Neplodnost Neplodnost Asistovaná reprodukce Lidská neplodnost je podle WHO považována za nemoc = stav, kdy v průběhu jednoho roku při pravidelném pohlavním styku nedojde k otěhotnění WHO dělí neplodnost do následujících kategorií: primární neplodnost sekundární neplodnost pravidelné spontánní potraty/kojenecká úmrtnost neobjasněná neplodnost (idiopatická) Mužská neplodnost genetická (autozómy, gonozómy) andrologická (poruchy reprodukčních orgánů a jejich funkcí) imunologická hormonální Hormonální poruchy vrozená porucha tvorby/sekrece gonadoliberinů (Kallmanův sy., hypogonadotropní hypogonadismus, mutace GnRH receptoru) sekundární porucha tvorby/sekrece gonadoliberinů (nádor, poranění, ozáření, systémová onemocnění) snížená tvorba hormonů hypofýzy (hypopituitarizmus) snížená sekrece testosteronu hyperprolaktinémie (nádory, léky, drogy) porucha receptorů (pro androgeny nebo hormony hypofýzy) Poruchy reprodukčních orgánů nesestouplá varlata (poškození zárodečného epitelu) varikokéla nádory a záněty varlat obstrukce vývodných cest (infekce, vazektomie, operace kýly a slepého střeva) porucha transportu spermií (ektopické vyústění uretry, deformace penisu, fimóza, anejakulace, erektilní dysfunkce) Imunologická příčina Ochrana mužských reprodukčních orgánů před vytvořením autoimunity pasivní (snížená antigennost buněk) aktivní (účast tlumivých buněk a mezibuněčných působků) seminální plazma obsahuje řadu imunosupresivních faktorů, např. cytokiny, které vznikají mezibuněčnou souhrou semenných buněk - T-lymfocytů, makrofágů, granulocytů jejich produkty (tlumivé cytokiny) chrání spermie před autoimunitním poškozením seminální plazma však obsahuje celou řadu dalších nespecifických působků (beta2-mikroglobulin, alfa2 makroglobulin, laktátdehydrogenázu, a jiné enzymy, transferin, albumin, prostaglandiny ) celkově ejakulát obsahuje > 500 bílkovinných a peptidových složek, ale jen některé jsou schopny indukovat vytváření protilátek 1
Imunologická příčina porucha hematotestikulární bariéry kontakt imunologicky chráněných povrchových epitopů spermií s imunokompetentními buňkami, které produkují příslušnou protilátku protilátky se naváží na povrch spermie a způsobí jejich aglutinaci, imobilizaci či cytotoxicitu protilátky proti spermiím shlukují spermie hlavičkami nebo bičíky nebo bičíky a hlavičkami současně neprůchodnost spermií hrdlem děložním nebo neschopnost spermie adherovat k zoně pellucidě protilátky brání progresivnímu pohybu spermií ženským pohlavním traktem, dokáží ovlivnit akrozomální reakci, zasahují do přímé fertilizace oocytu postfertilizační účinek namířený proti zygotě a proti časnému embryu v sérech pacientů nalézáme IgG protilátkový izotyp (nebo jeho kombinaci s IgA, výjimečně s IgM) v seminální plazmě převládá IgA (nebo v kombinaci s IgG vzácně s IgE) Porucha tvorby spermií vyšetření ejakulátu (spermiogram) množství, pohyblivost a morfologie spermií morfologické změny spermií (barvení) počítačová analýza motility spermií fluorescentní in situ hybridizace imunocytochemie - vyšetření pomocí monoklonálních protilátek (jakýkoli proteinový epitop) detekce intraakrozomálních proteinů (hyaluronidáza, akrozin, glukosamin) Motilita: Spermiogram a) rychlý progresivní pohyb (25µm/s = 5 délek hlavičky) b) pomalý progresivní pohyb c) pohyb na místě d) nepohyblivé spermie Morfologie: hlavička, akrozóm,krček, bičík Spermiogram Normospermie min. 20 mil./1 ml ejakulátu pohyb a+b min. 50%; patologie < 70% Oligozoospermie - < 20mil./1 ml Asthenozoospermie pohyb a+b < 