Oznámení o uzavřeném nakládání s geneticky modifikovanými organismy první a druhé kategorie rizika

Mikrobiologický ústav AV ČR Oznámení 1/10 Oznámení o uzavřeném nakládání s geneticky modifikovanými organismy první a druhé kategorie rizika Datum podání 11. 10. 2006 Díl 1. VŠEOBECNÉ NÁLEŽITOSTI OZNÁMENÍ 1. Osoba podávající oznámení (oznamovatel) (+) Kopie zřizovací nebo zakládací listiny Příloha 1 1.2. Název: Mikrobiologický ústav AV ČR (dále jen "MBÚ") 1.4. Sídlo: Vídeňská 1083, 14220 Praha 4 1.5. IČ: 61388971 1.6. DIČ: CZ61388971 1.7. Předmět činnosti: Vědecký výzkum a výuka 1.8. Statutární orgán: Prof. RNDr. Blanka Říhová, DrSc., ředitelka MBÚ 2. Odborný poradce Výpis z evidence Rejstříku trestů: Příloha 2 Doklad o dosaženém vzdělání a délce odborné praxe: Příloha 3 2.1. Miroslav Pátek, Ing. CSc. 2.2. Povolání: Vědecký pracovník Zaměstnavatel: Mikrobiologický ústav AV ČR, Vídeňská 1083, 14220 Praha 4 2.3. Vzdělání: VŠCHT, Praha 2.4. Odborné kurzy: 2.5. Dosavadní praxe: přes 20 let výzkumné práce s GMO v oboru mikrobiologie, odborný poradce pro GMO, Mikrobiologický ústav, konzultant a spolupracovník České komise pro nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty 2.6. Adresa bydliště: Zimova 625/3, 14200 Praha 4 2.7. Kontaktní adresa: Mikrobiologický ústav AV ČR, Vídeňská 1083, 14220 Praha 4 2.8. Telefon: 24106 2398, 24106 2354 2.9. Fax: 241722257 2.10. E-mail: patek@biomed.cas.cz Díl 2. DALŠÍ NÁLEŽITOSTI OZNÁMENÍ PRO 1. KATEGORII RIZIKA 1. Účel a doba trvání uzavřeného nakládání 1.1. Účel uzavřeného nakládání Účelem nakládání s geneticky modifikovanými organismy je vědecká práce a výuka za účelem získání originálních vědeckých poznatků a jejich zveřejnění formou odborných publikací. Doba nakládaní s GMO dle tohoto Oznámení je období 2006 2015. 1.2. Celková doba trvání uzavřeného nakládání a datum jeho předpokládaného zahájení Celková doba trvání uzavřeného nakládání: 10 let. Předpokládané zahájení práce s geneticky modifikovanými mikroorganismy: Pracovníci MBÚ pokračují v nakládání, dle nového Oznámení od 17. 10. 2006. 2. Hodnocení rizika: Příloha 4-1 2.1. Výsledek hodnocení rizika: První kategorie rizika

Mikrobiologický ústav AV ČR Oznámení 2/10 3. Pracoviště, na kterém bude uzavřené nakládání probíhat V případech, kdy již MŽP potvrdilo oprávněnost MBÚ nakládat s GMO za podmínek popsaných v Oznámeních podaných v r. 2005 a 2006 dle zákona č. 78/2004 Sb. jsou čísla těchto Oznámení uvedena v závorkách. (+) Provozní řád pracoviště (1. kat): Příloha 5-1 (+) Havarijní plán: Příloha 6 3.1. Adresa pracoviště: Mikrobiologický ústav AV ČR, Vídeňská 1083, 14220 Praha 4 3.2. Charakter pracoviště: Ústav základního výzkumu 3.3. Popis umístění prostor pro uzavřené nakládání a popis jejich nejdůležitějšího zařízení: (+)Plánek areálu s vyznačením umístění nejdůležitějších zařízení: Příloha 7 Práce s GMO (uzavřené nakládání 1. kategorie) bude probíhat v těchto místnostech: Budova C Laboratoře: suterén S07, zvěřinec (suterén B) přízemí 015, 016, 020, 021, 024 1. patro 112, 117, 118, 127, 129, 147, 150 2. patro 216, 221, 236, 237, 238, 241, 242, 244, 246, 248A, 249, 250 3. patro 306, 309, 312, 315, 321, 323, 326A, 327, 328, 329, 329A 331, 332, 338, 339, 340, 346, 347A, 348, 349 Chladové místnosti: 2. patro 243, 245 3. patro 336A, 344 Kultivační místnosti: přízemí 013, 014 Autokláv: přízemí 001, 024, 3. patro 301 Budova L Laboratoře: Přízemí: 011, 016, 022, 024 1. patro: 112, 113, 114, 116, 117A, 118, 119A, 120, 