Anatomie a morfologie kořenů mladých rostlinek smrku Bakalářská práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Anatomie a morfologie kořenů mladých rostlinek smrku Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Helena Vlašínová, Ph.D. Vypracovala: Ilona Šedá Brno 2011

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma,, Anatomie a morfologie kořenů mladých rostlinek smrku,, vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis autora

PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych ráda poděkovala Ing.Heleně Vlašínové,Ph.D.a RNDr.Karlu Slabému,CSc. za odborné vedení a cenné rady,mé poděkování patří také pracovníkům laboratoře Ústavu biologie rostlin za pomoc s experimentální částí práce.

ABSTRAKT Bakalářská práce je zacílena k získání poznatků týkajících se morfologické a anatomické stavby kořene mladých rostlinek smrku, zejména pak jejich rozdílů mezi kořeny ze somatických embryí a kořeny vypěstovanými ze zygotických embryí. Zjištění těchto rozdílů může přispět k objasnění důvodů obtížnějšího pěstování mladých rostlinek smrku ze somatických embryí. Vzhledem ke stále se zvyšujícímu využívání metod in vitro, zejména ve světě,nejen v oblasti šlechtění,ale také zachování genotypů původních populací jehličnanů, obzvláště pak smrku je třeba těmto otázkám věnovat náležitou pozornost. Pro svoje rozšíření, ekonomický a ekologický význam řadíme smrk ztepilý (Picea abies / L./ Karst.) mezi nejvýznamnější dřeviny střední Evropy. S ohledem na tento fakt, ale také proto, že je tato jehličnatá dřevina hospodářsky, svojí ekologickou šířkou a velmi pozitivní prognózou jeho využití v mnoha oblastech i do budoucnosti, naší nejdůležitější dřevinou vůbec, se tato práce věnuje na experimentální rovině smrku ztepilému.v práci je popsána také primární a sekundární struktura kořene, která je doplněna nákresy a fotografiemi, jež byly pořízeny na základě výsledků experimentu. Neméně důležitá část se zaobírá embryogenezí pomocí metod in vitro, která je nezbytná k získání vlastních somatických embryí bez nichž by nebylo možné kořínky ze somatických embryí získat. Experimentální část práce, jak vyplývá z informací uvedených výše, je zaměřena převážně na laboratorní studii rozdílů v anatomické a morfologické stavbě kořene smrku ztepilého. Ke studii kořenů smrku ze somatických embryí byla použita somatická embrya získaná z laboratoře ústavu biologie rostlin MENDELU, jež prošla všemi stádii somatické embryogeneze, až na fázi konverze, která byla prováděna v rámci experimentu. Kořeny ze zygotických embryí byly získány ze semen smrku ztepilého, jež pocházely ze tří oblastí označených pro účely studie 1,2,3. Pro pokus však byla využívána převážně semena s označením 1, 3,jež vykazovaly největší klíčivost. Z výsledků získaných studií mimo jiné vyplývá, že u kořenů ze somatických embryí je prokazatelně větší výskyt kořenového vlášení. U kořenů ze zygotických embryí je pak výskyt kořenového vlášení vzácnější. Rozdíly jsou patrny také na rovině anatomické stavby například u svazků cévních.

Klíčová slova: anatomická stavba, morfologická stavba, kořen, embryogeneze in vitro, smrk ztepilý ( Picea abies /L./ Karst.), klíčení.

ABSTRACT This thesis is aimed to the gaining of knowledge involving the morphological and anatomical structure of roots of young spruce seedlings, especially the differences between the roots of somatic embryos and the roots grown from zygotic embryos. The findings of these differences may help to explain the reasons for the difficult cultivation of young spruce seedlings from somatic embryos. In view of the constantly increasing use of the in vitro methods, particularly in the world, not only in the breeding area, but also in the conservation of genotypes of indigenous populations of conifers, especially the spruce, these issues should be given appropriate attention. For its numerous presence, economic and ecological importance we place the Norway Spruce (Picea abies / L. /Karst.) among the most important tree species in Central Europe. With this in mind, but also because economically and with its large ecological presence and a very positive prognosis of its use in many areas and in the future, this coniferous tree is our most important tree species in all, therefore this work focuses on the Norway Spruce on the experimental level. The paper also describes the primary and secondary structure of the root, which is accompanied by drawings and photographs that were taken on the basis of experiment results. Equally important section deals with the embryogenesis using the in vitro methods, which is necessary for obtaining the actual somatic embryos, without which the roots of somatic embryos could not be obtained. As the above information suggests, the experimental part of this work mainly focuses on the laboratory studies of differences in anatomical and morphological structure of the Norway spruce roots. To study the spruce roots of the somatic embryos, I used the somatic embryos obtained from the MENDELU laboratory at the Institute of Plant Biology, which passed through all stages of somatic embryogenesis, except to the stage of conversion, which was conducted during the experiment. The roots of the zygotic embryos were obtained from the seeds of Norway spruce which came from three areas, which for the purposes of the study were labeled as 1, 2 and 3. However, the test mainly used the seeds labeled 1 and 3, which showed the greatest germination. Among other things, the results obtained from the studies suggest that the roots of somatic embryos have a document able greater incidence of root hairs. Occurrence of root hairs on the

roots of zygotic embryos is rare. Differences are also evident at the level of anatomical structures, such as on the vascular clusters. Keywords: anatomical structure, morphologic structure, root, embryogenesis in vitro, Norway spruce (Picea abies / L. / Karst.),seedling.

OBSAH SEZNAM ZKRAZEK 1 ÚVOD A CÍL PRÁCE 11 2 SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 12 2.1 Botanická charakteristika smrku ztepilého 12 2.1.1 Zařazení do systému 12 2.1.2 Rozšíření a vnější stavba smrku ztepilého 12 2.2 Základní charakteristika kořene 13 2.3 Primární stavba kořene 14 2.3.1 Kořenová čepička 14 2.3.2 Kořenová pokožka 15 2.3.3 Primární kůra 15 2.3.4 Střední válec 16 2.4 Anatomie kořene nahosemenných rostlin 17 2.4.1 Primární stavba 17 2.4.2 Mykorhiza 17 2.4.3 Sekundární stavba 20 2.5 Embryogeneze in vitro 21 2.5.1 Somatická embryogeneze 22 2.5.2 Somatická polyembryogeneze 24 2.5.3 Somatická embryogeneze smrku 25 3. MATERIÁL A METODIKA 28 3.1 Rostlinný materiál pouţitý k experimentu 28 3.2 Klíčení somatických embryí 28 3.2.1 Indukce somatické embryogeneze 28 3.2.2 Udržování embryogenní kultury 31 3.2.3 Maturace somatických embryí 31

3.2.4 Klíčení embryí a růst kořene 32 3.3 Klíčení zygotických embryí 34 3.4 Metodika přípravy preparátů 35 3.5 Fotodokumentace 37 4. VÝSLEDKY 38 5. DISKUZE 40 6. ZÁVĚR 41 7. POUŢITÁ LITERATURA 42 Seznam obrázků 44 8. PŘÍLOHA-NÁKRESY A FOTODOKUMENTACE 45

SEZNAM SKRATEK ABA BAP 2,4-D IBA PEG kyselina abscisová benzylaminopurin kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina inodyl-3-máselná polyetylenglykol

