Genetická transformace bakterií III analýza dat a interpretace výsledků Předmět: Biologie ŠVP: Prokaryotní organismy, genetika Doporučený věk žáků: 16-18 let Doba trvání: 45 minut Specifické cíle: analyzovat data získaná z transformace bakterií Seznam pomůcek: kit na transformaci bakterií (katalogové číslo 166-0003EDU), digitální minutka, mikrovlnná trouba, vodní lázeň s nastavitelnou teplotou (termoska), teploměr, odměrný válec (500 ml), destilovaná voda (500 ml), led a nádoba na led, savo (10 ml), lihový popisovač bakterííbakterií Stručná anotace V tomto laboratorním cvičení se studenti naučí analyzovat získaná data a interpretovat výsledky z předchozích pokusů. 1
Přípravy pro učitele Analýza dat a interpretace výsledků 1. Do obrázku č. 1 zakreslete, co pozorujete na každé ze 4 agarových ploten. Výsledky zaznamenejte do tabulky též slovně. Zhodnoťte barvu, velikost, tvar a počty kolonií. Označte kontrolní plotny. Obr. č. 1 2
2. Které znaky, jež jste původně pozorovali u E. coli, nebyly transformací ovlivněny? (i) barva bakteriálních kolonií (při běžném světle zůstává bílá) (ii) velikost bakteriálních kolonií (zůstává stejná jako před transformací) 3. Které znaky, jež jste původně u E. coli nepozorovali, jsou výsledkem transformace buněk? (i) (ii) barva kolonií (na agarové plotně LB/amp/ara po ozáření UV světlem mají kolonie díky GFP proteinu barvu fluorescenčně zelenou) rezistence na ampicillin (gen je do buňky vnesen na plazmidu pglo) 4. Proč se bakterie po transformaci vysévají na misky s ampicillinem? Proč nestačí pouze přítomnost arabinózy v kultivačním médiu? Aby došlo k pozitivní selekci transformantů (antibiotikum zabije všechny bakterie, které neobsahují plazmid). V přítomnosti arabinózy rostou všechny buňky, tzn. transformované i netransformované. 5. Jak si vysvětlujete, že transformované bakterie rostou v přítomnosti antibiotika? Na plazmidu pglo je do buňky vnesen a exprimován gen kódující rezistenci k ampicillinu. Produktem tohoto genu je enzym -laktamáza, která rozkládá laktamový kruh v molekule penicilinových antibiotik, a tím je inaktivuje. 6. Jak se fenotypově liší transformované buňky E. coli rostoucí v přítomnosti a naopak nepřítomnosti arabinózy v kultivačním médiu? Jak lze tento fakt zdůvodnit na genetické úrovni? Gen pro GFP je klonován pod inducibilní arabinózový promotor. V přítomnosti arabinózy v kultivačním médiu dochází k expresi tohoto genu a syntéze proteinu, což vede k následné flourescenčně zelené barvě kolonií po ozáření UV světlem. Pokud arabinóza přítomna v kultivačním médiu není, k přepisu genu pro GFP nedochází a buňky se i pod UV světlem jeví bíle zabarvené. 3
7. Jak na základě získaných dat zdůvodníte, že za změnou vlastností transformovaných bakterií stojí právě proces transformace? Jaké plotny vzájemně porovnáte? Nejlepší je vzájemně porovnat kontrolní a pokusné plotny - tzn. buňky, které nebyly transformovány plazminem, a tudíž nemohou žít v přítomnosti antibiotika (plotna LB/amp DNA) a buňky, které byly transformovány plazmidem a jsou rezistentní k ampicillinu (plotny LB/amp +DNA a LB/amp/ara + DNA). 8. Vzpomeňte si a popište, co jste pozorovali, když jste před vlastní transformací svítili na plazmid pglo UV světlem. Odpověď zdůvodněte. Samotný vzorek plazmidu pglo nemůže fluorescenčně svítit. Za fluorescenci je odpovědný protein GFP, k jehož syntéze dochází až v bakteriální buňce, a to pouze v přítomnosti arabinózy v kultivačním médiu. Bezpečnost Analýza dat a interpretace výsledků je zcela bezpečná. Pokud dojde k manipulaci s Petriho miskami, doporučujeme použít laboratorní plášť a ochranné rukavice. Po definitivní skončení laboratorní práce je třeba ještě jednou desinfikovat stoly savem. 4
