Vývoj a funkce jater u savců

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a imunologie ţivočichů Vývoj a funkce jater u savců Bakalářská práce 2011 Autor: Veronika Dudková Vedoucí práce: Mgr. Jiří Pacherník, Ph.D.

Prohlášení Prohlašuji, ţe tato bakalářská práce je mé původní dílo, a ţe všechny pouţité zdroje jsou řádně citovány. Souhlasím s uloţením této bakalářské práce v knihovně Ústavu botaniky a zoologie PřF MU v Brně, případně v jiné knihovně MU, s jejím veřejným půjčováním a vyuţitím pro vědecké, vzdělávací nebo jiné veřejně prospěšné účely, a to za předpokladu, ţe převzaté informace budou řádně citovány a nebudou vyuţívány komerčně. V Brně dne: Podpis:

Poděkování Chtěla bych poděkovat mému vedoucímu práce panu Mgr. Jiřímu Pacherníkovi, PhD. za pomoc při vypracování mé práce, za cenné rady a připomínky. Můj dík také patří mé rodině a blízkým za pomoc a podporu při psaní bakalářské práce a při studiu.

Abstrakt Játra jsou největším ţlázovým orgánem v lidském těle. Zastávají mnoho ţivotně důleţitých funkcí jako je např. produkce ţluči, detoxikace nebo regulace hladiny krevní glukózy odbouráváním glykogenu. Játra pochází z entodermu předního střeva. Základní stavební jednotkou jater je jaterní lalůček a hlavní typ jaterních buněk jsou hepatocyty. Hepatocyty pocházejí z prekurzorů tzv. hepatoblastů, stejně jako buňky ţlučových epitelů. Výsledky výzkumu v posledních deseti letech popsaly klíčové interakce růstových a transkripčních faktorů, regulujících vývoj jater. Nejvíce informací o těchto faktorech a jejich signálních drahách bylo zjištěno experimenty na myších. Tato práce shrnuje současné poznatky o molekulárních mechanismech, které hepatogenezi řídí. Abstract The liver is the largest glandular organ in the human body and provides many essential functions such as productin of bile, detoxication or regulation of blood glucose by degradation of glycogen. Liver is derived from foregut endoderm. The main type of liver cells is hepatocyte. Hepatocytes derived from precursors called hepatoblasts, as well as billiary epithelial cells. In the last decade the results of research have described important interactions growth and transcription factors, which regulate liver development. A lot of informations about these factors and their signaling pathways have identified by experiments on mouse. This thesis summarizes current knowledge of the molecular mechanisms that control hepatogenesis.

Obsah Úvod... 7 1 Játra... 8 1.1 Anatomie jater... 8 1.2 Histologie jater... 9 1.2.1 Jaterní parenchym... 9 1.2.2 Hepatocyty... 10 1.3 Průtok krve játry... 10 1.4 Funkce jater... 11 2 Vývoj jater... 12 2.1 Morfogeneze jater... 12 2.2 Mechanismy indukce a regulace vzniku jaterní tkáně... 15 2.2.1 Formace entodermu... 15 2.2.2 Vývoj předního střeva... 16 2.2.3 Úloha srdečního mezodermu v raném vývoji jater... 17 2.2.4 Úloha mezenchymu septum transversum v raném vývoji jater... 18 2.2.5 Morfogeneze základu jater... 19 2.2.5.1 Hhex... 19 2.2.5.2 Gata... 20 2.2.5.3 Prox1, Onecut OC-1 (HNF6), OC-2... 20 2.2.5.4 Endoteliální buňky... 21 2.2.6 Růst jaterní vychlípeniny... 22 2.2.6.1 HGF... 22 2.2.6.2 TGFβ... 22 2.2.6.3 Hlx, Lhx2, N-myc... 23 2.2.6.4 Přeţití hepatoblastů... 23 2.2.7 Diferenciace hepatoblastů v hepatocyty a ţlučové epiteliální buňky... 23 2.2.7.1 Transkripční a růstové faktory potřebné pro diferenciaci hepatoblastů... 24

2.2.8 Ţlučník a extrahepatální ţlučovody... 26 3 Regenerace jater... 27 3.1 Oválné buňky... 27 3.2 Tvorba hepatocytů z kmenových buněk... 27 4 Vývojové poruchy... 29 4.1 Vrozená vada jaterních ţlučovodů (DPM)... 29 4.2 Alagilleův syndrom... 29 4.3 Progresivní intrahepatální cholestáza... 29 4.4 Cysta choledochu... 30 4.5 Genetická hemochromatóza... 31 4.6 Wilsonova choroba... 31 4.7 Hepatoblastom... 31 4.8 Cystické onemocnění jater... 31 Závěr... 33 Seznam zkratek... 34 Pouţitá literatura... 35 Seznam obrázků... 39