1 ÚVOD A CÍL PRÁCE Pro vývoj a růst mladých stromů lesních dřevin má značný význam kvalita klíčních rostlinek a dobré založení kořenové soustavy. Ontogenetický vývoj těchto rostlinek začíná již v semenech při procesu embryogeneze, kdy embrya prochází různými morfologickými, fyziologickými a molekulárně biologickými procesy.během těchto procesů dochází k formování základů budoucích orgánů rostlin a k ukládání zásobních látek pro počáteční růst klíčních rostlinek. V posledních letech se do popředí zájmu dostává množení rostlin pomocí metod in vitro.tyto metody se využívají i v reprodukci dřevin, zvláště jejich vybraných genotypů s žádoucími vlastnostmi.metody in vitro se však v naší republice pro množení jehličnanů,tedy i smrku příliš nevyužívají.práce je s ohledem na její náplň zaměřena z hlediska embryogeneze in vitro především na somatickou embryogenezi. U nahosemenných dřevin se nejvíce využívá metoda somatické polyembryogeneze u rodu smrk. Jedním z problémů u této metody je růst somatických embryí, který se liší od embryí zygotických ze semen. Při dopěstování rostlinek ze somatických embryí je často nedostatečný vývoj kořene, který se dá podpořit různými způsoby. Kromě morfologického vzhledu primárních kořenů smrku je důležitá i jejich anatomická stavba. Při vyhodnocení vlivu různých ošetření kořenů je nutné se věnovat i těmto otázkám. Cílem mé práce bylo zpracovat literaturu o morfologii a anatomii kořenů rostlin,zvláště pak jehličnanů.dále zvládnout přípravu mikroskopických preparátů a jejich dokumentaci. Dalším úkolem bylo srovnat morfologickou a anatomickou stavbu kořenů rostlinek smrku ze zygotických a somatických embryí. 11

2 SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 2.1 Botanické zařazení smrku ztepilého (Picea abies /L./ Karst.) 2.1.1 Zařazení do systému Říše: Plantae Rostliny Skupina: Gymnospermae Nahosemenné Oddělení: Pinophyta Jehličnany Třída: Pinopsida Jehličnaté Řád: Pinales Borovicotvaré Čeleď: Pinaceae Borovicovité Rod : Picea Smrk Druh: Picea abies /L./ Karst. Smrk ztepilý 2.1.2 Rozšíření a vnější stavba smrku ztepilého Smrk ztepilý se rozšířil z oblasti od Skandinávského po Balkánský poloostrov,kde ve výškách nad 800 m vytvořil porosty díky rozsáhlému vysazování již od 18. století. Dnes je tento jehličnan rozšířen prakticky do celého světa. Dorůstá výšky 30-50 m (v pralesovitých porostech až 70 m), koruna je pravidelně kuželovitá (Kremer,1995). Smrk ztepilý je stálezeleným jehličnatým stromem s přeslenitými větvemi, jež uprostřed kmene zpravidla odstávají, či jsou mírně vystoupavé. Borka je hnědavě červené či měděné barvy s jemnými šupinkami, spíše méně odlupčivá. U velmi starých stromů bývá zpravidla rozdělena v oblé odlupující se proužky. Kmen tohoto jehličnatého stromu může dosáhnout ve svém průměru až dvou metrů(banfi,consolinová,2001). 12

U mladých letorostů se setkáváme obyčejně s červenavým zbarvením. Jehlice jsou 1-3 cm dlouhé,na průřezu čtyřhranné se spirálovitým uspořádáním. Pupeny smrku ztepilého jsou tmavé, vejcovitého tvaru bez pryskyřice nebo jen slabě pryskyřičné.na jaře se objevují květní šištice. Pro samčí šištice je charakteristická žlutavé zbarvení,délka 1-1,5 cm a umístění na boku větví.k tvorbě samičích květních šištic dochází přímo na špičkách výhonů, zpočátku se vyznačují červenofialovým zbarvením a délkou cca 2 cm. Po opylení, se však v důsledku dozrávání velikost šištic mění až na 15 cm. I během zimního období, kdy dochází k uvolňování semen, zůstávají samičí šištice ještě po určitou dobu na větvích. Semena tohoto jehličnanu mají hnědou až černou barvu, velikost 2-5 mm. Okřídlení semen je oválně podlouhlého tvaru, světle hnědé barvy. Při letu semen slouží okřídlení k rotačnímu pohybu (Banfi,Consolinová, 2001). Rod smrk zahrnuje přibližně 40 druhů. Pro determinaci jednotlivých zástupců slouží charakteristické morfologické znaky. Jedná se především o tvar a zbarvení jehlic a šišek (Banfi, Consolinová, 2001). 2.2 Základní charakteristika kořene Kořen je zpravidla podzemním orgánem s geotropickým růstem. Tento rostlinný orgán se vyskytuje až u kapraďorostů a rostlin semenných. Činnost apikálního meristému, jež je kryt kořenovou čepičkou (kalyptra), umožňuje jeho neomezený růst do délky. Kořen zabezpečuje rostlině mnoho nezbytných funkcí. Mezi ně patří upevňovací, absorpční, vodivá, metabolická a zásobní funkce. Slouží však také k vegetativnímu rozmnožování (Novák a Skalický, 2008). Kořínek (radicula), je první částí rostlinného organismu, který se objevuje při klíčení semenných rostlin. Vyznačuje se kladným geotropickým růstem. Upevňuje klíční rostlinku v zemi a vyživuje ji. V důsledku prorůstání kořínku do půdy dochází k jeho přeměně na hlavní kořen. Kořenová soustava, jež upevňuje rostlinu v půdě, vzniká na základě větvení hlavního kořene jehož výsledkem jsou postranní kořeny. Hloubka prorůstání kořenů je odvislá od rostlinného druhu, půdních vlastností a výšky hladiny podzemní vody. U dvouděložných i majority nahosemenných rostlin se vyskytuje alorhize. Tedy z hlavního kořene vyrůstají kořeny postraní (Novák a Skalický, 2008). 13

Po zastavení růstu hlavního kořene (u jednoděložných rostlin) přebírají jeho funkci kořeny adventivní. Ty vyrůstají buď v uzlinách nebo v článcích. U kapraďorostů a většiny jednoděložných rostlin tak dochází ke vzniku svazčité kořenové soustavy, v tomto případě se tedy jedná o typ kořenové soustavy zvaný homorhyze (Novák a Skalický 2008). 2. 3 Primární stavba kořene Na rovině primární struktury se u kořene nachází kořenová čepička (kalyptra), pokožka (rhizodermis), primární kůra (cortex) a střední válec kořene (stélé). Činnost apikálního meristému dává vzniknout pletivům primární struktury. Protoderm, základní meristém a prokambium jsou tři základní pletivové celky jež lze rozpoznat na vzrostlém vrcholu. Protoderm má význam pro tvorbu kořenové pokožky, vznik primární kůry zabezpečuje základní meristém a z prokambia se tvoří střední válec. Elongační zóna kořene, neboli prodlužovací pásmo, se nachází nad vzrostným vrcholem kořene,kde však nedochází k dělení buněk, nýbrž k jejich růstu. Nad touto zónou se nachází pásmo absorpční, kde se počínají diferencovat primární pletiva kořene, nicméně specifikem tohoto místa je také tvorba kořenového vlášení. Pásmo větvení, které je místem počínajícího větvení kořene, se nachází nad kořenovými vlásky, po něm následuje pásmo vodivé. (Novák a Skalický 2008). 2.3.1 Kořenová čepička Kořenová čepička nebo-li kalyptra je tvořena vitálními parenchymatickými buňkami, které jsou obnovovány činností iniciály. Sloupek (kolumela), nacházející se v centrální části kalyptry, obsahuje značné množství statolitového škrobu. Kalyptra umožňuje, díky svému slizovému povrchu, proniknutí do substrátu, plní tedy funkci mechanickou. Slouží však také jako ochrana mladého kořínku (Novák a Skalický 2008). 14

