UTRASONOGRAFICKÁ DIAGNOSTIKA GRAVIDITY U KLISEN

Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat UTRASONOGRAFICKÁ DIAGNOSTIKA GRAVIDITY U KLISEN Diplomová práce Brno, 2006 Vedoucí diplomové práce: Ing. Martin Hošek, Ph. D. Vypracovala: Lucie Zavadilová

Prohlašuji, že jsem vypracovala diplomovou práci podle metodických pokynů vedoucího diplomové práce samostatně. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně MZLU v Brně a byla zpřístupněna ke studijním účelům. Lucie Zavadilová

Dovoluji si touto cestou poděkovat vedoucímu diplomové práce Ing. Martinu Hoškovi, Ph. D. za odborné vedení a instrukce při vypracování diplomové práce.

Annotation This work analyse the results of artifical insemination practised by using of the ultrasound set. The ultrasound examination is necessary to control the whole reproductive cycle in the mare including: the pregnancy determination, the twins detection, the pregnancy failure, the uterus pathology and the other reproduktive problems and cycle changes on ovaries and uterus. The insemination was practised during the years 1995 2005 in the field conditions of horse breeding in Czech Republic. The average pregnancy rates during the eleven years were 74,0 %, the pregnancy rates after insemination of fresh semem were 79,2 % and after the frozen semen 51,1 %. During the period 2000 až 2005 the pregnancy rates after fresh semen were 82,2 % by the end of the season and 60,8 % per cycle. In the years 1995 2005 7,8 % pregnancies were detected as the twin pregnancy. The average rates of embryonic mortality were 7,4 %. The rates of insemination doses used were 2,5 per inseminated mare and 3,4 per pregnant mare. Rates of the ultrasound examination were 8,2 per inseminated mare and 10,4 per pregnant mare. Using of the ultrasound improved the method of insemination and it is necessary for practical use in the field and for the modern biotechnical methods as well.

OBSAH 1. Úvod. 8 2. Literární přehled 9 2. 1. Morfologická stavba reprodukční soustavy klisny 9 2. 2. Pohlavní cyklus klisny..... 10 2. 2. 1. Fáze pohlavního cyklu.10 2. 3. Primární hormony reprodukce a jejich účinky 12 2. 3. 1. Hypotalamové hormony.. 13 2. 3. 2. Gonadotropní hormony 13 2. 3. 3. Ovariální hormony... 14 2. 3. 4. Děložní prostaglandin.. 14 2. 4. Březost klisny. 15 2. 4. 1. Diagnostika březosti 16 2. 5. Sonografie... 16 2. 5. 1. Princip sonografie... 16 2. 5. 2. Sonografické vyšetření klisny.18 2. 5. 2. 1. Sledování průběhu říje 18 2. 5. 2. 1. 1. Sonografie vaječníků.. 19 2. 5. 2. 1. 2. Sonografie dělohy... 20 2. 5. 2. 2. Sonografická diagnostika březosti. 22 2. 5. 2. 2. 1. Sonografická diagnostika a redukce dvojčat.. 24 2. 5. 2. 2. 2. Embryonální a fetální mortalita.. 25 2. 6. Úroveň březosti po inseminaci. 26 2. 6. 1. Úroveň březosti po inseminaci čerstvým a mraženým spermatem a po přirozené plemenitbě 26 2. 6. 1. 1. Čerstvé a zmrazené sperma.. 26 2. 6. 1. 2. Úroveň březosti.26 2. 6. 1. 3. Četnost výskytu dvojčat a embryonální mortality 28 3. Cíl práce 30 4. Materiál a metodika.. 31

5. Výsledky.. 32 5. 1. Celkové výsledky inseminace za období 1995 až 2005.. 32 5. 2. Výsledky inseminace čerstvým a mraženým spermatem za období 1995 až 2005.. 32 5. 3. Výsledky inseminace čerstvým spermatem ve sledu prvního až čvrtého říjového cyklu během připouštěcí sezony za období 2000 až 2005 33 5. 4. Četnost výskytu resorpcí a zmetání za období 1995 až 2005 34 5. 5. Četnost výskytu dvojčat za období 1995 až 2005.. 35 5. 6. Počty spotřebovaných inseminačních dávek za období 1995 až 2005. 35 5. 7. Počty provedených sonografických vyšetření za období 2000 až 2005 36 6. Diskuse. 37 6. 1. Počty inseminovaných klisen. 37 6. 2. Výsledky inseminace za období 1995 až 2005.. 38 6. 2. 1. Celkové výsledky inseminace za období 1995 až 2005. 38 6. 2. 2. Výsledky inseminace čerstvým a mraženým spermatem za období 1995 až 2005. 39 6. 2. 3. Výsledky inseminace čerstvým spermatem ve sledu prvního až čvrtého říjového cyklu během připouštěcí sezony za období 2000 až 2005. 40 6. 3. Četnost výskytu resorpcí a zmetání za období 1995 až 2005 41 6. 4. Četnost výskytu dvojčat za období 1995 až 2005..42 6. 5. Počty spotřebovaných inseminačních dávek za období 1995 až 2005 42 6. 6. Počty provedených sonografických vyšetření za období 2000 až 2005.. 43 7. Závěr.. 44 8. Seznam literatury 45 9. Příloha 48

8 1. ÚVOD Přestože umělá inseminace klisen má na našem území dlouhodobou tradici, k jejímu rozvoji a zavedení do plemenářské praxe v širším měřítku došlo teprve v průběhu devadesátých let. Tento rozvoj byl umožněn až nástupem využívání sonografické techniky v gynekologii hospodářských zvířat. Do té doby inseminace, i přes svůj zdravotní přínos, nebyla svými výsledky schopna konkurovat přirozené plemenitbě. V sedmdesátých a osmdesátých letech byla v ČR prováděna zejména v rámci výzkumu. Fyziologické zvláštnosti reprodukčního cyklu klisen, jako vysoká variabilita v délce trvání říje a v době ovulace během říje, sezónnost reprodukčního cyklu spojená v množstvím neplnohodnotných říjí a poměrně častý výskyt nežádoucích dvojčat, vyžadují v procesu intenzivní reprodukce pečlivou kontrolu. Tato kontrola není bez pomoci sonografu možná. Sledování průběhu říje pouze palpačním vyšetřením vaječníků a pozorováním vnějších příznaků říje je velmi nepřesné a vede k víceméně nahodilému provádění inseminace. Samotný úkon inseminace není nijak obtížný, ale stanovení vhodné doby pro inseminaci vyžaduje odborné zhodnocení všech dostupných informací. Sonografické zobrazení reprodukčních orgánů je u klisny velmi zřetelné a přehledné a diagnostika jednotlivých jevů je dobře propracována. Výhody využití sonografu umocňuje (v rámci druhů hospodářských zvířat unikátní) možnost diagnostiky gravidity ještě před případným nástupem následující říje. Tato včasná diagnostika březosti má v souvislosti s možností redukce dvojčat právě u klisen největší opodstatnění. V neposlední řadě jsou pomocí sonografu zjišťovány patologické stavy na reprodukčních orgánech, které brání zabřeznutí a které dříve nebylo možno jednoznačně a včas diagnostikovat. V návaznosti na uvedené fyziologické aspekty má sonografie nesporný ekonomický význam. Je prováděna u všech plemen koní. Sonografická diagnostika je základní podmínkou pro rozvoj dalších biotechnických metod, jako jsou embryotransfer a různé formy manipulace s vaječnými buňkami a embryi a dnes také klonování koní. V současné době je inseminace za pomoci sonografické techniky široce využívanou metodou. Je součástí plemenářských opatření, jejichž hlavním cílem je produkce vysoce výkonných sportovních koní. Proto je vhodné zhodnocení jejích dosavadních výsledků a celkového přínosu pro plemenitbu koní.