Úvod Játra jsou velice důleţitý a pro ţivot nezbytný orgán. V organismu zastávají mnoho funkcí. Vytváří ţluč, mají detoxikační funkci a podílí se na metabolismu. Základní stavební jednotkou je jaterní lalůček a v něm jsou uspořádány jaterní buňky hepatocyty. Hepatocyty pochází z tzv. hepatoblastů. Hepatoblasty jsou také předchůdci buněk ţlučových epitelů. K tomu, aby se hepatoblasty vytvořily z entodermu předního střeva a aby se z hepatoblastů vyvíjely hepatocyty a ţlučové buňky, je nutné působení různých růstových a transkripčních faktorů. Mechanismy působení transkripčních a růstových faktorů jsou velice sloţité. V posledních letech, se vědci zabývají vývojem jater na molekulární úrovni a snaţí se přijít na to, jak působí signální dráhy faktorů. Ke svým experimentům pouţívají nejčastěji laboratorní myši. U testů, ke kterým byly pouţity myši, jsem tuto skutečnost uvedla, protoţe myší embryogeneze je samozřejmě kratší, neţ lidská. Tudíţ, se její časování liší. V mé práci formou literární rešerše shrnu a srozumitelně vysvětlím poznatky vědců. Pochopení mechanismu vývoje jater na molekulární úrovni je velmi uţitečné. Aplikování těchto poznatků se vyuţívá při tvorbě hepatocytů z kmenových buněk. Hepatocyty odvozené z kmenových buněk se v budoucnu mohou pouţít jakou zdroj pro transplantaci jater. 7

1 Játra 1.1 Anatomie jater Játra jsou největší ţlázou lidského těla a tvoří přibliţně jednu padesátinu váhy lidského těla. Váţí asi 1500 g. U ţen jsou menší neţ u muţů. U novorozence činí hmotnost jater 150 g, coţ je asi jedna pětadvacetina hmotnosti těla. Za jeden rok se hmotnost jater zdvojnásobí a do konce puberty dosáhne dvojnásobku hmotnosti při narození. Mají hnědočervenou barvu a jsou křehká. Proto při nárazech často dochází k natrţení jater a krvácení do břišní dutiny. Vyplňují pravou část peritoneální dutiny a jsou uloţena pod pravou klenbou bránice (viz obr. 1.1). Játra jsou kryta serózním obalem (tunica serosa), který kryje skoro celá játra. Dále jsou kryta fibrózním obalem (ČIHÁK, 2002). Obr. 1.1: Umístění jater v břišní dutině Zdroj: URL 1 Horní plocha jater se nazývá facies diaphragmatica. Je rozdělená na dvě části pars superior směřuje nahoru a pars anterior zase dolů. Facies diaphragmatica naléhá na bránici. Dolní plocha, facies visceralis, naléhá na orgány břišní dutiny. Facies visceralis je mnohem tvarovanější neţ facies diaphragmatica. Horní i dolní plocha do sebe vzadu a vpravo plynule přecházejí. Vpředu je jejich přechod ostrý (PÁČ, 2010). 8