2.3.2 Kořenová pokoţka Kořenová pokožka (rhizodermis) je tvořena pouze jednou vrstvou buněk, které mají omezenou životnost. Od pokožky nadzemních orgánů se výrazně odlišuje, a to jak svými vlastnostmi, tak i funkcemi. Dobrá propustnost rhizodermis pro vodní roztoky anorganických látek je umožněna absencí kutikuly, která na rozdíl od pokožky nadzemních orgánů neobsahuje průduchy. Kořenové vlásky vyrůstají nad prodlužovacím pásmem z buněk rhizodermis jako její vychlípeniny. Vznik kořenových vlásků je však také možný ze specializovaných buněk rhizodermis-tichoblastů. Kořenové vlásky do půdy vylučují slizovou látku (mucigel), umožňující snadnější rozpuštění půdních částic, zvětšují však také absorpční plochu kořene (Novák a Skalický 2008). 2.3.3 Primární kůra Primární kůra(cortex)je utvářena vitálními parenchymatickými buňkami.kůra kořene bývá zpravidla mocnější než-li kůra stonku,u některých dvouděložných rostlin se nachází v primární kůře také sklerenchym či kolenchym.po odumření pokožky přebírá funkci krycího pletiva zevní vrstva primární kůry,jejíž buňky k sobě těsně přiléhají nezřídka kdy zkorkovatí, což vede k tomu,že tvoří na vnitřní straně svých stěn tzv.casparyho proužky.takto diferencovanou zevní část kůry nazýváme exodermis.u některých druhů rostlin je tato vrstva mnohovrstevná,většinou však bývá jednovrstevná. Mezodermis nebo-li střední vrstva primární kůry je utvářena tenkostěnnými parenchymatickými buňkami,mezi kterými se nachází intercelulární prostory,nazývané též vzdušné kanálky.u radix aerea hydrophyla epifitů se v mezodermis nacházejí chloroplasty.pryskyřičné kanálky,sekreční buňky a mléčnice i tyto struktury je možné u některých skupin rostlin v této vrstvě primární kůry nalézt.interní část primární kůry označujeme jako endodermis, jejíž diferenciace probíhá v oblasti vzniku kořenových vlásků a prvních elementů xylému.na kořeni je možné tuto areu nalézt na počátku jeho absorpční zóny.endodermis bývá zpravidla jednovrstevná,zřetelně odděluje primární kůru od stélé.buňky endodermis k sobě těsně přiléhají jsou tedy bez intercelulárních prostor.stěny buněk endodermis bývají zpočátku pružné a celulózní. Ke vzniku Casparyho proužků dochází právě na příčných a podélných buněčných stěnách endodermis v podobě rámečků, jako důsledek ukládání suberinu(slavíková,2002). 15

Na příčném řezu lze Casparyho proužky připodobnit ke ztlustlinám,je tomu tak proto,že Casparyho proužky sousedících buněk k sobě přiléhají.u rostlin,které sekundárně netloustnou stěny endodermálních buněk postupně korkovatějí celé(slavíková,2002). 2.3.4 Střední válec Vodivá pletiva kořene sdružuje střední válec(stélé),jehož zevní vrstvu označujeme názvem pericykl(perikambium),tato vrstva je zpravidla jednovrstevná, avšak u některých rostlin se setkáváme i s vícevrstevným perikambiem.pericykl je utvářen parenchymatickými buňkami,jež k sobě těsně přiléhají a jsou bohaté na plasmu.perikambium je latentním meristémem, po dlouhou dobu si tedy zachovává dělivou schopnost,je také místem,kde dochází v průběhu vývoje kořene k zakládání laterálních a adventivních kořenů spolu s adventivními pupeny.u kořenů sekundárně tloustnoucích rostlin se v pericyklu zakládá felogen,jeho buňkami je tvořena také část kambia.uvnitř pericyklu nacházíme pouze jediný radiální cévní svazek,jehož dřevní(xylém) a lýkové(floém) části jsou paprsčitě uspořádány(radiálně) a pravidelně se střídají.takový cévní svazek u nějž nacházíme jednu část xylému a jednu část floému nazýváme monarchní,ovšem tento typ cévního svazku se vyskytuje spíše vzácně, v případě cévního svazku s dvěma částmi floému a dvěma částmi xylému mluvíme o diarchním cévním svazku.dále rozeznáváme triarchní, tetrarchní a pentarchní cévní svazky u nichž je analogie tvorby názvu opět dána počtem xylémových a floémových částí.výše jmenované cévní svazky jsou typické pro rostliny dvouděložné a nahosemenné, u rostlin jednoděložných jsou cévní svazky polyarchní.v kořeni krytosemenných rostlin se v průběhu vývoje vodivého pletiva nejdříve začínají na interní straně pericyklu diferencovat z prokambia elementy lýka tzv.sítkovice, jež vytvářejí protofloém, ke středu kořene pak dochází k diferenciaci metafloému.primární floém je tvořen protofloémem a metafloémem, později pak dochází také k tvorbě primárního xylému,přičemž nejdříve se tvoří protoxylém( kruhovitě a šroubovitě ztlustlé tracheidy),následně metaxylém(tracheidy a tracheje).takovýto způsob vzniku dřeva označujeme jako exarchní(slavíková,2002). 16

2.4 Anatomi kořene nahosemenných rostlin Hlavním specifikem kořenů nahosemenných rostlin je schopnost tvorby sekundární stavby (druhotné tloustnutí), která je umožněna činností kambia.(sekundární stavba kořene se ovšem vyskytuje také u některých dvouděložných rostlin.) Pro kořeny většiny nahosemenných rostlin,zejména dřevin a keřů, je typická mykorhizní symbióza. 2.4.1 Primární stavba Vzhledem k tomu, že se primární struktura kořene nahosemenných rostlin od primární stavby kořene ostatních skupin rostlin zásadně neliší je o ní pojednáno pouze v kapitole 2.3. 2.4.2 Mykorhiza Mykorhiza je označením pro symbiotický vztah, jež se vytváří mezi houbami a kořeny vyšších rostlin. Tento symbiotický vztah je možno rozdělit na základě charakteru soužití houby a rostliny do dvou základních skupin, a to sice na ektomykorhizu a endomykorhizu. Pro ektotrofní mykorhizu je charakteristické,že se hyfy hub přisávají ke kořenům a stávají se tak pro ně zdrojem vody, důležitých živin a nezbytných fytohormonů, zvláště pak auxinů a giberelinů,houba pak na oplátku získává sacharidy.tento typ mykorhizy se vyskytuje například na úrovni soužití mladých smrčin s ryzcem, borovice s klouzkem, dubu s hřibem atd. Specifikem endotrofní mycorhizy je výskyt houby uvnitř kořene. Tedy v tomto případě se houbová vlákna nacházejí v buňkách poblíž endodermis. Zjištění tohoto typu mykorhizy je možné pouze mikroskopicky. Endotrofní mykorhiza se může vyskytovat například u cypřiše, tisu, jasanu, topolu (Procházka a kol., 1998). Pro dřeviny vyskytující se v našich zeměpisných šířkách je charakteristická ektotrofní mykorhiza, která je u těchto rostlin nejlépe vyhovují formou vzájemně prospěšného mutualistického soužití. Tento typ mykorhizy se však nachází pouze u 10% rostlin s mykorhizou. Daleko častější je endotrofní mykorhiza, jež je vlastní více než 80% rostlin 17