121, 122 2. patro: 205, 209, 212, 213A, 214A, 215, 216, 219, 220A, 222, 223, 224, 225 Chladová místnost 023 Budova Xa Laboratoře: 1. patro 205, 206, 207, 208, 210, 215, 216, 217, 218 Umývárna: přízemí 102 Centrifugovna: 104 3.4. Posouzení prostor a zařízení pracoviště a jeho umístění podle požadavků na uzavřený prostor: Příloha 8-1 4. Druhy používaných organismů a používané genetické modifikace, včetně jmenovitě uvedených validovaných metod na zjišťování přítomnosti geneticky modifikovaných organismů Příjemci: Agrobacterium tumefaciens, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Rhodococcus erythropolis, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schwanniomyces occidentalis.

Mikrobiologický ústav AV ČR Oznámení 3/10 Dárci: Bacillus subtilis, Brevundimonas diminuta, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Rhodococcus erythropolis, Streptomyces caelestis, Streptomyces granaticolor, Streptomyces lincolnensis, Ashbya gossypii, Aspergillus niger, Debaryomyces hansenii, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis, Trametes pubescens, Trigonopsis variabilis, Arabidopsis thaliana (huseníček rolní), Aequorea victoria, Discosoma sp., Eisenia fetida (žížala), Homo sapiens, Mus musculus (myš domácí). Konkrétní geneticky modifikované organismy, kmeny příjemců a dárců a používané genetické modifikace (vnášené nebo deletované geny, vektory) jsou uvedeny v Příloze 9. Množství použitých geneticky modifikovaných organismů Kultivace geneticky modifikovaných mikroorganismů bude probíhat na Petriho miskách (předpokládaný počet misek: méně než 300 misek měsíčně v jedné laboratoři) nebo v tekutých médiích v kultivačních nádobách o objemech 10 1000 ml, ve výjimečných případech ve větších objemech do 5 litrů (předpokládaný celkový objem tekutých kultur: méně než 30 litrů měsíčně v jedné laboratoři). Metody pro zjišťování přítomnosti GMO Přítomnost a únik GMO jsou zjišťovány ve vzduchu a pomocí stěrů (viz Havarijní plán). Finální důkaz je prováděn amplifikací DNA pomocí polymerasové řetězové reakce (PCR) Podrobnosti jsou uvedeny v Provozním řádu a v Havarijním plánu. 5. Údaje o nakládání s odpady pro jednotlivá pracoviště Veškeré GMO jsou po ukončení experimentů likvidovány autoklávováním nebo desinfekčními činidly (Ajatin, 2% roztok chloraminu nebo roztok chlornanu sodného - SAVO). Po inaktivaci GMO jsou sterilní odpady bez rizika přesouvány do běžného odpadu. V případě nutnosti jsou zneškodněné materiály jako odpad kat. č. 18 01 03 (Odpady, na jejichž sběr a odstraňování jsou kladeny zvláštní požadavky s ohledem na prevenci infekce) dle vyhlášky č. 381/2001 Sb. zákona 185/2001 Sb. o odpadech, likvidovány specializovanou firmou T.O.P. Umwelt s.r.o. dle uzavřené smlouvy. Podrobnosti jsou uvedeny v Provozním řádu pro práci s GMO v MBÚ AVČR. Žádné plynné škodliviny a nebezpečné odpady při nakládání nevznikají. Díl 3. DALŠÍ NÁLEŽITOSTI OZNÁMENÍ PRO 2. KATEGORII RIZIKA 1. Účel a doba trvání uzavřeného nakládání 1.1 Účel uzavřeného nakládání povaha práce, kterou bude uživatel provádět Vědecká práce a výuka 1.2 Očekávaný výsledek uzavřeného nakládání Získání poznatků o proteinech Orf1 a FrpC z Neisseria meningitidis a sekrece FrpC 1.3 Celková doba uzavřeného nakládání a datum jeho předpokládaného zahájení Celková doba nakládání 5 let. Pracovníci MBÚ zahájí nakládání v 2. kategorii dle nového Oznámení od 1. 12. 2006. 2. Hodnocení rizika (+) Hodnocení rizika podle 7 zákona Přílohy 4-2Ec a 4-2Nm.

