CHŘIPKOVÉ VIRY STRUKTURA, REPLIKACE, ANTIGENY, GENETICKÉ ZVLÁŠTNOSTI EMIL PAVLÍK ÚSTAV IMUNOLOGIE A MIKROBIOLOGIE A ÚSTAV KLINICKÉ BIOCHEMIE A LABORATORNÍ DIAGNOSTIKY 1.LÉKAŘSKÉ FAKULTY KARLOVY UNIVERZITY A VŠEOBECNÉ FAKULTNÍ NEMOCNICE V PRAZE, KLINLAB SPOL. S R.O.
CHŘIPKOVÉ VIRY Infikují člověka již téměř 2500 let (popsány epidemie vysoce nakažlivého onemocnění dýchacích cest s následnou pneumonií před rokem 400 př.n.l. Extrémně krátká inkubační doba 1 až 4 dny Infekce se přenáší vzduchem kapénkami při kýchání nebo kašli. Každá kapénka může obsahovat až 106 virionů. Imunita: vytvářejí se protilátky proti hemaglutininu a neuraminidase. Prodělané onemocnění nezaručí odolnost vůči aktuální infekci. Genetická variabilita jednotlivých typů viru.
NOMENKLATURA VIRŮ CHŘIPKY Influenza typ : A Izolát z živočišného druhu: u lidských kmenů se vynechává Místo izolace : HongKong Označení kmene : 1 Rok izolace : 68 Označení H N subtypů: H3N2 A/Hong Kong/1/68(H3N2) A/swine/Iowa/15/30(H1N1) A/Brisbane/57/2007(H1N1)
TAXONOMIE VIRŮ CHŘIPKY Čeleď: Orthomyxoviridae 3 rody: Influenza A,B,C Influenza A Influenza B Influenza C Hostitelé Člověk, prase, kůň, ptáci, mořští savci Člověk Člověk, prase Epidemiologie Antigenní drifty a shifty Antigenní drifty Antigenní drifty Genom 8 segmentů 8 segmentů 7 segmentů Struktura 10 virových proteinů, unikátní M2 11 virových proteinů, unikátní NB 9 virových proteinů, unikátní HEF Klinické zvláštnosti Působí pandemie s vysokou mortalitou postižených mladých jedinců Závažná onemocnění většinou starších a chronicky nemocných, pandemie nezaznamenány Mírné onemocnění bez sezónních výkyvů, běžné u dětí
STRUKTURA CHŘIPKOVÉHO VIRU Obalené viriony o průměru 80 až 120 nm vláknité s helikální symetrií nebo sférické. Virion Influenzy A má na povrchu přes 500 projekcí, 80 % z nich hemaglutinin, 20% neuraminidasa. Vnitřek obalu tvoří vrstva matricového proteinu M1, obalem prochází protein M2 (iontový kanál). Nukleokapsida obsahuje segmentovaný genom ssrna negativní polarity. Každý segment obsahuje transkriptázový komplex. Transkriptázový komplex NS2 Lipidová dvojvrstva Neuraminidasa Hemaglutinin Iontový kanál M2 Matricový protein M1 nukleokapsida SHORTS T: Understanding viruses, Jones & Bartlett 2009
GENOM: 8 SEGMENTŮ ssrna KÓDUJE 10 CHŘIPKOVÝCH PROTEINŮ. SEGMENTY 7 A 8 KÓDUJÍ 2 PROTEINY V PŘESAHUJÍCÍCH ČTECÍCH RÁMEČCÍCH. PŘÍSLUŠNÉ RNA SE PAK SPOJUJÍ (SPLICING) PODLE FLINT S.J. ET AL. PRINCIPLES OF VIROLOGY ASM PRESS 2003
GENOM Genom chřipkového viru byl kompletně osekvenován již roku 1982. Šlo o izolát viru chřipky typu A/Puerto Rico/8/34 používaný hojně jako laboratorní kmen. Genové knihovny jsou postupně doplňovány o segmenty různých dalších nově izolovaných chřipkových virů