50% Oligoasthenozoospermie Oligoasthenozoospermie gravis - < 5mil./1 ml Teratozoospermie patologie > 70% Kryptozoospermie spermie nalezeny až po centrifugaci Nekrozoospermie všechny spermie v ejakulátu mrtvé Azoospermie nepřítomnost spermií v ejakulátu Aspermie v ejakulátu žádné pohlavní buňky Pyospermie nadbytek leukocytů v ejakulátu Azoospermie 1. genetické vyšetření chromozomální aberace v 5-15% (z toho 91% porucha gonozómů) delece Y chr. inverze Y chr. ring Y chr. balancované translokace autozómů reciproké translokace mezi gonozómy nebo gonozómem a autozómem Robertsonovské translokace ring-chromozóm mutace v genu pro cystickou fibrózu Azoospermie Mikrodelece Y chromozómu vede k poruchám spermatogeneze na různých stupních PAR pseudoautozomální oblast na konci krátkého raménka (PAR1) obsahující sex determining region (SRY) a oblast na konci dlouhého raménka (PAR2) AZF (azoospermic factor) na dlouhém raménku (Yq11) obsahuje geny nezbytné pro spermatogenezi AZFa delece této oblasti způsobuje SCOS (Sertoli Cell Only Syndrome) = nepřítomnost spermatogonií AZFb obsahuje RBM (RNA-binding motif) exprimován u spermatogonií a primárních spermatocytů AZFc obsahuje DAZ rodinu (deleted in azoospermia) jeho proteiny potřebné ve fázi pozdních spermatid a pro tvorbu bičíku spermií 2
Y chromozóm Azoospermie Andrologická sterilita v souvislosti s genem pro cystickou fibrózu oboustranná vrozená aplázie vas deferens (CBAVD = Congenital Bilateral Absence of the Vas Deferens ) nález mutace u 20% mužů s azoospermií abnormality struktur utvářených z Wolffovy trubice (atrofie nadvarlat) vysoká četnost heterozygotního genotypu mutací F508del a R117H Azoospermie 2. andrologické vyšetření neobstrukční azoospermie snížené hodnoty FSH a testosteronu, malá varlata a nadvarlata obstrukční azoospermie vrozená získaná (vazektomie) Možnosti: MESA aspirace (nasátí) spermií z nadvarlete TESA aspirace spermií z varlete TESE extrakce spermií z tkáně varlete Ženská neplodnost hormonální (abnormální hladiny hormonů hypofýzy a vaječníků, anovulace, nedostatečná funkce žlutého tělíska) onemocnění/abnormality pohlavních orgánů (PCO, endometrióza, neprůchodnost vejcovodů, záněty, nádory) genetická imunologická předčasné ovariální selhání psychická Hormonální poruchy Smysluplné je provádět odběr krve na hormonální vyšetření 2x během menstruačního cyklu: 3. den cyklu (2.-4. den) - stanovení tzv. bazálních hormonů FSH hladina stoupá s klesající ovariální funkcí (k nastartování růstu folikulů normálně stačí nízká hladina FSH ~ 4IU/l) LH u žen trpících PCO FSH:LH > 1 = špatné výsledky i při IVF PRL - tlumí vyzrávání vajíčka ve vaječníku a menstruační cyklus a tím i možnost oplodnění, poruchy ovulace, nedostatečná tvorba ovariálních hormonů estradiol - nízká hladina vypovídá stejně jako nízká hladina FSH o dobré ovariální rezervě (norma 75-80 pg/ml) 22. den cyklu progesteron neproběhla ovulace (norma 10 ng/ml) Ženská neplodnost - anovulace Anovulace - soubor celé řady odchylek v hormonálním prostředí ženy nedostatečná funkce hypofýzy (FSH, LH) zvýšená hladina PRL ženy s polycystickými vaječníky snížená nebo zvýšená funkce štítné žlázy I. Nízká produkce estrogenů II. Neustálá sekrece estrogenů 3
