cobas WNV Test nukleových kyselin pro použití se systémy cobas 6800/8800 Pro diagnostické použití in vitro cobas WNV 96 P/N:

Test nukleových kyselin pro použití se systémy cobas 6800/8800 Pro diagnostické použití in vitro cobas WNV 96 P/N: 07001061190 cobas WNV 480 P/N: 07001070190 cobas WNV Control Kit P/N: 07001118190 cobas NHP Negative Control Kit P/N: 07002220190

Obsah Ú el použití... 4 Souhrn a výklad testu... 4 inidla a materiály... 7 inidla a kontroly cobas WNV... 7 inidla cobas omni pro p ípravu vzork... 10 Požadavky na uchovávání inidel a manipulaci s nimi... 11 Další pot ebný materiál... 12 Požadované p ístroje a software... 12 Bezpe nostní opat ení a požadavky na manipulaci... 13 Varování a bezpe nostní opat ení... 13 Manipulace s inidly... 13 Správná laboratorní praxe... 14 Odb r, p eprava, uchovávání a smíchávání vzork... 14 Vzorky krve žijících dárc... 14 Kadaverózní krevní vzorky... 17 Návod k použití... 18 Automatické pipetování a smíchávání vzork (volitelné)... 18 Procesní poznámky... 18 Provedení testu cobas WNV... 18 Výsledky... 19 Kontrola kvality a platnost výsledk... 19 Vyhodnocení výsledk... 20 Procedurální omezení... 20 Hodnocení neklinických funk ních parametr... 21 Klí ové funk ní charakteristiky... 21 Vzorky žijících dárc... 21 Mez detekce (Limit of Detection, LoD)... 21 Reprodukovatelnost... 23 Inkluzivita... 24 Analytická specificita... 25 Doc Rev. 4.0 2

Analytická specificita interferen ní látky... 26 Korelace... 27 Selhání celého systému... 27 Kadaverózní vzorky... 28 Senzitivita... 28 Specificita... 29 Reprodukovatelnost... 30 Dopl ující informace... 31 Hlavní parametry testu... 31 Symboly... 32 Výrobce a distributo i... 33 Obchodní zna ky a patenty... 33 Autorská práva (Copyright)... 33 Literatura... 34 Revize dokumentu... 36 cobas WNV Doc Rev. 4.0 3

Ú el použití Test cobas WNV je kvalitativní in vitro test k p ímé detekci RNA západonilského viru (WNV) v lidské plazm. Tento test je ur en pro skríningové testy dárc na RNA WNV ve vzorcích plazmy od jednotlivých dárc, v etn dárc plné krve a složek krve, a také od ostatních žijících dárc. Tento test je také ur en pro použití p i vyšet ení dárc orgán a tkání, kdy jsou vzorky dárce odebrány, zatímco jeho srdce ješt bije, a p i vyšet ení kadaverózních (zem elých) dárc (bez srde ního pulsu). Tento test není ur en pro použití na vzorcích krve z pupe níku. Plazma od všech dárc m že být otestována jako jednotlivé vzorky. U dárcovských odb r plné krve a složek krve, mohou být vzorky plazmy testovány jednotliv nebo mohou být testovány i ve sm sích alikvot jednotlivých vzork. Odb ry od kadaverózních dárc orgán a tkání (bez srde ního pulsu) mohou být testovány pouze jako jednotlivé vzorky. Tento test není ur en pro použití jako pom cka pro stanovení diagnózy infekce virem WNV. Souhrn a výklad testu Základní informace: Skríning krve pro virové infekce p enášené transfúzí Západonilský virus (WNV) je arbovirus (virus p enášený lenovci) s jedno et zcovou, pozitivn orientovanou RNA, který náleží do eledi Flaviviridae, rodu Flavivirus a sérokomplexu japonské encefalitidy. 1,2 Sérokomplex japonské encefalitidy také zahrnuje virus japonské encefalitidy, virus St. Louisské encefalitidy, virus encefalitidy Murray Valley a virus Kunjin (nyní je známo, že se jedná o variantu WNV). 3-5 Na základ fylogenetických studií byly identifikovány 2 hlavní linie viru WNV: linie 1 a linie 2. Kmeny z linie 1 se nachází v Africe, Indii, Austrálii a na západní polokouli a jsou p vodci nedávných epidemií v Evrop, st edomo í a v Severní i Jižní Americe. Kmeny z linie 2 byly hlášeny v subsaharské Africe 6 a v poslední dob i v jižní Evrop. 7,8 Stejn jako další arboviry se i WNV udržuje v enzootickém cyklu mezi komáry sajícími krev a dostupnými hostiteli z podkmene obratlovc (ptáci). 9 Ptáci slouží jako p irozená zásobárna hostitel z ad obratlovc a komá i rodu Culex jsou hlavními enzootickými p enaše i WNV, zatímco lidé a savci (nap. kon ) jsou náhodnými a obvykle kone nými hostiteli, protože se u nich pouze vzácn vyvine virémie o dostate ném titru, aby nakazili efektivní p enaše e z ad lenovc. 2,9,10 WNV je široce rozší en po Africe, St edním východ, jižní Evrop, západním Rusku, jihozápadní Asii a Austrálii (subtyp Kunjin viru WNV), vzhledem ke schopnosti WNV infikovat množství druh komár a pták. 1 Propuknutí nákazy u lidí, p evážn spojené s mírným hore natým onemocn ním, bylo nep íliš asto hlášeno v Izraeli a Africe do poloviny 90. let 20. století. 1 Od poloviny 90. let m ly nové virové kmeny, pravd podobn afrického p vod, za následek zvýšený po et infekcí v ástech Ruska a jižní a východní Evropy, s velkými vzplanutími nákaz se zvýšenou klinickou závažností v Rumunsku, Rusku, Izraeli a ecku. 1,8,11 WNV se nyní vyskytuje v mnoha zemích na západní polokouli, avšak pouze ve Spojených státech a Kanad zažili významnou incidenci onemocn ní u lidí. 1,12 Virus WNV se ve Spojených státech poprvé objevil v roce 1999 v New York City a v následujících letech se rychle ší il po celých Spojených státech. 13 WNV je nyní endemický ve všech 48 navzájem sousedících zemích Spojených stát a také ve všech kanadských provinciích. 1 Virus WNV je odpov dný za 3 nejv tší propuknutí arbovirových neuroinvazivních onemocn ní (encefalitida, meningitida nebo akutní chabé parézy), jaké kdy byly zaznamenány ve Spojených státech, s tém 3 000 p ípad neuroinvazivních onemocn ní zaznamenaných každý rok v letech 2002, 2003 a 2012. 1 Vysoká virová aktivita nastává b hem teplých m síc roku. 1 U devadesáti ty i procent pacient s infekcí WNV se vyvinou p íznaky v letních m sících. 1 Odhaduje se, že ve Spojených státech mezi lety 1999 a 2012 virus WNV infikoval více než 4 miliony osob, 1 p i emž bylo hlášeno celkem 16 196 pacient s neuroinvazivním onemocn ním zp sobeným WNV, v etn 1 549 souvisejících úmrtí. 1 Doc Rev. 4.0 4