Kódující geny Influenzy A RNA Délka seg- (nt) ment Kódovaný Funkce polypeptid
ANTIGENY U virů chřipky se vyskytuje celkem 16 rozdílných typů hemaglutininů a 9 typů neuraminidas U virů infikujících člověka však bylo zaznamenáno pouze 6 subtypů hemaglutininů (H1, H2, H3, H5, H7, H9) a 2 subtypy neuraminidas (N1,N2) Antigeny chřipkových virů nereagují zkříženě Všechny typy antigenů se vyskytují u ptačích virů
Největší výběr chřipkových antigenních typů lze nalézt u virů infikujících vodní ptáky, např. kachny
ADHEZE VIRU NA BUŇKU H protein viru chřipky se váže na rezidua sialové kyseliny na glykoproteinech a glykolipidech cylindrického epitelu s řasinkami v dýchacích cestách a sinech. Následuje endocytóza viru buňkou. Uvnitř endosomu je virus vystaven silnému poklesu ph (ze 7 na 5), což vyvolá nevratnou změnu konformace H proteinu sestávajícího ze 2 polypeptidů H1 a H2 spojených disulfidickou vazbou. FIELDS BN et al: Fields Virology, 4 ed., LW&W 2001
Změna konformace H proteinu v důsledku poklesu ph v endosomu BERGSTROM BP: Protein Sorting: Organellae Biogenesis and Protein Secretion, BIOL336: Cell Physiology. http://www.muskingum.edu Při syntéze novotvořeného virionu se tvoří prekursor H0. Aby byl virion infekční, musí být tento prekursor rozštěpen proteasami na komponenty H1 a H2. Pokud prekursor obsahuje furinový štepný bod, dojde ke štěpení endogenními proteasami v Golgiho aparátu a buňku opouští zralý virion. Pokud se štěpné místo v prekursoru nenachází, musí dojít ke štěpení (trypsinu podobnými) exogenními proteasami mimo hostitelskou buňku. ACHESON NH: Fundamentals of Molecular Virology, John Wiley&sons, 2006
Obecné pravidlo: Patogenní viry chřipky mají prekursor H0 rozštěpený buněčnými proteasami uvnitř buňky, takže po jejím opuštění jsou plně infekční, jejich šíření v hostitelském organismu není limitováno, mohou infikovat různé druhy buněk a napadat různé tělní systémy. Tzv. nepatogenní kmeny získávají infekčnost až po aktivaci exogenními proteasami. Jsou tedy závislé na určitých tkáních, kde se tyto enzymy vyskytují V případě bakteriální koinfekce chřipky však může dojít k aktivaci virionů bakteriálními proteasami, což výrazně zvyšuje závažnost infekce.
UNCOATING OBNAŽENÍ GENOMU K obnažení genomu dochází v endosomu. Po fúzi virového obalu a membrány hostitelské buňky, spuštěné změnou konformace proteinu H a okyselením ph, virový transmembránový protein M2, vytvoří ve virovém obalu jakýsi porin, jímž do virionu vniknou H+ ionty. Tím se oslabí interakce matricového proteinu M1 s RNA, NP a trankriptasovým komplexem. Ribonukleotidy jsou uvolněny do cytoplasmy a exportovány do jádra buňky, kde se replikují. FIELDS BN et al: Fields Virology, 4 ed., LW&W 2001