Uprostřed viscerální plochy se nachází jaterní brána, porta hepatis. V oblasti porta hepatis do jater vstupují cévy (vena portae vrátnicová žíla, arteria hepatica propria jaterní tepna, plexus hepaticus) a vystupují ţlučové cesty (ductus hepaticus). (GRIM et al., 2005) Játra jsou poměrně měkká, proto je jejich tvar výsledkem těsného kontaktu s okolními orgány. Na viscerální ploše jater lze najít rozsáhlý otisk ţaludku (impressio gastrica), menší otisk nadledviny (impressio suprarenalis), rozsáhlý otisk pravé ledviny (impressio renalis), otisk jícnu (impressio oesophagea), tlustého střeva (impressio colica) a dvanáctníku (impressio duodenalis). Na diafragmatické ploše je mělký otisk srdce v místě, kde na bránici shora nasedá srdce (impressio cardiaca). (ČIHÁK 2002) Vnitřní členění jater neodpovídá povrchovému členění laloků podle rýh na játrech. Podle společného větvení arteria hepatica, vena portae a intrahepatálních ţlučovodů trias hepatica se játra dělí na dva laloky, pravý lalok, lobus dexter a levý lalok, lobus sinister (viz obr. 1.2) a ty se dále vnitřně dělí na jaterní segmenty. V kaţdém z obou laloků jsou dva velké segmenty (ČIHÁK, 2002). Obr. 1.2: Játra Zdroj: URL 2 1.2 Histologie jater 1.2.1 Jaterní parenchym Morfologickou jednotkou ţlázového parenchymu jater je jaterní lalůček, lobulus hepatis, útvar podoby přibliţně šestibokého hranolu o rozměrech 1 2,5 mm (viz obr. 1.3). V jeho podélné ose probíhá vena centralis. Jaterní lalůček se skládá z jaterních buněk, hepatocytů, které jsou sestaveny do jednovrstevných nebo do dvouvrstevných jaterních trámců. Trámce jaterních buněk vykazují vzhledem k centrální véně charakteristické radiální uspořádání. Mezi trámci probíhají jaterní sinusoidy, které jsou vystlané endotelovými buňkami s ojedinělými 9

fagocyty Kupfferovy buňky. Mezi jaterním trámcem a stěnou sinusoidy je úzký štěrbinovitý perisinusoidální prostor (Disseho prostor), do kterého zasahují dlouhé mikroklky hepatocytů (HORKÝ & ČECH, 2003). Obr. 1.3: Jaterní lalůček Zdroj: URL 3 1.2.2 Hepatocyty Hepatocyty mají polyedrický tvar a jsou velké 25-30 µm, obsahují cytoplazmu s jedním, popř. dvěma i třemi kulatými jádry s nápadnými jadérky. Hepatocyty obsahují četné mitochondrie, objemný Golgiho aparát, hladké a zrnité endoplazmatické retikulum, primární i sekundární lyzosomy a peroxisomy. Kontaktní plochy mezi jaterními buňkami jsou převáţně hladké, pouze v místech ţlučových kapilár se vyskytují mikroklky. Intercelulární ţlučovody či ţlučové kapiláry jsou tenké kanálky o průměru 1 2 µm, které probíhají vţdy mezi dvěma sousedními jaterními buňkami. Povrchy hepatocytů, které ohraničují ţlučovou kapiláru, jsou členité a vybíhají v krátké mikroklky. Hepatocyty vytváří ţluč, která je odváděná do ţlučových kanálků, canaliculi biliferi (HORKÝ & ČECH, 2003). 1.3 Průtok krve játry V jaterní cirkulaci jsou hlavní dvě sloţky. První je sloţka funkční, kterou přivádí vena portae. Tato krev je bohatá na látky vstřebané z potravy a játra ji zpracovávají. Vena portae je tenkostěnná a asi 15 mm široká. Sbírá se z větví přicházejících z nepárových orgánů 10