D vod pro testování nukleových kyselin cobas WNV To, že se virus WNV p enáší transfuzí a transplantací orgán, se poprvé prokázalo b hem šet ení epidemie ve Spojených státech v roce 2002. 14,15 WNV se m že p enášet p i transfuzi ervených krvinek, desti ek, erstvé zmrazené plazmy a p i transplantaci srdce, ledvin, jater a plic. Infekce WNV p i štípnutí komárem však p esto u lidí p evažují. 1,2,14, 16 WNV se m že také potenciáln p enášet p i transplantaci hematopoetických progenitorních bun k. Transplacentální a perinatální p enos WNV byl také hlášen. 1 Mezi další vzácné zp soby p enosu WNV pat í p enos mate ským mlékem, pacienti podstupující dialýzu a vystavení v zam stnání (nap. pracovníci v laborato i [perkutánní nebo konjunktivální (spojivkové) expozice]; pracovníci na dr bežích farmách). 1,12 Infekce obvykle vytvo í celoživotní imunitu. 9 K p enosu WNV p i transfuzi obvykle dochází b hem akutní fáze infekce, když jsou infikovaní jedinci viremi tí a asymptomati tí, avšak dosud u nich nedošlo k sérokonverzi. 17 Vzhledem k tomu, že se klinicky významné onemocn ní vyvinulo pouze u n kolika infikovaných dárc, jsou dotazy dárc krve na nedávná onemocn ní nazna ujících infekci WNV p i zjiš ování infikovaných/séropozitivních dárc neú inné. 18,19 Data shromážd ná z plošného testování dárc krve ukazují, že nedávno infikovaní dárci s extrémn nízkým titrem virémie WNV, u nichž se nevyvinuly protilátky proti WNV, ú inn p enáší infekci WNV. 9,20 Darovaná krev s velmi nízkou virovou zát ží byla p í inou p ípad p enosu WNV p i transfuzi, 21 což p edstavuje nebezpe í obzvlášt pro pacienty se sníženou imunitou, kte í jsou p íjemci v tšiny krevních transfuzí. 22 Aby se zajistila bezpe nost transfuzí, bylo v roce 2003 zavedeno celonárodní testování nukleových kyselin (NAT) na RNA WNV. 9 B hem prvních 2 let plošného screeningového testování NAT viru WNV dárc krve ve Spojených státech bylo mezi 27,2 miliony dárcovských vzork identifikováno 1 039 pozitivních vzork (0,4 na 10 000 dárc ), avšak ísla se r znila až po velmi vysokou hodnotu 1 ze 150 dárc v n kterých oblastech b hem epidemie. 18 NAT screening dárc krve ve Spojených státech a Kanad tém eliminovalo riziko infekce západonilským virem p i transfuzi. 1 Mezi lety 2003 a 2013 se zabránilo p ibližn 3 000 infekcím WNV. 23 Mezi osobami infikovanými virem WNV je p ibližn 80 % asymptomatických, u 20 až 25 % se vyvine západonilská hore ka, 1,24 a u 1 ze 150 až 250 osob se vyvine neuroinvazivní onemocn ní. 1,25 Západonilská hore ka zahrnuje náhlý nástup bolestí hlavy, malátnosti, hore ky (obvykle nižší), bolesti sval, zimnice, zvracení a další gastrointestinálních p íznak, vyrážky, únavy a bolesti o í, které mohou trvat n kolik dní až n kolik týdn nebo dokonce m síc. 1,24 Neuroinvazivní forma západonilské hore ky se m že projevovat jako meningitida, encefalitida, meningoencefalitida, nebo akutní chabá paréza, a m že vést k nevratnému neurologickému poškození, kómatu a smrti. 1,26-31 Infekce WNV je také spojována s myokarditidou, pankreatitidou, fulminantní hepatitidou, rabdomyolýzou, multifokální choroiditiou, vitritidou a autonomní nestabilitou. 1 Následky neuroinvazivního onemocn ní mohou p etrvávat m síce i roky po zotavení z akutní infekce. Po propušt ní z nemocnice osoby se západonilskou encefalitidou obvykle vyžadují asistenci s každodenními innostmi. 1, 31,32 Neuropsychiatrické p íznaky, v etn deprese a úzkosti a také neurokognitivní deficity, mohou p etrvávat celé m síce až rok nebo i déle. 1,20,33 P ibližn 10 % osob, u nichž se vyvine neuroinvazivní forma západonilské hore ky, v jejím d sledku zem e; nejd ležit jším rizikovým faktorem je pokro ilý v k. 2 V porovnání s 0,8% rizikem úmrtí u pacient mladších 40 let iní riziko smrtelných následk u pacient ve v ku 70 let nebo starších 17 %. 1,33 Mezi další rizikové faktory pro úmrtí pat í encefalitida se závažnou svalovou slabostí, zm n ná úrove v domí, diabetes, kardiovaskulární onemocn ní, infekce virem hepatitidy C a 1,12, 33 imunosuprese. Princip testu Test cobas WNV je kvalitativní test, který se provádí na systémech cobas 6800 a cobas 8800. Test cobas WNV umož uje sou asnou detekci RNA WNV s interní kontrolou v jediném testu jednotlivého infikovaného dárcovského odb ru nebo smíchané plazmy z jednotlivých dárcovských odb r. Doc Rev. 4.0 5

Principy postupu cobas WNV Test cobas WNV se zakládá na pln automatizované p íprav vzork (extrakce a purifikace nukleové kyseliny) s následnou PCR amplifikací a detekcí. Systém cobas 6800/8800 se skládá z modulu pro dodávání vzork, p enosového modulu, zpracovacího modulu a analytického modulu. Software systému cobas 6800/8800 provádí automatizované zpracování dat, p i kterém p i azuje všem test m výsledky nereaktivní, reaktivní nebo neplatné (invalid). Výsledky lze prohlížet p ímo na obrazovce systému nebo vytisknout jako zprávu. Vzorky lze testovat individuáln, nebo lze zvolit testování sm sí sestávajících z mnoha vzork. Pokud se provádí tvorba sm si, lze v p edanalytickém kroku voliteln použít za ízení cobas p 680 nebo cobas Synergy Software s pipetorem Hamilton Microlab STAR IVD (cobas Synergy Core). Nukleové kyseliny ze vzorku a p idané molekuly Armored RNA vnit ní kontroly (IC) (které slouží jako procesní kontrola p ípravy vzorku a amplifikace/detekce) jsou zpracovány zárove. Test navíc využívá dv externí kontroly: pozitivní a negativní kontrolu. K uvoln ní virových nukleových kyselin dochází p idáním proteinázy a lytických inidel ke vzorku. Uvoln né nukleové kyseliny se váží na k emi itanový povrch p idaných magnetických sklen ných ástic. Nenavázané látky a ne istoty, jako nap íklad denaturované proteiny, bun ný odpad a p ípadné inhibitory PCR (jako nap íklad hemoglobin) jsou odstran ny b hem následujících krok promývacím inidlem; purifikované nukleové kyseliny jsou eluovány z magnetických sklen ných ástic elu ním pufrem p i zvýšené teplot. K selektivní amplifikaci cílových nukleových kyselin ze vzorku dárce dochází pomocí dop edných a zp tných primer specifických pro virové sekvence vybrané z vysoce konzervovaných oblastí virové nukleové kyseliny. Tepeln stabilní enzym DNA polymeráza se používá jak pro reverzní transkripci, tak pro amplifikaci. inidlo master mix obsahuje deoxyuridin trifosfát (dutp), namísto deoxythimidin trifosfátu (dttp), který je zabudováván do nov syntetizované DNA (amplikon). 34-36 Jakýkoliv kontaminující amplikon z p edcházejících cykl PCR je zni en enzymem AmpErase [uracil-n-glykosyláza], který je zahrnut ve sm si PCR, p i zah átí v prvním kroku tepelného cyklování. Nov vytvo ené amplikony však zni eny nejsou, protože enzym AmpErase je inaktivován po vystavení teplotám nad 55 C. inidlo Master Mix cobas WNV obsahuje detek ní sondy specifické pro nukleové kyseliny WNV a IC. Specifické detek ní sondy pro WNV a IC jsou ozna eny každá jedním ze dvou jedine ných fluorescen ních barviv, která mají oznamovací funkci. Každá sonda obsahuje též druhé barvivo, které má tlumící funkci. Dv oznamovací barviva jsou m ena p i definovaných vlnových délkách, což umož uje sou asnou detekci a rozlišení mezi amplifikovanými cílovými sekvencemi WNV a IC. 37,38 Fluorescen ní signál intaktních sond, které nejsou navázány na cílovou sekvenci, je potla en tlumicím barvivem. B hem kroku PCR amplifikace dochází kv li hybridizaci sond se specifickým templátem jedno et zcové DNA k št pení sondy 5' 3' exonukleázovou aktivitou DNA polymerázy, která zp sobí odd lení oznamovacího a tlumícího barviva a vznik fluorescen ního signálu. U každého PCR cyklu jsou generovány zvýšená množství rozšt pených sond a kumulativní signál oznamovacího barviva se postupn zvyšuje. Protože jsou dv specifická oznamovací barviva m ena p i definovaných vlnových délkách, je možná sou asná detekce a rozlišování mezi amplifikovanou cílovou sekvencí WNV a IC. Doc Rev. 4.0 6