Mikrobiologický ústav AV ČR Oznámení 4/10 2.1. Výsledek hodnocení rizika Uzavřené nakládání s popsanými kmeny Escherichia coli lze na základě Hodnocení rizika zařadit do druhé kategorie rizika. 3. Pracoviště, na kterém bude uzavřené nakládání probíhat V případech, kdy již MŽP potvrdilo oprávněnost MBÚ nakládat s GMO za podmínek popsaných v Oznámeních podaných v r. 2005 a 2006 dle zákona č. 78/2004 Sb., jsou čísla těchto Oznámení uvedena v závorkách. (+) Provozní řád pracoviště (2. kat.): Příloha 5-2 (+) Havarijní plán: Příloha 6 3.1. Adresa pracoviště: Mikrobiologický ústav AV ČR, Vídeňská 1083, 14220 Praha 4 3.2. Charakter pracoviště: Ústav základního výzkumu 3.3. Popis umístění prostor pro uzavřené nakládání a popis jejich nejdůležitějšího zařízení: (+)Plánek areálu s vyznačením umístění nejdůležitějších zařízení: Příloha 7 Práce s GMO (uzavřené nakládání 2. kategorie) bude probíhat v těchto místnostech: Budova L Kultivační a očkovací místnosti: 008, 014 Místnost L 008 (23220/ENV/06) laboratoř pro nakládání s GMO 2. kategorie. Místnost patří k Laboratoři molekulární biologie bakteriálních patogenů (125). Odpovědný pracovník Ing. Peter Šebo, CSc. Pro práci ve druhé kategorii rizika byla upravena a vybavena laboratoř L006 složená ze 3 samostatných komor a vybavená vzduchotechnickou instalací se zabezpečením proti úniku aerosolů. Laboratoř je oddělena od běžně přístupných prostor dveřmi s elektronickým zámkem s omezením vstupu výhradně na oprávněné osoby vybavené čipem. Za vstupními dveřmi je přetlaková komora s hermeticky instalovaným průkladovým autoklávem pro sterilizaci vycházejících odpadů. Dále se vstupuje do oddělené komory s hygienickou smyčkou (vybavenou sprchou a oční sprchou) a z ní do samotné laboratoře pro práci s GMO. Regulace výkonného větracího systému (300 m 3 /h) a přetlaku je nastavena tak, že v samotné GMO laboratoři je podtlak 50 Pa proti vnějšímu prostředí, v navazující hygienické smyčce je podtlak 20 Pa a v první místnosti, kam ústí průkladový autokláv, je přetlak +20 Pa. Tím je zajištěno, že při vstupu i výstupu z laboratoře GMO dochází výhradně k průniku vnějšího vzduchu do laboratoře GMO a nikoliv k úniku vzduchu z laboratoře. Vstupní i výstupní potrubí vzduchotechniky jsou vybaveny elektronicky řízenými klapkami zabezpečujícími hermetické uzavření potrubí servomotorky napojenými na záložní akumulátorové zdroje pro případ výpadku proudu, do doby, než naskočí záložní dieselagregátový rozvod proudu a dojde k obnovení funkce vzduchotechniky. Byla namontována dveřní signalizace zabraňující současnému otevření dveří laboratoře a hygienické vstupní smyčky a bylo provedeno měření těsnosti za pomoci únikového čidla. Vzduchotechnické rozvody jsou opatřeny manometry pro zobrazení tlaku ve všech třech místnostech. Veškerý odváděný vzduch je filtrován přes HEPA filtr EU13. Okna GMO laboratoře jsou hermeticky uzavřena. Tento systém zabraňuje jakémukoliv úniku aerosolu do okolního prostředí. Laboratoř je vybavena rovněž biohazard boxem s laminárním prouděním vzduchu a HEPA filtrem EU13. Průkladový autokláv je

