SELEKTOVATELNÉ GENY V JADERNÉ TRANSGENOZI ROSTLIN Doc. RNDr. Jindřich Bříza, CSc. BC AV ČR, v.v.i. a PřF JU, Branišovská 31 370 05 České Budějovice
Selektovatelný gen: gen zajišťující rezistenci k látce přidávané do kultivačního média (in vitro) nebo používané k postřiku rostlin (in vivo), což vede k selekci transgenních buněk a pletiv. Signální (reportérový) gen: gen, jehož biochemický produkt je možné snadno detekovat a kvantitativně stanovovat. Do současné doby použito v transgenozi rostlin (jaderné i plastidové) kolem 55 druhů selektovatelných či signálních genů.
SELEKTOVATELNÉ GENY Lze je rozdělit do dvou velkých skupin: Geny zajišťující pozitivní selekci Geny zajišťující negativní selekci V obou případech pak může být selekce podmíněna buď přítomností externího substrátu, nebo jeho přítomnost není vyžadována. Pozitivní selekce: dochází k podpoře růstu a diferenciace transformovaných buněk a pletiv. Negativní selekce: vede k inhibici růstu nebo smrti transformovaných buněk a pletiv.
SELEKTOVATELNÉ GENY Pozitivní selektovatelné geny spojené s použitím toxických látek (antibiotika, herbicidy apod.) byly prvními vyvinutými a používanými selekčními systémy.
SELEKTOVATELNÉ GENY
SELEKTOVATELNÉ GENY Později byly vyvíjeny pozitivní selekční systémy, kde selekčním agens je netoxická látka, která u transformovaných buněk slouží jako další (dodatkový) zdroj energie,čímž je zvýhodňuje v růstu a diferenciaci.
SELEKTOVATELNÉ GENY Nejnovější strategie jsou tvořeny pozitivními selektovatelnými geny, které nevyžadují žádný externí substrát a které mění fyziologické procesy zajišťující vývoj rostliny.
SELEKTOVATELNÉ GENY Negativní selektovatelné geny resp. jejich produkty konvertují netoxickou externí látku na toxickou, která vede ke smrti transgenních buněk.
SELEKTOVATELNÉ GENY Přes již zmíněný vysoký počet nejrůznějších selektovatelných genů, které kdy byly vyvinuty, pouze pár jich je skutečně masivně používáno.
SELEKTOVATELNÉ GENY Ne všechny selektovatelné geny jsou např. vhodné pro všechny rostlinné druhy (kanamycin x Viciaceae, Poaceae). Nejzávažnější problémy: i) přílišná toxicita látky (kanamycin x hygromycin) ii) příliš malý selekční efekt iii) příliš dlouhá selekce (až měsíce) Příklad kanamycinu (obv. konc. při selekci v mg/l): A. thaliana a B. napus 50; N. tabacum, Petunia, chryzantéma 100; rododendron 150; Kalmia 200; rajče 300, Clematis 800; karafiát 1600;
SELEKTOVATELNÉ GENY Je proto nutné otestovat před každým použitím určité selekční látky citlivost netransgenních rostlin. Po zhruba měsíci (u kanamycinu) hodnotíme s tím, že danou koncentraci látky můžeme použít k selekci, jestliže rostliny přestávají růst, nově vyrašené listy jsou bílé a rostliny nekoření. Při použití např. hygromycinu bývají používané koncentrace zhruba 10 x nižší a citlivost k němu nemusí korelovat s citlivostí ke kanamycinu.
