Pracovní úkol 1. Vytvořte kalibrační řadu roztoků pro stanovení orthofosforečnanů (viz část 1), stanovte vhodnou vlnovou délku pro kalibraci a proveďte kalibraci přístroje pro toto stanovení. 2. Na základě Vaší kalibrace stanovte koncentraci orthofosforečnanů ve vzorku povrchové, pitné a minerální vody (viz část 1). 3. Fotometricky stanovte koncentraci orthofosforečnanů ve vzorcích povrchové, pitné a minerální vody (viz část 2). 4. V závěru proveďte diskusi (komentář), zda jste správně provedli kalibraci přístroje pro stanovení orthofosforečnanů, na základě čeho jste to určili a rovněž proveďte komentář k naměřeným hodnotám tří rozdílných vzorků vody. 5. V protokolu musí být veškeré výpočty pro přípravu jednotlivých roztoků a to i v případě, pokud jsou roztoky již připraveny. Princip metody Spektrofotometrie patří mezi fyzikální popř. fyzikálně chemické metody analýzy, která ke stanovení látek využívá přístroje či zařízení. Z tohoto důvodu jsou častěji označovány jako instrumentální metody. Tato metoda je založena na interakci mezi elektromagnetickým zářením a molekulou stanovované látky, kterou dané elektromagnetické záření prošlo. Pokud měřená látka je schopná absorbovat elektromagnetické záření, bude se prošlý tok lišit od vstupního. A úkolem spektrofotometrie je pak studovat, při jakých vlnových délkách a k jak intenzivnímu pohlcení došlo. Molekuly mají schopnost pohlcovat elektromagnetické záření pouze určitých vlnových délek. Je to dáno tím, že mohou existovat jen v určitých kvantových stavech, které se liší obsahem energie. Jestliže má molekula přejít ze stavu s nižší energií do stavu s energií vyšší musí absorbovat záření o frekvenci υ, která právě odpovídá rozdílu energií mezi energetickými hladinami E p a E q obou kvantových stavů podle Planckovy podmínky: E = E p E q = h υ = h c / λ kde c je rychlost světla, λ vlnová délka, h Planckova konstanta (6,626.10-34 J s); podle konvence je exitovaná hladina označována indexem p (horní hladina), základním indexem q (spodní hladina). Podstatou UV a Vis spektrometrie je absorpce UV a Vis záření (200 až 800 nm) zředěnými roztoky molekul. Při absorpci dochází k excitaci valenčních elektronů. Proto tato spektra nazýváme elektronová a spektrometrii elektronovou spektrometrii. Nejnáročnější jsou přechody mezi elektronovými energetickými hladinami. K těmto přechodům dochází při absorpcí ultrafialového (190 až 400 nm) a viditelného záření (400 až 800 nm). Absorpce záření se měří na přístrojích, které se nazývají absorpční spektrofotometry. Spektrofotometr je jen jednopaprskový a měří tedy jen vystupující tok záření. Proto je třeba provést dvě měření, kdy vedle měření vlastního vzorku Φ, měříte ještě slepý (srovnávací pokus Φ o), u kterého nedochází k absorpci (tzn. prošlý tok Φ je stejný jako dopadající tok Φ o ). 1
