282 Vodík jako vedlejší produkt aceton-butanolové fermentace ing. Jakub Lipovský, ing. Pavel Šimáček PhD, ing. Petr Fribert, ing. Michaela Linhová, ing. Hana Čížková, Dr. ing. Petra Patáková, prof. ing. Mojmír Rychtera, CSc. a prof. ing. Karel Melzoch, CSc. VŠCHT v Praze, Ústav kvasné chemie a bioinženýrství, Technická 5, 66 28 Praha 6, e-mail: jakub.lipovsky@vscht.cz, tel.: 22044506, Abstrakt V dnešní době dochází díky biopalivům druhé generace k obnovení zájmu o technologie produkující butanol založené na aceton-butanol-etanolové (ABE) fermentaci. Při této fermentaci prováděné bakteriemi rodu Clostridium může za určitých podmínek vznikat poměrně velké množství vodíku, který je v posledních letech ceněným produktem používaným například v palivových článcích nebo přímo jako alternativní ekologické palivo. Obsah vodíku ve fermentačním plynu při ABE fermentaci může dosáhnout až 40%, proto by tento produkt mohl významně zlepšit ekonomiku celého procesu. Úvod Zájem o vodík byl obnoven v posledním desetiletí, především v Japonsku a Německu a do jisté míry i ve Spojených státech, za účelem nahrazení využívání fosilních paliv v energetice a chemickém průmyslu. Rozsáhlé využívání fosilních paliv začíná mít viditelné důsledky. Nadměrné používání fosilních paliv, je jednou z hlavních příčin globálního oteplování a kyselých dešťů, které začaly ovlivňovat zemské klima, vegetaci a vodní ekosystémy. Vzhledem k potřebě zabezpečení dostatku elektrické energie, stoupá tlak na vývoj zdroje čisté obnovitelné energie2. Právě vodík je takovým zdrojem energie, protože při jeho spalování vzniká jako jediný produkt voda bez skleníkových plynů3. Vodík lze vyrábět z obnovitelných surovin, například z organických odpadů. Proto je vodík možnou ekologickou náhradou fosilních paliv. Další výhodou vodíku je možnost užití odpadů závodů na zpracování potravin a zemědělských produktů k jeho výrobě. Některé z odpadních produktů jsou totiž ještě poměrně bohaté na obsah sacharidů. Mikrobiální produkce vodíku anaerobní fermentací by mohl být proces spojující smysluplné využití odpadů s výrobou energie2. Při mikrobiální produkci rozpouštědel ABE fermentací se za určitých podmínek uvolňuje vodík. Použití průmyslových odpadů k produkci vodíku a rozpouštědel by mohlo být vhodnou cestou k jejich opětovnému využití a tím i zároveň ke snížení celkového objemu odpadů. Mikroorganismy produkují vodík z organických sloučenin buď prostřednictvím využití chemické energie těchto substrátů (heterotrofní kvašení) nebo pomocí využití světelné energie (photoheterotrofní kvašení). V obou případech je výroba vodíku úzce spjata s příslušnými energetickými metabolismy. Vodík se uvolňuje jako finální produkt redukční činnosti hydrogenasy. Primární elektronový dárce pro enzym je ferredoxin, který přijímá elektrony od redukovaných produktů glykolýzy, tj. NADH nebo NADPH. 446
Vodík je představován jako potenciální řešení problémů spojených s energií a životním prostředím pro jeho výhodné vlastnosti například ekologičnost spalování a vysoká výhřevnost 2 kj / g která je 2,75 krát vyšší než u uhlovodíkových paliv. Vodík lze také přímo použít k výrobě elektřiny pomocí palivových článků2,3. Obecně se má za to, že použití vodíku může přispět k uspokojení rostoucí světové poptávky po energii. Tradičně, je vodík vyráběn hlavně konverzí uhlovodíků parou za vysokých teplot nebo elektrolýzou vody. Tyto metody jsou velmi energeticky náročné a neekologické4. Výroba vodíku pomocí mikroorganismů je méně energeticky náročná a ekologičtější ve srovnání s výrobou termochemickými a elektrochemickými procesy. Mezi fermentativní producenty vodíku patří zástupci rodu Clostridium jako Clostridium