dutiny břišní. V krvi, která přichází cestou vena lienalis (slezinná ţíla), je obsaţeno krevní barvivo z červených krvinek, které se rozpadají ve slezině. Z barviva je jaterními buňkami vychytáváno ţelezo a část krevního barviva se přemění na ţlučová barviva. Další sloţka cirkulace je sloţka nutritivní. Obsahuje okysličenou krev, kterou přivádí arteria hepatica propria. A. hepatica propria je jednou z větví truncus coeliacus (tepenný kmen vystupující z břišní aorty). Vyţivuje ţlučové cesty, stěny velkých ţil a vazivo (ČIHÁK, 2002). Vena portae a arteria hepatica propria se při vstupu do jater společně větví, procházejí játry a dále se větví společně. Větvením vznikají venae et arteriae interlobulares. Ty se nacházejí v kaţdém druhém portobiliárním prostoru (místo kontaktu tří sousedících lalůčků). Z portobiliárních prostorů cévy vysílají k plochám lalůčků větve venae et arteriae circumlobulares, z kterých vystupují arterioly a venuly do lalůčku mezi trámce buněk. Větve vena portae i arterioly vstupují do sinusoid lalůčku. Sinusoidy tedy přijímají i arteriální krev a postupují do centra lalůčku, kde vstupují do vena centralis. Venae centrales se spojují z více lalůčků ve větší venae sublobulares a ty se spojují ve venae hepaticae, které opouštějí játra. Venae hepaticae jsou tři. Dvě vychází z pravého a jedna z levého laloku a všechny tři vstupují do vena cava inferior (ČIHÁK, 2002). 1.4 Funkce jater Játra jsou naprosto nezbytná pro ţivot. Mají mnoho ţivotně důleţitých funkcí. Protoţe vykazují vysokou metabolickou aktivitu, jsou játra nejteplejším orgánem v lidském těle (39 ºC). Produkují ţluč, která je důleţitá pro trávení a vstřebávaní lipidů. Játra produkují asi 0,7-1,2 litrů ţluči za den. Ţluč obsahuje ţlučové kyseliny a ţlučová barviva. Obsahuje HCO - 3, a proto se podílí na vyrovnávání ph v duodenu. Není přímo odváděna do duodena, ale asi polovina je shromaţďována a zahušťována ve ţlučníku. Játra mají detoxikační funkci. Odbourávají látky tělu vlastní i látky z vnějšího prostředí (alkohol, léky, drogy). Inaktivují některé hormony, např. inzulin. Skladují ţelezo ve formě ferritinu, podílí se i při metabolismu sacharidů (TROJAN et al., 2003). Játra skladují glykogen. Při nízké koncentraci krevní glukózy se glykogen začne odbourávat. Odbouráním glykogenu vzniká glukóza-6-fosfát a působením enzymu glukóza-6- fosfatasy se přemění na glukózu. Glukóza je uvolňována do krve a tím se zvýší její koncentrace. Přeměna neglukózových molekul na glukózu se nazývá glukoneogeneze (GANONG, 2006). V játrech se tvoří močovina v ornithinovém (močovinovém) cyklu. Z molekuly amoniaku a karbamoylfosfátu. Amoniak je pro organismus toxický, proto se musí přeměnit na močovinu, která je vylučována z těla. Játra produkují látky potřebné pro hemokoagulaci (fibrinogen, 11

protrombin). Syntetizují plazmatické bílkoviny a podílí se na metabolismu cholesterolu (TROJAN et al., 2003). 2 Vývoj jater Vývoj člověka začíná oplozením ţenské pohlavní buňky (vajíčko, oocyt) muţskou pohlavní buňkou (spermie). Oplozené vajíčko se nazývá zygota. Po oplození nastává rýhování vajíčka, coţ jsou po sobě následující mitózy. Prvním rýhovacím dělením se zygota rozdělí a vznikají dvě blastomery. Ty se dále dělí a vzniká 4buněčné stadium (40 50 hodin po oplození). Následuje další dělení, neţ vznikne 16buněčné stadium (60 hodin po oplození). V tomto stadiu vstupuje zygota do dělohy a vzniká blastocysta. Blastocysta se skládá z vnitřní masy buněk (embryoblast) a zevní buněčnou vrstvou (trofoblast). Buňky trofoblastu se dostanou do kontaktu s děloţní sliznicí a začíná implantace (nidace). Trofoblast se rozliší na vnitřní cytotrofoblast a vnější syncytiotrofoblast (VACEK, 2006). Embryoblast se začne diferencovat asi v 5. 6. dni vývoje zárodku. Odštěpí se vrstva buněk a embryoblast se rozdělí na dvě vrstvy. Vnější ektoderm, který naléhá na cytotrofoblast a vnitřní entoderm, který se obrací do blastocystové dutiny. Ektoderm se postupně oddělí od cytotrofoblastu. Při oddělování ektodermu se tvoří základ amniové dutiny. K entodermu se přiloţí buňky extraembryonálního mezodermu, který tvoří hranici primitivního ţloutkového váčku. Mezi amniovým a ţloutkovým váčkem se nachází zárodečný terčík. Mezoderm (střední zárodečný list) se zakládá mezi ektodermem a entodermem. Rozkládá se po obou stranách chordy dorsalis a člení se na laterální, intermediární a paraaxiální mezoderm. Paraaxiální mezoderm se štěpí příčnými zářezy v párové útvary, zvané prvosegmenty (somity). Vytváří se jich 42 aţ 44 párů. Podle počtů prvosegmentů se určuje stáří zárodku (VACEK, 2006) 2.1 Morfogeneze jater Z entodermu pochází trávicí a dýchací soustava. Podstatná část trávicí trubice vzniká z primitivního střeva, které se skládá ze tří částí. Přední, střední a zadní střevo. Játra vznikají z předního střeva. Z ventrální stěny duodena se u embryí jiţ se 17 18 prvosegmenty zakládá slepá vychlípenina pro základ jater. Embryo je v té době velké asi 3 mm a staré 3 týdny. Základ jater je uloţen poměrně vysoko. Z kaudální stěny jaterní výchlipky vypučí základ pro ţlučník a jeho vývod (ductus cysticus). Lze rozlišit dvě části základu jater. Větší kraniální část pars hepatica a menší kaudální část pars cystica. Postupně základ jater sestoupí kaudálním směrem (VACEK, 2006). 12