9 2. LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1. Morfologická stavba reprodukční soustavy klisny Funkce samičích pohlavních orgánů spočívá v produkci pohlavních buněk a hormonů a v zajištění páření, dále slouží jako prostředí poskytující ochranu a výživu pro vyvíjející se zárodek a plod od oplození vajíčka až do porodu. Samičí pohlavní orgány se rozdělují na vnitřní, tj. vaječník, vejcovod, dělohu, pochvu a poševní předsíň a zevní, k nimž patří vulva a klitoris (Kresan a kol., 1979). Vaječník (ovarium) je párová pohlavní žláza, v níž se tvoří a vyvíjejí jednak samičí pohlavní buňky, jednak pohlavní hormony, estrogeny a progesteron. Nachází se v pánevní dutině, má tuhoelastickou konzistenci, ledvinovitý tvar a délku 5 8 cm (Kresan a kol., 1979). Ovarium je pokryto pobřišnicí kromě malého okrsku zvaného ovulační jamka (Jelínek a kol., 2003). Ke kraniálnímu konci vaječníku se třásněmi připojuje vejcovod. Vejcovod (tuba uterina) je párová, klikatě probíhající trubička sloužící k zachycení ovulované vaječné buňky a k jejímu převedení do dělohy. V počátečním úseku vejcovodu se také dokončuje vývoj vaječné buňky a dochází zde k oplození. Nálevkou s třásněmi se vejcovod přikládá k vaječníku, druhý konec vejcovodu se děložním ústím otevírá do děložního rohu. Děloha (uterus) je nepárový trubicovitý orgán, sloužící k vývoji nového jedince z oplozeného vajíčka až do narození mláděte. Skládá se z děložního krčku, děložního těla a děložních rohů. Děloha klisny je dvojrohá nerozdělená, má dva rohy a tělo s jednotnou dutinou, přecházející v kanál krčku. Děložní rohy jsou dlouhé 20 25 cm, kraniálně se rozbíhají a v mírném oblouku se zvedají nahoru. Děložní tělo navazuje kaudálně na děložní rohy a je dlouhé 20 25 cm. Děložní krček je tuhý válcovitý orgán dlouhý 6 7 cm. Jeho středem prochází úzký kanál, trvale uzavřený stahem tlusté vrstvy hladké svaloviny. Fyziologicky se kanál krčku otevírá jen při porodu a v období říje. Kanál děložního krčku končí kaudálně úzkým otvorem zevní děložní branky. Ta se nachází na vrcholu tzv. děložního čípku, vzniklého částečným vchlípením děložního krčku do pochvy.

10 Pochva (vagina) je pářící orgán a porodní cesta klisny a má charakter široké trubice dlouhé 15 20 cm. Poševní předsíň (vestibulum vaginae) je kaudálním pokračováním pochvy a slouží zároveň jako vývodná močová cesta. Je dlouhá 10 12 cm. Vulva je vstupem do pohlavního ústrojí samice a spolu s clitorisem tvoří jeho zevní část (Kresan a kol., 1979). 2. 2. Pohlavní cyklus klisny Pohlavní (říjový) cyklus je fyziologický děj, při němž se v celém organismu, především však v pohlavních orgánech, periodicky vytvářejí příznivé podmínky pro oplození vajíčka a pro vývoj zárodku a plodu (Kresan a kol., 1979). Klisna je zvíře sezónně polyestrické. Během určitého ročního období u ní probíhá několik pohlavních cyklů, které jsou pak vystřídány různě dlouhým klidovým obdobím, anestrií (Kudláč a kol., 1987). Pohlavní cyklus je u klisny výrazně ovlivňován fotoperiodismem. V průběhu roku se první říje zpravidla dostavují na začátku jara, příznaky jsou méně zřetelné a trvají relativně dlouho. S pokračujícím jarem se průběh pohlavních cyklů zpravidelňuje, říje se stává zřetelnější a trvá kratší dobu (Jelínek a kol., 2003). 2. 2. 1. Fáze pohlavního cyklu V průběhu pohlavního cyklu vznikají složité morfologicko funkční změny na pohlavních orgánech a v celém organismu samice a dochází ke změnám v jejím chování. Podle těchto změn se zřetelem k převeze produkce specifického pohlavního hormonu se pohlavní cyklus rozděluje na fáze: - estrogenní neboli proliferační : proestrus (období přípravy k říji) a estrus (vlastní říje). - progesteronovou neboli sekreční : metestrus (období po říji) a diestrus (období mezi říjemi, metestrem a proestrem), (Kudláč a kol., 1987).

11 Proestrus. Pod vlivem FSH uvolňovaného z adenohypofýzy dochází k růstu a zrání folikulů a současně pod vlivem prostaglandinu F2α probíhá regrese žlutého tělíska z předchozího cyklu. Ve zrajících folikulech se tvoří estrogenní hormon 17 β estradiol. Pod jeho vlivem se zvyšuje přívod krve do pohlavního ústrojí, dochází k edematoznímu prosáknutí sliznic, proliferaci žlázek a zvyšuje se dráždivost svalové vrstvy vývodných pohlavních cest.uvolňuje se tonus hymenálního prstence, otevírá se děložní krček a začíná tvorba cervikálního hlenu. Hlavní psychickou změnou je zvýšená erotizace, projevy pohlavního pudu a neklid samice. Estrus. Dochází k dozrávání folikulů, dokončení proliferačních změn na pohlavním ústrojí, vrcholí pohlavní podráždění a dostavuje se hlavní fenomén říje, tj. svolnost k páření. Vyvrcholením říje vyvolané předchozím krátkodobým zvýšením adenohypofyzárního luteinizačního hormonu (LH) je dozrání folikulu a jeho ovulace. S ovulací rychle mizí příznaky říje a na místě prasklého folikulu se začínají vytvářet žlutá tělíska. Metestrus je charakterizován zánikem vnitřních i vnějších příznaků říje. Na ovariích se vyvíjí jedno nebo více žlutých tělísek, v nichž začíná produkce progesteronu. Diestrus. Dochází k dokončení vývoje žlutého tělíska. Jeho další osud je závislý na tom, zda klisna zabřezla či nikoliv. V pozitivním případě vyvíjející se blastocysta dráždí receptory děložní sliznice, nedojde k uvolňování luteolyticky působícího prostaglandinu F2α, žluté tělísko produkuje progesteron a garantuje další nerušený vývoj embrya a plodu a průběh březosti až do porodu. V případě, že nedojde k oplození a samice nezabřezne, endometrium začíná kolem 15. dne produkovat prostaglandin, který vyvolá regresi žlutého tělíska, přeruší se produkce progesteronu a je umožněn vývoj dalšího pohlavního cyklu nastupuje proestrus (Jelínek a kol., 2003). U klisny je průměrná délka pohlavního cyklu 21 dní, hraniční hodnoty jsou udávány mezi 16 30 dny. Délka pohlavního cyklu záleží na délce říje. S třítýdenním cyklem lze počítat jen u těch klisen, jejichž říje netrvá déle než 5 dní. Je-li říje delší, prodlužuje se

