Cystická fibróza. Iveta Valášková ivalskova@fnbrno.cz. Fakultní nemocnice Brno Oddělení lékařské genetiky

Cystická fibróza Iveta Valášková ivalskova@fnbrno.cz Fakultní nemocnice Brno Oddělení lékařské genetiky

Cystická fibróza nejčastěji se vyskytující autozomálně recesivní dědičná metabolická porucha v zakavkazské populaci Incidence 1 : 3000 živě narozených dětí Frekvence přenašečů 1 : 25 V ČR se každý rok rodí 40 50 dětí s CF

Základní fyziologický defekt při onemocnění CF porucha v transportu iontů chlóru, sodíku a vody přes apikální membránu specializovaných epiteliálních buněk některé exokrinní žlázy produkují hustý, lepkavý hlen tím zapříčiněny hlavní symptomy nemoci

Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein CFTR chloridový kanál regulující transportiontů přes buněčnou membránu cyklický adenosin monofosfát lokalizovaný v apikální membráně epiteliálních buněk Tvořen 5ti doménami: 2 membrane spanning domains 2 nucleotide binding domains 1 regulatory domain

CFTR gen kóduje CFTR protein lokalizován na chromozomu 7 (7q31) 250 kb dlouhý 27 exonů cdna sekvence dlouhá 6129 bp kóduje 1480 aminokyselin CFTR proteinu Mutace v tomto genu způsobují onemocnění CF

CFTR mutace 1500 CFTR mutací bylo nalezeno v CFTR genu (CFTR Mutation Table; http://www.genet.sickkids.on.ca./cftr-cgibin/fulltable Většina z nich je raritní, privátní nebo jejich vztah k CF nebyl prokázán Z celkového počtu 30ti doposud u nás nalezených mutací (zahrnujících celkem 95% všech CF alel) se pouze 8 mutací vyskytuje na více než 1% CF patologických alel Je pozorováno široké rozpětí ve frekvenci jednotlivých mutací u různých populací Nejčastější mutatace df508 je detekována u cca 70% CF pacientů

Mutace v genu CFTR u českých CF pacientů F508del 71,57% dele2,3(21kb) 4,64% G551D 4,03% N1303K 3,02 % G542 2,22% 1898+1GtoA 2,02% 2143delT 1,21% R347P 0,81% W1282 0,60% 4374+1GtoA, 1717-1GtoA, R1162, E92, 2184insA, 3849+10kb každá 0,4% R334W, R553, 621+1GtoT,... každá 0,2%

CF - autosomálně recesivní dědičnost OTEC PŘENAŠEČ MATKA PŘENAŠEČKA ZDRAVÉ DÍTĚ PŘENAŠEČ PŘENAŠEČ DÍTĚ S CF non mt/non mt non mt/mutace mutace/mutace 1. alela 2. alela

CF polysystémové onemocnění Zasahuje různé orgány -plíce - pankreas - trávící trakt - reprodukční orgány

plíce Zahlenění a infekce průdušek znesnadňuje dýchání. Sekundární infekce narušující plíce jsou u lidí s CF nejčastější příčinou smrti játra Ucpávání drobných žlučovodů znesnadňuje trávení a narušuje funkci jater asi u 5% pacientů. slinivka břišní Asi u 85% pacientů dochází k uzavření jejích kanálků. Trávící enzymy nemohou být dopraveny do střev. tenké střevo Ucpávání střeva hustou stolicí si vynucuje chirurchický zákrok asi u 10% novorozenců. reprodukční orgány Nefunkčnost kanálků v pohlavním ústrojí(např. vas deferenc) je z 95% příčinou mužské sterility.příčinou neplodnosti u žen je ucpání děložního hrdla hleny,které znemožní spermiím proniknout dále do dělohy. potní žlázy Porušená funkce se projevuje nadměrným vylučováním solí (NaCl).