REPLIKACE RNA CHŘIPKOVÝCH VIRŮ PROBÍHÁ V JÁDŘE HOSTITELSKÉ BUŇKY Kromě virových mrna (vmrna) (vrna=templát) se tvoří rovněž antigenom RNA pozitivní orientace Viry chřipky se mohou replikovat pouze ve fyziologicky aktivních buňkách obsahujících DNA- dependentní RNA polymerasu (RNA-polymerasa II) Virová mrna + orientace Antigenom RNA (vcrna) Kratší než templát Přesná kopie genomu Segmentovaný genom Segment Obsahuje 3 poly(a) ocas Neobsahuje Obsahuje 5 cap neobsahuje Syntéza je intenzívní Syntéza vyžaduje kontinuální syntézu k inhibitorům proteosyntézy virových proteinů
Cap-snatching CAP-SNATCHING: virové PB2 proteiny se vážou na cap struktury hostitelských informačních RNA (mrna), ty společně s 10 až 13 nukleotidy se od 5 konce mrna hostitelské bbuňky oddělí a PB1 a PA z RNP komplexu je následně využijí jako primery k iniciaci transkripce vrna. ACHESON NH: Fundamentals of Molecular Virology, John Wiley&sons, 2006
GENETICKÁ VARIABILITA Mutace jsou v průběhu virové replikace RNA virů běžné Virové RNA-dependentní RNA polymerasy nejsou schopné ani konroly (proofreading), ani opravy (vyskytuje se zde přibližně 104x více chyb než u DNA-polymeras Mutační poměr chřipky: 1.5x10-5/nukleotid/ infekční cyklus, což má za následek 2 až 3 změny aminokyselin v H proteinu ročně.. Genetickou variabilitu zásadně ovlivňují 2 procesy: ANTIGENNÍ POSUN (DRIFT) a ANTIGENNÍ ZLOM (SHIFT)
ANTIGENNÍ POSUN (drift) ANTIGENNÍ DRIFT JE VÝSLEDKEM MALÝCH POSTUPNÝCH ZMĚN GENŮ (AKUMULACE NOVÝCH EPITOPŮ) NA H PROTEINU (A V MENŠÍ MÍŘE NA N PROTEINU) ANNENBERG MEDIA: Rediscovering Biology, 1997
ANTIGENNÍ ZLOM (shift) ANTIGENNÍ SHIFT NASTÁVÁ, KDYŽ VIRUS CHŘIPKY ZÍSKÁ ZCELA NOVÝ H NEBO N GEN (PŘÍPADNĚ OBA). JDE O ZÁSADNÍ ZMĚNU POVRCHOVÝCH ANTIGENŮ VIRU. ČASTO JDE O VÝSLEDEK MEZIDRUHOVÉ REKOMBINACE VIRŮ ANNENBERG MEDIA: Rediscovering Biology, 1997
JE ČÍNA INKUBÁTOREM VIRŮ CHŘIPKY? SHORTS T: Understanding viruses, Jones & Bartlett 2009
ČÍNSKÉ ZKUŠENOSTI
PROTICHŘIPKOVÁ ANTIVIROTIKA M2 INHIBITORY: AMANTIDIN a RIMANTIDIN BLOKUJÍ IONTOVÝ KANÁL M2, ČÍMŽ BRÁNÍ OBNAŽENÍ GENOMU. PODÁVAJÍ SE PROFYLAKTICKY, NA TYP B NEÚČINNÉ, NA TYP A 80 AŽ 90 %. N INHIBITORY: ZANAMIVIR a OSELTAMIVIR ANALOGA KYSELINY SIALOVÉ, VÁŽOU SE NA AKTIVNÍ MÍSTO NEURAMINIDASY, INHIBUJÍ VÝSEV VIRIONŮ. ÚČINNÉ PROTI CHŘIPCE A I B. NUTNO ZAHÁJIT LÉČBU DO 48 HODIN PO INFEKCI SHORTS T: Understanding viruses, Jones & Bartlett 2009
ARDS a SIRS ACUTE RESPIRATORY DISTRESS SYNDROME viz schéma na obrázku SYSTEMIC INFLAMMATORY RESPONSE SYNDROME Tzv. cytokinová bouře je možným vysvětlením pro devastující efekt některých pandemií (1918) nebo tzv. ptačí chřipky H5N1. Jde o IL-6, IL-8 monocytový profylaktický protein (CCL2) a CCL5 SHORTS, T: Understanding Viruses, Jones & Bartlett 2009