žijícím na Zemi. Vzájemně prospěšné soužití s houbami je typické pro takměř 90% všech rostlin na Zemi (Mauer a kol., 2006). Dřeviny vyskytující se na našem území získávají živiny z půdy zejména prostřednictvím mykorhizy, která má z tohoto hlediska významnější úlohu než kořenové vlášení.rostlina poskytuje houbě sacharidy a ta je pak pro rostlinu zdrojem vody, minerálních látek a hormonů. Mykorhizní houby nejsou schopny růst v půdě trvale bez vzájemného soužití s kořeny rostlin. Typickým znakem vyskytujícím se u ektotrofní mykorhizy je tzv.hartigova síť, tvořená houbovým pláštěm a hyfy houby nacházejících se v intercelulárních prostorách parenchymatických buněk kořenů posledního řádu. Hyfy hub vyrůstající z povrchu houbového pláště prorůstají půdou a jsou nedílnou složkou husté sítě takzvaného extramatrikálního mycelia.tento druh podhoubí získává ve větší míře než ostatní z půdního prostředí vodu a minerální látky. Velmi pozitivním faktem je jeho schopnost zvýšit absorpční plochu kořenového systému pro příjem důležitých látek až 1000 krát. Pro naše hlavní dřeviny (smrk,borovice, jedle, modřín, douglaska, dub, habr) je ektomykorhiza životně důležitá. Ostatní druhy dřevin jsou schopny žít s ektomykorhizu, bez mykorhizy či s jinou podobou vzájemně prospěšného soužití s houbami, což je dáno půdní úrodností, přístupností vláhy, světla a výskytem dané houby. Houby náležící do podtřídy Basidiomycotina, řádu Agaricales jsou právě těmi, které mají největší podíl na tvorbě ektotrofní mykorhizy. V našich klimatických podmínkách žije takovýchto hub více než 1 400 druhů.bez přítomnosti mykorhizy se u sadebního materiálu lesních dřevin slabě rozvíjí kořenový systém po vysazení dochází k jeho slabšímu ujmutí a nezřídka kdy do 2 let odumírá. Pro ektomykorhizy lesních dřevin je typická různorodost závisející na hostitelské dřevině, prostředí a houbovém symbiontu. Důležitým aspektem je tedy zjišťování mykorhiz,které umožňuje odhadnout na podkladě anatomicko-morfologické stavby jejich fyziologické, ochranné a ekologické funkce (Mauer a kol., 2006). Obsah živin v půdě je důležitým hlediskem majícím vliv na rozvoj mykorhiz. Jejich vznik je podporován nízkým obsahem fosforu a dusíku v půdním prostředí. Negativní vliv na rozvoj mykorhiz má nadbytek dusíku spolu se snadno přijatelnou formou fosforu v půdním prostředí. K redukci mykorhiz dochází zejména v důsledku působení dusíku nacházejícího se v dusičnanové formě v půdě(mauer a kol.,2006). 18

Mykorhizní houby jsou schopny využívat také dusík v organické podobě. V případě půd s nedostatkem přístupného fosforu jsou schopny mykorhizní houby za pomoci enzymu kyselá fosfatáza zpřístupňovat tento prvek rostlinám. Čím nižší je podíl fosforu v půdě, tím vyšší je aktivita tohoto enzymu. Houbový plášť kořenů působící jako zásobárna živin má zásadní význam pro zásobování rostlin, žijících v symbióze s mykorhizními houbami, minerálními látkami. Hyfy hub,jež vyrůstají z povrchu mykorhizy zásobují rostlinu vodou a živinami z daleko větší vzdálenosti než kam dosahují kořeny stromu. Z hlediska mykotrofní výživy, zejména lesních dřevin, nelze opomenout vliv světla. K rozvoji mykorhizy dochází až na úrovni 12% denního záření (Mauer a kol., 2006). Uplatnění mykorhizy se nevztahuje pouze na oblast minerální výživy ale také na oblast ochrannou, kdy mykorhiza napomáhá rostlině v ochraně vůči škodlivým organismům napadajícím kořenový systém. Nelze opomenou také význam mykorhizy z hlediska tlumení stresů, jimž jsou rostliny v průběhu života vystaveny. Mykorhizy mající exramatrikální podhoubí a dobře vyvinutý plášť jsou schopny mechanicky zabraňovat vzniku infekce vyvolané patogenními houbami. Zvyšují také odolnost rostlin vůči chorobám. Například přítomnost mykorhizních hub ( Laccaria laccata a Hebeloma crustuliniforme) u sadebního materiálu borovice účinně chrání tuto mladou rostlinku před houbovým patogenem Fusarium oxysporum. Vzájemně prospěšné mykorhizní vztahy mezi rostlinami a houbami se rychle vyvíjejí,postupem času dochází k jejich proměnám. Druh dřeviny, stupeň vývoje porostu a stanoviště patří mezi faktory, jež rozhodují o tom, která z hub naváže mykorhizní kontakt s kořeny dané rostliny. Je známo, že některé rody hub jsou schopny vytvářet mykorhizu s více druhy dřevin (např. Boletus, Hebeloma). Na druhé straně však existují houby, které jsou uzpůsobeny vytvářet mykorhizu pouze s jedním druhem dřeviny (např. Rhizopogon luteolus na borovici). S postupným stárnutím stromů se obměňuje také soubor mykorhizních hub.se semenáčky a sazenicemi tvoří mykorhizu jiné druhy hub než se staršími porosty dřevin. V současné době je možné stanovit vhodný soubor mykorhizních hub a typ mykorhizy na základě druhu dřeviny v závislosti na jejím stanovišti. To má význam zejména při stanovování rizik pěstování konkrétních dřevin v předem specifikovaných podmínkách (Mauer a kol., 2006). 19

Mykorhizní funkce jsou narušovány imisemi, jež ovlivňují mykorhizní houby prostřednictvím půdy, která je kontaminována postulanty. V případě nepřítomnosti mykorhizních hub potřebných pro určité stadium vývoje konkrétního druhu dřeviny, dochází k náchylnosti sadebního materiálu k chorobám, což zvyšuje nároky na požívání přípravků určených k ochraně rostlin a hnojiv. Následkem je pak nežádoucí prohlubování degradace půdy (Mauer a kol., 2006). Mykorhizace sadebního materiálu je důležitá zejména z důvodu menších ztrát v kulturách. Sadební materiál s mykorhizou vykazuje větší ujímavost, a to až o desítky procent, než-li ten bez mykorhizy. Zalesňování a obnova lesa je s využitím mykorhizace zejména na degradovaných a jinak poškozených půdách výrazně efektivnější než bez jejího využití. S výhledem do budoucna je možné přepokládat, že se mykorhizní houby dostanou do popředí v boji s chorobami, zejména lesních dřevin ( Mauer a kol., 2006). 2.4.3 Sekundární stavba Ke vzniku druhotných (sekundárních) pletiv dochází v důsledku činnosti sekundárního meristému-kambia. Zakládání kambia se děje postupně, nejdříve dochází k dělení parenchymatických buněk na úrovni interní části elementárního lýka, následuje dělení buněk mezi elementárním dřevem a elementárním lýkem, a posléze dochází k dělení buněk pericyklu, jež se nachází proti elementárnímu dřevu. Postupně tak vzniká ucelené kambium, u kterého je možno pozorovat na příčném řezu v případě diarchního svazku cévního formu oválu, u triarchního cévního svazku tvar trojúhelníku, a u tetrarchního, pentarchního a hexarchního cévního svazku je kambium hvězdicovité. Kambiální funkce je založena na tom, že se směrem dovnitř oddělují elementy druhotného dřeva (deuteroxylému), směrem ven pak elementy sekundárního lýka (deuterofloému). Na interní straně lýka produkuje kambium dřevo dříve a ve větším množství,než-li na zevní straně dřeva. Interfascikulární kambium, diferencované z pericyklu produkuje primární dřeňové paprsky, sekundární dřeňové paprsky se vytvářejí z fascikulárního kambia. Pro činnost kořenového kambia je typická periodicita u níž však nejsou letokruhy tak výrazné jako je tomu u stonku (Slavíková, 2002). 20