12 v přímé závislosti i délka pohlavního cyklu. Začátek příští říje se nejlépe stanoví připočtením 16 dnů k poslednímu dni proběhlé říje Říje u klisny nejčastěji trvá 3 10 dnů. Po porodu se první říje objevuje 4. 7. den a trvá do 10. 13. dne. Optimální doba k zapuštění bývá 9. den. Pokud klisna nezabřezne nebo není zapuštěna, může nastat u kojící klisny laktační anestrus, který končí zpravidla až po odstavu hříběte. Zevní příznaky říje jsou charakterizovány tzv. blýskáním, klisna často močí, je neochotná k práci, v přítomnosti hřebce klidně stojí..zevní pohlavní orgány jsou zduřelejší, sliznice poševní předsíně zarudlá a lze pozorovat výtok táhlého hlenu v malém množství K ovulaci Graafova folikulu dochází asi 24 36 hodin před odezněním zevních příznaků říje. Největší naději na oplození dává zapuštění nebo inseminace klisny krátce před ovulací. Za tímto účelem je doporučitelná rektální kontrola.růstu a zralosti Graafova folikulu. Graafův folikul před ovulací obvykle měří 4 6 cm, vyklenuje se z ovulační jamky nad povrch ovaria, jeho stěna je tenká a obsah zřetelně fluktuuje. Těsně před ovulací lze zjistit zřetelné uvolnění v napětí stěn folikulu. Na děloze jsou charakteristickým příznakem estru častější a silnější kontrakce stěny děložní (Kudláč a kol., 1987). 2. 3. Primární hormony reprodukce a jejich účinky Hormony se podle vztahu k reprodukčním funkcím rozdělují na: - primární hormony reprodukce, tj. hormony bezprostředně řídící pohlavní funkce. Jsou to hypotalamické neurohormony nebo gonadotropiny uvolňující hormony, hypofyzární a extrahypofyzární gonadotropiny a gonadální a placentární sexageny; - sekundární hormony reprodukce, tj. ostatní hormony, které jsou vytvářeny v těle a mají nepřímý vztah k pohlavním funkcím. Řízení pohlavních funkcí je velmi účinně ovlivňováno ještě látkami nehormonální povahy. Patří sem neurotransmitery, prostaglandiny a feromony (Kudláč a kol., 1987). Pro regulaci endokrinních funkcí pohlavních žláz je primárně důležitá osa hypotalamus hypofýza gonády (Jelínek a kol., 2003).

13 2. 3. 1. Hypotalamové hormony Hypotalamové hormony rozdělujeme na uvolňovací a inhibiční hormony, které řídí činnost adenohypofýzy, a na neurohypofyzární hormony. Gonadotropiny uvolňující hormony (Gn-RH) : Luteinizační hormony uvolňující hormon (LH) uvolňuje LH i FSH, proto je někdy označován jako FSH/LH RH. Prolaktin uvolňující hormon (PRH). Neurohypofyzární hormony: Oxytocin způsobuje u samice kontrakce hladké svaloviny dělohy a myoepiteliálních buněk mléčné žlázy. Ovlivňuje transport gamet, při porodu vypuzení plodu a ejekci mléka. 2. 3. 2. Gonadotropní hormony Gonadotropní aktivita je reprezentována třemi pohlavně nespecifickými hormony. Folikuly stimulující hormon (FSH).Fyziologickým účinkem FSH u samic je stimulace růstu a zrání folikulů v ovariích. Luteinizační hormon (LH). Navazuje na účinek FSH a přivodí u samice dozrání a ovulaci folikulů. Společně s FSH vyvolává sekreci estrogenů. Dále působí růst luteinové tkáně a stimuluje formování žlutého tělíska. Luteotropní hormon (LTH). Je nutný k vyvolání a udržení laktace.

14 Kromě gonadotropinů hypofyzárního původu jsou známy gonadotropiny extrahypofyzárního původu. Koňský sérový gonadotropin PMSG. Je vytvářen endometriem od 40. do 90. dne gravidity. Jeho maximální množství lze zjistit okolo 70. dne. Jeho účinek je analogický účinku hypofyzárního FSH a LH, tudíž je schopen navodit zrání a ovulaci folikulů. Humánní choriový gonadotropin HCG. Je produkován v choriových buňkách placenty ženy. Účinek HCG ja analogický hypofyzárnímu LH. V humánní i veterinární gynekologii je používán HCG s komerčním názvem Pregnyl. 2. 3. 3. Ovariální hormony Samičí pohlavní hormony vytvářené v průběhu cyklu na ovariích jsou estrogeny, progesteron a relaxin. Estrogeny jsou vytvářeny zrajícím folikulem a intersticiem vaječníku, rozeznáváme tři základní přirozené estrogeny 17- β estradiol, estron a estriol. Fyziologickým účinkem estrogenů je stimulace růstu vývodných pohlavních cest, vytvoření sekundárních pohlavních znaků a růst a vývoj vývodného systému mléčné žlázy. Vyvolávají psychické příznaky říje a podmiňují morfologické a funkční změny na vejcovodech, děloze a pochvě během cyklu. Progesteron se vytváří ve žlutém tělísku. Svým účinkem dokončuje změny na pohlavním ústrojí vyvolané estrogeny a je nezbytný pro vznik a zachování březosti. Významnou úlohu má při vývoji alveolárního systému mléčné žlázy, při vzniku mateřského pudu a při ovulaci folikulů. Estrogeny a progesteron se vytvářejí v relativně velkých množstvích za březosti v placentě a mají u březích zvířat velký význam pro normální průběh gravidity a vznik porodu. Během prvních asi 6 týdnů zůstává původní graviditní žluté tělísko plně zachováno, později dochází k jeho regresi. Mezi 6. až 20. týdnem březosti dochází pod vlivem sérového gonadotropinu a hypofyzárního FSH k růstu a zrání folikulů a k jejich ovulaci nebo luteinizaci, takže na ovariích se postupně vytváří značný počet tzv. přídatných žlutých tělísek, která vytvářejí progesteron. Od pátého měsíce, kdy z krve vymizí sérový gonadotropin, regresují jak větší folikuly, tak žlutá tělíska, takže v pozdních stadiích gravidity jsou na vaječnících přítomny jen zbytky luteální tkáně.

15 Relaxin. Jeho fyziologickým účinkem je příprava porodních cest k porodu a stimulace růstu mléčné žlázy (Kudláč a kol., 1987). 2. 3. 4. Děložní prostaglandin Prostaglandiny jsou skupinou biologicky aktivních lipidů, zasahujících do průběhu reprodukčních procesů. Mají hormonům podobný účinek a jsou také označovány jako tkáňové hormony. Nejdůležitějším je PGF2α, vytvářený v endometriu. Je schopen navodit rychlou regresi žutého tělíska a zastavit tak produkci progesteronu. Uplatňuje se také při vzniku porodu. žluté tělísko je citlivé vůči PGF2α jen v určité době pohlavního cyklu, u klisny 5. až 16. den. V praxi je používán jeho syntetický analog Remophan (Kudláč a kol., 1987). 2. 4. Březost klisny Březost klisny trvá v průměru 333 dní s hraničními hodnotami 310 360 dní (Jelínek a kol., 2003). K oplození dochází v horní části vejcovodu, rýhující se zygota sestupuje do dělohy 3. až 5. den (Kudláč a kol., 1987). Ball (2000) uvádí sestup zárodku do dělohy ve stáří 5,5 dne. Blastocysta do 16. dne od oplození migruje v děloze (z jednoho rohu do druhého i několikrát denně) a je vyživována děložní tekutinou, tzv. uterinním mlékem. Do 16. dne má kulovitý tvar. K implantaci do děložní sliznice dochází až v 90 až 100 dnech březosti. Placenta má klky rozeseté po celém povrchu choria. Od 25. do 40. až 50. dne se na placentě vyskytují endometriální kalíšky. Jsou zdrojem gonadotropinů (PMSG) a účastní se na endokrinní regulaci březosti klisny. Březí děloha mění s vývojem zárodku svůj tvar i velikost a zhruba od 60. dne klesá do dutiny břišní a spolu s ní i vaječníky (Kudláč a kol., 1987).

