronchioly, pokračující jako alveolární dukty, na ně navazují alveolární váčky. Viditelné jsou alveoly, které představují zakončení bronchiálního stromu. V lumen jsou pozorovatelné erytrocyty v cévách. (48) 14

2.3 NÁDORY PLIC 2.3.1 Nezhoubný - benigní nádor Dobře ohraničený, roste omezeně, nevytváří metastázy. Tvoří přibliţně 5-10 % všech plicních nádorů. Obvykle je diagnostikován náhodným vyšetřením plic. Tyto nádory jsou tvořeny různými druhy buněk, např. z tkáně chrupavčité, tukové, vaziva, z hladkého svalstva, ze slizniční výstelky průdušek. (13) (9) Nezhoubné nádory přímo ţivot neohroţují, ale v případě, ţe prorůstají do vnitřního průsvitu průdušky nebo tlakem zvenčí, mohou zapříčinit uzávěr průdušky s následným poškozením přilehlé plicní tkáně. Tato plicní tkáň je méně odolná vůči infekci. Nezhoubný nádor se můţe i zvrhnout ve zhoubný. (13) (9) 2.3.1.1 Chondrohamartom Je tuhé, tvrdé konzistence, tvořený chrupavčitou tkání. Podle uloţení léze v plícním parenchymu, která můţe být bez souvislosti s bronchiální stěnou tzv. parenchymový chondrohamartom, bývá loţisko klinicky němé. V druhém případě v souvislosti se stěnou bronchu tzv. endobronchiální chondrohamartom. Velice často se objevuje kašel, hemoptoe a poststenotické bronchopneumonie. (13) (9) 2.3.2 Zhoubný - maligní nádor Je charakterizovány nekontrolovatelným růstem. Prorůstá do okolní tkáně, vytváří vzdálená loţiska tzv. metastázy. Velkou většinou se jedná o karcinomy, které se odvozují ze sliznice bronchů tzv. bronchogenní karcinomy. Plicní epitel, neţ se stane invazivní, musí projít morfologickými změnami. Epitel postupně prochází těmito stádii: hyperplazie - zvětšení orgánu způsobené zmnoţením buněk metaplazie - přeměnu jedné diferencované tkáně v diferencovanou tkáň jiného typu dysplazie - prekarcinózní stav - ztráta uniformity buněk a orientovaného tkáňového uspořádání buňky karcinom in situ - zhoubný nádor na původním místě 15

Pokud přestanou působit karcinogenní podněty, mohou být tyto změny do určité míry reverzibilní. Karcinom plic je velmi agresivní onemocnění. Pro osobu s právě diagnostikovaným novotvarem je pravděpodobnost přeţití následujících pěti let pouze 7 %. (13) (9) Z histologického hlediska zhoubné nádory dělíme: 2.3.2.1 Nemalobuňecný karcinom - NSCLC Nemalobuňecný karcinom - NSCLC (Non - Small Cell Lung Cancor). Představují 70 80 % nádorů plic. Vykazuje pomalejší růst, méně diferencovaný ve srovnání s malobuněčným karcinomem. (9) 2.3.2.1.1 Dlaţdicobuněčný karcinom Dlaţdicobuněčný karcinom (spinocelulární, epidermoidní, skvamózní). Představuje 25 30 % všech plicních karcinomů. Vzniká z dlaţdicového metaplastického epitelu, který se vyskytuje v bronších. Nádory mohou růst dovnitř bronchů. Často rostou v hilové oblasti plic nebo ve velkých bronších. Dochází k proliferaci nádorových buněk do hloubky. Histologicky dobře diferencované nádory obsahují tzv. rohové perly. (obr.č.6) (9) 2.3.2.1.2 Adenokarcinom 30 35 % všech plicních karcinomů. Objevují se v plíci centrálně. Mohou se objevit i v periferních oblastech a v okolí jizev. Tento druh karcinomu se nedává do souvislosti s kouřením. Rostou pomalu, často metastazují, nevytvářejí velkou nádorovou masu. (obr.č.7) (9) 2.3.2.1.3 Velkobuňěčný karcinom 10-15 % všech plicních karcinomů tvořeny špatně diferencovanými buňkami. Nelze rozlišit, zda pocházejí ze ţlázového nebo dlaţdicobuňečného epitelu. Je tvořen velkými 16

anaplastickými buňkami, případně i velkými mnohojadernými buňkami. Nádor má špatnou prognózu. Rychle se šíří a metastazuje např. do lymfatických uzlin, na pleuru, do jater i mozku. (13) (9) 2.3.2.2 Malobuněčný (neuroendokrinní) karcinom - SCLC Malobuněčný (neuroendokrinní) karcinom - SCLC (small - cell lung cancor). Tvoří 20 30 % všech plicních karcinomů. Vzniká v hilové plicní oblasti a velice časně postihuje hilové a mediastinální lymfatické uzliny. Nádorové buňky jsou malé, ale asi dvojnásobně velké neţ malé lymfocyty. Obsahují kulatá nebo lehce protáhlá hyperchromní jádra (tzv. ovískový karcinom) s úzkým lemem cytoplazmy. Vysoce maligní, agresivní nádor, roste velmi rychle s častými mimohrudními metastázami. Mnohdy tvoří hormony např. antidiuretický hormon, kalcitonin. Tento karcinom se odvozuje od neuroendokrinních buněk plic. (13) (9) 2.3.2.3 Smíšené nádory Zaujímají 5 10 % všech plicních nádorů. 2.3.2.3.1 Smíšené dlaţdicobuněčné karcinomy a adenokarcinomy 2.3.2.3.2 Smíšené dláţdicobuněčné karcinomy a malobuněčné karcinomy 17

Obr. č. 6:. Dlaţdicobuněčný karcinom plic Maligní rohovějící,epitelový nádor. Nádorové buňky vytvářejí mapovitá loţiska a trámce, vykazující invazivní růst s narušenou stratifikací dlaţdicového epitelu. Nádorové buňky jsou různé velikosti s obšírnou cytoplazmu. Mají zvýšený nukleo - cytoplazmatický poměr, s jadernou polymorfií, hrubým chromatinem s eozinofilním jádrem. Přítomny jsou četné mitózy. (46) Obr. č. 7: Adenokarcinom plic Adenokarcinom plíce acinárně a papilárně uspořádaný. Nízké kubické aţ cylindrické buňky s větším jádrem s hrubým chromatinem, výjimečně s patrnými jadérky. Různě vysoko v cytoplazmě jsou uloţena jádra nádorových buněk. V některých buňkách v cytoplazmě je viditelná objemná hlenová vakuola. (47) 18

2.4 KARCINOM PLIC Obecně velice různorodá skupina nádorového onemocnění. Zahrnuje jak zhoubné nádory průdušek, tak nádory vznikající v plicním parenchymu. Jejich klinický obraz je velmi podobný, nelze je od sebe přesně oddělit. (11) 2.4.1 Epidemiologie karcinomu plic Plicní karcinom je z hlediska mortality celosvětově nejčastějším onkologickým onemocněním. V roce 2002 bylo zjištěno 1,35 miliónu případu a 1,18 miliónu pacientů zemřelo. Nejvyšší zastoupení je v západní Evropě a v Severní Americe. Poměr muţů a ţen je asi 4 : 1. Česká republika náleţí mezi země s vysokou incidencí i mortalitou na karcinom plic. Ročně umírá v České republice více neţ 5455 nemocných (3977 muţů a 1478 ţen za rok 2009). (26) U muţů vykazuje karcinom plic nejvyšší incidenci i mortalitu ze všech maligních onemocnění. V roce 2009 incidence dosáhla u muţů 87,7 na 100 000 obyvatel. Mortalita se mírně sniţuje, asi o 15% za posledních 25 let. Přes to je stále velmi vysoká. (20) (26) U ţen dochází k vzestupu incidence i mortality, za posledních 30 let se ztrojnásobily (incidence v roce 2009 byla 35,9 na 100 000 obyvatel). V roce 2005 mu patřilo jiţ 3. místo ze všech karcinomů. (20) (26) Většina onemocnění se projevuje ve věkové skupině 55 80 let (meridián 70 let). Dochází k posunu do niţších věkových kategorií a zcela výjimečně se vyskytuje u mladých lidí do 30 let. (20) (26) Jen u malé části nemocných je onemocnění v časném stádiu diagnostikováno. Valná většina plicního karcinomu je zjištěna aţ v pokročilém stádiu s minimální pravděpodobnosti dlouhodobého přeţívání. (11) 2.4.2 Vznik a vývoj Vznik plicního karcinomu (kancerogeneze) je dlouhodobý proces. Rizikovým faktorem je aţ v 90 % opakovaná a dlouhodobá expozice tabákového kouře při aktivním i pasivním kouření. Vdechování radioaktivního radonu u osob ţijících v oblastech se zvýšeným obsahem 19

v podloţí nebo u osob pracujících v dolech. Případně profesionální expozice těţkými kovy, azbestem, chemickými látkami, mykotoxiny a radiačním zářením. (20) (11) Vlastní vznik nádorového bujení je závaţná změna genetické výbavy buňky tzv. mutace. Mutace mohou aktivovat protoonkogeny na onkogeny, které jsou dominantní nebo inaktivovat supresorové geny. K aktivaci onkogenů postačuje mutace jedné kopie. K inaktivaci supresorových genů je zásadní inaktivace obou genů heterozygotní buňky tj. mutace obou alel, případně mutace jedné a delece druhé alely postiţeného genu. (6) (4) Vlastní iniciaci buněčného cyklu dělení mohou zapříčinit změny různého rozsahu. Například bodové změny genomu na úrovni několika sekvencí (např. mutace p53) nebo větší, prokazatelné cytogenetické změny např. zvýšení exprese nebo amplifikace genů. (6) Jindy jde o chybu genetické výbavy buňky na úrovni chromosomů nebo jejich částí ve smyslu translokací. Aneuplodie tj. ztráty či dodání celých chromosomů, polyplodie tj. znásobení celé sady chromosomů. (6) Proces buněčného dělení a diferenciace má mnoho dalších kontrolních mechanizmů. Jedním z nejvýznamnějších je pro kaţdou ţivou buňku apoptóza tj. programovaná buněčná smrt. Podobným regulátorem replikace je mechanizmus senescence tj. stárnutí buňky. Lidské buňky se nemohou dělit neustále, proces se zpomaluje a po 60 70 dělení se zastaví. (6) 2.4.1.1 Mutace genu EGFR u NSCLC Důleţitou roli v regulaci buněčného cyklu, proliferaci a diferenciaci, signálních drah normálních buněk sehrává membránový glykoproteinový receptor pro epidermální růstový faktor EGFR, který je umístěn na buněčném povrchu. Je jedním ze čtyř prozatím známých členů erbb rodiny (HER1, HER2, HER3,HER4) tyrozinkinázových receptorů. (28) (30) (31) Membránový receptor EGF se skládá z části (domény) extracelulární, transmembránové a intracelulární. Receptory pro regulační peptidy jsou membránovými receptory s vlastní kinázovou aktivitou, které jsou ve své cytoplazmatické části tvořeny proteinkinázou tyrozinkinázou. Po vazbě signální molekuly neboli ligandu na extracelulární část receptoru nastávají nejprve změny samotného receptoru (dimerizace, internalizace, autofosforylace). Následně se indukují další nitrobuněčné pochody, kterými se přenos signálu uskutečňuje přes kaskádu enzymatických aktivací. (Stričková, 2011, str. 292) 20

EGFR gen je lokalizován na chromosomu 7p12, sloţen z 28 exonů o celkové velikosti 186 kb. Zvýšená exprese genu je způsobena bodovými mutacemi v exonu 18 (vzácné 5%), delecemi v exonu 19 (45%), inzercemi, bodovými mutacemi v exonu 20 (vzácné niţší neţ 1%) a bodovými mutacemi v exonu 21 (40-45 %). (obr.č.3) Hraje významnou úlohu v karcinogenezi. Je popisována u různých typů solidních nádorů, včetně nemalobuněčného plicního karcinomu (NSCLC). Frekvence výskytu je vyšší v asijské neţ kavkazské populaci, u které se pohybuje mezi 5 20 %. Nadměrná exprese koreluje s pokročilým stupněm onemocnění a nepříznivou prognózou. (28) (30) (31) Obr. č. 3: Distribuce a klasifikace mutací EGFR genu. (49) 2.4.1.2 Fúzní gen EML 4 - ALK u NSCLC EML 4 - ALK fúzní gen hraje rovněţ v onkogenezi klíčovou roli. U pacientů s NSCLC se vyskytuje ve 2-7 %. Přestavby jsou taktéţ uváděny např. u lymfomů, neuroblastomů, karcinomů ledvin, prsu, tlustého střeva. (17) (33) 21