Spolu s druhotným tloustnutím kořenů dochází v pericyklu k vzniku druhotného meristematického korkotvorného pletiva-felogenu, jež směrem vně produkuje vrstvu zkorkovatělých buněk-felemu (korek), směrem dovnitř pak vrstvu sekundárního krycího pletiva-felodermu, která je tvořena vitálními parenchymatickými buňkami. Periderm, který je tvořen dohromady felemem, felogenem a felodermem, nahrazuje funkci endodermis, jelikož buňky primární kůry a endodermis, které jsou vrstvami korku odděleny od interních živých pletiv, následně praskají a odlupují se (Slavíková, 2002). Na rovině sekundárního tloustnutí kořenů dochází, a to zejména u dřevin, ke změnám způsobených především tahovými a tlakovými silami, jež na kořeny působí při mechanickém zatížení. Stromy bývají nejčastěji namáhány působením sněhové pokrývky, nárazy větru ale i dalšími vlivy v důsledku nichž dochází ke změnám ve stavbě kořenů (Gebauer, Martínková, 2005). 2.5 Embryogeneze in vitro V procesu embryogeneze dochází postupně ke vzniku embrya z jedné buňky zpravidla zygoty, vznikající splynutím samičí a samčí pohlavní buňky. Jejím dělením vzniká dospělý zárodek, nacházející se v semeni. Za příhodných podmínek semeno vyklíčí v celistvou rostlinu.embryogeneze probíhá u jednotlivých druhů rostlin odlišně. Zejména mezi nahosemennými a krytosemennými rostlinami jsou patrné výraznější rozdíly v průběhu embryogeneze. Embrya se mohou i za normálních podmínek vyvíjet cestou apomixie, kdy k oplození nedochází, avšak embryo se opět vyvíjí z jedné buňky, nejčastěji z haploidní buňky gametofytu. Pokud gametofyt vzniká z haploidní spory, pak má vzniklé embryo haploidní počet chromozomů,v opačném případě, tedy pokud gametofyt vzniká z diploidní buňky nucellu,je embryo diploidní. Geneze diploidních embryí je možná také z diploidních somatických buněk. Podkladem ke vzniku embryí u některých rostlin mohou být také foliární somatické buňky.v laboratorních podmínkách je možný vývoj embryí prostřednictvím všech dostupných způsobů, výhodou je vyšší počet takto získaných zárodků. Na základě původu buněk, které jsou podkladem pro vznik embrya, vyvíjejícího se in vitro je možné rozdělit embryogenezi na zygotickou, somatickou, gametofytickou a somatickou polyembryogenezi (Procházka a kol., 1998). 21

2.5.1 Somatická embryogeneze Od poloviny 20. století, kdy byla somatická embryogeneze poprvé popsána se stala subjektem celé řady vědeckých výzkumů. Studie týkající se somatické embryogeneze jsou zaměřeny především na její využití pro masové množení rostlin, nelze však opomenout výzkumy, kde se somatické embryogeneze využívá jako prostředníka pro studium vývojových stádií zygotické embryogeneze (Ďurkovič, Krajňáková, 2010). U somatické embryogeneze se vytváří ze somatického pletiva bipolární embrya. Somatická embrya vznikají z jedné somatické buňky,popřípadě menšího počtu vegetativních buněk. Somatická embryogeneze ve své podstatě shrnuje procesy, ke kterým dochází v průběhu zygotické embryogeneze při tvorbě embryí (Ďurkovič, Krajňáková, 2010). Pro somatickou embryogenezi je typický nepřímý vývoj embryí s tvorbou kalusu, jedná se tedy o nepřímou regeneraci. Existuje ovšem tzv. sekundární somatická embryogeneze, kde se nově vznikající embrya tvoří z entodermálních buněk embryí, jež byly vytvořeny těsně před jejich vznikem somatickou embryogenezí. Kalusové stádium není přítomno také u somatické polyembryogeneze.somatická embryogeneze probíhá čtyřmi hlavními fázemi. Jedná se o indukci, vytváření somatických embryí, zrání somatických embryí a jejich klíčení (Procházka a kol., 1998). Indukce reprezentuje takové vývojové stádium somatické embryogeneze, při němž somatická buňka získává totožné vlastnosti jaké má zygota. U některých rostlinných buněk k tomu stačí pouze vytvoření vhodného explantátu, který je umístěn do jednoduchého kultivačního média. Jiné buňky naproti tomu vyžadují komplikovanější intervence, aby dosáhly embryogenní determinence. Převážně má pro jejich indukci klíčový význam výskyt látek auxinové podstaty v kultivačním médiu. Mezi nejvýznamnější patří kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová, menší význam pak má kyselina α-naftyloctová. S největší pravděpodobností má tedy celý proces svůj počátek v jedné buňce, u níž pak probíhá embryogeneze ve stejných fázích jako u zygotické embryogeneze(procházka a kol..1998). Vzhledem k tomu, že podmínky ve vyvíjejícím se semeni jsou přece jen do určité míry odlišné od podmínek kultivačních, může dojít k nejrůznějším nepravidelnostem. 22