Ženská neplodnost - anovulace Řešení: vyšetření hormonálního profilu (2.- 4. den MC) možnost podávání léků provokujících ovulaci = antiestrogeny (obsazují estrogenní receptory v hypofýze vzniká falešná informace o nedostatku estrogenů v organismu a dojde k vyplavení FSH) podání rfsh, hcg UZ potvrzení ovulace v půlce MC ovulační testy Ženská neplodnost PCO syndrom polycystických vaječníků (hyperandrogenní syndrom) přítomnost velkého počtu měchýřků (cyst o velikosti 2-8 mm) naplněných tekutinou anovulace oligo-/amenorrhea hypersekrece androgenů a LH metabolické abnormality hyperinsulinémie, inzulínová rezistence (riziko cukrovky nezávislé na inzulínu), dyslipidemie Řešení: podávání antiestrogenů, antiandrogenů Ženská neplodnost Neprůchodnost vejcovodů oboustranná nebo jednostranná částečná x úplná často způsobená komplikovaným průběhem zánětu slepého střeva, gynekologickými záněty v malé pánvi, sactosalpingy nebo mimoděložním těhotenstvím ve vejcovodu Diagnóza: laparoskopické vyšetření drobné srůsty lze odstranit (při úplném srůstu je jediným řešením umělé oplodnění) hysterosalpingografie Ženská neplodnost Endometrióza onemocnění, při kterém se děložní sliznice vyskytuje na pobřišnici, ve vaječnících, ale i kdekoliv jinde ložiska endometriózy reagují na hormonální změny v průběhu menstruačního cyklu tak, že v nich probíhá narůstání, přeměna a odlučování s krvácením stejně jako v děložní sliznici (tento proces poškozuje tkáně v okolí může vyvolávat bolesti a často vede k srůstům) Diagnóza laparoskopie, biopsie, ultrasonografie, sérové markery (CA-125, C-reaktivní protein) Možnosti léčby: Odstranění lézí CO 2 laserem (u mírné až střední endometriózy) Hormonálně zastavení menstruace na dobu min. půl roku těhotenství Imunologické příčiny 1. protilátky proti spermiím v oblasti cervixu, dutiny děložní, vejcovodů, v peritoneální tekutině, v séru izoimunizační proces bývá usnadněn, když partnerovi chybí v ejakulátu imunosupresivní faktor seminální plazmy v děložním hrdle nacházíme protilátky proti spermiím v izotopu IgG, IgA, vzácně IgE cervikální T-lymfocyty se účastní buňkami zprostředkované reakce namířené jak proti různým mikroorganismům, tak i proti pohyblivým spermiím podobnou účinnost mají i makrofágy některé jsou přeškolené na specifickou reakci prostřednictvím buněčných mediátorů-lymfokinů některé spermie se za zcela fyziologických podmínek dostanou až k vajíčku, jiné jsou rychle fagocytovány makrofágy nebo polymorfonukleárními leukocyty už v hrdle Imunologické příčiny 2. protilátky proti zona pelucida vysoká hladina antizonálních protilátek způsobuje zabránění vstupu spermie do vajíčka při přirozené nebo umělé fertilizaci 3. antifosfolipidové protilátky (APA) skupina imunoglobulinů namířených proti negativně nabitým buněčným fosfolipidům mohou se vázat na fosfolipidy ovariální tkáně zabraňují vytvoření a uvolnění funkčního oocytu přítomnost vysokých hladin APA je důvodem k vyšetření dalších autoprotilátkových aktivit 4. další protilátky proti trofoblastu, antiendometriální protilátky, embryocytotoxické cytokiny (u pacientek s endometriózou), nedostatek vlastních blokujících protilátek (samovolné potraty z imunologické příčiny) 4
Asistovaná reprodukce Zjištění příčiny neplodnosti: Osobní a rodinná anamnéza Vyšetření muže spermiogram, v případě špatného výsledku genetické + andrologické vyšetření Vyšetření ženy obecné gynekologické vyšetření, hormonální profil, UZ verifikace ovulace (v polovině MC) Intrauterinní insemice (IUI) IUI = zavedení kapacitovaných spermií přímo do dělohy Podmínky: normální nebo lehce snížené hodnoty spermiogramu tubární průchodnost ovulace (přirozená nebo indukovaná) Intrauterinní insemice Postup: Oddělení spermií od seminální plazmy (centrifugace) Kapacitace Zavedení do dělohy pomocí katetru zkrácení cesty k vajíčku, překonání přirozených překážek (cervikální