Chmel na hygromycinu SELEKTOVATELNÉ GENY
1. Enzymy modifikující aminoglykosidická antibiotika (kanamycin, neomycin, gentamicin, paromomycin) 1.1. Neomycinfosfotransferáza II (NPT II) - katalyzuje ATP dependentní fosforylaci 3 -hydroxylové skupiny některých antibiotik (viz výše) - gen nptii (neo) pochází z transpozonu Tn5 z E. coli - nejužívanější (v r. 2002 44-77 % prací zabývajících se transgenozí rostlin využívalo k selekci tento gen) 1.2. Hygromycinfosfotransferáza (HPT) - katalyzuje ATP dependentní fosforylaci 7 -hydroxylové skupiny hygromycinu B - gen aphiv (hph, hpt) pochází z E. coli - druhý nejužívanější selekční systém
1.3. Streptomycinfosfotranferáza (SPT, APH) - gen pochází opět z bakteriálního transpozonu Tn5 - systém nedoznal obecného rozšíření - enzymy pod body 1.1. až 1.3. patří do aminoglykosid-ofosfotransferáz 1.4. ATP-binding casette (ABC) transporter - jeden z velké rodiny genů ABC transportérů u A. thaliana je gen Atwbc19, u nějž byla o prokázáno, že je u transgenních rostlin zodpovědný za rezistenci vůči kanamycinu (Mentewab a Stewart 2005) -může být cenným při transgenozi důležitých plodin či dřevin
1.5. Aminoglykosid-N-acetyltransferázy (AAC) -různé enzymy tohoto typu acetylují gentamycin, kanamycin, tobramycin, neomycin, paromomycin a apramycin - jeden z genů (6 gat ze Shigella sp.) je funkční alternativou genu nptii 1.6. Aminoglykosid-O-nukleotidyltransferázy - např. bakteriální gen aada kóduje aminoglykosid-3 - adenyltransferázu a zajišťuje tak rezistenci transgenních rostlin ke spektinomycinu a streptomycinu - selekce se však v tomto případě odehrává spíše na úrovni zelené x chlorotické pletivo než přežívající x rostoucí pletivo - pro selekci jaderných transgenů nevýznamný, avšak zatím nezastupitelný při selekci plastidových transformantů
2. Rezistence k bleomycinu - fleomycin a bleomycin jsou antibiotika glykopeptidového charakteru, jež způsobují místně specifické, jedno- i dvouřetězcové zlomy DNA -2 různé geny rezistence (z Tn5 E. coli a Streptoalloteichus hindustanus) pod promotorem 35S vedly k vysoké úrovni rezistence k fleomycinu u tabáku - systém se nerozšířil 3. Mutantní dihydropteroátsyntáza (DHPS) - sulfonamidy s antimikrobiální aktivitou inhibují enzym dihydropteroátsyntázu - gen rezistence suli z plazmidu R46 kóduje mutantní formu DHPS, která je rezistentní k inhibici sulfonamidy, mechanismem selekce tedy není (jako dosud) detoxifikace selekční látky - aby byl gen u rostlin účinný, musí být enzym směrován do plastidů
4. Streptotricinacetyltransferáza (SAT) - streptotriciny jsou produkovány streptomycetami a inhibují proteosyntézu vazbou na malou podjednotku ribozómů - gen sat3 z E. coli kóduje enzym SAT, který tyto látky inaktivuje - popsáno v r. 2000 u 4 druhů 5. Chloramfenikolacetyltransferáza (CAT) - enzym CAT pochází z Tn9 E. coli - jako selektovatelný gen málo účinný, ale citlivost testu enzymové aktivity CAT umožňovalo používat tento gen jako gen signální (nyní se však už nepoužívá)
6. Selekční systémy s herbicidy 6.1. Fosfinotrin-N-acetyltransferáza - fosfinotricin (PPT) je účinnou složkou řady herbicidů (Basta, Ignite, Liberty ) a je kompetitivním inhibitorem glutaminsyntázy, která je jediným rostlinným enzymem, jenž katalyzuje asimilaci amonných iontů - inhibice GS vede ke kumulaci amonných iontů a nakonec ke smrti rostlinné buňky - rezistence k PPT může být dvojího typu: i) zvýšením úrovně exprese GS s použitím silného promotoru (prakticky nevyužíváno)