Příkladem je tzv. polyembryonální komplex, kdy nedochází od počátku k tvorbě přísně organizované struktury, avšak z prvotní buňky se tvoří dělením nejdříve právě zmiňovaný komplex,na němž začíná organizovaný vývoj. Takto vzniklá embrya však mají opět svůj původ v jediné buňce. Vývojové fáze somatických embryí jsou shodné s vývojovými stádii, se kterými se setkáváme u zygotické embryogeneze dané systematické skupiny.tvorba suspenzoru je rovněž druhově závislá. Ty druhy, u nichž se i za normálních podmínek vyskytuje silně vyvinutý suspenzor mají podobný i v podmínkách in vitro, naopak druhy se slabě vyvinutým suspenzorem jej mají v těchto podmínkách rovněž slabě vyvinut. Následkem delší dobu trvajícího dělení v ranných fázích vývoje somatického embrya je vznik různých anomálií. Nejčastěji jsou příčinou vzniku anomálií neoptimální kultivační podmínky (Procházka a kol., 1998). Jak již bylo výše nastíněno lze somatická embrya získat z různorodých výchozích pletiv, za splnění podmínek nutných pro kultivaci in vitro a to dvěma způsoby. Vznik kalusu a dediferenciace výchozího pletiva jsou prvními procesy, k nimž musí dojít u nepřímé somatické embryogeneze. K tvorbě meristematických základů embryí dochází až v kalusu.u přímé somatické embryogeneze nedochází k tvorbě kalusu, k jejímu nastolení dochází v případě, že jsou již výchozí buňky potencionálně embryogenní.jako příklad lze uvést androgenezi, kdy dochází z pylových buněk k přímé diferenciaci embryí. Ze somatických embryí vznikají plnohodnotné rostliny, jimž jsou vlastní všechny genotypové a fenotypové znaky daného rostlinného druhu. Somatická embrya se liší od těch zygotických zejména tím, že jejich vývoj neprobíhá v kontaktu s mateřskou rostlinou a nemají klidové období, jimiž semena normálně prochází(šetlík, Seidlová, Šantrůček, 1998). Somatická embryogeneze nachází své uplatnění zejména v oblasti množení rostlin. Samotný proces somatické embryogeneze je ovlivňován celou řadou faktorů, mezi hlavní patří složení kultivačního media, teplota, světlo apod. Nelze však opomenout také důležitou roli výchozího materiálu. V průběhu indukce a tvorby somatických embryí dochází ke změnám nároků na přítomnost fytohormonů v kultivačním mediu.nejlépe vyhovující podmínky pro průběh somatické embryogeneze daného materiálu je třeba nejdříve vyzkoušet a poté je dodržovat (Šetlík, Seidlová, Šantrůček, 1998). Obecně lze regeneraci rostlin pomocí somatické embryogeneze rozčlenit do pěti fází. V první fázi dochází k indukci embryogenní kultury, kdy je daný explantát kultivován 23

na médiu, jež obsahuje fytohormony, zejména auxiny a cytokininy. Následuje proliferace embryogenní kultury, probíhající na tuhém či tekutém médiu. Dalším krokem je kultivace pletiv somatických embryí na specifickém médiu pro daný explantát, jedná se o dozrávání somatických embryí. Tuto fázi střídá stádium při němž dochází ke klíčení embryí a jejich růstu v semenáčky, vše probíhá na médiu bez obsahu fytohormonů. Celý proces je zakončen přemístěním somatických rostlinek do podmínek ex vitro ( Ďurkovič, Krajňáková, 2010). 2.5.2 Somatická polyembryogeneze U počátečních stádií somatických embryí jehličnanů se setkáváme s mocně vyvinutým suspenzorovým aparátem a skupinou embryonálních buněk, z nichž v dalších vývojových stádiích vzniká samotné embryo. Podobně je tomu tak i v podmínkách in vitro. Následkem kultivace nezralých či zralých zygotických embryí, jež se vytvořila ze zadržených embryí nacházejících se v oblasti suspenzoru,vznikají první časná stádia somatických embryí. Přemístění těchto embryí do podmínek in vitro poskytuje možnost dalšího vývoje, který by bez těchto podmínek nebyl možný. Raná somatická embrya mohou vznikat také na dělohách izolovaného somatického embrya ale i na dalších částech. Somatická embrya je možné také získat z jehlic klíčních rostlin, kde vznikají cestou přímé nebo nepřímé somatické embryogeneze, což je provázeno vznikem kalusového pletiva, které lze snadno od vzniklých embryí izolovat. Následný vývoj kultury raných somatických embryí je odlišný od somatické embryogeneze s níž se setkáváme u krytosemenných rostlin. Pro tuto kulturu je typická absence kalusových buněk, je složena pouze se somatických embryí, jež jsou ve své podstatě rovna raným zygotickým embryím. Jsou tedy složena z embryonální skupiny tvořené z drobných embryonálních buněk, embryonálního suspenzoru (dlouhé buňky embryonálního suspenzoru ztrácí kontakt podélných stěn) a embryonálních tabulárních buněk, z nichž na distálním konci dochází ke vniku embryonálního suspenzoru, jehož buňky jsou uvolňovány do kultivačního média. Takováto raná somatická embrya se množí dále sama ( Procházka a kol., 1998). Doposud jsou známy dvě možné cesty multiplikace, jedná se o štěpení a pučení. U prvního zmiňovaného způsobu dochází ke štěpení skupin zárodečných buněk, kdy se v důsledku vytváření tabulárních buněk na distálním konci obě nově vzniklé embryonální skupiny oddělují.k druhému možnému způsobu multiplikace, který byl donedávna 24

označován jako pučení, dochází na rovině tabulárních buněk a suspenzoru. Většina buněk nacházejících se v této oblasti pozbyly dělivou schopnost, některé buňky si ji však zachovaly, takovéto buňky bývají zpravidla označované jako megakaryocyty. U jádra těchto buněk dochází k dělení nejdříve na dvě jádra, z nichž jedno v důsledku apoptozy zaniká a druhé se postupně dostává k jednomu polu prodloužené buňky, následuje jeho další dělení a tvorba volných jader z nichž vznikají zárodečné buňky, jež jsou uvolňovány do kultivačního média, jejichž dalším dělením vznikají nová raná somatická embrya. Vzhledem k podobnosti tohoto procesu s průběhem vzniku vaječné buňky a břišní kanálkové buňky z centrální buňky v archegoniu a následnou zygotickou embryogenezí bylo pro označení tohoto procesu vybráno vhodnější označení diploidní partenogeneze ( Havel a Durzan,. 1992, 1996, Durzan a kol.1996,citace podle: Procházka a kol., 1998). Množení raných somatických embryí je tímto způsobem možné opakovaně. Celý proces obyčejně probíhá za přítomnosti kyseliny 2,4-dychlorfenoxyoctové a cytokyninu, jeho rychlost bývá značná. K dalšímu vývoji raných somatických embryí je nutno obměnit kultivační médium. Nejprve dochází ke zvýšení jeho osmotické hodnoty a následně pokračuje vývoj zacílený k plně vyvinutým zárodkům, jež se zpravidla dále dělí za absence růstových látek ( Procházka a kol., 1998). 2.5.3 Somatická embryogeneze smrku Nahosemenné rostliny se od dalších skupin rostlin odlišují především vývojem gametofytu a embrya. Pro nahosemenné rostliny je charakteristické jednoduché opylení, kdy i po opylení zůstává samičí gametofyt haploidním pletivem. Specifikem počátku embryogeneze, u rodů Pinus a Picea je přítomnost volných jader ve stádiu čtyř jaderných proembryí. U většiny jehličnanů se setkáváme se dvěma typy polyembryonie, jednoduchou a rozštěpitelnou(ďurkovič,krajňáková,2010). Každé embryo vzniklé jednoduchou polyembryonií je geneticky rozdílné, přičemž jedno embryo, které převládá nad ostatními pokračuje dále ve vývoji zatímco ostatní embrya odumírají. Rozštěpitelná polyembryonie je typická pro rody Pinus, Cedrus, Tsuga, Keteleeria, Abies. Embrya vzniklá cestou rozštěpitelné polyembryonie jsou výsledkem oddělování apikální vrstvy buněk jednoho proembrya do čtyř buněk, z každé takovébuňky pak může vzniknout samostatné avšak geneticky stejné embryo.i zde dochází 25