butyricum, C. acetobutylicum, C.saccharoperbutylacetonicum, C. pasteurianum, které se také používají pro ABE fermentaci3. Klostridia jsou nejúčinnějšími producenty vodíku. Clostridium saccharoperbutylacetonicum je znám jako solventogenní mikroorganismus používaný pro ABE fermentace na definovaných médiích. Jeho potenciál pro výrobu vodíku nebyl zatím podrobně studován5. Při vsádkové kultivaci tvoří rozpouštědla produkující druhy rodu Clostridium vodík, oxid uhličitý, acetát a butyrát během fáze exponenciálního růstu, která se zároveň často označuje jako acidogenní fáze. Při přechodu kultury do stacionární fáze růstu dochází ke změně metabolismu, kdy se koncovými produkty stávají rozpouštědla a nastává tak solventogenní fáze. Během této fáze dochází k reasimilaci kyselin za stálé spotřeby uhlíkatého zdroje6. Rovnováha mezi koncovými množstvími redukovaných, neutrálních a oxidovaných produktů v průběhu celé fermentace je vyvažována regulací produkce vodíku a ATP. Celkový zisk těchto látek je závislý na kultivačních podmínkách a použitém klostridiálním kmenu7. Butanol může být také tvořen přímo ze sacharidického zdroje bez zpětného využití již vytvořených kyselin, přičemž se netvoří vodík a nedochází k tvorbě ATP6. Alespoň částečná reutilizace kyselin je typická pro druhy C. acetobutylicum a C.beijerinckii, ale v případě C. tetanomorphum se tvoří simultánně butyrát s butanolem, aceton se netvoří a k reutilizaci butyrátu nedochází vůbec7. Zjednodušené schéma konverze rostlinné biomasy na rozpouštědla u bakterií rodu Clostridium je ukázáno na obrázku. Glukósa je preferovaný zdroj uhlíku pro fermentační procesy, které produkují acetát, butyrát a vodík a to podle následujících reakcí: C6H2O6 + 2H2O 2CH3COOH + 2CO2 + 4H2 C6H2O6 CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + 2H2 Z výše uvedených reakcí je zřejmé, že nejvyšší teoretický výtěžek na glukose je 4 mol H2/mol glukósy5. 447
biomasa škrob lignocelulosa celulosa 2 hemicelulosa 3 4 extracelulární prostor glukosa xylosa, arabinosa ----------------------------------------------------------------------------------------------------intracelulární prostor 5 0 6 laktát pyruvát,2,3 7 H2 CO2 acetát 4 acetyl-coa 8 acetoacetyl-coa butyrát 7 9 butyryl-coa 5 6 8 etanol aceton butanol Obr.. Zjednodušená konverze rostlinné biomasy na rozpouštědla u bakterií rodu Clostridium:. předúprava zrna / lignocelulosy; 2. hydrolýza škrobu (α-amylasa, β-amylasa, pullulanasa, glukoamylasa, α-glukosidasa); 3. hydrolýza celulosy (celulasa, β-glukosidasa); 4. hydrolýza hemicelulosy; 5. absorbce xylosy/arabinosy a následná transformace transketolasovou- transaldolasovou sekvencí na fruktosa 6-fosfát a glyceraldehyd 3-fosfát postupnou metabolizací Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) drahou; 6. přenos glukosy fosfotransferasovým systémem a konverze na pyruvát EMP drahou; 7. pyruvát-ferredoxin oxidoreduktasa; 8. thiolasa; 9. 3-hydroxybutyl-CoA dehydrogenasa, krotonasa a butyryl-coa dehydrogenasa; 0. laktát dehydrogenasa;. NADH- ferredoxin oxidoreduktasa; 2. NADPH- ferredoxin oxidoreduktasa; 3. hydrogenasa; 4. fosfát acetyltransferasa, acetát kinasa; 5.acetaldehyd dehydrogenasa, etanol dehydrogenasa; 6. acetoacetylcoa:acetát/butyrát:coa transferasa, acetoacetát decarboxylasa; 7. fosfát butyltransferasa, butyrát kinasa; 8. butyraldehyd dehydrogenasa, butanol dehydrogenasa8,9. 448