Mikrobiologický ústav AV ČR Oznámení 5/10 hermeticky usazen do zdi oddělující laboratoř GMO a vstupní přetlakovou komoru a neumožňuje současné otevření obou dveří autoklávu ani otevření druhých dveří, aniž proběhl sterilizační cyklus v komoře autoklávu. Žádné kultury ani média nebudou vylévány do kanalizace, ale budou inaktivovány v autoklávu před předáním k další likvidaci specializované firmě. Odpad výlevky z laboratoře je veden do speciální jímky, kde bude chemicky dekontaminován před odčerpáním do barelů a předání k další likvidaci. Místnost L 014 laboratoř pro nakládání s GMO 2. kategorie. Místnost patří k Laboratoři molekulární biologie bakteriálních patogenů (125). Odpovědný pracovník Ing. Peter Šebo, CSc. Místnost se sterilním boxem je vybavená zabezpečením biohazard třídy P2 (klimatizace a podtlakové větrání s filtrací vzduchu, biohazard box s laminárním prouděním vzduchu, aerosolový HEPA filtr EU13). Místnost je opatřena aktivním filtračně-ventilačním zařízením Zenithair s aerosolovým HEPA filtrem EU13 na vstupu a výstupu. Regulace větrání je nastavena tak, že při práci (spuštění) biohazard boxu a zapnutí přívodu sterilního filtrovaného vzduchu do místnosti vzniká v místnosti podtlak 100 Pa, který zabraňuje jakémukoliv úniku aerosolu z místnosti. Okna místnosti jsou hermeticky uzavřena a výduch laminárního biohazard boxu Gelaire BSL3 je opatřen aerosolovým HEPA filtrem na výstupu přes okno mimo budovu. Systém sterilizace vypouštěných vod: 1) Kultury mikroorganismů v kapalných mediích a jakékoliv kontaminované odpady jsou inaktivovány autoklávováním (125 C, 45 min). Veškeré odpadní vody jsou desinfikovány v odpadní jímce v desinfekční stanici, v níž je před každým vypouštěním kontrolován obsah chloru tolidinovým činidlem a koncentrace chloru vždy upravována za použití chlornanu sodného na obsah chloru 0,5 1,0 mg/l. Budova Xb (732/OER/05) Laboratoře: 115 (BTH) v přízemí a prvním patře, 142, 235, 236, 237, 238, 239, 242 Prostory patřící k Laboratoři fermentačních technologií 115 (odpovědný pracovník: Ing. Miroslav Sobotka, CSc.) kde bude nakládání s GMO probíhat, jsou lokalizovány v přízemí a prvním patře budovy Xb. Místnosti: 142, 235, 236, 237, 238, 239, 242. Budova Xb je od sousední budovy Xa oddělena uzamykatelnými dveřmi a přístup přes speciální bezpečnostní čip mají jen pracovníci Laboratoře 115 a někteří členové vedení MBÚ. Místnost č. 142 v místnosti je umístěna rotační třepačka na kultivaci mikroorganismů. Místnost je vybavena germicidní lampou, automatickou temperací, PHP a není vybavena odpadem. Místnost č. 235 laboratoř pro práci s GMO, vybavena germicidními lampami. V místnosti je umístěna lednice pro přechodné uchovávání formaldehydem inaktivovaných vzorků. Místnost č. 236 očkovací box, je vybaven germicidní lampou a biohazard boxem. Přístup do boxu je přes hygienickou smyčku. Místnost č. 237, 238, 239 hygienická smyčka se sprchou Místnost č. 242 vybavena bioreaktory s celkovým obsahem 5 L a 200 L, určenými pro práce s GMO. Místnost je vybavena PHP a parním sterilizátorem. RE rozvaděč elektřiny je umístěn v místnosti 236, 1. patro budovy Xb UP uzávěr plynu pro lab. 235 je umístěn před místností č. 145 v přízemí UV uzávěr vody je umístěn před místností č. 130 v přízemí H hydrant je umístěn v místnosti č. 129 v přízemí a v č. 227 v 1. patře