inidla a materiály inidla a kontroly cobas WNV Všechna neotev ená inidla a kontroly mají být uchovávány v souladu s doporu eními v Tabulka 1 až Tabulka 4. Tabulka 1 Test cobas WNV Test cobas WNV Uchovávejte p i 2 8 C Kazeta pro 96 test (P/N 07001061190) Kazeta pro 480 test (P/N 07001070190) Sou ásti soupravy Složky inidel Množství v souprav 96 test 480 test Roztok proteinázy (PASE) Vnit ní kontrola (IC) Tris pufr, < 0,05 % EDTA, chlorid vápenatý, octan vápenatý, 8 % (w/v) proteináza EUH210: Na vyžádání je kodispozici bezpe nostní list. EUH208: M že vyvolat alergickou reakci. Obsahuje: Subtilisin, 9014-01-1 Tris pufr, < 0,05 % EDTA, < 0,001 % konstrukt Armored RNA pro vnit ní kontrolu (neinfek ní RNA enkapsulovaná v bakteriofágu MS2), < 0,002 % Poly ra RNA (syntetická), < 0,1 % azid sodný 13 ml 38 ml 13 ml 38 ml Elu ní pufr (EB) inidlo Master Mix 1 (MMX-R1) Tris pufr, 0,2 % methyl-4-hydroxybenzoát 13 ml 38 ml Octan ho e natý, hydroxid draselný, < 0,1 % azid sodný 5,5 ml 14,5 ml inidlo WNV Master Mix 2 (WNV MMX-R2) Tricinový pufr, octan draselný, glycerin, 18 % dimethylsulfoxid, Tween 20, EDTA, < 0,06 % datp, dgtp, dctp, < 0,14 % dutp, < 0,01 % dop edné a zp tné primery WNV a vnit ní kontroly, < 0,01 % fluorescen n zna ené sondy specifické pro WNV, < 0,01 % fluorescen n zna ené sondy pro vnit ní kontrolu, < 0,01 % oligonukleotidový aptamer, < 0,01 % Z05D DNA polymeráza, < 0,01 % enzym AmpErase (uracil-n-glykosyláza) (mikrobiální), < 0,1 % azid sodný 6 ml 17,5 ml Doc Rev. 4.0 7

Tabulka 2 Kontrolní souprava cobas WNV cobas WNV Control Kit Uchovávejte p i 2 8 C (P/N 07001118190) Sou ásti soupravy Složky inidel Množství v souprav Bezpe nostní symboly a varování* Pozitivní kontrola WNV (WNV (+) C) < 0,001 % syntetická (armored) RNA viru WNV enkapsulovaná v obalovém proteinu bakteriofágu MS2, normální lidská plazma nereagující na protilátky proti HCV, HIV-1/2, HBsAg, protilátku proti HBc podle licen ních test ; RNA HIV-1, RNA HIV-2, RNA HCV, DNA HBV, RNA HEV, RNA WNV a DNA CMV nedetekovatelné PCR metodami. 0,1 % konzervantu ProClin 300 16 ml (16 x 1 ml) Varování H317: M že vyvolat alergickou kožní reakci. P261: Zamezte vdechování prachu/ dýmu/plynu/mlhy/par/aerosol. P272: Kontaminovaný pracovní od v neodnášejte z pracovišt. P280: Používejte ochranné rukavice. P302 + P352: P I STYKU S K ŽÍ: Omyjte velkým množstvím vody a mýdla. P333 + P313: P i podrážd ní k že nebo vyrážce: Vyhledejte léka skou pomoc/ ošet ení. P363: Kontaminovaný od v p ed op tovným použitím vyperte. * Bezpe nostní ozna ení produkt vychází primárn z pokyn GHS EU. Doc Rev. 4.0 8

Tabulka 3 Souprava negativní kontroly NHP cobas Souprava negativní kontroly NHP pro test cobas Uchovávejte p i 2 8 C (P/N 07002220190) Sou ásti soupravy Složky inidel Množství v souprav Bezpe nostní symboly a varování* Negativní kontrola normální lidské plazmy (NHP-NC) Normální lidská plazma nereagující na protilátky proti HCV, HIV-1/2, HBsAg, protilátku proti HBc podle licen ních test ; RNA HIV-1, RNA HIV-2, RNA HCV, DNA HBV, RNA HEV, RNA WNV a DNA CMV nedetekovatelné PCR metodami. < 0,1 % konzervantu ProClin 300 16 ml (16 x 1 ml) Varování H317: M že vyvolat alergickou kožní reakci. P261: Zamezte vdechování prachu/ dýmu/plynu/mlhy/par/aerosol. P272: Kontaminovaný pracovní od v neodnášejte z pracovišt. P280: Používejte ochranné rukavice. P302 + P352: P I STYKU S K ŽÍ: Omyjte velkým množstvím vody a mýdla. P333 + P313: P i podrážd ní k že nebo vyrážce: Vyhledejte léka skou pomoc/ ošet ení. P363: Kontaminovaný od v p ed op tovným použitím vyperte. * Bezpe nostní ozna ení produkt vychází primárn z pokyn GHS EU. Doc Rev. 4.0 9

inidla cobas omni pro p ípravu vzork Tabulka 4 inidla cobas omni pro p ípravu vzork * inidla Složky inidel Množství v souprav Bezpe nostní symboly a varování** inidlo MGP cobas omni (MGP) Uchovávejte p i 2 8 C (P/N 06997546190) Roztok pro ed ní vzork cobas omni (SPEC DIL) Uchovávejte p i 2 8 C (P/N 06997511190) Lytické inidlo cobas omni (LYS) Uchovávejte p i 2 8 C (P/N 06997538190) Promývací inidlo cobas omni (WASH) Uchovávejte p i 15-30 C (P/N 06997503190) Magnetické sklen né ástice, Tris pufr, 0,1 % methyl-4-hydroxybenzoát, < 0,1 % azid sodný Tris pufr, 0,1 % methyl-4-hydroxybenzoát, < 0,1 % azid sodný 42,56 % (w/w) guanidinthiokyanát, 5 % (w/v) polydokanol, 2 % (w/v) dithiothreitol, dihydrát citrátu sodného Dihydrát citrátu sodného, 0,1 % methyl- 4-hydroxybenzoát 480 test N/A = nevztahuje se 4 x 875 ml N/A = nevztahuje se 4 x 875 ml Nebezpe í H302: Zdraví škodlivý p i požití. H318: Zp sobuje vážné poškození o í. H412: Škodlivý pro vodní organismy, s dlouhodobými ú inky. EUH032: Uvol uje vysoce toxický plyn p i styku s kyselinami. P301 + P312: P I POŽITÍ: Necítíte-li se dob e, volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMA NÍ ST EDISKO nebo léka e. P264: Po manipulaci d kladn omyjte pokožku. P270: P i používání tohoto výrobku nejezte, nepijte ani neku te. P273: Zabra te uvoln ní do životního prost edí. P280: Používejte ochranné rukavice/ochranné brýle/obli ejový štít. P305+P351+P338: P I ZASAŽENÍ O Í: N kolik minut opatrn vyplachujte vodou. Vyjm te kontaktní o ky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokra ujte ve vyplachování. P310: Necítíte-li se dob e, okamžit volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMA NÍ ST EDISKO/léka e. P330: Vypláchn te ústa. 4,2 l N/A = nevztahuje se * Testovací souprava cobas WNV neobsahuje tato inidla. Viz seznam dodate ných požadovaných materiál (Tabulka 7). ** Bezpe nostní ozna ení produkt vychází primárn z pokyn GHS EU. Doc Rev. 4.0 10