Gen EML 4 (echinoderm microtubule associated protein like 4) je lokalizován na chromosomu 2p21. Kóduje protein, který v cytoplazmě buněk koordinuje uspořádání mikrotubulů. (33) Gen ALK (anaplastic lymphoma kinase) se nachází na chromosomu 2p23 a kóduje transmembránový glykoprotein s tyrozinkonázovou aktovitou. Patří do rodiny inzulínových receptorů, je sloţen z 1620 aminokyselin. (33) Přestavba EML 4 - ALK fúzního genu vniká v důsledku malé paracentrické inverze na chromosomu 2p23 a 2p21 (obr.č.4). Obsahuje více zlomových oblastí genu, v různé délce v exonech 2,6,13,14,15,17,18 a 20. Důsledkem je chimerický protein, který se účastní dimerizace proteinu, při autofosforylaci kinázových domén v řízení buněčné proliferace. (17) (33) Obr. č. 4: Fúze mezi geny ALK a EML4. (50) 2.4.1.3 Bodová mutace K - ras onkogenu Onkogeny označujeme geny, jejichţ expresí vznikají proteinové produkty, které transformují buňky v nádorový genotyp. U plicních karcinomů - NSCLC se uplatňuje aktivován K - ras (Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) onkogen u 15-20 % nemocných s horší prognózou přeţití. Gen je lokalizován na chromosomu 12p12. Patří do skupiny RAS onkogenů. Výsledný produkt G - protein zodpovídá za přenos extracelulárního signálu do jádra buňky. Onkogenní charakter získává bodovou mutací v kodonu 12, 13 a 61, označuje se také jako wild type mutace. Většina studií potvrdila, ţe K - ras mutace a mutace EGFR genu se vzájemně vylučují, jedná se o tzv. mutační exkluzivitu. (34) (36) 22

2.4.1.4 Ostatní mutace u NSCLC Ostatní mutace u NSCLC např. TP53 / PIK3CA / CTTNB1 / BRAF / NRAS / HER2 / IDH1/ AKT1 / MEK způsobují poruchy signální dráhy. (obr.č.5) Vyskytují se v různé míře i u jiných solidních nádorů. U 46 % NSCLC nebývá ţádná mutace detekována. (41) - Obr. č. 5 : Frekvence přítomnosti mutací u 54 % NSCLC. (52) 23

2.4.3 Symptomatologie, šíření karcinomu a metastázy Pro plicní karcinom je typický dlouhodobý asymptomatický průběh onemocnění. Následuje období s běţnými symptomy. Nejčastěji se projevuje neurčitá bolest v hrudní oblasti, kašel, dušnost, hemoptýza, únava, nechutenství a váhový úbytek. U primárního nádoru se kašel objeví sekundárně u 75 % pacientů. Příčinou můţe být invaze bronchiální sliznice, pneumonie za stenózou, nadprodukce hlenu, rozpad tumoru nebo pleurální výpotek. (11) (4) Varovným symptomem je kašel trvající dále jak 14 dnů zejména s hemoptýzou, která se projevuje aţ u třetiny nemocných a je vyvolána nekrózou tumoru, ulceracemi bronchiální sliznice, postobstrukční pneumonitidou či erozí plicních cév. Přibliţně třetina aţ polovina nemocných trpí kombinací těchto příznaků. Čtvrtinu aţ polovinu nemocných doprovází bolest v hrudní oblasti zapříčiněné nádorovou infiltrací pleury, mediastina případně hrudní stěny. Téměř třetina pacientů s karcinomem plic má známky mimohrudního (extrathorokálního) šíření. Metastatické projevy jsou pozdní příznaky pokročilých stádií onemocnění. Běţně postiţené cílové orgány či tkáně jsou nejčastěji kosti, lymfatické uzliny, játra, nadledviny, mícha a mozek. (3) (20) Malobuněčný karcinom metastazuje dříve a mnohočetně, je povaţován za systémovou nemoc jiţ v době diagnózy. Nemalobuněčný plicní karcinom bývá diagnostikován ve stádiu metastatické nemoci asi ve 40-50 %. (Klein, 2006, str. 27) Přibliţně 10 % pacientů s plicním karcinomem má rozvinuté systémové projevy. Způsobené uvolňováním bioaktivních látek produkovaných tumorem nebo reakcí na přítomnost tumoru. Tyto projevy mohou i předcházet diagnózu, objevit se v průběhu. Běţné endokrinní syndromy jsou hyperkalcémie, hyponatremie, nepřiměřená sekrece antidiuretického hormonu. Skeletální manifestací je hypertrofická plicní osteoartropatie, paličkovité prsty. (3) Pro hodnocení karcinomů se pouţívá tzv. TNM klasifikace (Tumor, Nodes and Metastases Classification). Tato klasifikace je jednotná, pravidelně revidovaná, stupně jsou určeny numericky. Pro diagnózu patologickou je označena ptnm. Poskytuje informace 24

o vlastnostech, velikosti a šíření nádoru. Umoţňuje objektivně posoudit předpokládanou prognózu, plánovat léčebnou terapii a vyhodnocovat její výsledky. (6) (20) Klasifikace popisuje rozsah plicního nádoru: T T0 T1 T2 T3 T4 primární nádor bez známek tumoru tumor o průměru do 3 cm, bez infiltrace pleury nebo hlavního bronchu tumor větší neţ 3 cm, s infiltrací viscerální pleury nebo hlavního bronchu dále 2 cm od kariny, s atelektázou nezasahující celou plíci tumor s přímým šířením do hrudní stěny, bránice, perikardu, mediastinální nebo parientální pleury, hlavního bronchu méně neţ 2 cm od kariny, s atelektázou celé plicní tkáně tumor s infiltrací do mediastina, velkých cév, trachey, jícnu, obratlů, kariny, srdce, s maligním pleurálním nebo perikardiálním výpotkem, se satelitním uzlem ve stejném laloku s primárním nádorem N postiţení regionálních uzlin N0 uzliny nejsou postiţeny metastázou N1 metastázy ve stejnostranných intrapulmonálních nebo hilových uzlinách N2 metastázy ve stejnostranných mediastinálních nebo subkarinálních uzlinách N3 metastázy v druhostranných mediastinálních nebo hilových uzlinách či ve stejnostranných skalenových nebo supraklavilárních uzlinách M přítomnost vzdálených metastáz M0 nezjištěny vzdálené metastázy M1 zjištěny vzdálené metastázy s metastázy do kontralaterální plíce (3) (20) Stádia rakoviny plic: stádium 0 T0 N0 M0 stádium IA T1 N0 M0 stádium IB T2 N0 M0 stádium IIA T1 N1 M0 25

stádium IIB T2 N1 M0, T3 N0 M0 stádium IIIA T3 N1 M0, T1-3 N2 M0 stádium IIIB T4 N0-3 M0, T1-3 N3 M0 stádium IV T1-4 N0-3 M1 (3) (20) 2.5 DIAGNOSTIKA KARCINOMU PLIC Příznaky nádorového onemocnění plic se objevují aţ v pokročilých stadiích nemocí. Příčinou je minimální senzitivní inervace a značná respirační rezerva plic. Zhoubnost karcinomu se odvíjí od rychlosti jeho růstu a od jeho schopnosti časně do vzdálených orgánů metastazovat. Nicméně existuje celá řada vyšetřovacích metod, fyzikálních, mikroskopických, zobrazovacích a laboratorních k průkazu nemoci. V jejich kombinaci lze anamnézu potvrdit, případně vyvrátit. (6) (20) 2.5.1 Histologické vyšetření Histologické - řezové preparáty slouţí ke studiu struktury, patologických změn a pro diagnostiku tkání. Při prekancerózách a karcinomech se vyskytují buňky metaplastické a atypické. Většinou se zvětšenými hyperchromními jádry a menším objemem cytoplazmy. (8) U dlaţdicobuněčného karcinomu dominuje polymorfie jader s výraznými nukleoly, tendence k rohovění nebo výrazné rohovění. Změny jsou rozdílné u karcinomu z buněk bazocelulárního typu, intermediálního typu a superficiálního typu. Malobuněčný karcinom (ovískový) je charakterizován drobnými buňkami s tmavými jádry a s malým mnoţstvím cytoplazmy nebo jádry bez cytoplazmy a bez zřetelných jadérek. Buňky se často seskupují v trsy. Adenokarcinomy vykazují většinou buněčnou polymorfii, přítomnost hlenu v cytoplazmě, případně řazení buněk do adenoidních formací. Polymorfní velkobuněčný karcinom je charakterizován velkými polymorfními buňkami, některé buňky mají mitotické figury, nebývají přítomny známky rohovění a produkce hlenu. (Dvořák, Dvořáková, Lukáš, 2008, str. 57) 26

2.5.1.1 Materiál a způsoby odběru Získaný materiál při bronchoskopickém vyšetření nejčastěji z transbronchiální punkce, materiál z transthorakální aspirace loţiska v plíci. Způsoby odběru: bronchoskopická biopsie endoskopické vyšetření dolních cest dýchacích s lokální, nebo celkovou anestézií (méně časté) s odběrem tkáně. diagnostické bioptické odběry operační výkon, za sterilních podmínek je z resekované tkáně odebrán materiál na mikroskopické vyšetření. Diagnostická plicní biopsie je prováděna u nejasných plicních procesů s podezřením na nádorové bujení. Je to cílená excize, klínovitého tvaru o velikosti cca 1,5 2,5 cm. jehlová biopsie probíhá při ultrazvukové nebo CT navigaci. Jehla se zavádí přes hrudní stěnu znecitlivěnou lokálním anestetikem, do plicní tkáně a odštípne se vzorek. kartáčová biopsie (brush) - za pouţití různých naváděcích systému (skiaskopie, endrobronchiální ultrazvuk nebo elektromagnetická navigace). Senzitivita vyšetření se uvádí aţ 95%. VATS (video-assistedthoracicsurgery) vyuţívá se endoskopický přístroj s kamerou (thorakoskop), který se zavádí přes malý řez hrudní stěnou do hrudní dutiny, kde umoţní odběr plícní tkáně. transbronchiální punkce - probíhá do míst standardní lokalizace nitrohrudních uzlin nebo za pomocí endobronchiálního ultrazvuku. Tato metoda se vyuţívá především k určení TNM klasifikace karcinomu plic. transthorakální aspirace odběr nasátím jehlou z plicní tkáně nebo orgánů mezihrudí (43) (44) Transport bioptického materiálu se provádí ve fixačním roztoku (nejčastěji 10 % formalín 40 % formaldehyd v ředění 1 díl formaldehydu a 9 dílů vody), v nativní formě po domluvě s patologem uloţený ve fyziologickém roztoku, případně zamraţený. (7) 27

2.5.2 Cytologické vyšetření Cytologická vyšetření v pneumologii mají dlouholetou tradici. Stala se nezastupitelnou součástí v diferenciální diagnostice onemocnění plic. S nárůstem incidence karcinomu plic se zvýšila potřeba rychlejší a efektivnější verifikace nálezů. (37) 2.5.2.1 Materiál a způsoby odběru Odebraný materiál při bronchoskopickém vyšetření jsou nejčastěji stěry či aspiráty, výplachy z bronchu, materiál z bronchoalveolární laváţe. Dále materiál z transthorakální aspirace loţiska v plíci nebo sputum. Způsoby odběru: bronchoalveolární laváţe endoskopický přístroj nedosáhne do vzdálených nejmenších průdušek, dochází k vypuštění malého mnoţství fyziologického roztoku. Po chvíli se tekutina odsaje i se získanými buňkami a vzorek odešle k cytologickému vyšetření. kartáčová biopsie (brush) - za pouţití různých naváděcích systému (skiaskopie, endrobronchiální ultrazvuk nebo elektromagnetická navigace). Senzitivita vyšetření se uvádí aţ 95 %. transthorakální aspirace odběr nasátím jehlou z plicní tkáně nebo orgánů mezihrudí. thorakocentéza punkce pleurální dutiny dutou jehlou s následnou aspirací pleurálního výpotku (43) (44) Po odběru je nutné okamţitě provést fixaci odebraného materiálu. Případná pozdní fixace vede k zaschnutí nebo k autolytickému poškození buněk, coţ působí obtíţné aţ nemoţné zhodnocení materiálu. Jednou z moţností fixace je volné zaschnutí na vzduchu, případně ponořením skla do fixačního média alkoholétheru. (1) (19) Transport cytologického materiálu se provádí ve speciálních boxech. Před samotným transportem je materiál uchováván v lednici do 4 C. Nesmí se mrazit. Tělní tekutiny jsou pro cytologické zpracování dodávány nefixovány v těsnící zkumavce. 28

Získaný materiál pro cytologické zpracování: sputum fixováno 70 % alkoholem a dodáváno v plastové nádobě cytologické nátěry dodávány zaschlé preparáty bez pouţití fixačního prostředku na podloţních sklíčcích tkáňové mikrofragmenty fixovány 10 % formalínem s následným zpracováním na cytobloky tělní tekutiny např. pleurální, bronchoalveolární laváţ dodávány nefixované ve sterilních plastových nádobách, transportovány v chladu do 4 C, určené k cytospinovému zpracování otiskové preparáty dodávány na podloţních sklíčcích zaschlé bez fixačního prostředku. Řezná plocha vyšetřované tkáně je lékařem otištěna na odmaštěné podloţní sklíčko. Provádí se většinou minimálně dva informativní otisky. (38) 2.5.2.3 Výhody a nevýhody cytologie Výhodou cytologického vyšetření je pro pacienta méně invazivní odběr materiálu neţ na histologii. Spočívá především v moţnosti zhodnotit i malé mnoţství získaného vzorku. Je důleţitým indikátorem pro včasnou detekci maligních a premaligních lézí. Jeví se jako jednoduchá metoda zpracování materiálu, finančně a metodicky nenáročná s rychlejší interpretací výsledku. (37) Nevýhodou vyšetření je ztráta kontinuity tkáně. Diagnóza můţe být v některých případech méně přesná. Nutno doplnit o histologické vyšetření. Diagnózu lze upřesnit vyuţitím další pomocné metody např. imunocytochemického vyšetření, popřípadě imunohistochemického vyšetření. (37) 2.5.3 Molekulárně genetická a cytogenetická diagnostika S příchodem nových terapeutických moţností zaujímá stále významnější pozici molekulárně genetické a cytogenetické vyšetření. Vede k hlubšímu poznání karcinogeneze na úrovni chromosomů či DNA nádorových onemocnění. (6) 29