Fertilita nemocných CF Muži Sterilní v 95% Porucha vývoje vas diferentia (CBVAD), epididymis a vesiculi seminalis Obstruktivní azoospermie může být zcela izolovaným příznakem Nejčastější mutace asociované s CBVAD: 5T vatianta v intronu 8 R117H Ženy Plodnost snížena pro viskozitu cervikálního hlenu Častá primární nebo sekundární amenorrhea v důsledku poruch výživy a plicních změn

Cílená mutační analýza CFTR genu je prováděna: A, pro potvrzení diagnosy 1. u pacientů s dg. CF 2. u členů rodin s výskytem CF 3. prenatálně u plodů v riziku s pozitivní CF rodinnou anamnézou 4. prenatálně u plodů s patologickým ultrazvukový nálezem (abnormalita střevních kliček) 5. u novorozenců s mekoniovým ileem 6. u mužů s poruchami reprodukce B, prevence 1. u příbuzenských párů 2. u manželských párů zařazených do IVF programu 3. u dárců gamet a embryí 4. u partnerů (partnerek) heterozygotů

Cystická fibróza Kaskádovitá strategie rutinní molekulárně genetické diagnostiky CF suspektní CF pacient nebo přenašeč partner přenašeče přenašeč Scoring 6 nejčastějších CFTR mutací jedna nebo obě alely neidentifikovány Scoring 36 CFTR mutací jedna nebo obě alely neidentifikovány obě CF alely identifikovány CF diagnóza potvrzena Scanning celé CFTR-codující sekvence

Využití Real Time PCR v detekci CF mutací

Test založený na analýze bodu tání fluorescenčně značených prob po vysokorychlostní PCR na přístroji LightCycler rychlý bezpečný snadno interpretovateln

CFTRdele2,3(21kb) G542 G551D df508 R553 Set 3 separ ov aných PCR re akcí u j edno ho testov aného j edince 5 nej častěj ších CF mutací Five major CF mutations are detected j e detekov áno za 1 h odi nu in less than 1 hour

Cystická fibróza scoring nejčastějších mutací CFTRdele2,3(21kb) G542 G551D F508del R553 N1303K

Detekce mutace df508 Fluorescenční monitoring df508 lokusu 1 2 3 4 5 6 PCR: jeden pár primerů wt wt wt wt df508/nondf508 K-DNA Analýza bodu tání: jeden systém prob 1 3 2 5 5 4 6 according to Burgraf, 2001 df508

1 Detekce mutací G542, G551D a R553 PCR: jeden pár primerů Analýza bodu tání: dva systémy prob 5 5 2 Fluorescenční monitoring G551D/R553 lokusu 1 2 3 4 5 6 wt wt R553/non G551D/non G542/non K-DNA Fluorescenční monitoring G542 lokusu G542 according to Burgraf, 2001 G551D, R553 3 4 6 5 1,2,3,4 6

3 Detekce mutace CFTRdele2,3(21kb) PCR: jeden F primer dva specifické R primery LC Red705 1,2,,4,5,6 Analýza bodu tání: dva systémy prob 1 2 3 4 Primer Position: 59 154 5 6 Primer Position: 38 200 Fluorescenční analýza lokusu s delecí wt wt CFTRdele2,3(21kb)/non wt wt K-DNA 1 2 3 4 Primer Position: 37 889 breakpoint Alela bez delece - wt Primer Position: 37 889 deletion2,3(21kb) Alela s delecí - mt Fluorescenční analýza lokusu bez delece 5 6

Analýza CF mutací pomocí hybridizační techniky INNO - LiPA

Spektrum analyzovaných CF mutací je rozšířeno použitím INNO-LiPA CFTR 12 INNO-LiPA CFTR 17 + Tn 19 a 17 CF mutatcí a jejich wild-type sekvence Identifikuje polymorphism Tn (intron 8) asociovaný s CBVAD

Mutace INNO-LiPA CFRT12 Delta F508 G542 N1303K 1717-1G>A W 1282 G551D R553 Delta 1507 R560T 390 inst Q552 S1251N 394delTT G85E 621+1G>T R117H 1078delT R347P R334W E60 711+5G>A R1162 3659delC 3849+10kbC>T 2143delT A455E 2183AA>G 2184delA INNO-LiPA CFTR17+Tn

Jeden vzorek Jedna amplifikace Jeden strip Výsledek multihybridizace do 3 hodin po amplifikaci

Uvedenými postupy však nejsme schopni detekovat raritní a neznámé CF mutace, k jejichž odhalení musí být využívány rozličné vyhledávací metody Analýza celé CFTR kódující sekvence a přilehlých oblastí 4334 AtoC, E1401A, AAC>CAC A>C 2668del11>ins13, frameschift del GTATGTGTTCC ins ctcttgtgaccga