16 2. 4. 1. Diagnostika březosti Graviditu lze diagnostikovat četnými metodami, které v zásadě rozdělujeme na klinické a laboratorní. U klisen je využíváno pouze vnitřní rektální vyšetření. Březí dělohu lze pro její typický tvar rozpoznat palpací, ale dnes je již většinou ke spolehlivé diagnostice gravidity používána ultrasonografická metoda. 2. 5. Sonografie 2. 5. 1. Princip sonografie Sonografie využívá ultrazvukové vlnění. Energie zvuku je harmonické kmitání částeček prostředí, kterým se zvuk šíří, kolem rovnovážné polohy. Frekvence se udává v hertzech (Hz), přičemž 1 kmit za sekundu se rovná 1 Hz a milión kmitů za sekundu 1 megahertz (MHz). Slyšitelný zvuk má frekvenci 20 až 20 000 Hz, ultrazvuk je definován frekvecí 20 000-10 10 Hz. Pro diagnostické lékařské přístroje se používá ultrazvuk o frekvenci 1 až 10 MHz. V ultrazvukové praxi je používán pojem vlnová nebo akustická impedance, která je definována jako součin hustoty prostředí (tkání) a rychlosti šíření ultrazvuku v prostředí. Největší je pro pevné látky, nižší pro kapaliny a nejnižší pro plyny. Na rozdílu akustických impedancí prostředí (tkání) tvořících určité rozhraní bude mimo jiné záviset výsledné echo (obraz rozhraní). Při dopadu ultrazvukového paprsku na rozhraní mezi dvěma prostředími s rozdílnými hustotami bude část paprsku odražena a část projde přes přechod a může být odražena od hlouběji uložených přechodů. Ultrazvukový paprsek se ale téměř kompletně odrazí od přechodu s plynem, tudíž je při použití přístroje nezbytné vyloučit vzduch mezi sondou a vyšetřovanou oblastí (aplikací gelu, oleje apod.). Ultrazvukové vlny procházející materiálem (vyšetřovanou oblastí) jsou absorbovány, a tím jejich intenzita klesá. Velikost absopce je ovlivněna druhem tkáně (zejména obsahem kolagenu) a její hustotou. Mezi prostředí s malou intenzitou absorpce patří tkáně, které obsahují vysoké procento vody při relativně nízkém obsahu bílkovin (např. krev, moč, plodové vody, folikulární tekutina), nízká absorpce je také v tukové tkáni. S úbytkem vody

17 nebo s přibývajícím množstvím bílkovin a vaziva ve tkáni se absorpce zvyšuje (sval, kůže, šlacha, chrupavka, jizvy, srůsty), velmi vysoká je v kosti. Při konstrukci lékařských ultrazvukových přístrojů je využíván nepřímý piezoelektrický jev, při kterém krystal, na jehož povrch je střídavě a velmi rychle přiváděn pozitivní a negativní elektrický náboj, se smršťuje a roztahuje kmitá. Čím je krystal tenčí, tím generuje ultrazvukové vlnění o vyšší frekvenci. Měnič, hlavní součást ultrazvukové sondy, se vyrábí z tenkého výbrusu umělé keramiky (piezokeramiky), která je polykrystalická a má silné elektrostrikční vlastnosti. Ultrazvukové vlny vycházející z kmitajícího krystalu (sondy) do vyšetřované oblasti se na přechodech jednotlivých tkání a tekutin v závislosti na jejich akustické impedanci zčásti (eventuálně zcela) odrážejí a zčásti pronikají hlouběji, přičemž dochází k jejich různě velké absorpci. Zachycené ultrazvukové vlny jsou převáděny zpět na elektrický signál, který je dále zpracován a znázorňován ve vizuální formě na monitoru. Echa rozdílných intenzit se na televizní obrazovce zobrazí jako různě zářivé body pole. Zářivost (světlost) těchto bodů je reprezentována různým stupněm šedi od bílé až po černou. Bílou barvou se zobrazují echa nejvyšší intenzity v případě odrazu paprsků od vysoce echogenní tkáně (kost). Černě se zobrazí echa s nejnižší intenzitou, případně anechogenní oblasti, které neposkytují žádné odrazy (tekutina). K vyjádření relativní echogenity a tím i struktury vyšetřovaného útvaru se používají termíny hypoechogenní, hyperechogenní a izoechogenní. Echogenita určité tkáně se fyziologicky může měnit (např. endometrium v průběhu pohlavního cyklu), a tak je možné rozpoznat její stav. Pro transrektální vyšetření velkých hospodářských zvířat je nejčastěji využíván lineární B způsob zobrazení. Je charakterizován lineárním (obdélníkovým) tvarem obrazu, který se získává pomocí lineární sondy s krystaly uspořádanými v řadě. Nejvhodnější je sonda s frekvencí 5 MHz, která nabízí optimální rozlišení vzhledem k hloubce a uložení sledovaných objektů. Ultazvukový diagnostický přístroj (sonograf, ultrazvukový scanner) se skládá ze sondy (výkonné části) a vlastní přístrojové jednotky. Ta se skládá z elektronického bloku, monitoru, ovládací klávesnice a přídavných zařízení. Vysílač vytváří elektrický signál k buzení piezoelektrických krystalů sondy. Ty po odvysílání ultazvukového pulsu přijímají odražený ultrazvukový paprsek a přeměňují ho zpět na elektrický signál, který je veden kabelem sondy do přijímače. Tam je upraven, přenesen do monitoru a zobrazen na obrazovce.

18 S ohledem na účel použití se vyrábějí sonografy stabilní a mobilní. Stabilní sonografy jsou určeny pro specializovaná pracoviště a kliniky, jsou umístěny ve vyšetřovací místnosti a zvířata jsou k nim přiváděna. Jsou rozměrné s hmotností 50 až 250 kg, ale jejich technická výbava je dokonalejší a výsledný obraz kvalitnější. Pro gynekologickou praxi v terénních podmínkách jsou používány mobilní sonografy, z nichž některé v mnohých parametrech dosahují dokonalosti stabilních přístrojů. Jejich hmotnost bývá do 10 kg. Klisny jsou vyšetřovány zpravidla volně stojící, případně ve fixační kleci. Sonda je zaváděna kraniálně v ose zvířete. Pochva, krček a tělo děložní jsou zobrazeny podélně, děložní rohy v příčném průřezu. Na vaječníky je sonda přikládána podélně převážně z mediální strany. Vyšetření nelze provádět venku na přímém slunečním světle (Grygar a Kudláč, 1997). 2. 5. 2. Sonografické vyšetření klisny Sonografické vyšetření klisny je nezbytné k určení vhodné doby pro inseminaci či zapuštění, k detekci patologických stavů v děloze, k diagnostice březosti, ke zjištění přítomnosti dvojčat a k jejich redukci a k diagnostice embryonální a fetální mortality. 2. 5. 2. 1. Sledování průběhu říje Předpokladem pro zabřeznutí je určení vhodné doby k inseminaci klisny. K ovulaci dochází 24 36 hodin před odezněním zevních příznaků říje a nejvhodnější doba k inseminaci je krátce před ovulací (Kudláč a kol., 1987). Müller a kol. (2006) uvádí, že při inseminaci čerstvým spermatem přežívají hřebčí spermie v pohlavním aparátu klisny 48 hodin, při inseminaci mraženým spermatem jen 12-24 hodin. Pokud při inseminaci čerstvým spermatem nedojde k ovulaci do 48 hodin po inseminaci, je nutno inseminaci opakovat. Při inseminaci mraženým spermatem doporučuje opakované vyšetření klisny a přesné načasování doby inseminace. Pokud nedojde k ovulaci, je nutné opakovat inseminaci do 24 hodin. Pycock (2002) doporučuje zapouštění klisen do 48 hodin před ovulací, u inseminovaných klisen provést inseminaci ještě blíže k ovulaci. Franklin (2000) uvádí, že většina klisen ovuluje 24 až 48 hodin před koncem říje. Klisny je třeba