Při absorpčním měření se pro stanovenou vlnovou délku porovnává tok záření Φ prošlý měrnou kyvetou s tokem záření Φ o, prošlým kyvetou s čistým rozpouštědlem nebo slepým pokusem. Vstupující tok záření Φ ò, jehož hodnota není pro měření významná, je vždy absolutně vyšší o podíl odraženého nebo rozptýleného záření Φ r. Čisté rozpouštědlo nebo slepý pokus Vzorek Podíl odražený, Podíl odražený, Φ r rozptýlený Φ r rozptýlený Φ ò Φ o Φ ò Φ zářivý tok zářivý tok zářivý tok vstupující zářivý tok zeslabený vstupující vystupující absorpčním prostředím Podíl absorbovaný Φ a Podíl zářivých toků Φ a Φ o se nazývá propustnost neboli transmitance T T = Φ / Φ o Na spektrofotometru můžete odečíst i absorbanci A, tedy záporně vzatý logaritmus propustnosti: A = - log T = log (Φ o / Φ) Závislost propustnosti či absorbance na vlnové délce se nazývá absorpční spektrum. Kvantitativní analýza je založena na Labertově-Beerově zákoně, podle kterého je hodnota absorbance A při vlonové délce λ přímo úměrná látkové koncentraci c. Lambertbeerův zákon platí pro monochromatické záření a pro nízké koncentrace, řádově menší než 10-2 mol/l. Nejjednodušším ověřením platnosti tohoto zákona je proměření závislosti absorbance na různé koncentrace několika kalibračních roztoků při stejné vlnové délce a ve stejné kyvetě. Výsledná závislost musí být přímková a nazýváme ji kalibrační křivkou. Absorpční spektrofotometr se skládá ze 4 základních částí (viz obr. č. 1): 1. Zdroj pro viditelnou oblast je to wolframová nebo halogenová žárovka, 2. Monochromátor tvořený vstupní a výstupní štěrbinou, zrcadlovou nebo čočkovou soustavou a rozkladným prvkem (hranol nebo reflexní mřížka), 3. Absorpční prostředí kyveta s měrným nebo srovnávacím prostředím, 4. Detekční systém fotoelektrický detektor záření a elektronické zařízení na zpracování jeho odezvy. Ze zdroje vychází svazek polychromatického záření na vstupní štěrbinu monochromátoru. Po rozkladu se natáčením rozkladného prvku postupně zobrazují jednotlivé monochromatické obrazy záření s charakteristickým intervalem vlnových délek vstupní štěrbinou na štěrbinu výstupní. Střední hodnota tohoto intervalu je zvolená vlnová délka. Je nutné vybrat takovou vlnovou délku, při níž látka silně absorbuje. Po průchodu absorpčním prostředím dopadá monochromatické záření na fotoelektrický detektor. Signál z detektoru se zpracovává v zesilovači a jeho výstup se zobrazí na číslicovém displeji. 2
Obrázek 1: Složení absorpčního spektrofotometru ČÁST 1: SPEKTOFOTOMETRICKÉ STANOVENÍ ORTHOFOSFOREČNANŮ VE VZORCÍCH VODY Princip Veškerý fosfor se vyskytuje buď ve formě anorganické (P anorg ) nebo v organické (P organ. ). Jsou to hlavně orthofosforečnany (P ortho ) a polyfosforečnany (P poly ). Nejčastější formou výskytu jsou orthofosforečnany (PO 4 3-, HPO 4 2-, H 2 PO 4 -, H 3 PO 4 ). Zdrojem polyfosforečnanů jsou zejména výrobky s komplexotvorným účinkem (prací prostředky, prostředky pro povrchovou ochranu chladicích okruhů, apretační prostředky pro textilní průmysl, inhibitory koroze apod.). Stanovení (hmotnostní) se provádí za účelem posouzení podmínek eutrofizace. Vhodnou předpravou vzorku lze určit jednotlivé formy fosforu: V nefiltrovaném vzorku (P rozp + P nerozp ) orthofosforečnany - P ortho hydrolyzované polyfosforečnany P ortho + P poly celkový fosfor po mineralizaci P celk = P ortho + P poly + P org Ve filtrovaném vzorku (P rozp ) rozpuštěné orthofosforečnany - P ortho rozpuštěné hydrolyzované polyfosforečnany - P ortho + P poly celkový rozpuštěný fosfor po mineralizaci P celk = P ortho + P poly + P org 3