Pro stanovení efektivnější strategie terapie NSCLC (spíše adenokarcinomu), je doporučováno potvrzení patologem z histologie či cytologie a následně testovat pacienty na přítomnost mutace EGFR genu a fúze/translokace EML 4 ALK. (17) 2.5.3.1 Materiál a způsob odběru Patolog odebírá pro genetické vyšetření z bioptického materiálu reprezentativní vzorek. nádorovou tkáň velikost dle moţností, nativní tkáň uloţenou ve fyziologickém roztoku, fixovanou v FineFix roztoku, případně zamraţenou a uloţenou do sterilní mikroskumavky. V den odběru je nutno zajistit transport do laboratoře. parafínový bloček s označenou lokalizací maligní tkáně izolovaná DNA rozpuštěná ve vodě, případně TE pufru cytologický preparát na skle vyznačené nádorové buňky (39) 2.5.3.2 Molekulárně genetické vyšetření Somatické mutace EGFR genu u pacientu s NSCLC lze kvalitně detekovat různými molekulárně genetickými metodami s poměrně vysokou citlivostí testů mutovaných alel na pozadí bez mutace.(tab.č.1) (17) Metoda detekce Detekční limit Mutant enriched PCR 0,09 % Mutant allele specific amplification PCR 0,1 % Real Time PCR (TheraScreen EGFR kit) 1 % High performance liquid chromatografy 1 % PCR and fragment analysis 5% Pyrosekvenace (TheraScreen EGFR Pyro kit) 5 % SNaPshot analysis 5 % Sekvenace 15-25 % Tab. č. 1: Detekční limity pro stanovení EGFR mutace. (17) 30

Průkaz mutace v EGFR genu umoţňuje rychlou, spolehlivou detekci pomocí amplifikace sekvencí DNA metodou RT - PCR. Mutace identifikuje v exonech 18-21 genu EGFR. Amplifikace DNA za pomocí PCR spočívá v opakované replikaci úseku DNA, které jsou vymezené specifickými primery termostabilní DNA polymerázy (Taq - izolovaná z termofilních mikroorganismů Thermus aquaticus), procesem opakovaného teplotního cyklování. V kaţdém cyklu dochází ke zdvojení amplifikované sekvence, která exponenciálně roste. (5) (42) RT - PCR sleduje průběh PCR přímo během reakce, za pomocí barviv či častěji fluorescenčních sond, které detekují kvantitu PCR produktu během reakce navýšením své fluorescenční aktivity. RT - PCR se provádí s pomocí přístrojů termocyklerů, které zajišťují teplotní cyklování i detekci fluorescence. (5) (42) 2.5.3.3 Cytogenetické vyšetření Cytogenetika je obor, který studuje chromosomy a jejich odchýlení od normálního počtu nebo struktury. (21) FISH metoda se pouţívá pro detekci chromosomových aberací např. u genů EGFR, ALK přestaveb, ale i genů HER 2. Vyznačuje se vyšší citlivostí oproti IHC metodě. (36) Principem fluorescenční in situ hybridizace - FISH metody je hybridizace fluorescenčně značených sond, které se váţí k vyšetřované DNA na základě komplementarity bazí a tím dochází k následné vizualizaci cílových úseku vyšetřované DNA. Identifikují se fluorescenční signály ve fluorescenčním mikroskopu. (5) 2.5.4 Prognóza a prediktivní faktory Mezi hlavní úkoly moderní medicíny, kromě přesné diagnostiky, kvalitní léčby, se řadí také odhad prognózy (odhad průběhu onemocnění bez ohledu na léčbu) nemoci, predikce (odhad průběhu onemocnění ve spojitosti s konkrétní léčbou) reakce na danou léčbu a monitorování změn v průběhu léčby. Jsou to informace velice zásadní a na nich závisí strategie další léčby. (19) V současnosti se řídíme především histologickým typem nádoru, lokalizací, stupněm diferenciace, rozsahem nemoci (TNM klasifikací), celkovým zdravotním stavem nemocného. 31

Výzkumy zaměřené na hledání nových markerů, které by správně mohly určit prognostické faktory a vyhledat vhodný typ léčby pro konkrétního pacienta, patří mezi nejvíce se rozvíjející oblasti nejen v onkologii. Aby mohl být prediktivní marker zaveden do běţné praxe, musí splnit dostatečnou senzitivitu, specificitu, musí byt technicky proveditelný, cenově dostupný apod. (1) (19) Smysl prediktivních faktorů stoupá se zavedením inhibitorů EGFR tyrosinkinázy do praxe. U cílené léčby nacházíme významnější korelace s prediktivními faktory neţ u chemoterapie, protoţe je zaměřena na zamezení specifického proteinu v signální dráze nádorové buňky. Cílem je zvýšit současný stav znalostí se zaměřením na separaci pacientů, kteří budou mít skutečně prospěch z terapie. (14) 2.6 TERAPIE Léčba bronchogenního karcinomu závisí na histologickém typu a rozsahu nádoru. Vývoj a šíření karcinomu plic ze svého počátečního zdroje představuje důleţitý faktor ovlivňující terapeutický postup a prognózu nemocného. (11) 2.6.1 Chirurgická léčba Úplné chirurgické odstranění nádoru se povaţuje za nejúčinnější metodu. Operačně lze odstraňovat i nádory s metastázemi do svodných lymfatických uzlin s dodrţením přesných kritérií, při jakém rozsahu lze provést radikální operaci. Podle velikosti a polohy nádoru se provádí buď resekce části plicního křídla (lobektomie) nebo celého plicního křídla (pneumonektomie). (3) 2.6.2 Radioterapie Radioaktivní záření vykazuje schopnost ničit nádorové buňky. S vyuţitím v případech, kdy nelze provést radikální chirurgický zákrok. Samotné záření je moţné aplikovat zevní radioterapii, kdy se zářič nachází mimo pacienta. Celková doba cílené radioterapie plicní léze bývá 4-6 týdnů. Dochází k ozáření vlastního plicního nádoru, případně je moţné radioterapii vyuţít i k ovlivnění dalších loţisek. (11) (3) 32

Jiným způsobem radioaktivní léčby je brachyradioterapie. Zářič se zavádí do velkých průdušek pomocí bronchoskopu co nejblíţe k nádorovému loţisku. Ozáření pak trvá jen několik minut. Terapii je moţno opakovat v intervalu jednoho či několika týdnů. Vyuţívá se i kombinace zevního záření a brachyradioterapie. Speciálním pouţitím je tzv. zajišťující ozáření. Aplikuje se po radikální operaci nádoru, se sníţením moţnosti vzniku recidivy v poloze původního nádoru. (11) (3) 2.6.3 Lokální léčba s vyuţitím laseru V ojedinělých případech dochází k růstu nádorové léze směrem dovnitř velkých průdušek nebo průdušnice. Následkem je částečné nebo zcela uzavření průdušky a vyřazení z funkce části plicní tkáně. Tato vede k dechovým potíţím, kašli, zvýšené úzkosti. Zde je moţné mechanické odstranění nádoru laserem uvnitř průdušky, který se zavádí bronchoskopem. (3) 2.6.4 Chemoterapie Léčba cytostatiky, léky, které mají schopnost ničit nádorové buňky v celém organismu. Čehoţ se vyuţívá i u nádorových loţisek ve vzdálených orgánech a tkáních nebo při preventivním uţívání se snahou zamezit vzniku metastáz po chirurgické operaci nádoru. Vyuţití chemoterapie bývá nejčastější u nádorových procesů, kde nelze vyuţít chirurgickou léčbu. (11) Chemoterapie se vyuţívá téměř vţdy u léčebných schémat malobuněčného karcinomu. U nemalobuněčného karcinomu lze pouţít i jiné způsoby léčby. Pro zvýšení účinnosti se obvykle pouţívá současně několik cytostatik. Podávají se ve formě nitroţilních infuzí nebo injekcí, méně časté je podávání ve formě tablet. Léčba se zpravidla opakuje v několika týdenních intervalech. (11) (3) 33

2.6.5 Cílená léčba V boji proti závaţným onkologickým chorobám hraje cílená léčba stále významnější roli s rozšiřujícím se polem působnosti. Léčba se uskutečňuje buď pomocí monoklonálních protilátek proti povrchovým buněčným receptorům (Cetuximab EGFR), které se váţí na extracelulární doménu receptoru a znesnadňují navázání ligandu a jeho následnou aktivaci. Biologický poločas monoklonálních protilátek je relativně dlouhý a mohou být podávány v delším intervalu (týden aţ tři týdny). Druhou skupinou léku jsou přesně definované nízkomolekulární chemické látky, které do nádorové buňky pronikají difúzí a cíleně blokují nitrobuněčné pochody u aktivovaných nádorových buněk. Výzkum se zaměřil na nejrůznější genetické alternace v buněčné signální cestě s moţnosti jejich ovlivnění. Molekuly, které jsou nově vyvíjené, reagují s buněčným molekulárním cílem, který je přesně specifikován. (4) Nezastupitelnou úlohu zaujímají molekulárně - biologické markery. Mohou poskytnout zásadní informace při rozhodování o volbě léčebné strategie a umoţnit predikci terapeutické odpovědi. Léčba onkologických pacientů se stále více přiklání k individualizované terapii. V roce 2010 byl vypracován národní konsensus patologů, pneumoonkologů a molekulárních genetiků v ČR o kvalitní mezioborové spolupráci. V roce 2012 byl upraven o nové poznatky v diagnostice a terapii NSCLC. (4) (17) 2.6.5.1 Cílená léčba inhibitory tyrozinkináz Představuje jednu z nových významných postupů v terapii pokročilého NSCLC. Samotná léčba tyrozinkinázovými inhibitory (TKI) fosforylace v intracelulární části EGFR receptoru. Je zaloţená na blokaci aktivace kaskády receptoru pro epidermální růstový faktor. Blokováním mitogenní aktivity dochází ke zpomalení, případně zastavení proliferace nádorových buněk, tedy k zástavě růstu tumoru. (17) (29) (32) Významné pro praxi jsou mutace EGFR a fúze/translokace EML 4 - ALK, které korelují s vnímavosti nádoru na terapii. Dále pak také onkogen K - ras, který však v současnosti nemá klinickou alternativu léčby. (14) 34

V léčbě NSCLC jsou běţně uplatňovány dva EGFR TKI (obr.č.8), erlotinib - Tarceva a gefitinib - Iressa. Význam mutací genu EGFR jako prediktorem dobré odezvy na terapii EGFR TKI, byl poprvé objasněn autory Lynchem a Paezem v roce 2004 a následně byl ověřen řadou dalších klinických studií. Léčba je povaţována za velice bezpečnou, léky nemají hematologickou či jinou závaţnou toxicitu. (14) 2.6.5.1.1 Gefitinib Gefitinib je nízkomolekulární, syntetický anilinochinazolinový inhibitor, značený ZD 1839, který se podává perorálně. Je vhodný k léčbě s lokálně pokročilým nebo metastazujícím NSCLC s diagnostikovanou mutaci EGFR. (32) (35) Selektivní inhibice EGFR - TK gefitinibem přerušuje mitogenní a antiapoptotické signály, které vedou k proliferaci nádoru, metastazování, angoigenezi a ovlivňují i účinnost chemoterapie či radioterapie. (Pešek, 2010, str. 145) Vykazuje lepší účinnost ve srovnání s chemoterapií v 1. linii léčby. Je dobře snášen s minimálním výskytem neţádoucích účinků - průjem, vyráţka a postiţení plicního intersticia cca do 1 % nemocných. (12) (35) 2.6.5.1.2 Erlotinib Erlotinib je rovněţ nízkomolekulární, syntetický anilinochinazolinový derivát, značený OSI 774, podávaný perorálně. Ireverzibilně, silně inhibuje intracelulární fosforylaci HER1/EGFR receptoru, na povrchu nádorových buněk. Erlotinib je v ČR schválen a doporučován pro 2. a 3. linii terapie NSCLC. Nejčastější neţádoucí účinky takto léčených pacientu jsou vyráţka a průjem. (32) (35) 35

Obr. č. 8 : EGFR mutace citlivé a odolné na TKI. (51) 2.6.5.1.3 Rezistence na EGFR TKI Valná většina léčených pacientů EGFR - TKI získává do jednoho roku rezistenci. Příčinou vzniku je popsáno několik mechanizmu. K nejvýznamnějším patří sekundární bodová mutace EGFR T790M a amplifikace C MET genu. Nejčastějším mechanizmem rezistence de novo se uvádí mutace genu K - ras. (36) 2.6.5.1.4 Crizotinib Crizonitib je nízkomolekulární selektivní inhibitor tyrozinkinázy ALK a jejich mutovaných variant a C MET kinázy. Léčba se aplikuje orálně. Klinické studie fáze 1. a 2. u NSCLC potvrdily bezpečnost léku, účinnost a schopnost prodlouţit dobu přeţití bez progrese. (36) (40) 36