19 vyšetřovat denně ultrazvukem a palpací, až se vyvine na ováriu folikul větší než 35 mm a v děloze se zvýrazní endometriální řasy. Pak je nutné provádět vyšetření každých 6 8 hodin. Pokud klisna při inseminaci mraženým spermatem zovuluje déle než 12 hodin po inseminaci, doporučuje ji inseminovat ještě jednou do 6 hodin po ovulaci. Dále doporučuje sonografické vyšetření klisen ještě 12 hodin po poslední inseminaci pro zhodnocení reakce dělohy na ředidlo, kryoprotektiva, glycerol a semeno obsažené v dávce. Relativně nejspolehlivější pro určení plnohodnotné říje je současné posouzení sonografického a palpačního nálezu na vaječnících, sonografického obrazu dělohy a výsledků její palpace, případně výsledků vaginálního vyšetření. Dále je nezbytné posouzení zevních příznaků říje (Grygar a Kudláč, 1997). 2. 5. 2. 1. 1. Sonografie vaječníků Sonografie umožňuje sledovat růst, zrání a ovulaci folikulů. Růst preovulačního folikulu začíná 5 7 dní před ovulací. V té době má kulovitý tvar a průměr asi 2,5 až 3,5 cm. Zvětšuje se přibližně o 2 3 mm za den a jeho tvar se postupně mění na hruškovitý nebo nepravidelný (viz. obr. č. 5. v příloze). Před ovulací dochází k určitému zesílení stěny folikulu. Folikuly do jednoho dne před ovulací mají v průměru asi 45 mm (35 60 mm) a jeví se jako měkké (viz. obr. č. 6. v příloze). Někdy bývá zachycena právě skončená ovulace jako meandrovitě kolabující folikulární dutina s malým množstvím tekutiny. Většinou bývá ovulace diagnostikována nezjištěním dříve přítomného folikulu. Sonografie umožňuje dobře sledovat dvojitou ovulaci. Údaje o frekvenci výskytu dvojitých ovulací jsou značně rozdílné. Podle Grygara a Kudláče (1997) se vyskytují u 4 44 % klisen, průměr činí 16 %. Výskyt trojitých ovulací přichází méně než u 1 % klisen. Morel (2004) sledoval 3075 ovulací u 1581 převážně plnokrevných klisen, vícečetná ovulace se vyskytla ve 29,3 % případů. Zároveň Górecka (2003) poukazuje na větší tendenci k dvojité ovulaci u klisen anglického plnokrevníka. Velkou předností sonografie je možnost zjištění žlutého tělíska, které je pouhou palpací obtížně identifikovatelné. Lze jej vidět ode dne ovulace nejméně do poloviny meziovulačního intervalu. Žlutá tělíska se jeví buď jako strukturálně homogenní, a tudíž uniformně echogenní (viz. obr. č. 9. a 10. v příloze), nebo se v jejich centrální části nachází anechogenní dutina vyplněná chuchvalci sražené krve (viz. obr. č. 11. v příloze). Dutina se

20 postupně redukuje. Oba typy žlutých tělísek jsou považovány za fyziologické a funkčně rovnocenné (Grygar a Kudláč, 1997). Kromě uvedených fyziologických struktur na ováriích sonografie umožňuje stanovit i patologické stavy, zejména neovulované folikuly. Neovulované folikuly bez luteinizace jsou přibližně stejně velké jako zralé ovulující folikuly nebo jsou o něco větší (7-10 cm), viz. obr. č. 7. v příloze. Vyskytují se též neovulované luteinizované folikuly (viz. obr. č. 8. v příloze), oba typy se souhrnně označují jako anovulační hemoragické folikuly. Častý výskyt neovulovaných folikulů bývá v přechodném období na začátku a na konci připouštěcího období. Dále se vyskytují velké ovariální cysty s anechogenním obsahem, které se nemění po dlouhé období a vedou k atrofii funční ovariální tkáně. Autoři dále uvádějí, že cysty vyskytující se u klisen nezpůsobují poruchy v průběhu pohlavního cyklu, nejsou ve většině případů příčinou poruch plodnosti a svou povahou se zásadně liší od tzv. syndromu ovariálních cyst u skotu. Oproti tomu Mottershead (2002) uvádí souvislost mezi anechogenními, resp. echogenními anovulačními folikuly u klisen a folikulárními, resp. luteálními cystami u skotu. Dále se zmiňuje, že perzistující anovulační folikuly se vykytují u asi 8 % cyklů. Říje, v které se objeví, je nevyužitá a dochází k oddálení i následující říje. 2. 5. 2. 1. 2. Sonografie dělohy Sonograficky lze dobře odlišit krček, tělo a rohy děložní. Struktura děložního krčku je během diestru a gravidity vzhledem k endometriu děložního těla hyperechogenní, během říje dochází vlivem edematizace ke snížení jeho echogenity a jeho rozlišení je obtížnější. Echo struktura endometria v období mimo říji je homogenní, v děložním těle je viditelná různě výrazná tenká echogenní linie, vyznačující děložní dutinu. Tvar děložního těla bývá hrohovitý nebo oválný. V říji lze pozorovat výrazné zvětšení průměru děložního těla a rohů. Dochází k edému a prominenci endometriálních řas, což se projeví střídáním hyperechogenních a hypoechogenních oblastí (viz. obr. č. 3. v příloze). Za říje lze v děložním luminu zjistit malé množství anechogenní tekutiny (děložního sekretu), viz. obr. č. 4. v příloze, kterou je třeba odlišit od patologického obsahu v děloze (Grygar a Kudláč, 1997). Pycock (2002) ve své studii uvádí, že edém a stažení endometria se poprvé objevuje v průměru v sedmém dni

21 před ovulací, zesiluje a vrcholí 24 až 48 hodin před ovulací, během ovulace ustupuje ale vždy ještě přetrvává. Nikdy však netrvá déle než do jednoho dne po ovulaci. Dále poukazuje na souvislost mezi stažením dělohy a hodnotou progesteronu v krvi a na využití zjištění embryonálnícho edému pro diagnostiku rané embryonální odúmrti. Sonografie je využívána při sledování involuce dělohy v postpartálním období, zejména se zřetelem na přítomnost tekutiny v děložním luminu v době první poporodní ovulace. Lze toho využít k ovlivňování chovatelské strategie a k zlepšení zabřezávání klisen během první poporodní říje (Grygar a Kudláč, 1997). Mc Kinnon (2003) poukazuje na velmi krátkou dobu k involuci dělohy a schopnosti přijmout nové embryo. Uvádí, že klisny, jejichž děloha obsahuje tekutinu a nedošlo k její involuci, nesmí být zapuštěny v první poporodní říji aby mohly později úspěšně zabřeznout. Sonografie je velmi důležitá metoda pro diagnostiku zánětlivých onemocnění dělohy. Sonografický nález různého množství tekutiny, která může být více či méně echogenní (tzv. sněžení ), je typický pro endometritidu. Množství i charakter tekutiny kolísá nejen od zvířete k zvířeti, ale i u stejné klisny v závislosti na stadiu cyklu (Grygar a Kudláč, 1997). Pycock (2003) uvádí variabilitu v množství tekutiny od několika ml až po objem přesahující jeden litr v extrémních případech. Někdy se sněžící tekutina zobrazí jen v některé části děložního těla nebo děložních rohů, jindy dilatuje dutinu děložní v celém rozsahu (pyometra). Vzhledem k tomu, že do dutiny děložní prominují endometriální řasy, které odděluje děložní dutinu dilatující tekutina, získává vnitřní obrys děložního rohu na příčném průřezu mnohdy hvězdicovitý tvar (Grygar a Kudláč, 1997), viz. obr. č. 12. v příloze. Pycock (2003) považuje za častou příčinu nezabřeznutí klisny perzistující připuštěním indukovanou endometritidu. Je to v podstatě zánětlivá reakce na sperma, které organismus vnímá jako cizorodou látku. U některých klisen dochází ke spontánnímu potlačení zánětu během 24 72 hodin, ovšem ponechání klisny bez léčby snižuje pravděpodobnost zabřeznutí. Endometritida přetrvávající čtvrtý až pátý den po ovulaci je neslučitelná s přijetím embrya do dělohy a přechází v chronickou endometritidu (viz. obr. č. 12. v příloze). Při inseminaci je předpokladem úspěchu vedle úzkostlivé hygieny hlavně časté ultrazvukové vyšetření klisny během říje a redukce počtu inseminací na pouhou jednu. Inseminaci pouze čerstvým spermatem je vhodné provést 48 hodin před ovulací, což