Reagencie (Činidla) 1. Destilovaná voda. 2. Kyselina sírová, roztok c(h 2 SO 4 ) 9 mol/l, v 2000 ml kádince se k 500 ml destilované vody za neustálého míchání a chlazení přidá 500 ml koncentrované H 2 SO 4 (ρ = 1,84 g/l). 3. Kyselina sírová, roztok c(h 2 SO 4 ) 4,5 mol/l, v 2000 ml kádince se k 500 ml destilované vody za neustálého míchání a chlazení přidá 500 ml koncentrované H 2 SO 4 c(h 2 SO 4 ) 9 mol/l (činidlo 2). 4. Kyselina askorbová, roztok (10%), v ledničce ve 100 ml odměrné baňce se v destilované vodě rozpustí vypočtené množství (výpočet uvést v protokolu, pokud roztok připravujete, výpočet uvést i v laboratorním deníku) kyseliny askorbové, doplní se po rysku, přelije se do láhve z hnědého skla a uchovává se v ledničce. Roztok je stálý asi 2 týdny. 5. Molybden amonný, kyselý roztok I., (POZOR, TOXICKÁ LÁTKA!), v ledničce v kádince se ve 100 ml destilované vody rozpustí 13 g molybdenanu amonného (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 4 H 2 O, v další kádince se ve 100 ml destilované vody rozpustí 0,35 g vinanu antimonylodraselného K(SbO)C 4 H 4 O 6 1/2 H 2 O (POZOR, TOXICKÁ LÁTKA!). K 300 ml kyseliny sírové o koncentraci (H 2 SO 4 ) 9 mol/l (činidlo 2) se přidá za neustálého míchání roztok molybdenanu a poté roztok vinanu. Po ochlazení se roztok uchovává v láhvi z hnědého skla a v chladu. Je stálý asi 2 měsíce. 6. Zásobní roztok standardu, dihydrogenfosforečnan draselný, ρ(po 4-3 ) = 500 mg/l, v 1000 ml odměrné baňce se rozpustí v destilované vodě předem 2 hodiny vysušeného (při 105 C) 0,7165 g dihydrogenfosforečnanu draselného - KH 2 PO 4 a doplní se po rysku. 7. Povrchová voda donese student 8. Pitná voda, destilovaná voda 9. Minerální (mořská) voda donese student Pomůcky Spektrofotometr. Kádinka 100 ml (2 ks). Odměrné baňky 50 ml (11 ks), 100ml (1 ks), 2000 ml (1 ks). Budík. Kyvety 5 cm. Pipety 1 ml, 2 ml, 5 ml (2 ks), 10 ml. 4
Kalibrace 1. Příprava pracovního roztoku: Pro přípravu kalibrační řady si nejdříve musíte připravit ze zásobního roztoku (činidlo 6), pracovní roztok o vhodné koncentraci. Při výpočtu postupujete dle následující rovnice: P B V ZR. ρ ZR = V PR. ρ PR (1) kde: P V ZR = pipetovaný objem zásobního roztoku (chceme vypočítat) ρ ZR = koncentrace zásobního roztoku (viz popis činidla 6) B V PR = požadovaný objem pracovního roztoku (v našem případě tj. 1 l odměrná baňka) ρ PR = požadovaná koncentrace pracovního roztoku (zjistíte odhadem, aby se vám dobře pipetovalo) 2. Příprava kalibrační řady o koncentraci 0,2 mg/l 1 mg/l orthofosforečnanů Pro přípravu kalibrační řady použijte pracovní roztok o koncentraci, kterou jste si zvolili. Na základě pracovního roztoku si vypočítejte kalibrační řadu o koncentraci 0mg/l a 0,2 mg/l až 1 mg/l po 0,2 mg/l. Do protokolu uveďte výpočet prvního roztoku a ostatní roztoky stačí formou tabulky (viz tabulka č. 1). Pro výpočet použijte následující rovnici: P B V PR. ρ PR = V KR. ρ KR (2) kde: P V PR = pipetovaný objem pracovního roztoku (chceme vypočítat) ρ PR = koncentrace pracovního roztoku (vypočítali jsme v 1. přípravě) B V KR = konečný objem kalibračního roztoku ρ KR = koncentrace kalibračního roztoku ( v našem případě tj. postupně 0; 0,2; 0,4 1 mg/l) 5