Požadavky na uchovávání inidel a manipulaci s nimi Podmínky uchovávání inidel a manipulace s nimi uvádí Tabulka 5 a Tabulka 6. Pokud nejsou inidla nadávkována v systémech cobas 6800/8800, uchovávejte je p i odpovídající teplot, kterou uvádí Tabulka 5. Tabulka 5 Uchovávání inidel (když nejsou nadávkována v systému) inidlo cobas WNV 96 2-8 C cobas WNV 480 2-8 C Kontrolní souprava cobas WNV 2-8 C Souprava negativní kontroly NHP pro test cobas 2-8 C Lytické inidlo cobas omni 2-8 C inidlo MGP cobas omni 2-8 C Roztok pro ed ní vzork cobas omni 2-8 C Promývací inidlo cobas omni 15-30 C Teplota uchovávání inidla nadávkovaná do systém cobas 6800/8800 jsou uložena p i p íslušných teplotách a systém monitoruje jejich dobu použitelnosti. Systém umožní používání inidel, pouze pokud jsou spln ny podmínky, které uvádí Tabulka 6. Systém automaticky znemož uje použití prošlých inidel. Tabulka 6 vysv tluje uživatel m podmínky manipulace s inidly, platné v systémech cobas 6800/8800. Tabulka 6 Podmínky dodržování doby použitelnosti inidel v systémech cobas 6800/8800 inidlo Doba použitelnosti soupravy Stabilita otev ené soupravy Po et cykl, pro který m že být tato souprava použita Stabilita na ploše (celková doba na ploše mimo ledni ku) cobas WNV 96 Doba zatím neuplynula 30 dn od prvního použití Maximáln 10 cykl Maximáln 8 hodin cobas WNV 480 Doba zatím neuplynula 30 dn od prvního použití Maximáln 20 cykl Maximáln 20 hodin Kontrolní souprava cobas WNV Doba zatím neuplynula N/A = nevztahuje se N/A = nevztahuje se Maximáln 10 hodin Souprava negativní kontroly NHP pro test cobas Doba zatím neuplynula N/A = nevztahuje se N/A = nevztahuje se Maximáln 10 hodin Lytické inidlo cobas omni Doba zatím neuplynula 30 dn od naložení* N/A = nevztahuje se N/A = nevztahuje se inidlo MGP cobas omni Doba zatím neuplynula 30 dn od naložení* N/A = nevztahuje se N/A = nevztahuje se Roztok pro ed ní vzork cobas omni Doba zatím neuplynula 30 dn od naložení* N/A = nevztahuje se N/A = nevztahuje se Promývací inidlo cobas omni Doba zatím neuplynula 30 dn od naložení* N/A = nevztahuje se N/A = nevztahuje se * as se m í od doby, kdy bylo inidlo poprvé naloženo do systém cobas 6800/8800. Doc Rev. 4.0 11

Další pot ebný materiál Tabulka 7 Materiály a spot ební materiál pro použití v systémech cobas 6800/8800 Materiál P/N Desti ka pro zpracování vzork cobas omni 05534917001 Desti ka pro amplifikaci cobas omni 05534941001 Špi ky na pipety cobas omni 05534925001 Nádoba na tekutý odpad cobas omni 07094388001 Lytické inidlo cobas omni 06997538190 inidlo MGP cobas omni 06997546190 Roztok pro ed ní vzork cobas omni 06997511190 Promývací inidlo cobas omni 06997503190 Pytel na pevný odpad 07435967001 Nádoba na pevný odpad 07094361001 Požadované p ístroje a software Na p ístroji (p ístrojích) má být nainstalován software cobas 6800/8800 a analytický balí ek cobas WNV. Se systémem je poskytnut server Instrument Gateway (IG). Tabulka 8 P ístroje Systémy cobas 6800 / 8800 P/N Systém cobas 6800 (možnost: pohyblivý) 05524245001 a 06379672001 Systém cobas 6800 (instalovaný napevno) 05524245001 a 06379664001 Systém cobas 8800 05412722001 Modul pro dodávání vzork 06301037001 Možnosti pro pipetování a tvorbu sm si P/N Za ízení cobas p 680 06578624001 cobas Synergy Software pro použití s pipetorem Hamilton Microlab STAR IVD 07788096001 a 07788339001 Hamilton Microlab STAR IVD 04640535001 Dodate né informace o primárních a sekundárních zkumavkách na vzorky, které jsou p ijatelné pro p ístroje, najdete v provozní p íru ce systém cobas 6800/8800 a provozní p íru ce p ístroje cobas p 680 nebo p íru ce pro uživatele cobas Synergy Software. Pozn.: Kontaktujte místního zástupce spole nosti Roche ohledn podrobných seznam pro objednávky stojan na vzorky, stojan pro špi ky se sraženinou a stojany, které se vejdou do p ístroj. Doc Rev. 4.0 12

Bezpe nostní opat ení a požadavky na manipulaci Varování a bezpe nostní opat ení Jak je tomu p i každém testovacím postupu, je pro správné fungování tohoto testu zásadním požadavkem dodržovat principy správné laboratorní praxe. Vzhledem k vysoké senzitivit testu je t eba dbát opatrnosti, aby mezi inidly a amplifika ními sm smi nedošlo ke kontaminaci. Pouze pro ú ely diagnostiky in vitro. Se všemi vzorky je nutno zacházet, jako by byly infek ní, za použití správných laboratorních postup, tak jak jsou popsány v publikaci Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories a v dokumentu CLSI íslo M29-A4. 39,40 Tento postup smí provád t pouze personál zkušený v zacházení s infek ními vzorky a s použitím testu cobas WNV, se systémy cobas 6800/8800 a (voliteln ) se za ízením cobas p 680 nebo pipetorem Hamilton Microlab STAR IVD s použitím cobas Synergy Core. Veškeré materiály pocházející z lidských zdroj by m ly být považovány za potenciáln infek ní a musí se s nimi zacházet dle všeobecných bezpe nostních opat ení. Pokud dojde k rozlití vzorku, ihned místo dezinfikujte erstv p ipraveným roztokem 0,5 % chlornanu sodného v destilované nebo deionizované vod (b lidlo pro domácnost z ed né 1:10) nebo postupujte dle vlastních vhodných procedur laborato e. Kontrolní souprava pro test cobas WNV a negativní kontrolní souprava NHP pro test cobas obsahuje plazmu z lidské krve. Zdrojový materiál byl analyzován pomocí licen ních test na protilátky a byl shledán nereaktivním v i protilátce proti HCV, protilátce proti HIV-1/2, HBsAg a protilátce proti HBc. Testování normální lidské plazmy metodami PCR také neprokázalo žádnou detekovatelnou RNA HIV-1 (skupin M a O), RNA HIV-2, RNA HCV, DNA HBV, RNA HEV, RNA WNV ani DNA CMV. Nicmén žádná známá testovací metoda nep edstavuje dokonalou záruku, že se s deriváty z lidské krve nep enesou n jaká infek ní agens. Plnou krev nezmrazujte. Doporu uje se používat sterilní pipety na jedno použití a špi ky na pipety bez nukleázy. Pro zajišt ní optimální ú innosti testu používejte pouze spot ební materiál, který je sou ástí dodávky, nebo specifikovaný požadovaný materiál. Bezpe nostní listy (SDS) zašle na vyžádání Váš místní zástupce spole nosti Roche. Pe liv dodržujte uvedené postupy a p edpisy, aby se zajistilo správné provedení test. Jakákoliv odchylka od postup a p edpis m že negativn ovlivnit optimální ú innost testu. Pokud nebude b hem manipulace a zpracování vzork pat i n kontrolována kontaminace p enosem, mohou vzniknout falešn pozitivní výsledky. Manipulace s inidly Aby nedošlo u vzork nebo kontrol ke kontaminaci p enosem, zacházejte se všemi inidly, kontrolami a vzorky podle zásad správné laboratorní praxe. P ed použitím vizuáln zkontrolujte každou kazetu s inidly, roztok pro ed ní vzork, lytické inidlo a promývací inidlo, zda nejeví žádné známky net snosti. Pokud známky net snosti vykazuje, nepoužívejte tento materiál k testování. Lytické inidlo cobas omni obsahuje potenciáln nebezpe nou látku guanidinthiokyanát. Vyhn te se kontaktu inidel s pokožkou, o ima nebo sliznicemi. Pokud dojde ke kontaktu, okamžit postiženou oblast omyjte velkým množstvím vody, jinak m že dojít k popáleninám. Testovací soupravy cobas WNV, inidlo MGP cobas omni a roztok pro ed ní vzork cobas omni obsahují konzerva ní prost edek azid sodný. Vyhn te se kontaktu inidel s pokožkou, o ima nebo sliznicemi. Pokud dojde ke kontaktu, okamžit postiženou oblast omyjte velkým množstvím vody, jinak m že dojít k popáleninám. Pokud se inidlo rozlije, z e te ho p ed vyt ením dosucha vodou. Doc Rev. 4.0 13