Pracovní list pro studenty PRACOVNÍ LIST 1 Transformace buněk E. coli plazmidem pglo Odpovědi je třeba doplnit před vlastní analýzou výsledků! 1. Na které z agarových ploten očekáváte bakterie nejvíce podobné původním netransformovaným buňkám E. coli HB101? Svou odpověď zdůvodněte. Nárůst takových bakterií lze očekávat na agarových plotnách označených LB. Tyto bakterie byly pouze odebrány z původní startovací plotny, nebyl k nim přidán žádný plazmid a byly pouze znova vysety na čerstvé živné médium. 2. Na které z agarových ploten očekáváte narůst pouze transformovaných buněk? Svou odpověď zdůvodněte. Nárůst transformovaných buněk lze očekávat na agarových plotnách označených LB/amp a LB/amp/ara. Zde narostlé buňky přijaly v průběhu transformace cizorodou DNA, která jim udělila resistenci k antibiotiku. 3. Které z agarových ploten vzájemně porovnáte, abyste zjistili, zda transformace proběhla úspěšně? Svou odpověď zdůvodněte. Porovnány musí být agarové plotny LB/amp ( )DNA a LB/amp (+)DNA. Buňky, ke kterým nebyl v průběhu transformace přidán plazmid pglo, by neměly být rezistentní k ampicillinu, tudíž na plotnách LB/amp by neměly růst žádné bakteriální kolonie. Buňky, ke kterým byl v průběhu transformace přidán plazmid pglo, by měly exprimovat gen pro rezistenci k antibiotiku, tudíž na plotnách LB/amp by měly růst pouze transformované buňky. 5
4. Co se skrývá pod pojmem kontrolní plotna? Jakému účelu slouží? Kontrolní plotny pomáhají interpretovat dosažené výsledky. V našem experimentu byly jako kontrolní používány plotny LB ( )DNA a LB/amp ( )DNA. PRACOVNÍ LIST 2 Genetická transformace 1. Představte si kulturu bakterií, o které nevíte, zda je citlivá k ampicilinu. Navrhněte jednoduchý experiment, kterým rezistenci či citlivost k danému antibiotiku nejsnáze prokážete. Kulturu bakterií vysejeme na dvě agarové plotny: s testovaným antibiotikem a bez antibiotika. Pokud je bakteriální kmen k danému antibiotiku citlivý, naroste pouze na plotně bez antibiotika. Pokud je kultura rezistentní, budeme pozorovat srovnatelný nárůst bakterií na obou plotnách. 2. Vlastními slovy popište důkaz úspěšné genetické transformace plazmidem pglo. Jak se tento důkaz liší od neúspěšné genetické transformace? Úspěšná transformace je reprezentována nárůstem kolonií na agarových plotnách LB/amp (+)DNA a LB/amp/ara (+)DNA a absencí kolonií na plotně LB/amp (-)DNA. Neúspěšná transformace je reprezentována absencí kolonií na agarových plotnách LB/amp (+)DNA a LB/amp/ara (+)DNA. Příčinou může být chybný postup při transformaci (k bakteriím nebyla přidána plazmidová DNA nebo naopak k plazmidové DNA nebyla přidána bakteriální kolonie). 3. Proč byla pro expresi genu gfp v buňce nutná přítomnost arabinózy v kultivačním médiu? Gen gfp byl klonován pod inducibilní arabinózový promotor. V nepřítomnosti arabinózy nedochází z tohoto promotoru k jeho expresi. 6