3 SPECIÁLNÍ ČÁST Ve speciální části této práce jsem prováděla průkaz mutace v EGFR genu. Rychlou, spolehlivou detekci pomocí amplifikace sekvencí DNA umoţňuje metoda PCR v reálném čase (Real Time PCR, RT PCR). Metoda FISH slouţí k detekci chromosomových aberací u genů EGFR a fúze genů EML 4 ALK. Záměrem práce bylo dostatečně senzitivní metodou prokázat tyto mutace u pacientů s NSCLC pro prognostický a prediktivní faktor účinnosti cílené léčby. 3.1 RT - PCR metoda 3.1.1 PCR Polymerázová řetězová reakce (Polymerase chain reaction) umoţňuje amplifikaci (zmnoţení) specifické sekvence DNA. Tento úsek je vymezen vazbou primerů, oligonukleotidů, coţ jsou úseky DNA obsahující 20 25 nukleotidů. Tyto primery musí nasedat za stejné teploty tání, kterou lze vypočítat dle sekvence primerů. Konce těchto primerů nesmějí být vzájemně komplementární. Zachován musí být i poměr DNA, primerů, nukleotidů a Mg 2+ iontů (kofaktor polymerázy) v reakci. Zásadní je taktéţ teplota reakce. Čím je vyšší teplota tání a niţší koncentrace Mg 2+ iontů, tím přesněji nasedají primery, ale výkonnost DNA polymerázy se sniţuje. DNA polymeráza je izolovaná z termofilních mikroorganismů Thermus aquaticus (Taq DNA polymeráza) odolná vysokým teplotám při denaturaci řetězce. Principem PCR metody je cyklicky opakující se syntéza nových řetězců za pomocí polymerázy, a to podle templátové DNA. Prostřednictvím DNA polymerázy vzniká nový řetězec ve směru 5 3. Sekvence nukleotidů stanovené DNA je vymezena primery, které komplementárně nasedají na protilehlé řetězce a jejich 3 směřují proti sobě. Reakce probíhá v přístroji zvaném termocykler. V naprogramovaných časových intervalech se teplota mění automaticky. denaturace cílová DNA se po dobu 20 30 sekund zahřívá na 92-96 C, dochází k uvolnění vodíkových můstků mezi DNA, k rozvolnění dvoušroubovice a vzniku jednovláknové DNA 37

annealing - hybridizace (dosednutí) primerů na specifické úseky DNA, při teplotách 40 65 C a tím vymezení cílové sekvence, která má být amplifikována elongace syntéza DNA při 70-74 C, DNA polymeráza nasedá na 3 konce primerů a připojuje jednotlivé nukleotidy Výsledným produktem jsou amplikony, úseky DNA o definované délce, které lze dále prokázat kvalitativně elektroforézou v agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu nebo kvantitativně v reálném čase RT - PCR. Mnoţství amplikonů roste exponenciálně (2n; n = počet cyklů). Obr. č. 9: Princip PCR metody denaturace, annealing, elongace. (53) 3.1.2 Real Time PCR Jedna z variant PCR je real - time PCR (RT PCR), která umoţňuje v průběhu reakce přímo kvantifikovat vznikající produkty. Mnoţství amplikonu se detekuje pomocí fluorescence, signál je kvantifikován v reálném čase. Nejčastěji se vyuţívají fluorescenčně 38

značené hybridizační sondy. Fluorofór je látka, která se po absorpci světelného paprsku ze zdroje záření (UV lampa, laser, halogenové ţárovky, LED diody), dostane do vyšší energetické hladiny excitace. Zpět do původní energetické hladiny nadbytečnou energii vyzáří, dochází k emisi ve formě fluorescence. Zhášeč obsahuje dvojitě značené sondy. Přijme z fluoroforu energii ve formě světla a rozptýlí ji ve formě světla nebo tepla. Za předpokladu, ţe absorpční spektrum zhášeče se překrývá s emisním spektrem fluoroforu. Pro detekci se vyuţívá mnoho různých technologií. Např. kyaninová barviva SYBR Green, oligonukleotidové TaqMan sondy, molekulární majáky, ethidium bromid nebo hybridizační FRET technologie aj. K výhodám této metody se řadí zejména vysoká citlivost, kvantifikace, potřeba malého mnoţství DNA a krátké trvání diagnostického procesu. 3.1.2.1 Přístroje a pomůcky stolní mikrocentrifuga (EPPENDORF) stolní míchadlo vortex (IKA) laminární box sterilní práce a příprava PCR (BIOSTAR) mikropipety (NICHIRYO) jednorázové špičky s aerosolovou barierou (BIOTIX) mikrotitrační destička a zalepovací fólie (COBAS) aplikátor zalepovací fólie (COBAS) 1,5 ml Safe Lock zkumavky pro PCR (EPPENDORF) filtrační zkumavky (COBAS) odběrové zkumavky (SARSTEDT) suché vyhřívací bloky (LABNET) spektrofotometr (IMPLEM) termocyklér (COBAS Z 480) chladnička (ZANUSSI) mraznička (LEIBHERR) jednorázové rukavice 39

3.1.2.2 Materiál a reagencie DNA Sample Preparation Kit 24 testů P/N:05985536190 (COBAS), EGFR MUTATION TEST 24 testů P/N:06471463190 (COBAS), DNA TLB tkáňový litický pufr (COBAS), PK proteináza K (COBAS), DNA PBB vazebný pufr pro DNA v parafinových blocích (COBAS), WB I DNA promývací pufr I (COBAS), WB II DNA promývací pufr II (COBAS), DNA EB DNA eluční pufr (COBAS), EGFR MMX 1 master mix (COBAS), EGFR MMX 2 master mix (COBAS), EGFR MMX 3 - master mix (COBAS), MGAC octan hořečnatý (COBAS), EGFR MC pozitivní kontrola mutace EGFR (COBAS), DNA SD roztok pro ředění vzorků DNA (COBAS), xylen C 6 H 4 (CH 3 ) 2 (SIGMA), ethanol C 2 H 5 OH (SIGMA), izopropanol - (CH 3 ) 2 CHOH (SIGMA), sterilní voda, bez nukleázy čistota pro PCR H 2 O (APPLIED BIOSYSTEMS) 3.1.2.3 Příprava činidel Rekonstituovala jsem Proteinázu K (PK) přidáním 4,5 ml sterilní vody (čistoty pro PCR bez nukleázy) pomocí sterilní jednorázové 5ml pipety na jedno pouţití. Důkladně jsem lahvičku promíchala. Oddělila alikvotní podíly 450 µl rekonstituované PK do 1,5 ml zkumavek (Safe - Lock pro mikrocentrifugu) a nadbytečné alikvotní podíly jsem zamrazila při - 20 C. Připravila jsem DNA promývací pufr I (WB I) přidáním 15 ml absolutního etanolu do lahvičky WB I. Uchovávání při teplotě 15 C aţ 30 C. Připravila jsem DNA promývací pufr II (WB II) přidáním 50 ml absolutního etanolu do lahvičky WB II. Uchovávání při teplotě 15 C aţ 30 C. 3.1.2.4 Klinický materiál Pro stanovení kvalitativní detekce a identifikace mutací v exonech 18, 19, 20 a 21 genu EGFR v DNA se pouţívají formalínem fixované parafinové bločky (FFPET) z nádorových tkání s pokročilým NSCLC. 40

3.1.2.4.1 Deparafinizace FFPET Řezy na sklíčku: Sklíčko označené číslem vzorku s 5 µm FFPET řezem jsem vloţila do kyvety s xylenem a nechala jsem působit 5 minut. Přenesla jsem sklíčko do kyvety s absolutním etanolem a nechala opět působit 5 minut. Po vyjmutí z kyvety jsem sklíčko ponechala volně na vzduchu vyschnout po dobu 5 10 minut. Do označené zkumavky číslem vzorku (Safe Lock pro mikrocentrifugaci) jsem napipetovala 180 µl DNA TLB a 70 µl rekonstituované PK. Seškrábla jsem vyznačenou nádorovou tkáň ze sklíčka do zkumavky se směsí DNA TLB/PK. Řezy neumístěné na sklíčku: Vloţila jsem 5µm FFPET řez do označené zkumavky číslem vzorku (Safe-Lock pro mikrocentrifugu). Přidala jsem 500 µl xylenu, promíchala vířením po dobu 10 sekund. Poté jsem ponechala zkumavku stát 5 minut při teplotě 15 C aţ 30 C. Přidala jsem 500 µl absolutního etanolu a promíchala na vertexu po dobu 10 sekund. Ponechala jsem opět zkumavku volně stát 5 minut při teplotě 15 C aţ 30 C. Po odstředění jsem odstranila supernatant. Přidala jsem 1 ml absolutního etanolu a promíchala vířením po dobu 10 sekund. Po 2 minutách odstřeďování jsem odstranila supernatant. Vysušila jsem tkáňovou peletu s otevřenou zkumavkou ve vyhřívacím bloku po dobu 10 minut při 56 C do úplného odpaření etanolu. Resuspendovala jsem tkáňovou peletu ve180 µl DNA TLB s 70 µl rekonstituované PK. 3.1.2.4.2 Izolace DNA Negativní kontrolu jsem zpracovala souběţně se vzorky. Připravila jsem ji smícháním 180 µl DNA TLB a 70 µl roztoku PK v zkumavce Safe-Lock pro mikrocentrifugu. Vířením po dobu 30 sekund jsem promíchala zkumavky se směsí vzorku/dna TLB/PK a se směsí s negativní kontrolou. Vloţila jsem zkumavky do suchého vyhřívacího bloku a následně inkubovala 60 minut při teplotě 56 C. Poté jsem lehce zkumavky promíchala na vortexu. Vloţila jsem zkumavky znovu do suchého vyhřívacího bloku a inkubovala 60 minut při teplotě 90 C. Připravila jsem si filtrační zkumavky s víčky. Vloţila jsem je do odběrové zkumavky a kaţdé víčko jsem označila číslem pacienta. Pro kaţdý vzorek je zapotřebí jedna filtrační zkumavka, tři odběrové zkumavky a jedna eluční zkumavka (1,5 ml zkumavka pro mikrocentrifugu). Zkumavky s lyzátem jsem nechala vychladnout při pokojové teplotě. 41

Zkumavky jsem centrifugovala pro odstranění kapaliny z víček. Do kaţdé zkumavky jsem nepipetovala 200 µl DNA PBB a pipetováním 3x nahoru a dolů smíchala. Inkubovala jsem 10 minut při pokojové teplotě. Do kaţdé zkumavky jsem přidala 100 µl isopropanolu a pipetováním 3x nahoru a dolů lyzát smíchala. Lyzát jsem přenesla do označené filtrační zkumavky a odběrové zkumavky a odstředila jsem při 8000 x g po dobu 1 minuty. Vloţila jsem kaţdou filtrační zkumavku do nové odběrové zkumavky. Přidala jsem 500 µl pracovního WB I do kaţdé filtrační zkumavky. Odstředila jsem je při 8 000 x g po dobu 1 minuty. Přidala jsem 500 µl pracovního WB II do kaţdé filtrační zkumavky. Opět jsem je odstředila. Vloţila jsem kaţdou filtrační zkumavky do nové odběrové zkumavky a nechala jsem je odstřeďovat při 16 000 aţ 20 000 x g po dobu 1 minuty, aby vyschly membránové filtry. Vloţila jsem kaţdou filtrační zkumavku do eluční zkumavky (1,5 ml zkumavka pro mikrocentrifugu) předem označenou identifikačními čísly vzorku nebo kontroly. Přidala jsem 100 µl DNA EB do středu kaţdé membrány filtrační zkumavky, inkubovala jsem spolu s eluční zkumavkou při pokojové teplotě po dobu 5 minut. Odstředila jsem filtrační zkumavku s eluční zkumavkou při 8 000 x g po dobu 1 minuty. Filtrační zkumavky jsem odstranila a uzavřela jsem víčka elučních zkumavek se zásobní DNA. 3.1.2.4.3 Kvantifikace DNA Kaţdou zásobní DNA jsem promíchala na vortexu. Spektrofotometrem jsem kvantifikovala DNA podle protokolu výrobce. DNA EB jsem pouţila jako slepou kontrolu (blank). Pro výpočet průměru jsou nutná dvě opakovaná měření. Pro provedení testu mutací v EGFR genu, musí být koncentrace zásobní DNA v minimální koncentraci 2 ng/µl. Pokud je koncentrace zásobní DNA < 2 ng/µl, je nutné deparafinaci, izolaci a kvantifikaci opakovat s pouţitím dvou 5 µm FFPET řezů. 3.1.2.4.4 Amplifikace a detekce DNA Zásobní DNA ze vzorků jsem ředila bezprostředně před amplifikací a detekcí. Z kaţdého vzorku byly provedeny tři amplifikace / detekce. Potřebovala jsem celkem 75 µl (25 µl pro kaţdou ze tří reakcí) 2 ng/µl ředění zásobní DNA (celkem 150 ng DNA). 42