ii) vnesením bakteriálních genů: bar (bialophos resistance, bialophos se skládá z PPT a 2 alaninů) ze Streptomyces hygroscopicus nebo pat (phosphinothricin N-acetyltrans-ferase) ze S. viridochromogenes. Oba kódují PAT, jež acetyluje volnou amino skupinu PPT, takže ten není schopen se vázat na GS - v publikacích z r. 2002 byl gen bar mezi rezistencemi k herbicidům nejužívanějším selekčním genem (4-31 %)
6.2. Enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntáza (EPSP) - glyfozát je účinnou složkou herbicidu Roundup a působí jako inhibitor plastidového enzymu 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntázy, který je esenciální pro biosyntézu aromatických aminokyselin - možné mechanismy rezistence ke glyfozátu: i) zvýšená exprese EPSP z petúnie pomocí promotoru 35S, což vedlo k 20-40 násobnému zvýšení exprese a tím k toleranci transgenních petúnií k herbicidu ii) exprese mutantní EPSP (gen aroa ze S. typhimurium nebo E. coli) cílené do plastidů; tento mutantní enzym má senzitivitu ke glyfozátu až o tři řády nižší iii) vnesením genu, který glyfozát katabolizuje, např. genu pro glyfozátoxidoreduktázu (GOX); syntéza enzymu musí být cílena do plastidů - tento systém selekce je stále široce využíván
6.3. Acetolaktátsyntáza (ALS) - ALS (AHAS=acetohydroxyacid synthase) se podílí na regulaci biosyntézy aminokyselin s rozvětveným řetězcem v plastidech - je inhibována některými skupinami herbicidů (sulfomočoviny, imidazolinony, triazolopyrimidiny, pyrimidinylthiobenzoáty) - mutantní formy ALS (např. gen surb z tabáku) mohou fungovat jako účinné selektovatelné systémy 6.4. Bromoxynilnitráza - oxynilové herbicidy inhibují fotosystém II - gen bnx z Klebsiella pneumoniae kóduje enzym s nitrilázovou aktivitou, jež vede k detoxifikaci bromoxynilu na netoxické produkty - využíváno velmi málo
6.5. Glutamát-1-semialdehydaminotransferáza (GSA-AT) - selekční agens je gabakulin (bakt. fytotoxin) - mutantní forma GSA-AT směrovaná do plastidů a kódovaná genem heml ze Synechococcus byla využita k selekci transgenních rostlin tabáku - navrženo jako systém vhodný pro selekci transformovaných plastidů, ale dosud nepoužito 6.6. Kyanamidhydratáza - kyanamid používán jako hnojivo či jako preemergentní herbicid - gen cah (z půdní houby Myrothecium verrucaria) kóduje kyanamidhydratázu, která detoxifikuje kyanamid na močovinu
6.7. Gen pro α-tubulin - v r. 2008 Yemets et al. popsali využití mutantních forem přirozeně se vyskytujícího genu pro α-tubulin z kalužnice indické (Eleusine indica), které zajišťují svému nositeli rezistenci vůči řadě herbicidů s inhibičními účinky na tvorbu mikrotubulů (např. trifluralin, TFL) - autoři testovali použití selekčního genu při transformaci různých druhů (s TFL jako selekční látkou) a zjistili srovnatelnou transformační účinnost jako při použití kanamycinu nebo PPT
6.8. Protoporfyrinogenoxidáza (PPO) - enzym je klíčový při biosyntéze chlorofylu a je inhibován herbicidem butafenacilem - mutantní rezistentní enzym PPO z Arabidopsis lze použít jako selektovatelný gen (kukuřice, 2003) 7. Jiné pozitivní selekční systémy 7.1. 2-deoxyglukóza-6-fosfátfosfatáza - 2-deoxyglukóza je v cytosolu přeměňována na 2-deoxyglukóza- 6-fosfát, který funguje jako kompetitor glukóza-6-fosfátu, což vede nakonec k buněčné smrti - gen DOG R -1 z kvasinek vede k rezistenci transgenních rostlin k 2-deoxyglukóze