22 umožní eliminovat zánět ještě před ovulací, dokud je otevřený děložní krček a děloha se kontrahuje. Dále Pycock (2003) upozorňuje na častý výskyt tohoto typu endometritidy u starších poprvé zapouštěných klisen. Franklin (2000) uvádí, že klisny s obsahem tekutiny v děloze nemají být inseminovány mraženým spermatem, neboť je u nich pravděpodobná zánětlivá reakce na ředidlo, kryoprotektiva, glycerol a sperma samotné. Dalším přínosem sonografie je také možnost diagnostikovat děložní cysty, vyskytující se zejména u starších klisen. Cysty jsou buď solitární nebo multipní, veliké od několika mm po několik centimetrů (viz. obr. č. 13. a 14. v příloze). Vliv děložních cyst na plodnost je neustále diskutován. Významné jsou spíše velké cysty ve větším počtu, kdy změněné endometrium není schopno vytvořit děložní mléko a není zabezpečena výživa neimplantovaného embrya. Pro spolehlivé rozlišení endometriálních cyst od velmi časných stádií březosti (viz. obr. č. 13. v příloze) je nutno vyšetření opakovat (embryo roste relativně rychle, zatímco cysty zůstávají stále stejně velké), nejspolehlivější je detekce vlastního embrya s viditelnou pulsací srdeční (Grygar a Kudláč, 1997). 2. 5. 2. 2. Sonografická diagnostika březosti Pro spolehlivou diagnostiku březosti v jejím raném stadiu je sonografické vyšetření nezbytné. S 5 MHz sondou a kvalitním sonografen lze přítomnost embryonálního váčku v děloze zjistit nejdříve 9. 11. den po koncepci (průměr váčku je asi 3 6 mm. V praxi je ale možné spolehlivě diagnostikovat březost od 12. 15. dne po koncepci (průměr váčku asi 7 23 mm). Při nenalezení malého embryonálního váčku před 15. dnem po posledním připuštění klisny je vhodné opakovat vyšetření 18. až 20. den, neboť není možné přesně stanovit dobu oplození a embryo při prvním vyšetření ještě nemusí být detekovatelné. 18. 20. den je také možné v případě jalovosti klisny rozpoznat novou říji. Vyšetření březosti do 15. dne po ovulaci je vhodné zejména v případech, kdy je na základě zjištěné dvojité ovulace očekáván výskyt dvojčat (viz. dále). Starší klisny s přítomností embryonálnímu váčku podobných cyst na sliznici děložní je nutné opakovaně vyšetřit, aby bylo možné odlišit rychle rostoucí embryonální váček od děložní cysty (viz. obr. č. 13. v příloze).

23 Do 16. dne březosti (tj. do doby fixace) má embryo charakter relativně rychle se zvětšující kuličky naplněné anechogenní tekutinou (viz. obr. č. 15. v příloze). V 17. až 20. dni získává váček hruškovitý nebo nepravidelný tvar (viz. obr. č. 16., 17., a 18. v příloze). Vlastní embryo uvnitř zárodečného váčku je ultrazvukem poprvé viditelné mezi 19. až 25. dnem (viz. obr. č. 19., 20., a 21. v příloze) a téměř současně je zjistitelná i srdeční činnost zárodku (kardiální symptom březosti). Allantoidový vak je zřetelně viditelný od 24. dne březosti těsně pod embryem a v téže době začíná smršťování žloutkového váčku. Allantois zabírá asi 25 % vaku 26. den, 50 % vaku 29. den a 75 % vaku 32. den březosti (viz. obr. č. 22. v příloze). 37. den lze pozorovat embryo při dorzálním pólu vaku (viz. obr. č. 23. v příloze), po 40. dni žloutkový váček mizí, pupeční šňůra se prodlužuje od dorzálního pólu. Plod vlivem gravitace klesá do ventrální části vaku, kde je vidět obvykle ve hřbetní poloze od 48. až 50. dne. Od 40. dne březosti jsou zjistitelné aktivní pohyby plodu. Praktická znalost těchto vývojových stádií konceptu je určující pro posouzení jeho stáří a eventuálně jeho odúmrti. Správná diagnostika raných vývojových fází se opírá také o stanovení velikosti a hlavně dynamiky růstu embryonálního váčku.. Zjistilo se,že váček roste lineárně od 11. do 16. dne v průměru 3,4 mm denně. Od 16. dne se růst velmi zpomaluje a mezi 18. 26. dnem dochází téměř ke stagnaci růstu jeho velikosti. Proto není v tomto období určení velikosti embryonálního váčku vhodné pro stanovení stáří konceptu. Po 28. dnu roste váček opět lineárně (v průměru 1,8 mm za den). V pozdějších obdobích (třetí měsíc a později), kdy se již plod značně zvětšil, není možné jeho monitorování jako celku, ale dynamiku jeho růstu lze studovat, a tak určovat jeho stáří stanovením rozměrů různých orgánů (ultrazvuková fetometrie), viz. obr. č. 25. a 26. v příloze, (Grygar a Kudláč, 1997). Merkt a Moura (1999) uvádějí, že od 50. dne gravidity je možné sonograficky rozlišit pohlaví plodu. Během výzkumu provedli mezi 60. a 70. dnem březosti 64 vyšetření, z nichž ve 46 (72 %) stanovili diagnózu, která byla ve 40 (87 %) případech správná. Vyšetření je ale náročné pro vyšetřujícího i klisnu a v praxi nemá většího opodstatnění, proto se běžně neprovádí. V zájmu znalosti skutečného stavu (především se zřetelem na embryonální odúmrť) je účelné provést v době od 40. do 60. dne kontrolní vyšetření ultrazvukem a potvrzení březosti. Frekvence a počet následujících vyšetření po prvním zjištění březosti jsou určovány nejen stavem konceptu (velikost a kvalita embryonálního váčku a vlastního embrya, přítomnost dvojčat), ale také samotnou klisnou (reprodukční anamnéza) a dále zájmem majitele klisny (Grygar a Kudláč, 1997).