Výpočet pro ředění zásobní DNA při koncentracích 2 ng/µl - 36 ng/µl - pro kaţdý vzorek: Objem zásobní DNA v µl = (90 µl x 2 ng/µl) koncentrace zásobní DNA (ng/µl). Výpočet objemu (µl) roztoku pro ředění vzorků DNA (DNA SD) - pro kaţdý vzorek: µl DNA SD = 90 µl µl zásobní DNA Ředění vzorků: Připravila jsem si 1,5 ml zkumavky Safe-Lock pro mikrocentrifugy na naředění zásobní DNA a označila jsem je čísly vzorků. Napipetovala jsem pipetou se špičkou bránící vzniku aerosolů vypočtené objemy DNA SD do kaţdé zkumavky. Přidala jsem 45 µl DNA SD do zkumavky Safe-Lock označené negativní kontrolou. Vše jsem promíchala na vortexu. Připipetovala jsem vypočtený objem kaţdé zásobní DNA a do zkumavky označené negativní kontrola jsem dodala 45 µl negativní kontroly - extrahovaného eluátu. Zkumavky jsem uzavřela a kaţdou krátce pomíchala pomocí stolního míchadla. Příprava pracovních Master Mixů (MMX - 1, MMX - 2 a MMX - 3): Do jednotlivých 1,5 ml zkumavek Safe - Lock pro mikrocentrifugy jsem si připravila tři pracovní MMX, jednu s obsahem EGFR MMX - 1, druhou s obsahem EGFR MMX - 2 a třetí s obsahem EGFR MMX - 3. Objem poţadovaného EGFR MMX - 1 nebo EGFR MMX - 2 nebo EGFR MMX - 3 jsem vypočítala za pomocí vzorce - (počet vzorků + 2 kontroly +1) x 20 µl Vypočetla jsem objem potřebného MGAC octanu hořečnatého pro kaţdý MMX s pouţitím vzorce - (počet vzorků + 2 kontroly +1) x 5 µl Označila jsem sterilní zkumavky pro mikrocentrifugy pro pracovní MMX - 1, pracovní MMX - 2 a pracovní MMX - 3. Přidala jsem vypočítaný objem EGFR MMX - 1 nebo EGFR MMX - 2 nebo EGFR MMX - 3 do zkumavek pro pracovní MMX. Přidala jsem do zkumavek vypočtený objem MGAC. Zkumavky jsem krátce důkladně promíchala na vortexu. Příprava destičky: Do kaţdé reakční jamky na mikrotitrační destičce (AD - destičce) jsem nepipetovala 25 µl pracovního MMX, velice opatrně, špička pipety se nesměla dotknout destičky mimo jamku. Do jamek ve sloupcích 1, 4, 7 a 10 jsem přidala podle potřeby pracovní MMX 1 s EGFR MMX - 1. Do jamek ve sloupcích 2, 5, 8 a 11 jsem přidala podle potřeby pracovní MMX - 2 s obsahující EGFR MMX - 2. Do jamek ve sloupcích 3, 6, 9 a 12 jsem nepipetovala 43

podle potřeby pracovní MMX 3 s obsahující EGFR MMX - 3. Do jamek A1, A2 a A3 mikrotitrační destičky jsem napipetovala za pomocí vţdy nové špičky 25 µl EGFR pozitivní kontroly. Pipetou jsem důkladně promíchala odsátím a dávkováním. Napipetovala jsem do jamek B1, B2 a B3 25 µl negativní kontroly a opět pomocí pipety jsem dobře promíchala - odsátím a dávkováním v jamce alespoň dvakrát. Za pomocí nových špiček pro kaţdý naředěný vzorek DNA jsem přidala 25 µl prvního vzorku DNA do jamek C1, C2 a C3, důkladně jsem odsátím a dávkováním promíchala. Tímto způsobem jsem pokračovala u všech vzorků. Po vizuální kontrole, jsem za podpory aplikátoru pevně přilepila zalepovací fólii k mikrotitrační destičce a vloţila ji do termocykleru, zahájila jsem naprogramovaný cyklus RT PCR. Veškerou validaci cyklů a vzorků provádí software cobas 4800. Výrobce uvádí detekci mutace exonu 19 a 21 genu EGFR jiţ při hladině mutace 5 % za pouţití standardního vstupu 50 ng na reakční destičku. Při porovnávání výsledků se sekvenováním Sangerovou metodou, uvádí shodu 96,7 %. Obr.č.10: RT - PCR Cobas 4800 44

Výsledek testu Výsledek mutace Interpretace Mutation Detected Exon 19 delece S7681 Došlo k identifikaci mutace v cílové oblasti EGFR genu. T790M Mutation Not detected N/A Nenalezená mutace v cílové oblasti EGFR genu. Invalid N/A Výsledek je neplatný. Opakujte testování. Failed N/A Neúspěšný celý cyklus. Tab.č.2: Příklad interpretace výsledků testu cobas EGFR Mutation Test. (55) Exon 18 mutace G719X Mutace Změna aminokyselin ID COSMIC 2155 G>A G719S 6252 2155 G>T G719C 6253 2156 G>C G719A 6239 Exon 19 mutace exon 19 delece 2235_2249del15 E746_A750del 6223 2236_2250del15 E746_A750del 6225 2240_2257del18 L747_P753>S 12370 2240_2254del115 L747_P751del 12369 2239_2256del18 L747_S752del 6255 2239_2251>C L747_T751>P 12383 2237_2251del15 E746_T751>A 12678 2237_2255>T E746_S752>V 12384 2239_2248TTAACACAAG>C E747_A750>P 12382 2239_2253del15 L747_T751del 6254 2239_2247DEL9 L747_E749del 6218 2235_2252>AAT E746_T751>I 13551 2236_2253del18 E746_T751del 12728 2237_2254del18 E746_S752>A 12367 2238_2255del18 E746_S752>D 6220 2238_2248>GC L747_A750>P 12422 2238_2252_GCA L747_T751>Q 12419 45

2239_2258>CA L747_P753>Q 12387 2240_2251del12 L747_T751>S 6210 2233_2247del15 K745_E749del 26038 2253_2276del24 S752_I759del 13556 2235_2248>AATTC E746_A750>IP 13550 2237_2252>T E746_T751>V 12386 2235_2251>AATTC E746_T751>IP 13552 2235_2255>AAT E746_S752>I 12385 2237_2253>TTGCT E746_T751>VA 12416 2237_2257>TCT E746_P753>VS 18427 2238_2252del15 L747_T751del 23571 2239_2256>CAA L747_S752>Q 12403 Exon 20 mutace T790M, S768I, exon 20 inserce 2303G>T S768I 6241 2369C>T T790M 6240 2319_2320insCAC H773_V774insH 12377 2310_2311insGGT D770_N771insG 12378 2307_2308ins9GCCAGCGTG V769_D770insASV 12376 2309_2310AC>CCAGCGTGGAT V769_D770insASV 13558 2311_2312ins9GCGTGGACA D770_N771insSVD 13428 Exon 21 mutace L858R 2573T>G L858R 6224 2573_2574TG>GT L858R 12429 Tab.č.3: Mutace detekované testem - cobas EGFR Mutation Test. (55) 46

3.2 FISH metoda FISH - fluorescenční in situ hybridizace je velmi citlivá molekulárně - cytogenetická metoda. Umoţňuje lokalizaci a identifikaci sekvence nukleotidů v DNA. Principem metody je hybridizace fluorescenčně značených sond podle pravidla komplementarity přímo na vyšetřovanou DNA. Jednořetězcové DNA sondy se v současnosti nejvíce vyuţívají fluorescenčně značené o velikosti 200 300 kb. Při zvýšené teplotě 72-75 C dochází k denaturaci. Vlákna vyšetřované DNA se rozvolní a po ochlazení sonda hybridizuje s vyšetřovaným úsekem DNA. Takto dojde k označení a k následné vizualizaci cílových úseků vyšetřované DNA. Ve fluorescenčním mikroskopu se projeví barevným hybridizačním signálem. V digitální podobě jsou tyto signály snímány CCD kamerou a následně archivovány. Podle charakteru cílového úseku DNA lze sondy rozdělit do tří skupin: satelitní (centromerické, telometrické) sondy - hybridizují se satelitními sekvencemi v centromerických a heterochromatických oblastech. Vyuţívají se k vyšetření aneuploidií chromosomů, k identifikaci původu marker chromosomů v jádrech i mitózách, k hodnocení mozaicistu. lokus specifické sondy hybridizují s jedinečnými sekvencemi DNA. Vhodné pro vyšetření mikrodelecí, translokací a detekcí amplifikace onkogenů v jádrech i mitózách. celochromosomové (malovací) sondy hybridizují s mnohočetnými chromosomovými sekvencemi, lze jimi označit téměř celý chromosom. Umoţňují vyšetření chromosomových přestaveb pouze na metafázních chromosomech. K výhodám této metody se řadí zejména moţnost analýzy buněk v interfázi, rychlá diagnostika velkého mnoţství materiálů, vyšetření aberací, které nejsou klasickou cytogenetikou identifikovatelné a lokalizaci konkrétních úseků, resp. aberací na jednotlivých chromosomech. 47

3.2.1 Přístroje a pomůcky vodní lázeň (MEMMERT) termostat (JOUAN INCUCELL) ph metr (MAURICIUS) mikrocentrifuga (EPPENDORF) nahřívací plotýnka (THERM 01) laminární box (JOUAN MSC. 12 BIOHAZARD) skleněné kyvety (MERCI s.r.o.) skleněné odměrné válce (MERCI s.r.o.) skleněné zkumavky (MERCI s.r.o.) dávkovač (MERCI s.r.o.) digitální váhy EK 200 G digitální pipeta (NICHIRYO) petriho misky skleněné pasteurové pipety stojan na zkumavky chirurgické pinzety chirurgické nůţky jednorázové rukavice hybridizer (ThermoBrite - ABBOTT MOLECULAR) fluorescenční mikroskop s odpovídajícím filtrem a imerzním objektivem (Olympus CK 30 F200) 3.2.2 Materiál a reagencie DNA sonda (ON ALK (2p23) Break KREATECH Diagnostic), DNA sonda (ON EGFR, Her-1 (7p11) / SE 7 - KREATECH Diagnostic), Pepsin (DAKO), fluorescenční barvivo DAPI II.(VYSIS), neiontový detergent NP 40 (VYSIS), oplachovací pufr 20 x SSC salts (VYSIS), thiokyanát sodný NaSCN, dihydrát citrátu sodného - HOC(COONa)(CH 2 COONa) 2.2H2O, chlorid sodný NaCl, chlorid draselný KCl, dodekahydrát hydrogenfosforečnanu sodného - Na 2 HPO 4.12H 2 O, dihydrogenfosforečnan sodný - KH 2 PO 4, formaldehyd CHOH, fyziologický roztok - 0,9 % 48

NaCl, 96 % xylen C 6 H 4 (CH 3 ) 2, ethanol C 2 H 5 OH, imerzní olej (Olympus), deionizovaná voda, vlhká komůrka, HCl a NaOH na úpravu ph roztoků, podloţní a krycí sklíčka, lepidlo - Fixogum, mikropipety a příslušné špičky, mikrocentrifugační zkumavky, barvicí kyvety, teploměr, buničina či filtrační papír 3.2.3 Příprava roztoků 20x koncentrovaný SSC 175 g NaCl 88 g dihydrátu citrátu sodného Vše jsem rozpustila v 900 ml deionizované vody, upravila ph na 5,3 a doplnila do 1000 ml. 10x koncentrovaný PBS 80 g NaCl 2 g KCl 32,1 g Na 2 HPO 4.12H 2 O 2 g KH 2 PO 4 Po rozpuštění jsem doplnila do 1000 ml aqua pro injectione. Oplachovací pufr (2x SSC, ph 7,0) Zředěním 10x jsem připravila oplacovací pufr. A následným upravením ph ze zásobního 20x koncentrovaného SSC. Okyselený fyziologický roztok Fyziologický roztok, upravený na ph 2,0 pomocí HCl. Proteáza Bezprostředně před pouţitím jsem rozpustila 25 mg pepsinu (katalytická aktivita 2500-3000 U/mg) v 50 ml okyseleného fyziologického roztoku vytemperovaného na 37 ± 1 C. Mírně jsem vše promíchala. Toto mnoţství vystačí na deparafinizaci 6 preparátů v 1 kyvetě. 10 % formalín (4 % pufrovaný formaldehyd) 4 ml formaldehydu doplníme do 100 ml 1x PBS. 49