k dominanci jednoho embrya, jež pokračuje ve vývoji nad ostatními, které ve vývoji dále nepostupují. Embryo pokračující ve vývoji dále je prostřednictvím suspenzorových buněk tlačeno do centra megagametofytu, zde dochází k jeho rychlému zvětšování. Z buněk nacházejících se na distálním konci vzniká hypokotyl, pupenový apikální meristém a kotyledony. Ke vzniku kořenového apikálního meristému dochází pod pupenovým. Poté co embryo přejde do fáze zralosti přichází na řadu tvorba kořenové čepičky (Ďurkovič, Krajňáková, 2010). Pletiva s embryogenní aktivitou jsou po indukci somatické embryogeneze tvořena dvěma typy buněk. První typ buněk je prodlouženého tvaru s velkým počtem vakuol, druhý typ buněk má okrouhlý tvar a hustou cytoplazmu. V proliferujícím embryogenní pletivu jsou přítomny také buněčné agregáty pro něž je využíváno označení proembryogenní masy s používanou zkratkou celého názvu PEM ( Ďurkovič, Krajňáková, 2010). Vývin somatického embrya smrku ztepilého v podmínkách in vitro lze rozdělit do dvou základních fází, skládajících se z několika specifických stádií. Pro první fázi je charakteristická přítomnost proembryogenních mas, které prochází třemi specifickými stádii, jež je možno rozlišit na základě počtu buněk a jejich organizace. Jedná se o stádia PEM I, PEM II, PEM III. Proembryogenní masa PEM I je složena z buněk s malými vakuolami, tvořící skupinku, k nimž je přidružena buňka s velkými vakuolami. Obdobně je tomu tak i u PEM II, ve stádiu PEM III se buňky s hustou cytoplazmou zvětší a dochází k narušení polarity. Druhá fáze reprezentuje vývoj somatických embryí vznikajících nově z PEM III, jejichž další vývoj pak probíhá obdobně jako u zygotické embryogeneze. Důležitou podmínkou nutnou pro proliferaci PEM je přítomnost fytohormonů, zvláště pak auxinů a cytokininů, avšak pro vývin embrya z PEM III je naopak potřebná nepřítomnost fytohormonů ( Ďurkovič, Krajňáková, 2010). Regenerace smrku prostřednictvím somatické embryogeneze je náročným procesem u něhož se setkáváme s následujícími fázemi: indukce proembryogenní masy buněk, vytváření somatického embrya, dozrávání somatického embrya, vysušování a regenerace celé rostliny (Ďurkovič a Krajňáková,2010). 26

Somatická embryogeneze smrků se řadí mezi nejvíce úspěšné mezi všemi jehličnany, k čemuž přispívá fakt, že u ní bylo dosaženo také praktické realizace. Pro množitelské programy velkého rozsahu se využívají především následující druhy smrku: Picea glauca, Picea abies,picea sitchensis, Picea mariana a kříženec Picea engelmannii s Picea glauca ( Ďurkovič, Krajňáková, 2010). Nedávná studie prokázala, že je možné využít pro zefektivnění somatické embryogeneze u smrku jed pocházející z Latrunculia magnifica (mořská houby) s názvem latrunculin B. Pro buňky je tento jed ve vysokých dávkách destruktivní, avšak v menších koncentracích napomáhá selekci životaschopných embryí. Latrunculin B působí destruktivně na oblast suspenzoru embryí, konkrétněji na látku proteinové povahy aktin, jež tvoří jednu ze složek cytoskeletu buněk suspenzoru. U kultury somatických embryí, která byla ošetřena latrunculinem B je sice méně embryí jsou však lépe vyvinuté, následně pak také lépe klíčí ( Schwarzerová a kol., 2010). 27

3 MATERIÁL A METODIKA 3.1 Rostlinný materiál pouţitý k experimentu Pro získání kořenů ze zygotických embryí smrku ztepilého byla použita zralá semena ze tří oblastí: 1. lesní oblasti Českomoravské mezihoří (rok sběru 2005, klíčivost 98%), 2. ŠLP Křtiny (rok sběru 2006, klíčivost 98%), 3.oblast Podkomorské lesy (rok sběru 2008, klíčivost 98%). K získání kořenů smrku ztepilého ze somatických embryí byla použita embrya, získaná z Ústavu biologie rostlin MENDELU Brno, jež prošla všemi fázemi somatické embryogeneze, popsanými v kapitole 3.2, až na fázi klíčení a růstu kořene, která byla prováděna v rámci pokusu. Ovšem i fáze předcházející samotné konverzi byly ve svém průběhu sledovány.embrya použitá k založení pokusu byly získány ze zralých semen z oblasti Beskyd. 3.2 Klíčení somatických embryí Fáze, jež předcházejí u somatické embryogeneze klíčení a růstu kořene jsou popsány pomocí metodiky, která byla zpracována ve Výzkumném ústavu lesního hospodářství a myslivosti,v.v.i. v roce 2010, jedná se tedy o novou metodiku s dobrou perspektivou jejího využití do budoucna, proto je do této části práce zařazena. U samotného klíčení a růstu kořene bylo využito postupu,který byl již v laboratoři Ústavu biologie rostlin MENDELU vyzkoušen u podobných experimentů. 3.2.1 Indukce somatické embryogeneze Úspěšnost indukce ovlivňuje do značné míry zvolené indukční médium. Obecně lze média rozdělit na pevná, obsahující agar a tekutá. Pro indukci somatických embryí bývají častěji používána média pevná ( Vágner a kol., 2005). 28

Průběh indukce somatické embryogeneze je odvislý zejména od zvoleného primárního explantátu, svou roli ovšem také hraje jeho vývojové stádium. Primárními explantáty pro somatickou embryogenezi jsou tedy u lesních dřevin nejčastěji: samičí gametofyty, samčí gametofyty s intaktními zygoticými embryi, kotyledonární embrya, prekotyledonární zygotická embrya. Mezi další faktory ovlivňující fázi indukce u somatické embryogeneze lze řadit také koncentraci základních složek média, agar, ph, fotoperiodu a hladiny iontů dusíku ( Ďurkovič, Krajňáková, 2010). Jak zralá,tak i nezralá extirpovaná zygotická embrya je možné využít k indukci somatické embryogeneze u smrku ztepilého. Množství získaných embryogeních linií se odvíjí od toho,zda-li použijeme k založení embryogeních linií nezralá či zralá zygotická embrya. Lepších výsledků je možno dosáhnout v případě, že použijeme nezralá zygotická embrya. Abychom získali zygotická embrya je nutné si nejdříve opatřit semena, respektive šišky, příhodným obdobím pro jejich sběr jsou letní měsíce. Nezralé šišky pak uchováváme před vlastním zpracováním v teplotě 4 0 C. Získaná semena je pak nutno sterilizovat, vhodné je použití 1% roztoku SAVA.Již extirpovaná zygotická embrya je nutno přemístit na vhodné živné médium. Takovýmto médiem může být modifikované živné médium E ( Gupta a Durzan, 1985), obsahující makroelementy, mikroelementy a vitamíny, které je komplementováno kasein hydrolyzátem v koncentraci 400mg.l -1, sacharózou s koncentrací 20g.l -1, BAP o koncentraci 0,5 mg.l -1, kinetinem s koncentrací 0,5 mg.l -1, kyselinou 2,4-D v koncentraci 1,0 mg.l -1 a putrescinem o koncentraci 1,5 g.l - 1. K zpevnění média, je vhodné do něj přidat gelrit 2 g.l -1, ph média pak upravíme na 5,8. Sterilizace živných médií probíhá v autoklávu za teploty 120 0 C a tlaku 150 kpa s délkou trvání 20 minut. Nejvhodnějšími podmínkami pro kultivaci je klimatizovaný prostor, tma a teplota 22 0 C. Pro získání embryogeních kultur je nutné odvozené rostoucí embryogenní linie pasážovat s rozestupem čtyř týdnů na čerstvém médiu stejného složení ( Malá, Cvikrová, Cvrčková, Máchová, 2010). 29