24 2. 5. 2. 2. 1. Sonografická diagnostika a redukce dvojčat Ultrasonografie je významnou pomocí k zjištění dvojitých ovulací a v jejich souvislosti relativně často se vyskytujících dvojčat. I když někdy dochází ke spontánní odúmrti jednoho embrya, je vždy eminentní zájem na jejich včasném zjištění a provedení redukce uměle. V případě pokračování březosti dvojčat dochází k jejich abortu, předčasnému porodu, nebo porodu dvou mrtvých hříbat v termínu. V případě, že jsou hříbata donošena, jsou malá, málo životná a často po narození hynou. Pro umělou redukci dvojčat je účelné včas zjistit jejich přítomnost v děloze ještě před fixací embryí (do 15. dne po koncepci), kdy je možné jejich oddálení (viz. obr. č. 24. v příloze). Podle Grygara a Kudláče (1997) se ve více případech (65 %) embrya fixují v jednom děložním rohu unilaterálně, než odděleně v každém děložním rohu - bilaterálně(35 %). Manuální oddálení a redukce je prováděna rozmáčknutím jednoho embrya přímo tlakem ultrazvukové sondy a vyšetřující sleduje destrukci na obrazovce sonografu. Mottershead a St. Martin (2005) poukazují na nutnost odlišení dvojčat od podobně vypadajících děložních cyst. Dále doporučují vždy provádět nejméně dvě ultrazvuková vyšetření březosti. První do 15. dne a druhé nejpozději do 28. dne po ovulaci. Důvodem je možnost asynchronní ovulace (uvádí případ, kdy rozdíl ve stáří dvou embryí byl 6 dní), následkem které není mladší embryonální váček při prvním ultrazvukovém vyšetření ještě rozeznatelný. Pokud jsou již embrya fixována a zejména pokud se dotýkají, existuje riziko, že po redukci jednoho embrya dojde k odúmrti obou embryí. Grygar a Kudláč (1997) uvádějí úspěšně provedenou redukci dvojčat v 32. dnu březosti a 88,5 % případů (redukce byly provedeny v rozmezí 14. až 34. dne březosti), kdy bylo při kontrolním vyšetření zjištěno jedno fyziologicky se vyvíjející embryo. Oproti tomu Mottershead a St. Martin (2005) doporučují při diagnóze dvojčat po 28. dnu březosti raději aplikaci prostaglandinu vedoucí k přerušení březosti a novému návratu klisny do říje. Dále poukazují na větší naději na zabřeznutí po vícečetné ovulaci, je tudíž nesprávné (při možnosti v 97 % úspěšné redukce dvojčat) takovou říji nevyužít a klisnu nezapustit.

25 2. 5. 2. 2. 2. Embryonální a fetální mortalita Zatímco výskyt abortů zapříčiněných březostí dvojčat se díky využití ultrazvuku podařilo omezit na minimum, velkým problémem zůstává relativně častý výskyt embryonální a fetální mortality. Z tohoto důvodu se provádějí opakovaná vyšetření březosti, nejlépe 2 3krát v intervalech 15 dní. Častým případem je absence dříve zjištěného zárodku v děloze, nebo vymizení srdeční činnosti embrya resp. plodu. Na embryonální odúmrť poukazuje také velikost embryonálního váčku neodpovídající stádiu březosti, jeho nefyziologický tvar, echogenní částice ( sněžení ) v tekutině váčku, přítomnost volné tekutiny v děložní dutině s případným flotujícím embryonálním váčkem nebo zbytky vlastního embrya. Nápadné je také neodpovídající uspořádání plodových obalů. Odumírání embrya signalizuje snížení srdeční frekvence. Při odúmrti v pozdějších stádiích březosti může různě dlouho po resorpci plodových vod docházet k zadržení osifikovaných částí plodu v děložní dutině. Ty jsou sonografem dobře viditelné (Grygar a Kudláč, 1997). Ricketts (2003) diagnostikoval 80 raných embryonálních odúmrtí ultazvukovým vyšetřením od 14. do 65. dne po posledním připuštění. V téměř 50 % případů byla odúmrť zjištěna absencí konceptu, který byl v děloze dříve přítomen bez známek abnormality. Pouze u 4 % klisen byla cytologickým a bakteriologickým vyšetřením zjištěna endometritida. Autor se domnívá, že většina odúmrtí byla zapříčiněna genetickými, vývojovými nebo funkčními poruchami embrya. Vliv věku klisny nebyl prokázán. Naopak Ball (2000) zdůrazňuje vliv věku na ranou embryonální mortalitu. Za hlavní příčiny považuje dále genetické poruchy již na úrovni oocytu a také nevyhovující prostředí ve vejcovodech. Rambags (2003) uvádí častější výskyt rané embryonální mortality u starších klisen. Za příčiny považuje chromozomální abnormality, nepříznivé prostředí ve vejcovodech a endometritidy indukované připuštěním. Možnost omezení výskytu odúmrtí vidí v prevenci a léčbě zánětlivých reakcí dělohy po připuštění.

26 2. 6. Úroveň březosti po inseminaci 2. 6. 1. Úroveň březosti po inseminaci čerstvým a mraženým spermatem a po přirozené plemenitbě 2. 6. 1. 1. Čerstvé a zmrazené sperma Při inseminaci klisen čerstvým spermatem je používáno naředěné sperma zchlazené na teplotu 4 8 C. Jedna inseminační dávka obsahuje minimálně 500 milionů spermií. Zpracované sperma je použitelné k inseminaci do 24, případně do 36 hodin po odběru. Po provedené inseminaci přežívají oplozeníschopné spermie v pohlavních orgánech klisny 48 hodin. Pokud nedošlo k ovulaci, je nutné inseminaci opakovat v intervalu maximálně 48 hodin. Při inseminaci klisen zmrazeným spermatem je používáno zpracované sperma dlouhodobě skladované v kapalném dusíku při teplotě -196 C buď v aluminiových tubách o objemu 6 ml,nebo v 0,5 ml pejetách. Jedna inseminační dávka obsahuje zpravidla 200 milionů pohyblivých spermií. Oplozovací schopnost spermií je oproti čerstvému spermatu snížena. Po rozmrazení a provedené inseminaci přežívají oplozeníschopné spermie v pohlavních orgánech klisny 12 až 24 hodin. Nedošlo-li k ovulaci, je třeba opakovat inseminaci po maximálně 24 hodinách ( Müller a kol., 2006). 2. 6. 1. 2. Úroveň březosti Müller (2003) vyhodnotil úroveň březosti po inseminaci čerstvým spermatem. Z celkem 1418 klisen zabřezlo po první říji 47,4 % klisen, celková březost na konci připouštěcího období dosáhla 71,0 %. Katila ( 2003) ve své studii sledoval 1085 klisen a 1908 říjových cyklů. Po inseminaci čerstvým spermatem přímo na stanici, kde byl odběr proveden, zjistil po první říji 56,1 % březích klisen. Po inseminaci čerstvým semenem zaslaným k chovateli byla dosažena 51,7 % úroveň březosti a při použití zmrazeného spermatu 33,1 %. Vidament (2005) uvádí, že během dvaceti let využívání inseminace zmrazeným spermatem ve Francii (inseminováno více než 1500 klisen ročně) bylo dosaženo průměrně 45,0 48,0 % březosti po první říji. Průměrný počet cyklů na jednu březí klisnu byl 1,8 a