Pepsin 20 µl 10 % pepsinu jsem nepipetovala do kyvety s 40 ml 0,01 M HCl, pepsin jsem rozpustila před pouţitím v 50 ml fyziologického roztoku (roztok 0,1 M HCl termostatu vytemperovaný na 37 C) Pufrující neutrální roztok formalínu Smícháním 48 ml PBS roztoku s 2 ml formaldehydu. Promývací roztok I (0,4x SSC / 0,3% NP - 40) Smícháním 20 ml 20x SSC a 3 ml NP - 40 jsem připravila roztok. Doplnila do cca 900 ml purifikovanou vodou a upravila jsem ph na 7,0-7,5. Doplnila do 1000 ml. Promývací roztok II (2x SSC / 0,1% NP - 40) Připravila jsem smícháním 100 ml 20x SSC a 1 ml NP - 40. Doplnila jsem cca do 900 ml purifikovanou vodou a upravila jsem ph na 7,0 ± 0,2 C. 3.2.4 Klinický materiál 3.2.4.1 Příprava parafinového řezu Parafínové řezy, připravené na kladně nabitém skle, jsem inkubovala na vyhřívané plotýnce při teplotě 56 C přes noc v termostatu. Záměrem tohoto vyhřívání bylo dosáhnout rovnoměrné a pevné adheze tkáně na podloţku. Při deparafinizaci tkáňových řezů jsem inkubovala zahřátá skla v xylenu po dobu 10 min při laboratorní teplotě. Opakovala jsem 3x, vţdy s novým xylenem. Dále jsem inkubovala preparáty v 96 % etanolu po dobu 5 min při laboratorní teplotě. Opakovala jsem 2x. Provedla jsem vysušení preparátů na vyhřívané plotýnce při 45 50 C po dobu 2-5 min. Dále jsem inkubovala preparáty v následujících roztocích: 0, 2 M HCl po dobu 20 min, deionizovaná voda - 3 min, oplachovací pufr - 3 min, roztok NaSCN při 80 C ve vodní lázni po dobu 35 min, oplach preparátu v deionizované vodě - 1 min, v oplachovacím pufru - 5 min. Opakovala jsem 2x. Po vyjmutí skel z kyvety jsem preparáty nechala stéci přes roh skla na buničinu. Natrávení preparátu probíhalo v roztoku pepsinu nebo v roztoku proteázy při 37 C v termostatu cca 40-45 min. Následně jsem promyla preparáty v oplachovacích pufrech 2x po dobu 5 min. Vysušení probíhalo na vyhřívané plotně při 45 50 C po dobu 2-5 min. Posléze jsem preparáty fixovala 50

v 10 % roztoku formalínu. Následoval oplach v splachovacím pufru 2x po dobu 5 min a oplach preparátu v neionizované vodě rovněţ po dobu 5 min. Po osušení byly preparáty připravené pro následné provedení hybridizace. Sondu jsem ponechala temperovat na pokojovou teplotu, po promíchání na vertexu a centrifugaci 2 3 sekundy pomocí stolní mikrocentrifugy, jsem aplikovala 10 µl sondy na sklo se vzorkem a překryla jsem ho krycím sklíčkem. Okraje překrytého preparátu jsem zalepila tenkou vrstvou lepidla Fixogum. A následně jsem nechala preparáty společně kodenaturovat při 85 C pomocí přístroje ThermoBride po dobu 1 min. Přes noc ve tmavé, vlhké komůrce při 37 C jsem ponechala preparáty inkubovat hybridizovat. 3.2.4.2 Odmytí nenavázané sondy Po uplynutí hybridizační doby jsem opatrně pinzetou odstranila lepidlo z okrajů krycího sklíčka na preparátu. Preparát jsem ponořila do promývacího roztoku I. (0,4x SSC / 0,3 % NP - 40), vyhřátého na 73 ± 1 C a poté inkubovala 2 min. Mokrý, mírně okapaný preparát jsem přenesla do promývacího roztoku II (2x SSC / 0,1 % NP - 40), opět 2 minuty inkubace. Lehce jsem osušila přitisknutím hrany skla na savou podloţku a nechala volně zaschnout na tmavém místě. 3.2.4.3 Barvení preparátu Poté jsem na preparát nanesla 10 µl barviva DAPI II. Překryla jsem krycím sklíčkem. Aby nedošlo k posunu skla a znehodnocení preparátu, okraje se mohou překrýt tenkou vrstvou laku na nehty. 3.2.4.4 Skladování a vyhodnocení preparátu Hybridizované preparáty uchováváme v krabičce v lednici při teplotě 4 C. Takto připravený preparát lze po vytemperování na pokojovou teplotu zhodnotit pomocí fluoračního mikroskopu vybaveného odpovídajícími filtry Spektrum Orange (emisní / excitační maximum pro značenou fluorochrom Orange sondu je 588 nm / 559nm) a Spektrum Green (emisní / excitační maximum pro značenou fluorochrom Green sondu je 524 nm / 497 nm). 51

Obr. č. 11: Detekce polysomie chromosomu 7 metodou FISH. Obr. č. 12: Detekce amplifikace EGFR genu na chromozomu 7p12 metodou FISH. 52

Obr. č. 13: Detekce přestavby ALK genu. 53

4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST V této části bakalářské práce jsem se zaobírala vyhodnocením případných mutací v EGFR genu, za pomocí detekce amplifikace specifické sekvence DNA metodou RT PCR a metodou FISH pro detekci chromosomových aberací u genů EGFR a přestavby ALK genu. PO- ROK POH- TYP RT - PCR FISH FISH FISH ČET NARO- LAVÍ MATE- mutace amplifikace polysomie 7 přestavba ALK ZENÍ RIÁLU EGFR genu EGFR chromosomu 1. 1937 M S-PB W-T nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 2. 1952 Ţ S-PB W-T x 4,3 negativní 3. 1945 Ţ PB W-T negativní negativní negativní 4. 1926 M S-PB W-T negativní negativní negativní 5. 1951 M S-PB W-T 31 x negativní 6. 1931 M PB W-T nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 7. 1942 M S-PB W-T negativní negativní negativní 8. 1953 Ţ S-PB W-T negativní negativní negativní 9. 1943 M PB W-T negativní negativní negativní 10. 1953 M PB W-T 7,76 5,04 negativní 11. 1949 M PB W-T 5,6 4,3 negativní 12. 1936 M S-PB W-T 6 x negativní 13. 1949 M S-PB W-T negativní negativní negativní 14. 1946 Ţ S-PB W-T 4,4 x negativní 15. 1942 M S-PB W-T nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 16. 1946 M S-PB W-T negativní negativní negativní 17. 1942 M S-PB W-T negativní negativní negativní 18. 1945 M PB L858R negativní negativní negativní 19. 1962 M PB W-T negativní negativní negativní 20. 1931 Ţ S-PB W-T x 4,3 negativní 21. 1940 M S-PB W-T 6,2 5,28 negativní 22. 1947 M PB W-T negativní negativní negativní 23. 1944 M PB W-T negativní negativní negativní 24. 1953 M S-PB W-T negativní 5,16 negativní 54

25. 1932 M S-PB W-T nehodnoceno nehodnoceno hraniční 8 %, málo nádorových buněk 26. 1947 M S-PB W-T x 4,32 negativní 27. 1939 M S-PB W-T ex 19 W-T ex 21 nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 28. 1941 Ţ S-PB W-T x 4,74 negativní 29. 1947 M S-PB W-T x 4,3 negativní 30. 1940 M S-PB W-T x 5,02 negativní 31. 1952 Ţ S-PB W-T negativní negativní negativní 32. 1939 M PB W-T nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 33. 1956 M S-PB L858R nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 34. 1942 M S-PB W-T x 5,7 38 % přestavba 35. 1948 M S-PB W-T negativní negativní negativní 36. 1938 M S-PB W-T málo materiálu málo materiálu 14 % přestavba 37. 1941 Ţ PB W-T x 4,12 negativní 38. 1940 Ţ S-PB W-T málo materiálu málo materiálu málo materiálu 39. 1947 M S-PB W-T 4,6 5,56 negativní 40. 1932 Ţ PB W-T negativní negativní negativní 41. 1949 M S-PB W-T 4,42 6,78 negativní 42. 1952 M PB W-T 4,48 x negativní 43. 1942 M S-PB W-T negativní negativní negativní 44. 1947 Ţ S-PB del.-ex19 málo materiálu málo materiálu málo materiálu 45. 1948 M S-PB L858R nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 46. 1947 Ţ S-PB L858R x 4,36 negativní 47. 1941 M S-PB W-T negativní negativní negativní 48. 1961 M S-PB W-T x 5,36 negativní 49. 1948 M PB W-T negativní negativní nehybridizuje 50. 1939 M S-PB W-T ex 19 neúspěšná amplifikace nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 51. 1940 M S-PB W-T x 4,78 negativní 52. 1938 M S-PB W-T negativní negativní negativní 53. 1926 M S-PB W-T málo materiálu málo materiálu málo materiálu 54. 1947 M S-PB W-T x 4,9 negativní 55. 1954 M PB W-T 6,32 x negativní 56. 1937 M PB W-T x 4,28 negativní 57. 1947 Ţ PB W-T x 5,68 negativní 55

58. 1943 M S-PB W-T negativní negativní negativní 59. 1931 M S-PB W-T 5,1 6,36 negativní 60. 1943 M S-PB W-T x 4,3 negativní 61. 1950 M S-PB W-T x 5,6 negativní 62. 1957 M S-PB W-T 5,2 x negativní 63. 1945 M S-PB W-T 5,06 x negativní 64. 1937 M S-PB W-T negativní negativní 23 % přestavba 65. 1937 M S-PB W-T x 4,5 negativní 66. 1951 Ţ S-PB W-T ex 19 W-T ex 21 málo materiálu málo materiálu málo materiálu 67. 1932 M S-PB W-T x x 46% přestavba 68. 1958 M PB W-T 7,2 x negativní 69. 1961 Ţ PB W-T málo materiálu málo materiálu málo materiálu 70. 1958 Ţ PB W-T nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 71. 1932 Ţ PB W-T ex 19 W-T ex 21 málo materiálku málo materiálu málo materiálu 72. 1965 Ţ S-PB W-T málo materiálu málo materiálu málo materiálu 73. 1952 M PB W-T negativní negativní negativní 74. 1937 M PB W-T negativní negativní negativní 75. 1938 M S-PB W-T ex 19 W-T ex 21 nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 76. 1950 M S-PB W-T nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 77. 1953 Ţ S-PB inzerce v exonu 20 nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 78. 1942 M S-PB W-T ex 19 W-T ex 21 nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 79. 1930 M S-PB W-T 4,2 x 22 % přestavba 80. 1952 Ţ S-PB W-T negativní negativní negativní 81. 1946 Ţ S-PB poţadavek na vyšetření změněn na IHC EGFR receptorů 82. 1935 Ţ S-PB W-T nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 83. 1973 Ţ PB W-T negativní negativní negativní 84. 1973 M S-PB W-T negativní negativní negativní 85. 1942 M S-PB W-T nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 86. 1944 M S-PB W-T ex 19 W-T ex 21 negativní negativní negativní 56

87. 1950 M S-PB W-T ex 19 W-T ex 21 4,6 x x 88. 1954 Ţ PB W-T negativní negativní negativní 89. 1947 M S-PB W-T negativní negativní negativní 90. 1956 M S-PB W-T ex 19 W-T ex 21 málo materiálu málo materiálu málo materiálu 91. 1945 M PB W-T málo materiálu málo materiálu málo materiálu 92. 1943 M S-PB W-T ex 19 W-T ex 21 málo materiálu. málo materiálu. málo materiálu 93. 1947 M PB W-T x 4,42 32 % přestavba 94. 1945 Ţ PB W-T nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 95. 1959 M PB W-T x 7,1 x 96. 1944 Ţ S-PB W-T nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 97. 1944 M S-PB W-T nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 98. 1940 M S-PB W-T nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 99. 1937 M S-PB W-T ex 19 W-T ex 21 nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 100. 1941 M PB W-T nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 101. 1951 M PB W-T ex 19 W-T ex 21 nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 102. 1952 Ţ PB W-T negativní negativní negativní 103. 1954 Ţ PB W-T negativní negativní negativní 104. 1950 Ţ PB L858R málo matriálu málo matriálu málo matriálu 105. 1945 Ţ S-PB del.-ex19 18 x negativní W-T ex 19 negativní negativní negativní 106. 1933 Ţ S-PB W-T ex 21 107. 1955 M PB W-T negativní negativní negativní 108. 1925 M PB W-T x 6 negativní 109. 1964 M PB W-T negativní negativní negativní 110. 1943 M PB W-T negativní negativní negativní 111. 1953 Ţ PB del.-ex19 málo matriálu málo matriálu málo matriálu 112. 1925 M S-PB W-T x 6 negativní 113. 1949 Ţ PB neúspěšná amplifikace málo matriálu. málo matriálu málo matriálu 114. 1941 M S-PB W-T negativní negativní negativní 115. 1958 Ţ S-PB W-T nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 116. 1943 Ţ S-PB W-T málo matriálu málo matriálu málo matriálu 117. 1951 Ţ PB W-T nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 118. 1949 M PB W-T negativní 5,9 negativní 119. 1972 Ţ PB W-T negativní negativní negativní 57

120. 1944 M S-PB W-T nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 121. 1950 M S-PB W-T negativní negativní negativní 122. 1934 M PB W-T nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 123. 1948 M S-PB W-T negativní negativní 17 % přestavba 124. 1966 Ţ PB W-T negativní negativní negativní 125. 1948 M S-PB W-T negativní negativní negativní 126. 1928 Ţ S-PB W-T negativní negativní negativní 127. 1937 M S-PB W-T negativní negativní negativní 128. 1944 Ţ S-PB del.-ex19 negativní negativní 16 % přestavba. 129. 1942 M S-PB W-T 6,1. 4,7. negativní 130. 1931 Ţ S-PB W-T negativní negativní negativní 131. 1946 M S-PB W-T negativní 5,8. negativní 132. 1950 Ţ S-PB W-T 8,78 negativní negativní 133. 1937 M S-PB invalid negativní negativní negativní 134. 1937 Ţ S-PB W-T málo materiálu málo materiálu málo materiálu 135. 1947 Ţ S-PB W-T negativní negativní negativní 136. 1931 M S-PB W-T negativní negativní negativní 137. 1947 M S-PB W-T málo materiálu málo materiálu málo materiálu 138. 1955 Ţ S-PB W-T x x x 139. 1947 M S-PB W-T negativní 4 22 % přestavba 140. 1944 Ţ S-PB G719X negativní 4,4 negativní 141. 1956 Ţ PB W-T 7,6 negativní negativní 142. 1953 M PB W-T málo materiálu málo materiálu málo materiálu 143. 1958 Ţ S-PB W-T 8,6 4,8 negativní 144. 1940 M S-PB W-T negativní negativní negativní 145. 1958 Ţ PB W-T negativní negativní 22 % přestavba 146. 1938 M PB W-T 7 4,1 19 % přestavba 147. 1952 M S-PB W-T negativní 5,8 negativní 148. 1937 M S-PB W-T negativní negativní negativní 149. 1947 M S-PB del.-ex19 málo materiálu málo materiálu málo materiálu 150. 1955 M S-PB inzerce v exonu 20 málo materiálu málo materiálu málo materiálu 151. 1951 M PB W-T málo materiálu málo materiálu málo materiálu 152. 1941 M PB W-T nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 153. 1951 M PB W-T negativní 4,98 negativní 154. 1935 Ţ S-PB W-T negativní 4,2 negativní 155. 1950 M S-PB W-T nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 156. 1952 M PB W-T negativní 4 negativní 157. 1953 M S-PB W-T negativní negativní negativní 158. 1954 Ţ S-PB W-T ex 19 nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 58