Mikrobiologický ústav AV ČR Oznámení 6/10 3.4. Posouzení prostor a zařízení pracoviště a jeho umístění podle požadavků na uzavřený prostor: Příloha 8-2 4. Geneticky modifikovaný organismus (1415/OER/05) Přehled kmenů Escherichia coli nesoucí geny orf1, frpc, hlyb a hlyd Příjemce Dárce Gen/inzert Vektor/(Konstrukt) Escherichia coli BL21 Neisseria meningitidis 10/96 gen kódující Orf1 psu39 phsg575 Escherichia coli Neisseria meningitidis gen kódující ptz19r VT5600 10/96 Orf1 Escherichia coli Neisseria meningitidis gen kódující ptz19r VT5600 10/96 FrpC Escherichia coli VT5600 Escherichia coli 2001 geny kódující HlyB a HlyD (plg575) 4.1. Údaje o dárcovském organismu, včetně jeho původu Neisseria meningitidis 10/96: Reference: Osička et al., Infect. Immun. 69:5509-19 (2001) Escherichia coli 2001: Escherichia coli je běžný komenzál tlustého střeva. Určité kmeny E. coli však mohou vyvolat tři typy onemocnění člověka: infekce močových cest, neonatální meningitidy a infekce intestinálního traktu. Kmen 2001 patří mezi uropatogenní E. coli. Uropatogenní E. coli způsobuje 90 % infekcí močových cest u anatomicky normálních, volných močových cest. E. coli je citlivá primárně na většinu antibiotik (s výjimkou benzylpenicilinu), ale zejména nemocniční kmeny mají sekundární rezistenci přenosového typu. Terapie infekcí způsobených uropatogenní E. coli tedy spočívá v léčbě antibiotiky. Reference: Mackman N., Holland I. B., Mol. Gen. Genet. 196(1):129 (1984) Mackman et al., Mol. Gen. Genet. 201:282 (1985) Mackman et al., Mol. Gen. Genet. 201:529 (1985) 4.2. Údaje o příjemci a rodičovském organismu, včetně jejich původu Escherichia coli kmen BL21 (F -, ompt, hsds (r B, m B ), gal, dcm): Původ: Komerční laboratorní kmen, Novagen (USA). Nepatogenní derivát laboratorního kmene E. coli B. Reference: Kang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 59:523 (2002) Escherichia coli kmene VT5600 je běžně používaný laboratorní kmen Escherichia coli. Původ: J.-M. Clément, Institut Pasteur, Paris, Francie Reference: Sebo P., Ladant D., Mol. Microbiol. 9:999 (1993) Uvedené kmeny Escherichia coli nejsou patogenní pro člověka, zvířata nebo rostliny. 4.3. Údaje o vektoru, včetně jeho původu psu39: Expresní vektor, nese gen pro rezistenci ke kanamycinu a multiklonovací místo pro klonování cizorodé DNA. Reference: Bartolome et al., Gene 102, 75 (1991)

Mikrobiologický ústav AV ČR Oznámení 7/10 phsg575: Expresní vektor, nese gen pro rezistenci k chloramfenikolu a multiklonovací místo pro klonování cizorodé DNA. Reference: Takeshita et al., Gene 61, 63 (1987) ptz19r: Běžně používaný vektor, MŽP již potvrdilo oprávněnost MBÚ AV ČR nakládat s tímto vektorem v režimu uzavřeného nakládání, v druhé kategorii rizika (zdroj: USB). plg575 Již připravený, běžně používaný konstrukt, který nese gen pro rezistenci k chloramfenikolu a geny pro proteiny HlyB a HlyD. Reference: Mackman et al., Mol. Gen. Genet. 201, 282 (1985) 4.4. Údaje o insertech Orf1, frpc a jejich varianty: Geny kódují proteiny, jejichž produkce je regulována stejným, železem regulovaným promotorem. FrpC nese znaky RTX proteinů, ORF1 by mohl mít vliv na biogenezi/aktivitu proteinu FrpC. Vložené geny orf1 a frpc, nedeterminují znaky, které by mohly způsobovat nebo zvyšovat infekčnost, patogenitu, virulenci nebo toxigenicitu příjemce nebo schopnost příjemce kolonizovat další organismy. Reference: Thompson, S. A., Wang, L. L., and Sparling, P. F., Mol. Microbiol. 9, 85 (1993); Osička et al., Infect. Immun. 