Lytické inidlo cobas omni, jež obsahuje guanidinthiokyanát, se nesmí dostat do styku s roztokem chlornanu sodného (b licím prost edkem). Tato sm s vytvá í vysoce toxický plyn. Všechen materiál, který se dostal do kontaktu se vzorky a inidly, zlikvidujte dle celostátních, respektive místních p edpis. Správná laboratorní praxe Nepipetujte ústy. V pracovních laboratorních prostorách nejezte, nepijte a neku te. P i práci se vzorky a inidly používejte laboratorní rukavice, laboratorní plášt a ochranné brýle. P i p echodu od manipulace se vzorky k manipulaci se soupravami testu cobas WNV a inidly cobas omni je nutno vym nit rukavice, aby nedošlo ke kontaminaci. Zabra te kontaminaci rukavic p i manipulaci se vzorky a kontrolami. Po manipulaci se vzorky a inidly soupravy si d kladn umyjte ruce, jakož i po svléknutí rukavic. Všechny pracovní plochy d kladn o ist te a vydezinfikujte erstv p ipraveným 0,5% roztokem chlornanu sodného v destilované nebo deionizované vod (z ed ný b licí prost edek pro domácnosti 1:10). Dále povrch ot ete 70% etanolem. Pokud dojde k rozlití kapaliny na p ístrojích cobas 6800/8800, ádn jejich povrch vy ist te a dekontaminujte podle pokyn v provozní p íru ce systém cobas 6800/8800. Odb r, p eprava, uchovávání a smíchávání vzork Pozn.: Zacházejte se vzorky a kontrolami jako s potenciáln infek ním materiálem. Všechny vzorky dárc uchovávejte p i stanovených teplotách. Zvýšené teploty ovliv ují stabilitu vzork. Vzorky krve žijících dárc Pro test cobas WNV m že být použita plazma s antikoagulanty EDTA, CPD, CPDA1 a CP2D. Postupujte dle pokyn výrobce zkumavky/vaku na odb r vzork týkajících se manipulace a odst e ování. Krev odebraná s antikoagulantem EDTA m že být uchovávána až po dobu 12 dn za následujících podmínek: o Vzorky je nutno odst edit do 72 hodin po odb ru. o P i uchovávání vzork p i teplot nad 8 C lze vzorky uchovávat po dobu 72 hodin p i teplot do 25 C a z t chto 72 hodin mohou být 24 hodin p i teplot do 30 C. S výjimkou výše uvedeného se vzorky uchovávají p i teplot 2 8 C. Navíc lze plazmu odd lenou od bun k uchovávat až po dobu 12 m síc p i teplot -18 C se t emi cykly zmrazení a rozmrazení. Viz Obrázek 1. Doc Rev. 4.0 14

Obrázek 1 Podmínky uchovávání vzork s antikoagulantem EDTA 30 Antikoagulant EDTA 25 Teplota ( C) 8 Plná krev 2-18 1 3 12 Zmrazená plazma (Až 3 cykly zmrazení/rozmrazení) 0 M síce 12 Krev odebraná do zkumavek s antikoagulantem CPD, CPDA1 nebo CP2D, zkumavek na p ípravu plazmy s EDTA spole nosti Becton-Dickinson (BD PPT ) nebo gelových zkumavek na plazmu K2EDTA spole nosti Greiner Vacuette m že být uchovávána až po dobu 12 dn za následujících podmínek: o Vzorky je nutno odst edit do 72 hodin po odb ru. o P i uchovávání vzork p i teplot nad 8 C lze vzorky uchovávat po dobu 72 hodin p i teplot do 25 C a z t chto 72 hodin mohou být 24 hodin p i teplot do 30 C. S výjimkou výše uvedeného se vzorky uchovávají p i 2 8 C. Navíc lze plazmu odd lenou od bun k uchovávat až po 30 dn p i teplot < 18 C se t emi cykly zmrazení a rozmrazení. Viz Obrázek 2. Doc Rev. 4.0 15

Obrázek 2 Podmínky uchovávání vzork žijících dárc 30 Antikoagulant CPD, CPDA1, CP2D, zkumavky BD PPT TM nebo gelové zkumavky na plazmu K2EDTA spole nosti Greiner Vacuette 25 Teplota ( C) 8 Plná krev -18 2 1 3 12 Zmrazená plazma (Až 3 cykly zmrazení/rozmrazení) 0 30 Dn Doc Rev. 4.0 16

Kadaverózní krevní vzorky cobas WNV Kadaverózní krevní vzorky odebrané do zkumavek s antikoagulantem EDTA nebo do srážecích zkumavek na sérum lze použít s testem cobas WNV. Postupujte dle pokyn výrobce zkumavky/vaku na odb r vzork týkajících se manipulace a odst e ování. Kadaverózní krev odebraná s antikoagulantem EDTA m že být uchovávána až po dobu 8 dn p i teplot 2 8 C za následujících podmínek: o Vzorky je nutné odst edit a plazmu separovat od bun k do 24 hodin od odb ru. o P i uchovávání vzork p i teplot nad 8 C lze vzorky uchovávat p i teplot do 25 C po dobu 24 hodin. S výjimkou výše uvedeného lze vzorky kadaverózní EDTA plazmy odd lené od bun k uchovávat až 30 dn p i teplot -18 C. Viz Obrázek 3. Obrázek 3 Podmínky uchovávání kadaverózních vzork 25 Antikoagulant EDTA Teplota ( C) -18 8 2 Plná krev Plazma 1 8 Zmrazená plazma (Až 3 cykly zmrazení/rozmrazení) 0 Dn 30 Vzorky kadaverózní krve odebrané do sérových srážecích zkumavek mohou být skladovány až po dobu 4 dn p i teplot 2 8 C za následujících podmínek: o Vzorky je nutné odst edit a sérum separovat od bun k do 24 hodin od odb ru. o P i uchovávání vzork p i teplot nad 8 C lze vzorky uchovávat p i teplot do 25 C po 4 hodin z t chto 24 hodin. S výjimkou výše uvedeného lze vzorky séra odd leného od bun k uchovávat až 14 dn p i teplot -18 C se t emi cykly zmrazení a rozmrazení. Pokud mají být vzorky žijících dárc a/nebo kadaverózní vzorky p epravovány, musí být zabaleny a ozna eny dle platných státních anebo mezinárodních p edpis o p eprav vzork a etiologických agens. Doc Rev. 4.0 17

Návod k použití Automatické pipetování a smíchávání vzork (volitelné) Za ízení cobas p 680 nebo cobas Synergy Core lze použít jako volitelnou sou ást systém cobas 6800/8800 k automatickému pipetování a tvorb sm sí alikvot v tšího po tu primárních vzork do jednoho smíšeného vzorku. Další informace najdete v provozní p íru ce p ístroje cobas p 680 nebo uživatelské nápov d pro cobas Synergy Software. Procesní poznámky Nepoužívejte inidla testu cobas WNV, kontrolní soupravy cobas WNV, soupravy negativní kontroly NHP cobas ani inidla cobas omni po uplynutí jejich doby použitelnosti. Nepoužívejte spot ební materiál opakovan. Slouží pouze k jednorázovému použití. Pokyny k ádné údržb p ístroj najdete v provozní p íru ce systém cobas 6800/8800. Provedení testu cobas WNV Postup testu je podrobn popsán v provozní p íru ce za ízení cobas 6800/8800; informace o volitelných postupech tvorby sm sí naleznete v provozní p íru ce pro za ízení cobas p 680 nebo uživatelské nápov d pro cobas Synergy Software. Obrázek 4 níže uvádí souhrn postupu. Obrázek 4 Postup testu cobas WNV Doc Rev. 4.0 18