W-T ex 21 159. 1939 Ţ S-PB W-T negativní negativní negativní 160. 1956 M S-PB W-T negativní negativní 15 % přestavba 161. 1947 M S-PB W-T 4,46 negativní 15 % přestavba 162. 1935 Ţ S-PB W-T negativní negativní negativní 163. 1940 M PB W-T negativní 7,5 negativní 164. 1940 M PB del.-ex19 negativní 4,12 negativní 165. 1970 Ţ S-PB W-T negativní negativní 80 % přestavba 166. 1940 M S-PB W-T 9,94 negativní negativní 167. 1940 Ţ PB W-T ex 19 neúspěšná amplifikace nehybridizuje nehybridizuje nehybridizuje 168. 1944 Ţ S-PB W-T x 4,3 negativní 169. 1949 M S-PB W-T negativní negativní negativní 170. 1952 M S-PB W-T negativní negativní negativní 171. 1947 M S-PB W-T negativní 4,6 negativní 172. 1937 M PB neúspěšná amplifikace málo materiálu málo materiálu málo materiálu 173. 1941 Ţ S-PB W-T negativní 5,16 negativní 174. 1945 Ţ S-PB W-T negativní negativní 30 % přestavba 175. 1944 M S-PB W-T negativní málo materiálu. negativní 176. 1951 Ţ S-PB W-T negativní negativní negativní 177. 1961 Ţ S-PB W-T negativní negativní negativní 178. 1945 M S-PB W-T negativní negativní negativní 179. 1941 Ţ PB del.-ex19 negativní negativní negativní 180. 1934 Ţ S-PB W-T x 4,82 negativní 181. 1950 M PB W-T negativní negativní negativní 182. 1939 Ţ PB W-T málo materiálu málo materiálu málo materiálu Tab.č.4: Soubor vyšetřovaných pacientů metodou RT - PCR a FISH. Statistický soubor zahrnuje 182 pacientů 120 muţů (66 %) a 62 ţen (34 %) vyšetřených v laboratoři molekulární genetiky a cytogenetiky v CGB laboratořích Ostrava, a.s. v roce 2012. (tab.č.4) (graf č.1) Bohuţel nemám k dispozici informace o vztahu konkrétních diagnostikovaných pacientů ke kouření. U těchto nemocných v roce 2012 s průměrným věkem 66,3 (mediánem 66.5) let byl histologicky či cytologicky diagnostikován maligní nádor plic. (graf č.2) 59

Klinický materiál z histologické laboratoře byl pro stanovení mutace v EGRF genu metodou RT - PCR a současně detekce amplifikace EGFR, polysomie chromosomu 7 a přestavby ALK genu metodou FISH dodáván ve formě parafinových bloků (PB), případně cytologických řezů umístěných na skle (S PB). Jednotlivé postupy práce a metody jsem popsala ve speciální části této práce. Metodou RT - PCR z 182 pacientů nebyla detekována pozitivní mutace u 160 nemocných (111 muţů a 49 ţen), coţ představuje 87,79 % wild type (divoký typ) mutace onkogenu K ras. Celkem u 15 pacientů (6 muţů a 9 ţen), coţ představuje 8,24 %, byla prokázaná pozitivní mutace EGFR genu. Byla diagnostikována u 5 (3 muţi a 2 ţeny) L858R - bodová mutace v exonu 21 EGFR genu, coţ tvoří 2,75 % pacientů. Delece v exonu 19 EGFR genu u 7 (2 muţi a 5 ţen) nemocných, coţ reprezentuje 3,84 % všech vyšetřovaných pacientů. Inzerce v exonu 20 EGFR genu u 2 pacientů (1 muţ a 1 ţena), coţ představuje 1,10 % nemocných. Mutace G719X v exonu 18 EGFR genu u 1 vyšetřované pacientky, coţ tvoří 0,55 % všech nemocných. Jeden vzorek nebyl hodnocen. (graf č.3) Současně metodou FISH byly u těchto 182 pacientů detekovány chromosomové aberace u 22 nemocných (18 muţů, 4 ţeny) tedy u 12,09 % všech pacientů. U 39 vzorků (25 muţů, 14 ţen) tedy u 21,42 % pacientů, nedošlo k hybridizaci fluorescenčně značenou sondou ve stanovené DNA. U 101 pacientů (71 muţů, 30 ţen), coţ představuje 55,50 %, byl stanoven negativní výsledek. U 20 pacientů (10 muţů, 10 ţen) tedy u 10,99 % bylo na stanovení metodou FISH dodáno málo vzorku. Jeden vzorek nebyl vyhodnocen. (graf č.4) Polysomie chromosomu 7 metodou FISH byla diagnostikována u 46 pacientů (34 muţů, 12 ţen) tedy u 25,27 % nemocných. U 36 (26 muţů, 10 ţen), u 19,78 % pacientů nedošlo k hybridizaci. Negativní výsledek byl stanoven u 75 pacientů (47 muţů, 28 ţen) coţ znázorňuje 41,21 % všech pacientů. U 24 pacientů (16 muţi, 8 ţen) tedy u 13,18 % bylo na stanovení polysomie chromosomu 7 metodou FISH dodáno málo vzorku. Jeden vzorek nebyl hodnocen. (graf č.5) Metodou FISH byla detekována přestavba ALK genu u 19 nemocných (11 muţů, 8 ţen), coţ představuje 10,44 %. U 32 (23 muţů, 9 ţen) tedy u 17,59 % pacientů, nedošlo k hybridizaci. Negativní výsledek byl stanoven u 113 pacientů (78 muţů, 35 ţen), coţ reprezentuje 62,08 % všech pacientů. A u 17 pacientů (9 muţů, 8 ţen), tedy u 9,34 % všech vyšetřovaných pacientů bylo dodáno málo materiálu ke stanovení. Jeden vzorek nebyl hodnocen. (graf č.6) 60

Byl prokázán metodou RT - PCR častější výskyt mutací genu EGFR s wild type mutacemi onkogenu K ras u 161 pacientů (112 muţů, 49 ţen), coţ zaujímá 88,54 %, který však v současnosti nemá v klinické diagnostice relevantní roli. Informuje o horší prognóze. Současně metodou FISH byly detekovány chromozomální aberace amplifikace EGFR genu na chromosomu 7p 12 u 22 nemocných (18 muţů, 4 ţeny). Detekce polysomie chromosomu 7 metodou FISH byla diagnostikována u 46 pacientů (34 muţů, 12 ţen). A detekována metodou FISH byla přestavba ALK genu u 19 nemocných (11 muţů, 8 ţen). U těchto pacientů při zavedení cílené léčby tyrozinkinázovými inhibitory, které brání aktivaci kaskády receptoru EGFR, dochází ke sníţení proliferace nádorových buněk, ke stabilizaci a zlepšení kvality a délky ţivota. Graf č.1: Soubor vyšetřených pacientů v celých číslech. 61

Graf č.2: Soubor vyšetřených pacientů dle věkových kategorií v celých číslech. Graf č.3: Výsledky mutačních analýz metodou RT - PCR v celých číslech. 62

Graf.č.4: Amplifikace EGFR genu metodou FISH v celých číslech. Graf č.5: Detekce polysomie chromosomu 7 metodou FISH v celých číslech. 63

Graf č.6: Detekce přestavby ALK genu metodou FISH v celých číslech. 64

5 STUDIE 5.1 Mutace genu EGFR u pacientů s pokročilým NSCLC Tato studie se zaobírala zmapováním incidence mutací genu EGFR u pacientů v naši populaci s pokročilým NSCLC a posouzením jejich vlivu na efekt léčby EGFR - TKI. Veškeré informace jsou čerpány z časopisu Klinická onkologie, coţ je oficiální časopis České onkologické společnosti ČLS JEP a Slovenské onkologické společnosti SLS. (54) Genetické vyšetření - delece v 19 exonu a bodová mutace v 21 exonu, byly provedeny u 613 pacientů v letech 2002 2012 s pokročilým NSCLC - stadium IIIB, IV. U 73 (11,9 %) pacientů byla prokázaná mutace genu EGFR, 540 (88,1 %) pacientů byli nositelé wild - type EGFR genu. U 49 byla zjištěna delece v exonu 19, bodová mutace v 21 exonu - L858R byla zjištěna u 22 pacientů, obě tyto mutace byly zjištěny u 2 pacientů. Byl dokázán častější výskyt mutací genu EGFR u pacientů s adenokarcinomem (14,9 % vs 7,8 %, p = 0,008), ţen (20,2 % vs 7,1 %, p < 0,001) a nekuřáků (29,9 % vs 7,0 %, p < 0,001). 60 pacientů s mutací genu EGFR a 350 pacientů s wild - type EGFR genem bylo následně léčeno EGFR - TKI. Medián PFS při léčbě EGFR - TKI u pacientů s mutací EGFR dosáhnul 7,2 vs 2,0 měsíce u pacientů s wild - type EGFR (p < 0,001), medián OS u pacientů s mutací EGFR činil 14,5 vs 7,5 měsíce u pacientů s wild - type EGFR (p = 0,019). Incidence mutací genu EGFR u NSCLC v naší populaci i jejich vyšší výskyt u pacientů s adenokarcinomem, ţen a nekuřáků koreluje s daty, která byla publikována v literatuře. Výsledky analýzy přeţití u nemocných léčených EGFR - TKI potvrzují vysoký potenciál aktivačních mutací EGFR pro predikci dobrého efektu terapie EGFR - TKI. (54) 65

6 DISKUZE Pozitivní mutace genu EGFR byla celkem prokázána u 8,24 % nemocných, ve srovnání s uvedenou studií, kde prezentují průkaz u 11,90 % všech geneticky vyšetřených pacientů. Delece v exonu 19 EGFR genu byla detekována u 3,85 % nemocných, ve studii byla zjištěna u 8,00 % pacientů, bodová mutace v exonu 21 u 2,75 % nemocných, ve studii uvádějí 3,60 % pacientů. Inzerce v exonu 20 EGFR genu stanovena u 1,09 % pacientů a mutace G719X v exonu 18 u 0,55 % nemocných. Tyto dvě posledně zmíněné mutace ve studii nebyly prezentovány, prokázány. U 87,79 % byl detekován wild - type (divoký typ) mutace onkogenu K ras. Ve studii uvádějí výskyt této mutace u 88,10 % nemocných. Nepochybně svou úlohu v detekci niţšího procentuálního průkazu nemocných sehrál fakt vyšetření menšího souboru pacientů a zařazení do statistických údajů také pacientů, kdy byl dodán nedostatečně reprezentativní vzorek nádorové tkáně, a proto se vyšetření nemohlo uskutečnit, případně amplifikace či hybridizace nebyla úspěšná. 66

7 ZÁVĚR Úmyslem práce bylo dostatečně senzitivní, rychlou a spolehlivou metodou prokázat amplifikace sekvencí DNA u aktivačních mutací EGFR genu metodou RT PCR. Stanovení FISH pro detekci chromosomových aberací u genu EGFR a fúze genů EML 4 ALK, které se vyskytují u pacientů s histologickým subtypem NSCLC, pro prognostický a prediktivní činitel účinné cílené terapie inhibitory tyrozinkináz. Výsledky sledovaného souboru pacientů v experimentální části této práce verifikují nezastupitelnou úlohu stanovení těchto mutací v diagnostice onemocnění, mají zásadní dopad na volbu optimální onkologické léčby. Nádory, nesoucí tyto změny, jsou senzitivní k inhibitorům tyrozinkinázové fosforylace v intracelulární oblasti EGFR, které účinně redukují proliferaci nádorových buněk, zabraňují růstu novotvaru. Tím dochází ke stabilizaci nádoru, zlepšení kvality a délky ţivota pro konkrétního pacienta. Multidisciplinární přístup v oblasti diagnostiky i léčby, mezi pneumology, patology a molekulárně genetickou či cytogenetickou laboratoří zaručuje rychlejší, citlivější a přesnou diagnostiku karcinomu plic. Závěrem lze konstatovat, ţe v současnosti probíhá intenzivní výzkum nových strategií aplikovatelných v léčbě nádorových onemocnění s dosaţením vysoké afinity k nádorové buňce a relativně nízké toxicity pro ostatní tkáně. V oblasti onkogenetiky probíhají jak genetické, tak klinické studie s dalšími preparáty cílené léčby, které budou působit na více receptoru signální dráhy buňky. 67