69:5509-19. (2001) hlyb a hlyd: Geny kódující proteiny HlyA a HlyB podílející se na sekreci hemolyzinu HlyA bakterie Escherichia coli. Vložené geny nemohou zvýšit patogenitu příjemce. Po vložení genů do organismu příjemce nebylo pozorováno škodlivé působení na organismy. Ve spojení s vloženým genem tedy nehrozí žádné přímé riziko pro člověka, zvířata či rostliny. Reference: Mackman et al., Mol. Gen. Genet. 201, 282 (1985) Mackman et al., Mol. Gen. Genet. 201, 529 (1985) 4.5. Metoda vnesení insertu Potřebný inzert byl vložen do daného vektoru ligací. Vzniklé konstrukty budou do buněk příjemce přeneseny transformací (tyto metody jsou popsány v laboratorní manuálu Molecular Cloning. A laboratory manual. J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Matias, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989). 4.6 Údaje o geneticky modifikovaném organismu Geneticky modifikovaný organismus, Escherichia coli nesoucí uvedené geny nebo jejich kombinaci je nepatogenní. Vložené úseky DNA kódující popsané proteiny nemohou způsobovat nebo zvyšovat patogenitu příjemce. Tak lze vyloučit škodlivé působení výsledných GMO na člověka, zvířata a rostliny (viz Hodnocení rizika). 4.7 Údaje o množství použitých geneticky modifikovaných organismů V průběhu nakládání s GMO budou z tekuté bakteriální kultury o objemu max. 0,5 L odebírány převážně vzorky o objemu 5 až 10 ml. Zbytek kultury bude inaktivován autoklávováním. Potřeba výsevu GMO na pevné půdy se bude v průběhu práce měnit. Očekáváme, že žádný experiment nebude vyžadovat spotřebu vyšší než 10 Petriho misek za týden. 4.8 Údaje o tom, zda GMO již byl schválen v jiném státě a pro jaké účely Nebyl.

Mikrobiologický ústav AV ČR Oznámení 8/10 5. Popis nakládání s geneticky modifikovaným organismem 5.1 V případě dovozu nebo vývozu GMO pro uzavřené nakládání GMO nebude dovážen ani vyvážen. 5.2. Popis nakládání s GMO v souladu s hodnocením rizika Popis nakládání s geneticky modifikovaným organismem v souladu s hodnocením rizika Jedná se o uzavřené nakládání s GMO v druhé kategorii rizika které probíhá výhradně v náležitě vybavených a zabezpečených laboratořích opatřených technickými prostředky zamezujícími úniku GMO do prostředí a ohrožení zdraví osob, zvířat a druhové rozmanitosti s následnou úplnou a bezpečnou likvidací připraveného nebo použitého GMO. Kultivace geneticky modifikovaných mikroorganismů probíhá ve vyhrazené laboratoři zabezpečené pro 2. kategorii rizika předepsanými technickými prostředky s následnou kontrolou účinnosti a v souladu s provozním řádem laboratoře obsahujícím také havarijní pokyny pro bezpečni likvidaci GMO materiálu. GMO jsou pěstovány na Petriho miskách v termostatu nebo v tekutých médiích na třepačce v kultivačních nádobách o objemech 10 5000 ml. Veškerá manipulace s Petriho miskami a s tekutými kulturami, především pak očkování kličkou a manipulace tekutých kultur a buněčných suspenzí je prováděna výhradně v boxu s laminárním prouděním třídy Biohazard (Gelaire 4BA) s recirkulací a sterilní filtrací proudícího vzduchu a následnou sterilizací boxu UV zářením. Techniky manipulace zahrnují konjugaci a transformaci kompetentních bakteriálních buněk kmenů rodů Escherichia a Neisseria rekombinantní DNA ve formě cirkulárních nebo linearizovaných plazmidů, nesoucích inserty, po níž jsou selektovány transformanti obsahující mimochromosomovou DNA nebo DNA integrovanou do chromosomu. Tím se provádí cílené přerušení genomových sekvencí nebo jejich částečné či úplné nahrazení rekombinantní DNA. DNA je získávána izolací z bakteriálních buněk nebo pomocí technik PCR a RT PCR. Manipulace s DNA probíhá s využitím komerčních enzymů a souprav pro práci s rekombinantní DNA dle doporučení výrobců pro restrikční štěpení, ligaci, cílenou mutagenezi a sekvenování. 