7.2. Aldehyddehydrogenáza - malé aldehydy, jako např. betainaldehyd, jsou pro rostliny toxické - existují enzymy, např. betainaldehyddehydrogenáza (BADH) ze špenátu, které je mohou konvertovat na netoxické produkty - enzym je směrován do plastidů - systém použit při jaderné transformaci u rajčete, ale s účinností nižší než při použití genu nptii - naopak při použití k selekci plastidových transformantů byl vysoce účinný a je nadějí do budoucna 7.3. Tryptofandekarboxyláza (TDC) - selekční systém využívá gen tdc z barvínkovce růžového (Catharantus roseus), který kóduje enzym přeměňující toxický 4- metyltryptofan na netoxický 4-metyltryptamin - použito zatím jen u tabáku
7.4. Dihydrofolátreduktáza (DHFR) -některé látky, např. metotrexát, se váží na aktivní místo enzymu dihydrofolátreduktázy, což v konečných důsledcích vede k buněčné smrti - rezistentní DHFR byla nalezena např. v E. coli či v Candida albicans a u petúnie bylo ukázáno, že může být použita k selekci transgenních rostlin 7.5. Xylózaizomeráza - rostliny většinou nedokáží metabolizovat D-xylózu, ale enzym xylózaizomeráza (D-xylóza-ketol-izomeráza) ji konvertuje na D- xylulózu, která je po fosforylaci xylulokinázou využívána rostlinným metabolismem v pentosofosfátové dráze - gen xyla (Streptomyces rubiginosus, Thermoanaerobacterium thermosulfurogens) pro xylózaizomerázu byl použit při transformaci rajčete, tabáku a bramboru
7.6. UDP-glukóza:galaktóza-1-fosfáturidyltransferáza - selekční látkou galaktóza, která je v rostlinách fosforylována interním enzymem na galaktóza-1-fosfát inhibující fosfoglukomutázu - enzym kódovaný genem galt z E. coli použit k selekci transformantů u bramboru a řepky 7.7. Manóza-6-fosfátizomeráza (PMI) - selekční látkou je manóza, která má na většinu rostlin toxické účinky, které se přisuzují manóza-6-fosfátu, jenž vzniká z manózy v rostlinné buňce po fosforylaci vnitřní hexokinázou - produkt genu pmi (mana z E. coli) konvertuje M-6-P na fruktóza- 6-fosfát, který je dále metabolicky využitelný - použito u celé řady plodin (kukuřice, pšenice, řepa, maniok, Arabidopsis, pomerančovník)
7.8. -glukuronidáza - selekční látka benzyladenin N-3-glukuronid je hydrolyzována produktem genu uida (gusa) z E. coli, tj. -glukuronidázou, na aktivní cytokinin, takže na médiu se selekční látkou (a bez aktivních cytokininů) transformované buňky rostou a diferencují, zatímco netransformované buňky trpí nedostatkem cytokininů -ověřeno u tabáku -současně (a hlavně) signálním genem 7.9. Ferredoxin-like protein (PFLP) - selekčním agens suspenze patogena Erwinia carotovora - gen pflp (pepper ferredoxin-like protein) zajišťuje transgenním rostlinám vůči tomuto patogenu rezistenci - využito zatím u orchidejí rodu Oncidium
7.10. D-laktátdehydrogenáza (Wienstroer et al. 2012) - selekční látkou je D-laktát případně methylglyoxal - transgenní rostliny konstitutivně nadprodukující D-laktát dehydrogenázu z A. thaliana na selekčním médiu rostly a vyvíjely se (D-laktát byl metabolizován na pyruvát), zatímco vývoj netransgenních rostlin byl zastaven krátce po vyklíčení semen - autoři postulují, že vyvinuli nový selekční systém umožňující selekci v následné generaci transformovaných rostlin