8 SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY 1. DVOŘÁK, K., DVOŘÁKOVÁ, Z., LUKÁŠ, Z., Základy histopatologických vyšetřovacích metod, Brno: 2008, počet stran 118 2. ECKSCHLAGER, T., PRŮŠA, R., Laboratorní vyšetření v onkologii, Praha: Triton, 2002, počet stran 254, ISBN 80-7254-18-62 3. KLEIN, J., Chirurgie karcinomu plic, Praha: GRADA, 2006, počet stran 220, ISBN 80-247-1384-5 4. KLÉNER, P., Základy klinické onkologie, Praha: GALÉN Karolinum, 2002, počet stran 686, ISBN 978-80-7262-716-5 5. KOČÁREK, E., Molekulární biologie v medicíně, NCONZO: Brno 2007, počet stran 216, ISBN 978-80-7013-450-4 6. KOLÁŘ, Z., Molekulární patologie nádorů, Olomouc: EPAVA, 2003, počet stran 168, ISBN 80-86297-15-2 7. KONRÁDOVÁ, V., UHLÍK, J., VAJNER, L., Funkční histologie, Jinočany HaH: 2000, počet stran 291, ISBN 80-86022-80-3 8. LICHNOVSKÝ, V., Základy histologie pro bakaláře, Olomouc: Univerzita Palackého, 2002, počet stran 80, ISBN 80-244-0439-7 9. MÁČÁK, J., MAČÁKOVÁ, J., Patologie, Praha: GRADA, 2004, počet stran 347, ISBN 80-247-0785-3 10. MARTÍNEK, J., VACEK, Z., Histologický atlas, Praha: GRADA, 2009, počet stran 134, ISBN 978-80-247-2393-8 11. PEŠEK, M., Bronchogenní karcinom, Praha: GALÉN, 2002, počet stran 235, ISBN 80-7262-115-7 12. PEŠEK, M., Farmakoterapie-reprint Gefitinib, 2/2010, ročník 6, strany 145-148 13. POVÝŠIL, C., ŠTEINER, I., Speciální patologie, Praha: GALÉN: Karolinum, 2009, počet stran 430, ISBN 978-80-7262-494-2 14. STRIČKOVÁ, J., BABIČKOVÁ, L., TOMIŠKOVÁ, M., Biologická léčba nemalobuněčného karcinomu plic - interní med., 2011; 13(7,8): strany 292 295. 15. ŠEBESTOVÁ, R., Histologické návody a praktické cvičení, LF MU Brno 2007, počet stran 71 16. ŠIMIČKOVÁ, M., NEKULOVÁ, M., Roche Nádorové markery, Praha, počet stran 45 68

17. UVÍROVÁ, M., Kvalitní mezioborová spolupráce, Zdravotnické noviny, Lékařské listy 4/2012 18. VACEK, Z., Histologie a histologická technika, Díl 1, Brno: PROTISK Slavkov, 1996, počet stran 332, ISBN 80-7013-201-9 19. VACEK, Z., Histologie a histologická technika, Díl. 2, Brno: PROTISK Slavkov, 1995, počet stran 184, ISBN 80-7013-202-7 20. ZATLOUKAL, P., PETRUŢELKA, L., Karcinom plic, Praha: Grada Publishing, 2001, počet stran 367, ISBN 80-7169-819-9 21. ZATLOUKAL, P., Biologická léčba nemalobuněčného karcinomu plic, Onkologie 2009; 3(5): 292 296. INTERNETOVÉ ZDROJE: 22. http://www.wikiskripta.eu/index.php/pl%c3%adce [cit. 12.11.2012] 23. http://cs.wikipedia.org/wiki/pl%c3%adce [cit. 10.11.2012] 24. http://www.kst.cz/web/?page_id=2201 [cit. 10.11.2012] 25. http://www.med.muni.cz/patanat/plice.html [cit. 10.11.2012] 26. www.svod.cz [cit. 18.11.2012] 27. http://www.mou.cz/cz/nadory-plic/article.html?id=36 [cit. 14.12.2012] 28. http://www.remedia.cz/okruhy-temat/onkologie/vyznam-signalni-cesty-egfr-aprediktivni-markery-cilene-lecby-u-karcinomu-hlavy-a-krku/8-1h-yt.magarticle.aspx [cit. 3.1.2013] 29. http://www.eonkologie.cz/cs/2012-4/2012-04-fiala [cit. 7.1.2013] 30. http://is.muni.cz/th/323869/prif_b_a2/signalni_drahy_egfr_rodiny_u_nadoru_cns.pdf [cit. 4.3.2013] 31. http://theses.cz/id/19ogqk/diplomova_prace_em.pdf [cit. 7.3.2013] 32. http://www.internimedicina.cz/pdfs/int/2011/07/04.pdf [cit. 7.3.2013] 33. http://www.linkos.cz/files/klinicka-onkologie/175/4154.pdf [cit. 8.3.2013] 34. http://www.mou.cz/casopis-klinicka-onkologie-6--2008/file.html?id=561 [cit. 12.3.2013] 35. http://lem.ocol.cz/cs/info/detekce-bodovych-a-delecnich-mutaci-genu-egfr1-a-genu-k-ras [cit.17.3.2013] 36. http://theses.cz/id/297ymw/bakalarska_prace_anna_machalkova_pdf.pdf [cit. 12.3.2013] 37. http://www.cytologietrutnov.cz/co_jsou_cytologie.htm [cit. 7.1.2013] 69

38. http://www.pathology.cz/media/laboratorni-prirucky/c-plaboratorni_prirucka_patologie.pdf [cit. 8.1.2013] 39. http://www.pathology.cz/laboratore/molekularni-genetika/vysetreni [cit. 7.1 2013] 40. http://www.tribune.cz/clanek/28582-crizotinib-ve-znameni-personalizace [cit. 24.3.2013] 41. http://www.tribune.cz/clanek/25848-lecba-v-md-anderson-neni-nic-exkluzivnihoonkologove-by-se-meli-oprostit-od-porazenectvi [cit. 24.3.2013] 42. http://www.generi-biotech.com/real-time-pcr-sondy-kvantitativni-real-time-pcr/ [cit. 25.3.2013] 43. http://www.linkos.cz/slovnicek/?wizard_filter_item_glossary_name=biopsie [cit. 12.3.2013] 44. http://rakovinaplic.cz/vysetrovaci-metody/ [cit. 7.1.2013] ZDROJE OBRAZOVÉ DOKUMENTACE: 45. www.google.cz/search?q=anatomie+plic [cit. 17.11.2012] 46. http://old.lf3.cuni.cz/histologie/atlas/demo/26/ipage00024.htm [cit. 17.11.2012] 47. http://old.lf3.cuni.cz/histologie/atlas/demo/26/ipage00027.htm [cit. 17.11.2012] 48. http://old.lf3.cuni.cz/histologie/atlas/demo/26/ipage00001.htm [cit. 17.11.2012] 49. http://cancergrace.org/lung/2009/03/20/np-egfr-muts-demystified/ [cit. 7.3.2013] 50. http://www.jst.go.jp/en/seika/01/seika18.html [cit. 7.3.2013] 51. http://www.mycancergenome.org/content/disease/lung-cancer/egfr/5 [cit. 12.3.2013] 52. http://cancergrace.org/lung/files/2012/04/slide10.jpg [cit. 24.3.2013] 53. http://oceanexplorer.noaa.gov/explorations/04etta/background/dna/media/dna_1.html [cit. 25.3.2012] 54. http://www.linkos.cz/files/klinicka-onkologie/171/4016.pdf [cit. 30.3.2013] Klin Onkol 2012; 25(4): 267 273 ZDROJE - TABULKY: 55. http://www.roche-diagnostics.cz/download/mol/geneticke/cobas_egfr_ce-ivd- CZ3.0.pdf [cit. 1.3.2013] ZDROJE PŘÍLOHY: 56. http://www.svod.cz/analyse.php?modul=incmor# [cit. 18.11.2012] 57. http://www.svod.cz/graph/ [cit. 18.11.2012] 70

58. http://www.svod.cz/analyse.php?modul=incmor# [cit. 18.11.2012] 59. http://www.svod.cz/analyse.php?modul=trendy# [cit. 18.11.2012] 60. http://www.svod.cz/analyse.php?modul=stadia# [cit. 18.11.2012] 61. http://www.svod.cz/analyse.php?modul=vek# [cit.19.11.2012] 62. http://www.svod.cz/analysez.php# [cit. 19.11.2012] 63. http://www.svod.cz/analyse.php?modul=regionprehled# [cit. 19.11.2012] 71

9 SEZNAM PŘÍLOH Příloha č. 1: Incidence a mortalita v ČR od roku 1999 aţ 2009 u diagnózy: C34 Zhoubný novotvar průdušky bronchu a plíce (absolutní počty) (1) (58) C34 - ZN průdušky - bronchu a plíce Časový vývoj, Počet případů Rok 1999 2000 2001 2002 2003 Incidence 5984 6100 5984 6014 6063 Mortalita 5532 5453 5353 5308 5220 Rok 2004 2005 2006 2007 2008 2009 Incidence 6336 6312 6244 6531 6553 6422 Mortalita 5309 5205 5304 5421 5522 5412 72

Příloha č. 2: Incidence a mortality v ČR od roku 1999 aţ 2009 u diagnózy: C34 Zhoubný novotvar průdušky bronchu a plíce (přepočet na 100 000 osob) (58) (57) C34 - ZN průdušky - bronchu a plíce Časový vývoj, Počet případů na 100 000 osob Rok 1999 2000 2001 2002 2003 Incidence 58.22 59.38 58.63 58.94 59.37 Mortalita 53.82 53.08 52.45 52.02 51.12 Rok 2004 2005 2006 2007 2008 2009 Incidence 61.99 61.57 60.7 62.91 62.6 61.12 Mortalita 51.94 50.78 51.56 52.22 52.75 51.51 73

Příloha č. 3: Index růstu incidence od roku 1999 aţ 2009 v ČR u diagnózy: C34 Zhoubný novotvar průdušky bronchu a plíce (absolutní počet) (59) (57) C34 - ZN průdušky - bronchu a plíce index růstu incidence k roku 1999, index růstu v absolutních počtech Rok 1999 2000 2001 2002 2003 Index růstu 0 116 0 30 79 Rok 2004 2005 2006 2007 2008 2009 Index růstu 352 328 260 547 569 438 74

Příloha č. 4: Index růstu incidence od roku 1999 aţ 2009 v ČR u diagnózy: C34 Zhoubný novotvar průdušky bronchu a plíce ( v procentech) (59) (57) C34 - ZN průdušky - bronchu a plíce časový trend ve vývoji incidence k roku 1999, index růstu v procentech Rok 1999 2000 2001 2002 2003 Index růstu (%) 0 1.94 0 0.5 1.32 Rok 2004 2005 2006 2007 2008 2009 Index růstu (%) 5.88 5.48 4.34 9.14 9.51 7.32 75

Příloha č. 5: Vývoj zastoupení klinických stádií v procentech od roku 1999 aţ 2009 u diagnózy: C34 Zhoubný novotvar průdušky bronchu a plíce (59) C34 - ZN průdušky - bronchu a plíce vývoj zastoupení klinických stadií v procentech Rok 1999 2000 2001 2002 2003 Stadium I (%) 8.1 7.8 8 8.4 8.3 Stadium II (%) 5.7 6.4 7.3 7.1 6.2 Stadium III (%) 22.9 23.7 25.2 22.7 22.9 Stadium IV (%) 27.3 31.2 32.2 34.5 36.4 Stadium neznámo (%) 35.9 30.9 27.3 27.3 26.2 Rok 2004 2005 2006 2007 2008 2009 průměr Stadium I (%) 7.8 9.2 9.3 9 9.6 9.4 8.6% Stadium II (%) 6.5 5.5 5.7 5.5 5.7 5.9 6.1% Stadium III (%) 22.3 20.1 20.6 20.9 23.1 24.5 22.6% Stadium IV (%) 38.2 35.6 41.8 44.5 47.2 48.2 38.1% Stadium neznámo (%) 25.3 29.6 22.6 20.1 14.4 12.1 24.5% 76

Příloha č. 6: Věková struktura populace incidence pacientů v procentech u diagnózy: C34 Zhoubný novotvar průdušky bronchu a plíce (61) (57) C34 - ZN průdušky - bronchu a plíce - Incidence věková struktura populace pacientů % případů dle věkových kategorií Věková kategorie 0-4 5-9 10-14 15-19 20-24 25-29 30-34 35-39 40-44 Incidence 0% 0% 0% 0.01% 0.02% 0.06% 0.17% 0.59% 1.78% Věková kategorie 45-49 50-54 55-59 60-64 65-69 70-74 75-79 80-84 85+ Incidence 4.48% 9.05% 13.94% 16.67% 17.46% 15.93% 11.47% 5.93% 2.43% 77

Příloha č. 7: Srovnání incidence v ČR s ostatními zeměmi světa - přepočet na světový standard ASR u diagnózy: C33, C34 Zhoubný novotvar průdušnice, průdušky a plíce (62) 78

Příloha č. 8: Regionální přehled incidence dle počtu na světový standard od roku 1999 aţ 2009 u diagnózy: C34 Zhoubný novotvar průdušnice, průdušky a plíce (63) (57) C34 - ZN průdušky - bronchu a plíce - Incidence regionální přehled dle přepočtu na světový standard (ASR-W) za období 1977-2009 Kraj PHA STC JHC PLK KVK ULK LBK Hodnota 32.68 36.96 40.55 41.28 53.52 49.80 37.77 Kraj HKK PAK VYS JHM OLK ZLK MSK Hodnota 32.36 33.26 31.49 31.37 34.48 29.09 38.37 Česká republika: 36.57 79