Koncentrace kalibračního roztoku mg/l 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Tabulka 1: Kalibrační řada Objem pracovního roztoku ml Postup Úkol č. 1: Vytvoření kalibrační řady pro stanovení orthofosforečnanů 1. Ze zásobní suspenze dihydrogenfosforečnanu draselného (činidlo 6) si nejdříve připravíte pracovní roztok dihydrogenfosforečnanu draselného, kdy si do 1000 ml odměrné baňky odměříte vypočtené množství zásobního roztoku dle výpočtu (1), který jste si udělali při kalibraci a objem po rysku doplníte destilovanou vodou. 2. Z pracovní suspenze si v odměrných baňkách o objemu 50 ml připravte řadu kalibračních suspenzí, jejichž objem jste si vypočetli dle výpočtu (2) a zapsali do tabulky č. 1. 3. Tzn. do první odměrné baňky s označením PO 4-3 0 mg/l nalijete destilovanou vodu (0 mg/l PO 4 3- ) po rysku baňky. Vezměte druhou odměrnou baňku s označením PO 4 3-0,2 mg/l a napipetujete vámi vypočtený objem a zbytek po rysku doplníte destilovanou vodou. Stejně pokračujete s ostatními roztoky. Kalibrační roztoky 0 mg/l a 1 mg/l připravte 2 krát. 4. Kalibrační roztoky důkladně promíchejte. 5. Z takto připravených kalibračních roztoků odpipetujte 10 ml roztoku, tak aby Vám zůstalo v odměrné baňce 6. Přidejte 1 ml kyseliny askorbové (činidlo 4) a 2 ml kyselého roztoku molybdenanu I. (činidlo 5). 7. Roztoky promíchejte a destilovanou vodou doplňte po rysku a nechte 15 minut stát. Úkol č. 2: Volba vhodné vlnové délky pro kalibraci 1. Z připravené kalibrační řady (po 15 minutách) vyberte standard o koncentraci 0 mg/l a 1 mg/l PO 4 3- a proměřte absorbanci při vlnových délkách 698 702 nm v kyvetě 5 cm. Pro každou vlnovou délku použijte jako blank kalibrační roztok o koncentraci 0 mg/l (při měření postupujte dle návodu u přístroje - kalibrace). 2. Výsledky zaznamenejte do tabulky č. 2. 3. Vyberte vlnovou délku, při které má kalibrační roztok o koncentraci 1 mg/l nejvyšší absorbanci. Tuto vlnovou délku použijte pro další vlastní měření kalibrační křivky a stanovení orthofosforečnanů ve vzorcích vod. 6
Tabulka 2: Absorbance Vlnová délka [nm] Absorbance 698 699 700 701 702 Úkol č. 3: Kalibrace spektrofotometru pro stanovení orthofosforečnanů 1. Postupujte podle návodu pro kalibraci přístroje (položený u spektrofotometru - kalibrace). 2. Postupně budete nalévat kalibrační roztoky (od nejmenšího obsahu orthofosforečnanů 0 až do 1 mg/l) do kyvety s optickou dráhou 5 cm a vkládat do spektrofotometru, kde budete proměřovat kalibrační roztoky při vlnové délce, kterou jste určili v úkolu č. 2. 3. Z naměřených hodnot koncentrace orthofosforečnů (osa x) a absorbance (osa y) vytvořte graf (kalibrační křivku) jejich závislostí. Úkol č. 4: Stanovení orthofosforečnanů ve vzorcích pitné, povrchové a minerální vody 1. Do 50 ml odměrné baňky odměřte 40 ± 0,1 ml roztoku vzorku povrchové, pitné, minerální a destilované vody (slepý vzorek). 2. Přidejte 1 ml kyseliny askorbové (činidlo 4) a 2 ml kyselého roztoku molybdenanu I. (činidlo 5). 3. Roztoky promíchejte a destilovanou vodou doplňte po rysku a nechte 15 minut stát. 4. Dále postupujte podle návodu pro stanovení látek (položený u spektrofotometru). 5. Vzorky vod proměřujte při vlnové délce, kterou jste si zvolili v úkolu č. 2, v kyvetě optické dráhy 5 cm. Zbarvení je stálé několik hodin. Stejným postupem proveďte slepé stanovení s destilovanou vodou. Tabulka 3: Naměřené hodnoty absorbance a koncentrace orthofosforečnanů při kalibraci. Tabulka 4: Naměřené a vypočtené hodnoty absorbance a koncentrace orthofosforečnanů ve vzorcích vody. Výpočty 1. Výpočet přípravy pracovního roztoku standardu při kalibraci. 2. Výpočet přípravy kalibračních roztoku o koncentraci 0,2 mg/l 1 mg/l orthofosforečnanů při kalibraci. 3. Výpočet množství kyseliny askorbové použité pro přípravu 10 % roztoku kyseliny askorbové na objem 100 ml. 7