27 bylo spotřebováno průměrně 32 35 ks pejet na jednu klisnu ročně. Pro porovnání uvádí 57,0 59,0 % březost po první říji v přirozené plemenitbě. Loomi a Squires (2005) zjistili březost po inseminaci mraženým spermatem provedené dvakrát během říje (před a po ovulaci) 48,1 %.a po pouze jedné inseminaci provedené 6 hodin po ovulaci 47,3 %. Squires a kol (1996) při inseminaci klisen čerstvým spermatem dvakrát v jedné říji dosáhl 64,0 % březosti. Franklin (2001) zaznamenal po inseminaci mraženým spermatem úroveň březosti od 31,0 do 73,0 %, přičemž největších úspěchů bylo dosaženo u klisen se známou reprodukční anamnézou, vyšetřovaných každých 6 hodin, ošetřených HCG a inseminovaných těsně před ovulací a do 6 hodin po ní. Müller (2003) poukazuje na velký vliv odborné způsobilosti a praktických zkušeností inseminačního technika. Porovnával výsledky jednotlivých techniků, provádějících inseminaci čerstvým spermatem v praktických podmínkách v chovu koní v ČR. Zjistil značnou variabilitu mezi jednotlivými pracovníky (úroveň březosti v rozmezí 40,0 91,0 %). Průměrná březost po první říji dosáhla 47,0 % celková březost na konci sezóny 71,0 %. Stejně tak podmínky, v kterých je inseminace prováděna, hrají významnou roli v úspěšnosti inseminace..v terénních podmínkách bylo inseminováno 1217 klisen a z nich bylo 69,1 % na konci připouštěcí sezóny březích. Na specializované klinice (vysoká odbornost, možnost častého ultrazvukového vyšetření klisny, dobré hygienické podmínky, možnost terapeutického zásahu) byla dosažena u 201 klisen úroveň březosti 85,6 %. Dále autor hodnotí úroveň březosti po první a následných říjích (po inseminaci čerstvým spermatem v terénních podmínkách). Po první říji zabřezlo 47,4 % klisen, po druhé říji 43,8 % klisen, po třetí říji 51,9 % a po čtvrté říji 46,03 % klisen.

28 Ústřední evidence koní ve Slatiňanech zpracovává údaje o plemenitbě koní v ČR. V následující tabulce jsou uvedeny počty inseminovaných klisen a registrovaných hříbat za období 2000 až 2005 (hříbata z inseminace v roce 2005 ještě nejsou registrována). Rok Inseminováno Registrováno hříbat klisen Hřebečků Klisniček 2000 1 190 265 294 2001 1 582 385 406 2002 1 659 356 421 2003 1 451 364 354 2004 1 304 245 290 2005 1 371 - - Tabulka 1. (zdroj Ústřední evidence koní ČR, NH Kladruby n. L., s. p., Hřebčín Slatiňany, 2006). Publikované údaje o výsledcích přirozené plemenitby se značně liší zejména podle podmínek, za kterých je prováděna. Vidament (2005) uvádí výsledky přirozené plemenitby ve Francii za období 1985 až 2005, úroveň březosti po prvním říjovém cyklu se pohybovala mezi 57,0 až 59,0 %. Zavadil (1987) zaznamenal za čtyřleté období v severomoravském kraji 52,1 až 59,4 % úroveň březosti. Hemberg a kol. (2004) se zmiňuje o využívání sonografie v přirozené plemenitbě plnokrevných klisen ve velmi dobře vedeném hřebčíně ve Švédsku. Úroveň březosti zde dosahuje 88,8 až 92,2 %. 2. 6. 1. 3. Četnost výskytu dvojčat a embryonální mortality Katila (2003) uvádí výskyt dvojitých ovulací v 11,0 % případů z celkem 1908 cyklů a zjištění březosti dvojčat v 6,1 % případů. Hemberg a kol. (2004) zaznamenali dvojčata v 10,5 % případů ze 430 klisen a jejich úspěšnou redukci v 88,9 % případů. Morel a kol.(2004) sledovali 3075 ovulací u 1581 převážně plnokrevných klisen. Vícečetná ovulace se vyskytla ve 29,3 % cyklů. Po těchto vícečetných ovulacích bylo 63,0 % klisen březích, z nichž u 25,2 % byla diagnostikována dvojčata ve 13. 14. dnu březosti. Allen (2001) uvádí, že u 10,0 až 15,0 % březích klisen dochází k odúmrti plodu a abortu

29 a k většině těchto ztrát dojde během prvních 40 dnů gravidity. Ricketts (2003) zaznamenal 6,5 % výskyt rané embryonální mortality. Z 80 takto diagnostikovaných klisen 64,0 % opět zabřezlo a následující rok porodilo živé hříbě.

30 3. CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce je zhodnocení výsledků inseminace klisen prováděné s využitím sonografické techniky v terénních podmínkách v chovu koní v ČR v letech 1995 až 2005. V letech 1995 až 2005 byly sledovány tyto ukazatele: 1. Úroveň březosti celková 2. Úroveň březosti po inseminaci čerstvým spermatem 3. Úroveň březosti po inseminaci mraženým spermatem 4. Relativní četnost výskytu dvojčat 5. Relativní četnost výskytu resopcí 6. Relativní četnost výskytu zmetání 7. Počet spotřebovaných inseminačních dávek na 1 inseminovanou a na 1 březí klisnu V letech 2000 až 2005 byly sledovány tyto ukazatele: 1. Úroveň březosti po inseminaci čerstvým spermatem 2. Úroveň březosti po inseminaci čerstvým spermatem ve sledu prvního až čtvrtého říjového cyklu během připouštěcí sezóny 3. Počet provedených sonografických vyšetření na 1 inseminovanou a na 1 březí klisnu V letech 2002 až 2005 byly sledovány tyto ukazatele: 1. Zabřezávání po opětovné inseminaci po proběhlé resorpci embrya 2. Úspěšnost provedené redukce dvojčat

31 4. MATERIÁL A METODIKA Ke zpracování byly použity podklady ing. Radana Zavadila, který provádí inseminaci klisen v oblasti východních Čech. Jmenovaný je absolvetem VŠZ v Brně a po tříleté praxi na inseminační stanici hřebců v Mněticích u Pardubic působí od roku 1995 jako samostatný inseminační technik pro inseminaci klisen. Ke své činnosti využívá sonograf ALOKA SSD 210DX II s lineární 5 MHz sondou. K uskladnění inseminačních dávek zmrazeného spermatu používá kontejner od firmy ABS o objemu 18 l. Zpracovány byly záznamy z let 1995 2005. V těchto letech bylo inseminováno celkem 1144 klisen. Soubor zahrnoval klisny převážně teplokrevných, ale i chladnokrevných plemen chovaných v ČR, klisny plemene hafling, Shagya arab, quarter horse a pony. Klisny byly různého věku v rozmezí 3 23 let. Používány byly inseminační dávky čerstvého spermatu distribuované registrovanými inseminačními stanicemi v ČR. Dávky zmrazeného spermatu byly vyrobeny převážně v ČR, ale i v zahraničí (Německo, Francie, Maďarsko). Inseminované klisny byly během říje vícekrát sonograficky vyšetřovány. Sonografická diagnostika gravidity byla prováděna od 12. dne po ovulaci nebo poslední inseminaci, dále byla dle potřeby opakována. Všechny klisny byly opětovně přešetřeny v 30. až 60. dnu březosti a dle přání majitele klisny ještě kdykoliv poté. V případě nálezu dvojčat byla vždy provedena jejich redukce a následné přešetření a zjištění výsledku. Klisny nezabřezlé v první říji byly inseminovány v dalších říjích do konce připouštěcí sezóny podle přání majitele klisny. Některé klisny, které nezabřezly po inseminaci mraženým spermatem, byly v téže sezóně v zájmu reprodukčního využití klisny a po dohodě s majitelem klisny inseminovány čerstvým spermatem. Jsou tudíž vedeny jako klisny inseminované mraženým spermatem i jako klisny inseminované čerstvým spermatem, díky tomu jsou součty počtu klisen inseminovaných čerstvým a mraženým spermatem vyšší než celkový počet klisen inseminovaných v daném roce.