kanálek, hlen) AIH použití spermií manžela AID použití spermií dárce In vitro fertilizace (IVF) 1. Hormonální stimulace vaječníků 2. Odběr vajíček 3. Oplození vajíček 4. Přenos embryí do děloh IVF - hormonální stimulace vaječníků zvýšení úspěšnosti léčby ve vaječnících se vyvíjí a dozrává vyšší počet vajíček podání léků obsahující gonadotropiny (FSH a LH) analoga gonadoliberinu - tlumí funkci hypofýzy a tím zabrání vyplavení hormonu, který je odpovědný za uvolnění vajíček z folikulu (zabránění prasknutí folikulů a uvolnění vajíček ještě před odběrem) GnRH agonisti - bifázické působení první dny stimulují sekreci gonadotropinů a zvyšují LH a FSH v plazmě; v další fázi jsou tyto hormony potlačovány aplikace hcg (36 hodin před odběrem vajíček) uvolnění vajíček z folikulů IVF - hormonální stimulace vaječníků Krátký protokol GnRH-a se podávají déle současně s injekcemi FSH; dlouhodobou aplikací GnRH-a dojde k útlumu funkce hypofýzy a tak by nemělo dojít k předčasnému uvolnění vajíčka z folikulů Dlouhý protokol z folikulární fáze první nebo druhý den menstruačního krvácení se aplikuje GnRH-a s dlouhodobým účinkem (snížení funkce hypofýzy jako příprava na superovulaci) za 14 18 dnů se provádí UZ vyšetření, při kterém se hodnotí děložní sliznice, ta by neměla být vyšší než 4 mm a vaječníky by neměly obsahovat žádné cysty ani folikuly větší než 10 mm; při odpovídajícím UZ nálezu a hladině estradiolu je možné aplikovat denně gonadotropiny 5
IVF - hormonální stimulace vaječníků Protokol s antagonisty GnRH antagonisti působí proti GnRH zabraňují produkci LH a tím předčasné ovulaci druhý nebo třetí den menstruace se začne aplikovat FSH po čtyřech až pěti dnech léčby se provádí UZ vyšetření jestliže jsou ve vaječnících již folikuly větší než 12 mm, začne se s aplikací antagonistů další postup je totožný jako v protokolech předchozích když při UZ vyšetření dosáhne průměr největšího folikulu nejméně 16 mm, aplikuje se hcg IVF odběr oocytů (ovum pick-up) Výkon v celkové anestezii Probíhá transvaginálně pod kontrolou ultrazvuku Odsání vajíček z folikulů i s folikulární tekutinou Okamžitá kontrola v embryologické laboratoři Oplození vajíček (fertilizace) Zpracování spermií (oddělení od seminální plazmy a kapacitace) Fertilizace (dle spermiogramu) Inseminace in vitro ICSI (intracytoplazmatická injekce) Oplodnění vajíček - inseminace in vitro přidání kapacitovaných spermií do média s oocyty po 18 hodinách očištění vajíček od spermií a zbytků kumulárních buněk a kontrola fertilizace Oplodnění vajíček - ICSI Mikromanipulátor očištění vajíček od kumulárních buněk mikroinjekce jediné spermie do cytoplazmy oocytu po 18 hodinách kontrola fertilizace 6
Mikropipety holding ICSI hatching biopsy denuding Přenos embrya do dělohy (embryotransfer) kultivace embryí 72-120 hodin selekce nejlepších embryí přenos tenkým katetrem přes děložní hrdlo pod kontrolou ultrazvuku (ambulantní výkon) obvykle přenos dvou embryí Další metody asistované reprodukce Asistovaný hatching Kryokonzervace embryí Kryokonzervace spermií Odběr blastomer při PGD (prenatální genetická diagnostika) Program darovaných oocytů a spermií Asistovaný hatching (AH) Šetrné narušení zona pellucida pomocí mikropipety usnadnění vycestování embrya z obalu vyšší šance uhnízdění do děložní sliznice u starších pacientek u pacientek s vyššími hodnotami FSH je-li zona příliš silná či tuhá při opakovaném neúspěchu IVF Historie Kryokonzervace 1949 glycerol dokáže ochránit spermie před poškozením při mrazení 1950 použití glycerolu při