Vyjadřování výsledků Výsledky kalibrace a stanovení orthofosforečnanů ve vzorku vody se uvádí v jednotkách mg/l na 3 platné číslice. Závěr Odpověď na odstavec pracovní úkol a komentář k naměřeným hodnotám. K protokolu přiložte graf závislosti absorbance a stanovené hodnoty kalibračních roztoků orthofosforečnanů kalibrační křivku. ČÁST 2: KOLORIMETRICKÉ STANOVENÍ ORTHOFOSFOREČNANŮ VE VZORCÍCH VODY Princip Kolorimetrie je nejstarší optická metoda. Spočívá ve vizuálním porovnávání intenzity zbarvení vzorku a standardu. Porovnáváme buď roztok vzorku se sadou různě koncentrovaných roztoků při stejných tloušťkách absorpční vrstvy, nebo měníme tloušťku absorbující vrstvy, dokud se nedosáhne shodné absorpce: Reagencie (Činidla) 1. Destilovaná voda. 2. Povrchová voda donese student 3. Pitná voda, destilovaná voda 4. Minerální (mořská) voda donese student 5. Standard PO 4-1 6. Standard PO 4-2 Pomůcky Fotometr Multy. Pipeta 10 ml (2 ks). Kyveta 24 mm. A x = A st c l = c x x st l st 8
Postup Úkol č. 1: Stanovení orthofosforečnanů ve vzorcích pitné, povrchové a minerální vody 1. Do kyvety odpipetujte 10 ml vzorku povrchové, pitné a minerální vody. Do druhé kyvety odměřte 10 ml destilované vody. 2. Do každé kyvety přidejte 10 kapek PO 4-1 (činidlo 2), kyvetu zavřete a promíchejte. 3. Po promíchání do každé kyvety přidejte 2 modré lžičky PO 4-2 (činidlo 3), kyvetu opět zavřete a promíchejte. 4. Zapněte fotometr a naťukejte číslo metody 383 a zmáčkněte ENTER. 5. Až se metoda objeví, na displeji zmáčkněte START. 6. Přístroj začne odpočítávat 5 minut, po které musí roztoky v kyvetě stát. 7. Po uplynutí této doby vložte kyvetu se slepým vzorkem (destilovaná voda) do místa pro měření a zmáčkněte ZERO. 8. Jakmile v dolní části displeje nebude svítit zeoring, kyvetu vyjměte. 9. Vložte postupně kyvety se vzorky a vždy zmáčkněte TEST. Pro měření dalšího vzorku vždy zmáčkněte TEST. 10. Naměřené hodnoty orthofosforečnanů si zapište do Vámi vytvořené tabulky. Tabulka 5: Naměřené hodnoty koncentrace orthofosforečnanů ve vzorcích vody. Závěr Odpověď na odstavec pracovní úkol a komentář k naměřeným hodnotám. Porovnejte naměřené hodnoty orthofosofrečnanů a stanovené fotometricky a kolorimetricky. DŮLEŽITÉ 1. Používejte jen činidla, sklo a další pomůcky určené pro danou úlohu. 2. Neberte nic z jiných stolů, pokud nebudete mít svolení od vyučujícího. 3. O doplnění chybějících pomůcek žádejte vyučujícího. 4. Po ukončení úlohy umyjte veškeré sklo, včetně pipet a opláchněte v destilované vodě. 5. Pracovní úkol, postup a důležité výpočty (u kterých je uvedeno, že mají být v laboratorním deníku) budou uvedeny v laboratorním deníku. 6. Opustit své pracoviště můžete, až budete mít: zkontrolováno pracoviště, zda je uvedeno do původního stavu, zkontrolován laboratorní deník ověřený podpisem vyučujícího. laboratorní deník, ověřený podpisem vyučujícího. 9