Entoderm pars hepatica proliferuje a rychle vrůstá do mezenchymu septum transversum (ploténka, která odděluje dutinu perikardovou a peritoneální) a mezi oba listy ventrálního mezenteria (mezenterium upíná trávicí trubici k ventrální stěně coelomu). Tím se rychle tvoří solidní buněčné trámce. Buněčné trámce zahýbají vpravo i vlevo od duodena do tvaru písmene U. Tvoří se tak základy pravého a levého jaterního laloku (viz obr. 2.1). (VACEK, 2006) Z buněk jaterního trámce se vytváří hepatoblasty. Analýzy hepatoblastů naznačují, ţe dávají původ hepatocytům i buňkám ţlučovodu. Hepatoblasty mají nepravidelný tvar, velké jádro a obsahují málo organel oproti zralým hepatocytům. Elektronová mikroskopie prokázala, ţe myší buňky jsou nejprve oválné, pak kulaté a nakonec mají polygonální tvar (DUNCAN, 2002). Prorůstáním do mezenchymu septum transversum se jaterní trámce buněk dostanou brzy do styku s venae omphalomesentericae (ţíly, které přivádějí krev ze ţloutkového váčku). Rostoucí trámce jaterních buněk začnou tvořit síť a venae omphalomesentericae se stávají primitivními sinusoidami jater. Z přívodných kmenů venae omphalomesentericae se vytvoří vena advehens hepatis, pozdější vena portae. Z kmenů, které krev odvádějí, se tvoří venae revehentes hepatis, pravostranná a levostranná. Později zůstane zachována pouze pravostranná vena revehens hepatis (VACEK, 2006). V podélné ose trámců jaterních buněk se tvoří koncem 1. měsíce základy ţlučových kapilár. Lumen kanálků je ohraničeno větším počtem buněk. Pak se trámce oplošťují a jsou sloţeny z 2 3 řad buněk. Proto i lumen primitivních ţlučových kapilár je ohraničeno dvěma buňkami. Ductus biliferi (ţlučové kanálky) se diferencují asi v polovině 2. měsíce z trámců jaterních buněk, které jsou uloţené v mezenchymu v sousedství větších kmenů přívodných omfalomezentrických ţil. Ductus biliferi se napojí na ductus hepaticus (jaterní vývod), který se diferencuje z buněk, které spojují jaterní vychlípeninu s masou jaterních trámců. Ve stejnou dobu vzniká ţlučový měchýř a ductus cysticus (vývod ţlučníku). Ductus cysticus se spojuje s ductus hepaticus v ductus choledochus (hlavní ţlučový vývod ústící do duodena). Jeho ústí je nejprve na ventrální straně. Později v souvislosti s rotací duodena se vyústění přesune na dorsální stěnu (VACEK, 2006). 13

Obr. 2.1: Řezy embryem v jaterní krajině. Zdroj: (VACEK, 2006), upraveno 1. a myotom, b chorda, c dorzální aorta, d kanálky mezonefros, e základ pankreatu, f mezenterium, g trámce základu jater, h duodenum, ch célom, i vena omphalomesenterica 2. a neurapofýza, b pleurapofýza, c dorzální aorta, d pankreas, e základ sleziny, f - mesenterium dorsale, g mesenterium ventrale, h játra, ch žaludek, i vena cava inferior, j základ těla obratle 3. a základ arcus vertebrae, b dorzální aorta, c linie srůstu dorzálního mezenteria se zadní stěnou dutiny břišní, d pankreas, e bursa omentalis, f slezina, g ligamentum gastrolienale, h žaludek, ch mesohepaticum ventrale, i omentus minus, j játra, k vena cava inferior, l corpus vertebrae 14