mrazení červených krvinek 1959 objevení DMSO jako kryoprotektantu 1972 získání živého jedince po zmrazení a rozmrazení osmibuněčného myšího embrya 1983 první dítě po zmrazení a rozmrazení osmibuněčného lidského embrya 1983 DMSO je nahrazen méně toxickým propylenglykolem 1985 první zamrazení lidských blastocyst za použití glycerolu 1987 první dítě po oplození zamrazených oocytů 1998 úspěšné zamrazení lidské ovariální tkáně Kryokonzervace v IVF Oocyty stále problematické může být poškozeno dělící vřeténko změny kortikálních granul zvýšení výskytu aneuploidií u embryí Embrya lze mrazit ve všech stádiích vývoje čím vyšší vývojové stádium, tím problematičtější mrazení a následné rozmrazení Spermie, tkáň varlete Ovariální tkáň 7
Princip kryokonzervace Hlavním faktorem způsobujícím poškození živých buněk při mrazení je tvorba intracelulárního ledu a s tím spojených osmotických změn Dehydratace buněk před zamrazením Přidání kryoprotektiv (chrání před poškozením a snižují bod tání kryoprotekčního média) Princip kryokonzervace 1. Dehydratace látky, které neprocházejí buněčnou membránou, umožňují prostup vody z buňky ve směru koncentračního gradientu (sacharóza) jeli dehydratace nedostatečná, vytvoří se intracelulární krystaly ledu a dojde k poškození buněk 2. Kryoprotektanty vážou vodu a tím redukují toxické vlivy vysokých koncentrací dalších sloučenin ve vysokých koncentracích minimalizují poškození způsobené vznikem ledových krystalů nutí vodu, aby mrzla v nekrystalické formě propandiol (propylenglykol) mrazení nižších vývojových stádií embryí a oocytů glycerol mrazení blastocyst Princip kryokonzervace Kryokonzervační metody 3. Postupné ochlazování vzorku rychlostí 0,3 C/min do -30 až -36 C KRYOPLANER 4. Uchování v tekutém dusíku (-196 C) Slow-freeze protokoly použití nízkých koncentrací kryoprotektantů ( 1,5M) Rapid-freeze vyšší koncentrace kryoprotektantů ( 4M) kratší čas působení Ultra rapid-freeze (vitrifikace) extrémně rychlé mrazení za využití vysokých koncentrací kryoprotektantů (>6M) Vitrifikace jednorázová expozice embryí vysokým koncentracím kryoprotekčního média s následným ochlazením na - 196 C na stojánku (vzorek nepřijde přímo do styku s tekutým dusíkem) speciálně upravený povrch zajišťuje efektivní a rychlou změnu teploty molekuly vody ve vzorku nemají dostatek času na přeskupení se do krystalické mřížky nedochází k tvorbě ledových krystalků Program darovaných gamet Darované spermie Azoospermie s nemožností získání spermií (TESE) Genetická zátěž OAT gravis Darované oocyty Ženy s předčasným ovariálním selháním Starší pacientky Genetická zátěž 8
Méně obvyklé metody v IVF GIFT (Gamets IntraFallopian Transfer) - laparoskopické zavedení spermií a odebraného vajíčka do vejcovodu FREDI (Fallopian Replacement of Eggs with Delayed Intrauterine Insemination) - zavedení vajíčka do vejcovodu s následným provedením inseminace EIFT (Embryo Stage IntraFallopian Transfer) - zavedení embryí různého vývojového stadia do vejcovodu DIPI (Direct IntraPeritoneal Insemination) - zavedení spermií do břišní dutiny POST (Peritoneal Oocyte and Sperm Transfer) - zavedení vajíček a spermií do břišní dutiny VITI (Vaginal IntraTubal Insemination) - zavedení spermií do vejcovodů Problémy spojené s IVF OHSS ovariální hyperstimulační syndrom nadměrná tvorba folikulů při stimulaci extrémně vysoké hodnoty pohlavních hormonů zahuštění krve (možnost orgánového selhání; riziko vzniku trombů) Krvácení Problémy spojené s anestezií Vícečetné těhotenství Redukce počtu plodů Mimoděložní těhotenství 9