Vliv počátečního ph na výrobu vodíku byl zkoumán na C. butyricum při použití hemicelulosového hydrolyzátu s počáteční koncentraci cukrů 20 g.l-. Počáteční ph se pohybovalo od 5,5 do 8,0 s nárůstem o 0,5. Teplota byla použitaºc. 37 Nejvyšší produkce vodíku je u C. butyricum dosahováno mezi hodnotami ph 5,5-5,7. Tyto hodnoty se v podstatě schodují s dříve publikovanými údaji pro C. butyricum na glukosovém médiu. Obecně lze říci, že nadměrné zvýšení počátečního ph vede k poklesu produkce vodíku2,3. Experimentální data Při ABE fermentacích provedených v naší laboratoři byla zaznamenána tvorba fermentačního plynu obsahujícího jako hlavní složky oxid uhličitý a vodík. Plyn vznikající při kultivaci byl vzorkován a koncentrace vodíku určována pomocí plynové chromatografie. Celková tvorba plynu byla stanovena pomocí speciálních plynotěsných vaků, kde byla koncentrace vodíku také změřena. Například při batch kultivaci s počáteční koncentrací glukosy 37 g.l- (na konci kultivace byla zbytková koncentrace glukosy v médiu 0,9 g.l-) a pracovním objemu reaktoru 2 l, bylo celkem odebráno 38,8 l plynu s objemovou koncentrací obsaženého vodíku 45,2 %obj. tj. 7,5 l vodíku. Toto množství plynu odpovídá 0,77 molu H2, přičemž bylo spotřebováno 0,290 molu glukosy. Kultivace probíhala při teplotě 37º C a počáteční hodnotě ph 5,6 bez regulace ph. Z předchozího textu je vidět, že bylo při kultivaci dosaženo výtěžku 2,47 molu H2 na mol glukosy tento výsledek koresponduje s literaturou5, kde se uvádí maximální možný výtěžek 4 moly H2 na mol glukosy při utilisaci glukosy na acetát. Časová závislost objemové koncentrace vodíku ve fermentačním plynu je znázorněna na Obr 2. 60.0 vodík [obj.%] 50.0 40.0 30.0 20.0 0.0 0.0 0.0 5.0 0.0 5.0 20.0 25.0 30.0 35.0 čas [h] Obr.2. Časová závislost objemové koncentrace vodíku ve fermentačním plynu. 449
Diskuse a závěr ABE fermentace má v současnosti řadu omezení. Produkce vodíku je jednou z cest jak vylepšit energetickou a ekonomickou bilanci celého procesu, který zatím trpí poměrně nízkými výtěžnostmi způsobenými hlavně inhibicí vznikajícími produkty hlavně butanolem. Při kultivacích ve fermentoru byl zjištěn zajímavý výtěžek vedlejšího produktu - vodíku a to 2,4 molu H2 na mol glukosy, což je výsledek srovnatelný s výsledky uváděnými v literatuře. V budoucnu se jeví jako velmi zajímavé využití odpadních lignocelulosových materiálů pro tvorbu biopaliv. Tato studie byla zpracována s finanční podporou projektu NAZV č. QH8323/2008 a výzkumného záměru MŠM604637305. Literatura. Claassen P. A. M., van Lier J. B., Lopez Contreras A. M., van Niel E. W. J., Sijtsma L., Stams A. J. M., de Vries S. S. and Weusthuis R. A.: Utilisation of biomass for the supply of energy carriers. Appl Microbiol Biotechnol 999, 52, 74-755. 2. Khanal S. K., Chen W.-H., Li L. and Sung S.: Biological hydrogen production: efects of ph and intermediate products. International Journal of Hydrogen Energy 2004, 29, 23-3. 3. Pattra S.,Sangyoka S.,Boonmee M. and Reungsang A.: Bio-hydrogen production from the fermentation of sugarcane bagasse hydrolysate by Clostridium butyricum. International Journal of Hydrogen Energy 2008, 33, 5256-5265. 4. Fan Y.-T., Xing Y., Ma H.-C., Pan C.-M. and Hou H.-W.: Enhanced cellulose-hydrogen production from corn stalk by lesser panda manure. International Journal of Hydrogen Energy 2008, 33, 6058-6065. 5. Walid M. A., Mohd S. K., Abdul A. H. K., Jamaliah M. J. and Najeeb M. A.:Hydrogen production using Clostridium saccharoperbutylacetonicum N-4 (ATCC 3564). International Journal of Hydrogen Energy 2008, 33, 7392 7396 6. Jones D. T., Woods D. R.: ACETONE-BUTANOL FERMENTATION REVISITED. Microbiol. Rev. 986, 50, 484. 7. Flickinger M.C., Drew S.W. (Eds): Encyclopedia of Bioprocess Technology Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation. Wiley, New York 999. 8. Ezeji T. C., Qureshi N., Blaschek H. P.: Bioproduction of butanol from biomass: from genes to bioreactors. Curr. Opin. Biotechnol. 2007, 8, 220. 9. Castaño D. M.: Dissertation. Technische Universität München, München, Deutschland, 2003. 450