Tab.1: Složení modifikovaného živného média E(Gupta a Durzan, 1985) Médium E mg.l -1 KNO 3 2 340 NH 4 NO 3 225 CaCl 2.2H 2 O 220 MgSO 4.7H 2 O 185 KH 2 PO 4 85 Na 2 EDTA 18.6 FeSO 4.7H 2 O 13.9 H 3 BO 4 3.1 MnSO 4.H 2 O 11.2 ZnSO 4.7H 2 O 4.3 KJ 0.4 Na 2 MoO 4.2H 2 O 0.1 CuSO 4.5H 2 O 0.01 COCl 2.6H 2 O 0.01 MYO-Inisitol 1000 Thiamin 1.0 Pyridoxin 0.5 Nicotinic acid 0.5 Glycin 2.0 L-glutamin 400 30

3.2.2 Udrţování embryogenní kultury V průběhu proliferace dochází v důsledku subkultivace embryogeních buněk k jejich neustálému růstu. Proliferace probíhá na polotuhých nebo tekutých médiích, které jsou zpravidla shodná s médii, jež byly použity k indukci, u fytohormonů a sacharózy,což jsou obvyklé složky médií používaných pro tyto aplikace, je možné snížit jejich koncentraci. U polotuhého média bývají embryogenní buňky přemisťovány na čerstvé médium s časovou periodou 10-14 dní, u tekutého média s časovým rozptylem 7 dní.není vhodné subkultivaci příliš prodlužovat z důvodu možného vzniku abnormálních struktur u embryí(ďurkovič, Krajňáková, 2010). 3.2.3 Maturace somatických embryí Samotné dozrávání začíná vývinem somatického embrya a je zakončeno jeho vysušováním. U jehličnanů je vývin somatického embrya vyvolán odstraněním fytohormonů, konkrétně auxinů a cytokininů, spolu s použitím kyseliny abscisové (Ďurkovič, Krajňáková, 2010). Pro získání zralých somatických embryí je nutné embryogenní kultury přemístit na maturační médium E, které má složení shodné s médiem použitým v procesu indukce. U tohoto média jsou již odstraněny auxiny a cytokininy, nahrazuje je však ABA o koncentraci 8 mg.l -1, nutné je ustálení osmotických poměrů po němž přidáme 20 g.l -1 PEG. Prostřednictvím membránového filtru vysterilizujeme roztok ABA, který k médiu přidáme až poté co je roztok kyseliny vysterilizován v autoklávu. Embryogenní kultury udržujeme ve tmě. Po uplynutí 14 dní je nezbytné přemístit embryogenní kulturu na čerstvé médium shodného složení. Po 5-6 týdnech kultury přemístíme na stejné E médium, kde je ABA nahrazena IBA o koncentraci 0,1 mg.l -1. Kultivujeme za16.hodinového působení světla ( osvětlení má intenzitu 30µmol.m -2.s -1 ) a teplotě 24 0 C (Malá, Cvikrová, Cvrčková, Máchová, 2010). 31

3.2.4 Klíčení embryí a růst kořene Tato fáze byla prováděna ve spolupráci s RNDr.Karlem Slabým,CSc.,který se této problematice dlouhodobě věnoval a pracovníky laboratoře Ústavu biologie rostlin.jako médium vhodné pro růst kořínků smrku ztepilého ze somatických embryí byla na základě zkušeností RNDr.Karla Slabého,CSc.s podobnými pokusy vybráno médium,získané kombinací dvou médií(gupta a Durzan, 1986., von Arnold, 1987),které bylo doplněno medicinálním uhlím 0.4%.K naklíčení byly použity již desikovaná vitální somatická embrya,jež prošla první fází konverze.klíčení probíhalo po dobu 7 dní. 32

Tab.2:Složení výsledného média použitého k naklíčení (kombinace médií Gupta a Durzan1986,.von Arnold 1987). Médium mg.l -1 KNO 3 2 340 NH 4 NO 3 275 CaCl 2.2H 2 O 220 MgSO 4.7H 2 O 185 KH 2 PO 4 85 Na 2 EDTA 18 900 FeSO 4.7H 2 O 13 900 H 3 BO 4 3 100 MnSO 4.4H 2 O 11 150 ZnSO 4.5H 2 O 4 300 Na 2 MoO 4.2H 2 O 125 CuSO 4.5H 2 O 12,5 CoCl 2.6H 2 O 12,5 Inisitol 1 000 Thiamin 1 Pyridoxin 0,5 Kyselina nikotinová 0,5 Gyicin 2 Glutamin 450 Kasein hydrolyzát 500 Sacharóza 30 000 Gerlit 3 500 33

Po naklíčení byly kořínky ze somatických embryí, jež dosáhly délky cca 2 cm,vždy v počtu 10 kořínků umístěny za pomocí chirurgické pinzety na horní okraj velkého filtračního papíru,který byl navlhčen destilovanou vodou a smotán, tak aby kořínky nevypadly,tento filtrační papír byl vložen do odměrného válce,na jehož dně byla voda,aby měli kořínky dostatek vláhy.odměrný válec byl umístěn na tmavé místo v laboratoři(teplota 22 0 C),kde měly kořínky vhodné podmínky ke svému dalšímu růstu,jehož doba se pohybovala od 6 po 8 dní.k přípravě preparátů byly použity jak kořínky čerstvě odebrané z kultivačního média,tak i kořínky,jejichž růst pokračoval v odměrném válci.cílem bylo zaznamenat rozdíly ve výskytu kořenového vlášení a po následném zhotovení preparátů z těchto kořínků také rozdíly v počtu svazků cévních ve srovnání s kořínky ze zygotických embryí. 3.3 Klíčení kořínků ze zygotických embryí K získání kořínků ze zygotických embryí byla použita zralá semena smrku ztepilého ze tří oblastí: 1.lesní oblasti Českomoravské mezihoří(rok sběru 2005,klíčivost 98%),2.ŠLP Křtiny(rok sběru 2006,klíčivost 98%),Podkomorské lesy(rok sběru 2008,klíčivost 98%).Pro účely experimentu byla semena z daných oblastí označena pomocí čísel 1,2,3,a to v pořadí uvedeném výše.semena byla sterilizována 20% roztokem SAVA,doba expozice činila 20 minut,následně byla semena propírána opakovaně destilovanou vodou a proudem tekoucí vody.takto připravená semena,vždy v počtu 50 byla umístěna chirurgickou pinzetou na předem navlhčený kulatý filtrační papír,který byl umístěn na Petriho misce.tedy od každé oblasti byla u konkrétního pokusu 1 Petriho miska s 50 ks semen. Petriho misky byly po svém obvodu opařeny potravinářskou folií z důvodů zabránění možné kontaminace a nežádoucího odparu vody.petriho misky byly uloženy mezi buničitou vatu a dány do krabice,jež byla umístěna na vyhrazené místo v laboratoři.vzhledem k tomu,že největší schopnost klíčivosti vykázaly semena z oblastí 1 a 3 byla v dalších pokusech využívány především semena, jež pocházela z těchto dvou oblastí,respektive semena s označením 1a3.Samotná doba potřebná k naklíčení se pohybovala od 6 do 9 dní v závislosti na ročním období,jak bylo v průběhu pokusu zjištěno. Již naklíčené kořínky o délce cca 2-3 cm byly umístěny na horní díl,předem navlhčeného filtračního papíru,vždy v počtu 10 kořínků. 34