Výsledky Systémy cobas 6800/8800 automaticky detekují RNA WNV sou asn ve vzorcích a kontrolách. Kontrola kvality a platnost výsledk S každou dávkou je zpracována jedna negativní [( ) C] a jedna pozitivní kontrola [WNV (+)]. Ov te platnost dávky v softwaru systému cobas 6800/8800 a/nebo ve zpráv tak, že zkontrolujete kontrolní zna ky (Flags p íznaky) a související výsledky. Dávka je platná, pokud se u obou kontrol neobjeví žádné p íznaky. Software cobas 6800/8800 vyhlašuje neplatnost výsledk automaticky na základ selhání negativních a pozitivních kontrol. Kontrolní zna ky Tabulka 9 Kontrolní varovné zna ky u negativních a pozitivních kontrol Negativní kontrola Varovná zna ka Výsledek Interpretace ( ) C Q02 Invalid Celá dávka je ozna ena jako neplatná (invalid), pokud je výsledek pro ( ) C neplatný. Pozitivní kontrola Varovná zna ka Výsledek Interpretace WNV (+) C Q02 Invalid Celá dávka je ozna ena jako neplatná (invalid), pokud je výsledek pro WNV (+) C neplatný. Pokud je dávka neplatná, opakujte testování celé dávky v etn vzork a kontrol. Doc Rev. 4.0 19

Vyhodnocení výsledk U každé platné dávky zkontrolujte u všech individuálních vzork, jestli software cobas 6800/8800 neregistruje anebo hlášení neobsahuje varovné zna ky. Interpretace výsledk je následující: Platná dávka m že zahrnovat platné i neplatné výsledky vzork dárc podle toho, zda se u jednotlivých vzork objeví varovné zna ky resp. komentá e nebo ne. Výsledky vzorku jsou platné jen pokud jsou platné p íslušné pozitivní kontroly i negativní kontrola pro doty nou dávku. U každého vzorku jsou sou asn m eny dva parametry: WNV a interní kontrola. Software systému p ipraví zprávu o kone ných výsledcích testu cobas WNV. Krom celkových výsledk zobrazí software cobas 6800/8800 také individuální cílové výsledky, které je t eba interpretovat následovn : Tabulka 10 Cílové výsledky WNV nereaktivní WNV reaktivní Invalid Cílové výsledky pro jednotlivé interpretace cílových výsledk Interpretace Nebyl detekován cílový signál pro WNV; signál IC byl detekován. Byl detekován cílový signál pro WNV; signál IC m že, ale nemusí být detekován. Cílový signál ani signál vnit ní kontroly nebyly detekovány. Procedurální omezení Test cobas WNV byl vyhodnocen pouze p i použití v kombinaci s kontrolní soupravou cobas WNV, soupravou negativní kontroly NHP cobas, inidlem cobas omni MGP, lytickým inidlem cobas omni, inidlem na ed ní vzork cobas omni a promývacím inidlem cobas omni spolu se systémy cobas 6800/8800. Spolehlivost výsledk závisí na dodržování ádných postup p i odb ru a uchovávání vzork i p i manipulaci s nimi. S tímto testem nepoužívejte heparinizovanou plazmu, protože je známo, že heparin p sobí inhibi n na PCR. Detekce RNA WNV závisí na tom, kolik virových ástic je ve vzorku p ítomno, na což má vliv odb r vzork, skladování a manipulace s nimi, faktory pacienta (nap. v k, p ítomnost p íznak ) a/nebo stádium infekce a velikost sm si. I když se vyskytují vzácn, mutace ve vysoce konzervovaných oblastech virového genomu pokryté testem cobas WNV mohou ovlivnit vázání primer anebo sond, a tak vést k selhání detekce viru. Vzhledem k rozdíl m mezi technologiemi se doporu uje, aby uživatelé p ed p echodem od jedné technologie k druhé provedli ve své laborato i studie pro stanovení rozdíl mezi t mito technologiemi. Uživatelé by m li dodržovat své vlastní zásady/postupy. Doc Rev. 4.0 20

Hodnocení neklinických funk ních parametr Klí ové funk ní charakteristiky Vzorky žijících dárc Mez detekce (Limit of Detection, LoD) Sekundární standard /izolát viru spole nosti Roche Meze detekce (LoD) testu cobas WNV pro RNA WNV linie 1 a 2 byly stanoveny pomocí následujícího standardu: Sekundárních standard spole nosti Roche pro WNV linie 1, kalibrovaný oproti kanadskému referen nímu zdravotnickému standardu WNV (Infectious Diseases, Canadian Blood Services, 1800 Alta Vista, Ottawa, Ontario, K1G 4J5) Izolát WNV linie 2 ISS0513 poskytlo st edisko the National Centre for Immunobiologicals Research and Evaluation, Istituto Superiore di Sanità (ISS), ím, Itálie 41 Pro Sekundární standard spole nosti Roche byly p ipraveny t i nezávislé série ed ní linie 1 WNV pomocí normální lidské EDTA plazmy negativní na virus (WNV). Každá ada ed ní byla testována pomocí t í r zných šarží souprav testu cobas WNV s 21 replikáty na šarži, celkem 189 replikát na jednu koncentraci. Pro izolát linie 2 WNV byly p ipraveny panely ed ním zásobního materiálu do normální lidské EDTA plazmy negativní na virus (WNV). Každá série ed ní byla testována pomocí t í r zných šarží souprav testu cobas WNV s 8 replikáty na šarži, celkem 72 replikát na jednu koncentraci. U vir WNV linie 1 a 2 byla použita analýza PROBIT dat kombinovaných ze všech sérií ed ní a šarží inidel pro odhad LoD i spodní a horní meze 95% intervalu spolehlivosti (Tabulka 11). Souhrny míry reaktivity pozorované ve studiích LoD pro linii 1 a 2 uvádí Tabulka 12 a Tabulka 13. Tabulka 11 Výsledky PROBIT analýzy LoD dat ve vzorcích EDTA plazmy s virovým standardem Analyt Jednotky m ení LoD (mez detekce) Dolní 95% mez spolehlivosti Horní 95% mez spolehlivosti WNV linie 1 kopií/ml 12,9 10,8 16,3 WNV linie 2 kopií/ml 6,2 4,8 8,9 Doc Rev. 4.0 21

Tabulka 12 Souhrn míry reaktivity pro WNV linie 1 v EDTA plazm Koncentrace RNA WNV (kopií/ml) Po et reaktivních Po et platných replikát % reaktivních Dolní mez spolehlivosti 95 % (jednostranná) 18,0 187 188 99,5 % 97,5 % 9,0 173 188 92,0 % 88,0 % 4,5 139 188 73,9 % 68,1 % 2,7 93 189 49,2 % 43,0 % 0,9 53 189 28,0 % 22,7 % Tabulka 13 Souhrn míry reaktivity pro WNV linie 2 v EDTA plazm Koncentrace RNA WNV (kopií/ml) Po et reaktivních Po et platných replikát % reaktivních Dolní mez spolehlivosti 95 % (jednostranná) 22,8 72 72 100,0 % 95,9 % 15,2 72 72 100,0 % 95,9 % 7,6 69 72 95,8 % 89,6 % 3,8 64 72 88,9 % 80,8 % 2,3 53 72 73,6 % 63,7 % 0,8 30 72 41,7 % 31,8 % Doc Rev. 4.0 22

Reprodukovatelnost Reprodukovatelnost testu cobas WNV na systémech cobas 6800/8800 byla pro WNV linie 1 zjišt na pomocí následujících standard. Tato studie zahrnovala testování t í panel WNV p i koncentracích p ibližn 18, 9 a 4,5 kopií/ml. Testovány byly následující složky variability: variabilita mezi jednotlivými dny po dobu t í dn variabilita mezi jednotlivými šaržemi s použitím t í r zných šarží inidel testu cobas WNV variabilita mezi jednotlivými p ístroji s použitím t í r zných systém cobas 8800 U každého ze t í t í panel bylo testováno dvacet jedna replikát s celkovým po tem 189 replikát na každou šarži inidel. Veškeré informace o reprodukovatelnosti byly vyhodnoceny výpo tem procentního podílu reaktivních výsledk test pro každou hladinu koncentrace a pro všechny složky variability. Meze dvoustranných 95% interval spolehlivosti pro každou míru reaktivity byly vypo teny pro každou ze t í hladin WNV testovaných po t i dny u t í šarží inidel a t í systém cobas 8800. Test cobas WNV je reprodukovatelný p i použití po dobu v tšího po tu dn s v tším po tem šarží inidel a v tším po tem p ístroj. Souhrn výsledk variability mezi šaržemi inidel uvádí Tabulka 14. Tabulka 14 Souhrn reprodukovatelnosti testu cobas WNV mezi šaržemi inidel Analyt WNV Koncentrace (kopií/ml) 18,0 9,0 4,5 Šarže inidla % reaktivních (po et reaktivních / po et platných replikát ) Dolní mez 95% intervalu spolehlivosti Horní mez 95% intervalu spolehlivosti 1 98,4 % (62/63) 91,5 % 100,0 % 2 100 % (63/63) 94,3 % 100,0 % 3 100 % (63/63) 94,2 % 100,0 % 1 92,1 % (58/63) 82,4 % 97,4 % 2 98,4 % (62/63) 91,5 % 100,0 % 3 85,5 % (53/62) 74,2 % 93,1 % 1 64,5 % (40/62) 51,3 % 76,3 % 2 77,8 % (49/63) 65,5 % 87,3 % 3 79,3 % (50/63) 67,3 % 88,5 % Doc Rev. 4.0 23