5.3 Opatření k ochraně zdraví lidí a zvířat, životního prostředí a biologické rozmanitosti Proškolení pracovníci smí pracovat s GMO pouze v souladu s Provozním řádem pracoviště. Zvířatům je vstup do prostor, kde dochází k manipulaci s GMO znemožněn. Ochrany životního prostředí a biologické rozmanitosti je docilováno důsledným zamezováním volného šíření GMO mimo uzavřený prostor. Veškeré podrobnosti jsou uvedeny v Provozním řádu pracoviště. 5.4 Četnost a způsob provádění kontrol výskytu GMO uvnitř i vně uzavřeného prostoru Kontrola přítomnosti GMO je prováděna v případě, dojde-li ke kontaminaci zařízení nebo povrchů, které by neměly s GMO přijít do přímého kontaktu a jsou chemicky dekontaminovány (SAVO, Ajatin, 2% roztok chloraminu) a UV zářením (germicidní lampy). Kontrolu provádí vždy pracovník, který nakládá s GMO. Kromě toho jsou prováděny s četností dvakrát ročně kontroly prostoru, zařízení a ochranných opatření odpovědným pracovníkem. Po každé kontrole bude proveden zápis v provozním deníku. Způsob provádění kontrol (postupy detekce přítomnosti GMO) Zjišťování kontaminace vzduchu Metoda slouží k monitorování úniku GMO do prostoru. Provádí pomocí Petriho misek. Půda v agarových miskách je složením specifická pro testované mikroorganismy, s nimiž se pracuje a u kterých hrozí riziko úniku, s antibiotikem selektujícím GMO s plazmidem nesoucím genetickou modifikaci. Misky s půdou se otevřené položí do prostor

Mikrobiologický ústav AV ČR Oznámení 9/10 s potencionálním rizikem úniku. Po 15 minutách se opět přikryjí a nechají inkubovat v termostatu na 37 C resp. 30 C podle mikroorganismu po dobu 1 3 dnů. V případě nárůstu kolonií se genetická modifikace vylučuje resp. dokazuje polymerasovou řetězovou reakcí s příslušnými primery. V případě pozitivní PCR následují opatření na zneškodnění detekovaného GMO (opakování dezinfekce prostoru germicidními lampami zapnutými přes noc). Zjišťování kontaminace povrchů stěrovou metodou Metoda se provádí setřením povrchu monitorovaného objektu sterilní gázou a následným rozetření na agarové misky uvedené v metodě zjišťování kontaminace vzduchu. V případě nárůstu kolonií se pokračuje podobně jako v předešlé metodě, metodou PCR a následnými opatřeními na inaktivaci zbytkové kontaminace. Detekce GMO pomocí polymerasové řetězové reakce Základní metodou detekce GMO je amplifikace úseku genu, ohraničeného zvolenými oligonukleotidy (primery): orf1 ATGAGACCATATGCTACTACC TTCTATCCCCAAACCTAATG frpc GAATGAGGGTGAAGTTGTT TTCTATCCCCAAACCTAATG hlyb-hlyd GAATTCTCTTGCTAAAAATG TTTTCGTCCTTTTCACGTA 5.5 Způsob likvidace GMO a kontroly její účinnosti Likvidaci kultur GMO na pevných a v kapalných médiích a zneškodnění GMO při dekontaminaci uzavřeného prostoru je možné v laboratořích, kde se nakládá s GMO provádět tepelnou sterilizací v autoklávu, chemickou dezinfekcí a germicidními lampami. Po ukončení kultivací jsou všechny kultury GMO na pevných půdách (na Petriho miskách), v tekutých půdách (v 500ml baňkách s médiem o objemu 50 ml) a veškeré kontaminované odpady (plasty) inaktivovány sterilizací autoklávováním (125 C, 45 min) v plastových, k tomuto