4. Proč nebyla pro expresi genu kódujícího rezistenci k antibiotiku nutná přítomnost arabinózy v kultivačním médiu? Gen pro beta-laktamázu není součástí arabinózového operonu, tudíž je jeho exprese na přítomnosti arabinózy nezávislá. Pro expresi tohoto genu je naopak nutná přítomnost ampicillinu v kultivačním médiu. 5. Jaké dvě podmínky musely být splněny, aby buňky E. coli HB101 exprimovaly gen kódující rezistenci k antibiotiku? První podmínka buňky musely obsahovat plazmid pglo; Druhá podmínka v médiu musel být přítomen ampicillin. 7
Slovníček pojmů Agar. Polysacharid (polygalaktóza) z mořských řas. Většina mikroorganizmů ho není schopna rozložit. V mikrobiologii se používá pro ztužování médií, obvykle v koncentraci 1-2%. Arabinóza. Monosacharid izolovaný z rostlin, obvykle se používá jako zdroj živin pro bakterie. Beta-laktamáza. Enzym rozkládající laktamový kruh v molekule penicillinových antibiotik, běžně se označuje jako penicilináza. Laktamázu tvoří některé bakterie, čímž získávají rezistenci na příslušné antibiotikum. Gen pro její tvorbu může být uložen na plazmidu. Chromozóm. Konkrétní molekula nukleové kyseliny (u buněčných organismů DNA). Prokaryotické buňky mají obvykle jen jeden chromozóm, eukaryotické naopak obvykle více chromozómů. Za chromozómy nejsou považovány krátší molekuly DNA např. plazmidy. GFP. (zkratka z anglického Green Fluorescent Protein) je protein sestávající z 238 aminokyselin. Byl izolován z medúzy Aequorea victoria a jeho zvláštností je, že fluoreskuje zeleně, pokud je vystaven UV světlu. V biochemii a molekulární biologii se často využívá jako reportérový gen pro vizualizaci exprese proteinů, či in vivo testování lokalizace a kolokalizace různých proteinů. Klonování. 1. rozmnožování nepohlavní cestou z jednoho jedince; 2. genetické zásahy (nepohlavní) vedoucí k získání jedince s alespoň jednou novou požadovanou vlastností. Kolonie. Organizmy podobného nebo stejného druhu žijící na určitém místě pohromadě. Po rozpadu kolonie je každý jedinec schopen existence. Kultivační médium. Živná půda (kapalná nebo tuhá) poskytující organizmům rostoucím in vitro výživu a další vhodné růstové podmínky. Příkladem je komplexní LB médium (Luria, Bertani) složené z kvasinkového extraktu, soli a vody a hojně využívané v bakterologii. Operon. Soubor genů, které mají společnou regulaci a společnou expresi. Operony lze nalézt u bakterií. Operony obvykle kódují metabolickou dráhu, která vyžaduje fyziologickou regulaci jako celek, např. využívání méně obvyklých substrátů. Petriho miska. Mělká skleněná nebo plastová kruhová miska s volně přiléhajícím víčkem používaná v mikrobiologii, mykologii a rostlinných biotechnologiích ke kultivaci mikrobiálních, houbových nebo rostlinných kultur. Plasmid. Kratší kruhová molekula DNA schopná se samostatně replikovat. Plasmidy lze nalézt převážně u bakterií a jsou na nich kódovány enzymy, které bakterie nepotřebuje bezprostředně k životu, ale které zvyšují její konkurenceschopnost (např. resistence vůči antibiotikům nebo schopnost využít některý neobvyklý substrát). pglo. Plazmid nesoucí mimo jiné gen pro GFP a gen pro beta-laktamázu. 8
Selektivní médium. Vhodné k růstu pouze některých organizmů, zpravidla těch, které je třeba izolovat (např. po genetické transformaci). Selekce se dociluje například přidáním antibiotik do živné půdy (bakterie náchylné k ampicillinu na médiu obsahujícím toto antibiotikum nevyrostou). Zdroj: Gymnázium Nad Alejí, Transformace bakterií 9