Inkluzivita cobas WNV Výkonnost testu cobas WNV p i detekci variant flaviviru WNV byl stanoven testováním jedine ných kultivovaných izolát pro každou variantu. Celkem 10 jednotlivých pozitivních kultivovaných izolát WNV linie 1 bylo testováno po z ed ní normální lidské EDTA plazmy negativní na virus (WNV) p i koncentraci p ibližn 36 kopií/ml. Všech 10 kultivovaných vzork bylo detekováno (Tabulka 15). Pro varianty flaviviru WNV byly testovány celkem 2 pozitivní kultivované izoláty viru japonské encefalitidy (JEV) se 4 replikáty po z ed ní normální lidské EDTA plazmy negativní na virus (WNV). Celkem jeden pozitivní kultivovaný izolát viru Saint Louisské encefalitidy (SLEV), encefalitidy Murray Valley (MVEV) a viru Kunjin (KUNV) byl testován s použitím ty replikát každého izolátu po p íprav logaritmických ed ní normální lidské plazmy s citrátem negativní na virus (WNV). Všechny kultivované izoláty byly detekovány (Tabulka 16). Tabulka 15 Kultivované izoláty WNV linie 1 Varianty flaviviru Koncentrace (kopií/ml) % reaktivních (po et reaktivních / po et testovaných vzork ) WNV 1 36 100,0 % (10/10) Tabulka 16 Kultivované izoláty variant flaviviru WNV ed ní vzorku % reaktivních (po et reaktivních / po et platných testovaných replikát ) JEV SLEV MVEV KUNV 1:1,00E+02 100 % (8/8) 100 % (4/4) 100 % (4/4) 100 % (4/4) 1:1,00E+03 100 % (8/8) 100 % (4/4) 100 % (4/4) 100 % (4/4) 1:1,00E+04 100 % (8/8) 100 % (4/4) 100 % (4/4) 100 % (4/4) 1:1,00E+05 100 % (8/8) 100 % (4/4) 100 % (4/4) 100 % (4/4) 1:1,00E+06 100 % (8/8) 100 % (4/4) 100 % (4/4) 100 % (4/4) 1:1,00E+07 100 % (8/8) 100 % (4/4) 100 % (4/4) 100 % (4/4) Doc Rev. 4.0 24

Analytická specificita Analytická specificita testu cobas WNV byla vyhodnocena na zk íženou reaktivitu u 27 mikroorganism p i koncentraci 10 6 ástic, kopií nebo PFU/ml, v etn 20 virových izolát, šesti bakteriálních kmen a jednoho kvasinkového izolátu (Tabulka 17). Mikroorganismy byly p idány do normální lidské EDTA plazmy negativní na virus (WNV) a testovány bez WNV a s WNV p idaným v koncentraci p ibližn 3 x LoD testu cobas WNV. U testovaných mikroorganism nedocházelo ke zk ížené reakci s testem cobas WNV ani k jeho narušování. Tabulka 17 Mikroorganismy testované na analytickou specificitu Viry Flavivirus Baktérie Kvasinky Adenovirus 5 Virus hore ky Dengue typ 1 Escherichia coli Candida albicans Cytomegalovirus Virus Usutu* Propionibacterium acnes Virus Epstein-Barrové Herpes simplex virus typ 1 Herpes simplex virus typ 2 Virus hepatitidy A Virus hepatitidy B Virus hepatitidy C Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus viridans Staphylococcus haemolyticus Virus hepatitidy E Virus hepatitidy G Virus selhání lidské imunity (HIV-1 skupiny M) Virus selhání lidské imunity (HIV-2) Lidský T-bun ný lymfotropní virus typ I Lidský T-bun ný lymfotropní virus typ II Lidský papilloma virus 6B Virus ch ipky A Virus Chikungunya Varicella zoster virus * Zk ížená reaktivita p i testování bez p idaného viru WNV v d sledku homologie sekvence nukleotidu s WNV. Test cobas WNV m že zk ížen reagovat s klinicky relevantními viry náležícími do skupiny vir Flaviviridae. Vzorky plazmy z každého stavu onemocn ní (Tabulka 18) byly testovány bez WNV a s WNV p idaným v koncentraci p ibližn 3 x LoD testu cobas WNV. U t chto stav onemocn ní nedocházelo ke zk ížené reakci s testem cobas WNV ani k jeho narušování. Tabulka 18 Vzorky onemocn ní testované na analytickou specificitu Onemocn ní Adenovirus typ 5 Virus hepatitidy A Lidský T-bun ný lymfotropní virus typ II Cytomegalovirus Virus hepatitidy B Virus Herpes simplex typ 1 Virus hore ky Dengue Virus hepatitidy C Herpes simplex virus typ 2 Virus Epstein-Barrové Lidský T-bun ný lymfotropní virus typ I Virus selhání lidské imunity (HIV-1) Doc Rev. 4.0 25

Analytická specificita interferen ní látky Endogenní interferující látky Vzorky plazmy s abnormáln vysokými úrovn mi triglycerid (až do 35,3 g/l), hemoglobinu (až do 4,7 g/l), nekonjugovaného bilirubinu (až do 0,21 g/l), albuminu (až do 61,3 g/l) nebo lidské DNA (až do 0,004 g/l) byly testovány bez WNV a s p idáním WNV p i koncentraci p ibližn 3 x LoD testu cobas WNV. Vzorky obsahující tyto endogenní látky nenarušovaly senzitivitu ani specificitu testu cobas WNV. Exogenní interferující látky Vzorky negativní lidské EDTA plazmy negativní na virus (WNV) obsahující abnormáln vysoké koncentrace lék (Tabulka 19) byly testovány bez WNV a s WNV p idaným v koncentraci p ibližn 3 x LoD testu cobas WNV. Tyto exogenní látky nenarušovaly senzitivitu ani specificitu testu cobas WNV. Tabulka 19 Klinické vzorky testované s léky Název testovaného léku Acetaminofen Kyselina acetylsalicylová Kyselina askorbová Atorvastatin Fluoxetin Ibuprofen Loratadin Nadolol Naproxen Paroxetin Fenylefrin hydrochlorid Sertralin Koncentrace 1324 µmol/l 3620 µmol/l 342 µmol/l 600 µg Eq/l 11,2 µmol/l 2425 µmol/l 0,78 µmol/l 3,88 µmol/l 2170 µmol/l 3,04 µmol/l 491 µmol/l 1,96 µmol/l Doc Rev. 4.0 26