účelu určených pytlích nebo v uzavřených nádobách (např. baňkách v nichž proběhly kultivace) nebo v případě nutnosti dezinfekčními přípravky a roztoky (SAVO, Ajatin, 2% roztok chloraminu). Nástroje, zařízení a povrchy, u nichž došlo během práce ke kontaminaci GMO, musí být rovněž dezinfikovány chemickou dezinfekcí. Ochranné oděvy (v každé laboratoři je pro dočasné skladování použitých ochranných oděvů určen plastový pytel označený Biohazard), se perou jako infekční materiál. Po dočasném ukončení nakládání s GMO jsou veškeré teoretické kontaminace prostor a ploch likvidovány UV zářením s použitím germicidních lamp nejméně po dobu 1 h ze vzdálenosti nejdále 2 m. Dle potřeby je prostor ozařován UV lampou přes noc. Kontrola účinnosti zneškodnění GMO se provádí metodami podrobně popsanými v bodě 5.4. 5.6 Popis nakládání s odpady (odpadní vody, odpadní plynné škodliviny, ostatní a nebezpečné odpady) Veškeré GMO jsou po ukončení experimentů likvidovány autoklávováním nebo desinfekčními činidly (Ajatin, 2% roztok chloraminu nebo roztok chlornanu sodného - SAVO). Po inaktivaci GMO jsou sterilní odpady bez rizika přesouvány do běžného odpadu. V případě nutnosti jsou zneškodněné materiály jako odpad kat. č. 18 01 03 (Odpady, na jejichž sběr a odstraňování jsou kladeny zvláštní požadavky s ohledem na prevenci infekce) dle vyhlášky č. 381/2001 Sb., zákona 185/2001 Sb. o odpadech, likvidovány specializovanou

Mikrobiologický ústav AV ČR Oznámení 10/10 firmou T.O.P. Umwelt s.r.o. dle uzavřené smlouvy. Podrobnosti jsou uvedeny v Provozním řádu pro práci s GMO v MBÚ AVČR Žádné plynné škodliviny a nebezpečné odpady při nakládání nevznikají. 6. Doplňující údaje 6.1 Místo uložení dokumentace o nakládání s GMO S uvedenými kmeny se bude pracovat pouze v Laboratoři molekulární biologie bakteriálních patogenů MBÚ (č. 125). Dokumentace vedená v laboratoři bude uložena u vedoucího laboratoře, odpovědného pracovníka (Ing. P. Šebo, CSc.): Provozní řád, Havarijní plán, provozní deníky obsahující údaje o průběhu nakládání, plány etap, závěrečné zprávy jednotlivých etap, a záznamy o kontrolách. 6.2 Plán školení zaměstnanců a proškolování Zaměstnanci budou proškoleni před zahájením nakládání s geneticky modifikovanými organismy a dále jednou za rok při pravidelném přeškolování o bezpečnosti práce v laboratoři. 6.3 Validované metody pro zjišťování přítomnosti GMO a v případě mikroorganismů též stanovení jejich množství Jsou uvedeny v bodě 5.4 a detailně v Havarijním plánu. Praha 10. 10. 2006 Prof. RNDr. Blanka Říhová, DrSc. ředitelka MBÚ AVČR Vyjádření odborného poradce: Oznámení o nakládání s geneticky modifikovanými mikroorganismy obsahuje všechny informace nezbytné pro posouzení nakládání s GMO (mikroorganismy) v MBÚ AV ČR, Praha, a odpovídá požadavkům zákona č. 78/2004 Sb. a vyhlášky č. 209/2004 Sb., ve znění zákona č. 346/2005 Sb. Praha 10. 10. 2006 Ing. Miroslav Pátek, CSc. Seznam příloh: Příloha 1: Kopie zakládající listiny MBÚ AV ČR Příloha 2: Čestné prohlášení odborného poradce a kopie výpisu z rejstříku trestů Příloha 3: Doklad o dosaženém vzdělání a délce odborné praxe Příloha 4: Hodnocení rizika Příloha 5: Provozní řád pracoviště Příloha 6: Havarijní plán Příloha 7: Plánek areálu s vyznačením umístění nejdůležitějších zařízení Příloha 8: Posouzení prostor a zařízení pracoviště a jeho umístění Příloha 9: Přehled GMO