Korelace Vyhodnocení výkonnosti testu cobas WNV ve srovnání s testem cobas TaqScreen WNV Výkonnost testu cobas WNV a testu cobas TaqScreen WNV byla porovnána s použitím 100 jednotlivých vzork EDTA plazmy pozitivní na NAT, které byly testovány ne ed né a z ed né v pom ru 1:6. Navíc bylo ob ma metodami testováno100 ne ed ných vzork EDTA plazmy negativních na WNV. Negativní vzorky na WNV vykázaly 100% specificitu a poskytly 100 nereaktivních výsledk ze 100 vzork u obou metod. Výsledky obou metod u pozitivních vzork souhlasily na základ McNemarova testu, což prokázalo, že výkonnost testu cobas WNV a testu cobas TaqScreen WNV je ekvivalentní (Tabulka 20). Tabulka 20 Korelace mezi pozitivními vzorky Test cobas TaqScreen WNV Metody cobas WNV Výsledky WNV Ne ed ný Z ed ný 1:6 Nereaktivní Nereaktivní 0 0 Reaktivní Nereaktivní 0 1* Nereaktivní Reaktivní 0 1* Reaktivní Reaktivní 100 98 Celkem 100 100 p hodnota McNemarova testu, (dvoustranný interval, = 0,05) 1,0 1,0 * Stejný vzorek byl testován ne ed ný (< 100 kopií/ml Národním genetickým institutem s použitím testu WNV RNA SuperQuant) a u obou test byl reaktivní. Selhání celého systému Míra selhání celého systému testu cobas WNV byla zjišt na testováním 100 replikát EDTA plazmy s p idaným virem WNV. Tyto vzorky byly testovány p i cílové koncentraci p ibližn 3 x LoD a byly analyzovány zvláš bez ed ní. Studie byla provedena pomocí systému cobas 8800 s p ístrojem cobas p 680 (pipetování a smíchávání). Z výsledk této studie vyplynulo, že všechny replikáty byly reaktivní pro každý cílový virus WNV, což znamená výslednou míru selhání celého systému ve výši 0 %. Dvoustranný 95% p esný interval spolehlivosti byl 0 % pro dolní mez a 3,62 % pro horní mez [0 %: 3,62 %]. Doc Rev. 4.0 27

Kadaverózní vzorky Senzitivita Klinická senzitivita testu cobas WNV pro RNA WNV byla vyhodnocena testováním celkem 60 jednotlivých virov negativních kadaverózních vzork, z nichž 35 bylo klasifikováno jako st edn hemolyzované (slámov žlutá až r žová barva) a 25 jako siln hemolyzované ( ervená až hn dá barva). Navíc bylo testováno celkem 60 jednotlivých virov negativních vzork žijících dárc. Všechny kadaverózní vzorky a vzorky žijících dárc byly rovnom rn rozd leny mezi t i šarže inidel a p t skupin pro p idání klinických vzork (WNV) se 12 vzorky na každou skupinu. Ke každému kadaveróznímu vzorku a vzorku žijícího dárce byly p idány jedine né klinické vzorky (WNV) p i koncentraci p ibližn 5 x LoD p íslušného vzorku. Každý kadaverózní vzorek byl v p ístroji z ed n 1:5,6 roztokem pro ed ní vzork cobas omni a zpracován postupem pro testování kadaverózních vzork. Všechny kadaverózní vzorky i vzorky žijících dárc vykázaly 100% míru reaktivity (95% interval spolehlivosti: 94,0 100 %). Klinická senzitivita pozorovaná u kadaverózních vzork odpovídala senzitivit zjišt né Fisherovým exaktním testem u vzork žijících dárc ; souhrn uvádí Tabulka 21. Tabulka 21 Souhrn míry reaktivity kadaverózních vzork EDTA plazmy a vzork EDTA plazmy žijících dárc Kadaverózní vzorek Vzorek žijícího dárce Analyt % reaktivních (po et reaktivních / po et testovaných vzork ) % reaktivních (po et reaktivních / po et testovaných vzork ) WNV 100 % (60/60) 100 % (60/60) Fisher v exaktní test, hodnota p ( = 0,05) Míra reaktivity nevykazuje významné rozdíly (p = 1,000) Doc Rev. 4.0 28

Specificita Specificita testu cobas WNV u kadaverózních vzork EDTA plazmy a séra byla vyhodnocena a srovnána se specificitou vzork žijících dárc testováním 64 jednotlivých kadaverózních vzork EDTA plazmy, z nichž 40 vzork jednotlivých dárc bylo klasifikováno jako st edn hemolyzované (slámov žlutá až r žová barva) a 24 jako siln hemolyzované ( ervená až hn dá barva), 62 jednotlivých kadaverózních vzork séra, z nichž 42 vzork jednotlivých dárc bylo klasifikováno jako st edn hemolyzované a 20 jako siln hemolyzované, 60 individuálních sérov negativních vzork plazmy žijících dárc a 60 individuálních vzork plazmy od živých dárc. Studie byla provedena se t emi nezávislými šaržemi inidel pro test cobas WNV. Každý kadaverózní vzorek byl v p ístroji z ed n 1:5,6 roztokem pro ed ní vzork cobas omni a zpracován postupem pro testování kadaverózních vzork. Všechny kadaverózní vzorky a vzorky žijících dárc, jak EDTA plazmy, tak i séra, byly nereaktivní se 100% specificitou. Specificita pozorovaná u kadaverózních vzork odpovídala specificit zjišt né Fisherovým exaktním testem ( = 0,05) u vzork žijících dárc ; souhrn uvádí Tabulka 22. Tabulka 22 Souhrn specificity kadaverózních vzork EDTA plazmy a séra a vzork EDTA plazmy a séra žijících dárc Matrice Typ vzorku Po et nereaktivních vzork Po et platných vzork % nereaktivních Dvoustranný 95% interval spolehlivosti Kadaverózní dárce 64 64 100 % 94,4 % 100 % EDTA plazma Žijící dárce 60 60 100 % 94,0 % 100 % Kadaverózní dárce 62 62 100 % 94,2 % 100 % Sérum Žijící dárce 60 60 100 % 94,0 % 100 % Celkové výsledky s použitím Fisherova exaktního testu ( = 0,05) Specificita kadaverózních vzork a vzork žijících dárc je ekvivalentní: Fisher v exaktní test, p = 1,000 Doc Rev. 4.0 29

Reprodukovatelnost cobas WNV Reprodukovatelnost testu cobas WNV na systémech cobas 6800/8800 byla zjišt na s použitím 20 kadaverózních vzork EDTA plazmy (st edn a siln hemolyzovaných) s p ídavkem sekundárního standardu Roche pro RNA WNV p i koncentraci p ibližn 5 x LoD testu cobas WNV. Výsledky byly srovnány s reprodukovatelností zjišt nou pomocí 20 vzork EDTA plazmy žijících dárc s p ídavkem sekundárního standardu Roche p i koncentraci p ibližn 5 x LoD testu cobas WNV. Testovány byly následující složky variability: variabilita mezi jednotlivými dny po dobu 6 dn variabilita mezi jednotlivými šaržemi s použitím t í r zných šarží inidel testu cobas WNV Jeden replikát byl testován s každou ze 3 šarží inidel po dobu 6 dn, celkem 18 replikát na každý kadaverózní vzorek a vzorek žijícího dárce. Každý kadaverózní vzorek byl v p ístroji z ed n 1:5,6 roztokem pro ed ní vzork cobas omni a zpracován postupem pro testování kadaverózních vzork. Všechna platná data studie reprodukovatelnosti byla vyhodnocena porovnáním míry reaktivity vzork žijících dárc a kadaverózních vzork (dvoustranné 95% intervaly spolehlivosti) pro všechny složky variability. Hodnota p Fisherova exaktního testu byla vypo ítána pro testování statistické významnosti rozdílu mezi podíly reaktivních výsledk pozorovaných u kadaverózních vzork a vzork od živých dárc. Nebyly pozorovány žádné významné rozdíly. Test cobas WNV je reprodukovatelný p i použití po dobu n kolika dn s použitím n kolika šarží inidel u kadaverózních vzork a vzork od živých dárc. Souhrn výsledk variability mezi šaržemi inidel uvádí Tabulka 23. Tabulka 23 od žijících dárc Souhrn reprodukovatelnosti testu cobas WNV mezi jednotlivými šaržemi inidel u kadaverózních vzork a vzork Analyt Šarže inidla Typ vzorku % reaktivních (po et reaktivních / po et platných replikát ) Dolní mez 95% intervalu spolehlivosti Horní mez 95% intervalu spolehlivosti Významný rozdíl podle Fisherova exaktního testu ( = 0,05) WNV 1 2 3 Kadaverózní 100,0 % (120/120) 97,0 % 100,0 % hodnota p = Žijící dárce 100,0 % (120/120) 97,0 % 100,0 % 1,0000 Kadaverózní 100,0 % (120/120) 97,0 % 100,0 % hodnota p = Žijící dárce 100,0 % (120/120) 97,0 % 100,0 % 1,0000 Kadaverózní 100,0 % (120/120) 97,0 % 100,0 % hodnota p = Žijící dárce 100,0 % (120/120) 97,0 % 100,0 % 1,0000 Doc Rev. 4.0 30