Při vývoji jater se ohraničují pravý a levý lalok. Na dorsální straně hranici tvoří duodenum. Na ventrální straně ohraničení vzniká později. Ohraničení tvoří pozůstatek z fetálního krevního oběhu ligamentum teres hepatis. Metabolická aktivita jaterních buněk se projevuje brzy. Glykogen se tvoří uţ ve 3. měsíci embryonálního vývoje a jeho mnoţství je v buňkách vysoké aţ do porodu. Hepatocyty se začnou podílet i na metabolismu lipidů. Ţlučová barviva se začnou tvořit od 4. měsíce embryonálního vývoje. Mají omezenou detoxikační funkci oproti postnatálnímu období vůči látkám pronikajícím do fetálního oběhu. Začátkem 2. měsíce embryonálního vývoje se začnou diferencovat krevní ostrůvky z mezenchymu mezi trámci jaterních buněk a základy jaterních sinusoid. Hematopoéza v játrech dosahuje maxima v 6. 7. měsíci embryonálního vývoje. Koncem 7. měsíce embryonálního vývoje krvetvorba ustává. Mezi 2. 3. měsícem embryonálního vývoje játra dosahují největšího rozvoje. Tvoří asi 10 % objemu těla. V dalším období jsou v růstu pozadu, u novorozenců tvoří asi 5 % objemu těla. Ve 2. měsíci embryonálního vývoje jsou oba laloky jater téměř stejně velké a zasahují aţ do malé pánve. Potom více roste pravý lalok a levý zůstává pozadu a relativně se zmenšuje. Tak vzniká výrazná asymetrie jater. Zároveň se ţlučník posouvá vpravo od mediánní čáry (VACEK, 2006). 2.2 Mechanismy indukce a regulace vzniku jaterní tkáně Játra pochází z entodermu předního střeva. Na jejich vývoj působí mnoho transkripčních a růstových faktorů. Růstové faktory faktory jsou produkovány buňkami okolních tkání, jako jsou entoderm předního střeva, mezenchym septum transversum a vyvíjející se srdce. Růstové faktory působí vně buňky, váţí se na své receptory na povrchu buněk a tím vyvolají signální kaskádu dějů vedoucí k aktivitě transkripčních faktorů. Transkripční faktory působí přímo v buňce a regulují expresi příslušných genů. 2.2.1 Formace entodermu Růstový faktor Nodal z rodiny růstových faktorů TGFβ (transforming growth factor) iniciuje formaci entodermu i mezodermu. Nízká koncentrace Nodalu navozuje tvorbu mezodermu a naopak vysoká koncentrace navozuje tvorbu entodermu. Nodal stimuluje expresi základní skupiny transkripčních faktorů entodermu, včetně faktoru Sox17 a faktorů Foxa1-3 (HNF3α/β/γ). Přední entoderm potřebuje vyšší koncentraci Nodalu neţ zadní entoderm. Foxa2 je potřeba ke vzniku definitivního předního mezodermu (ZORN, 2008). 15

Sox 17 Působí jako regulátor transkripce DNA. Inhibuje signalizaci Wnt. Má klíčovou roli v regulaci embryonálního vývoje a je potřebný pro normální vývoj entodermu (URL 4). Foxa Skupina transkripčních faktorů Foxa je dlouho zkoumána, a zjistilo se, ţe její členové Foxa1-3 jsou důleţité v několika fázích ţivota savců. Foxa2 je nutný pro tvorbu notochordu. Foxa1 a Foxa2 spolupracují na vývoji entodermu z předního střeva a jsou nezbytné pro vývoj orgánů odvozených z entodermu, tedy i pro vývoj jater. V případě mutace transkripčních faktorů Foxa se játra začnou vyvíjet špatně a nevylučují α-fetoprotein (Afp). Afp je první známka toho, ţe se játra začala správně vyvíjet (FRIEDMAN & KAESTNER, 2006). V postnatálním období se podílí na metabolismu glukózy. U myší, které postrádají transkripční faktor Foxa1 se projevuje hypoglykémie (sníţená hladina glukózy v krvi). Je to způsobeno tím, ţe je oslabena exprese proglukagonu. Transkripční faktory Foxa jsou tedy důleţité pro regulaci glukózy v krvi a jsou nezbytné jak pro játra, tak pro slinivku. Role faktoru Foxa2 ve slinivce se objasnila různými experimenty. Izolovaly se ostrůvky z myší slinivky, kterým chyběl faktor Foxa2 v β-buňkách. Tyto ostrůvky měly dvě vady. Při sníţené koncentraci glukózy nevylučovaly inzulín. A nevhodně vylučovaly inzulín v odpovědi na aminokyseliny (FRIEDMAN & KAESTNER, 2006). 2.2.2 Vývoj předního střeva Trávicí trubice se dělí na přední, střední a zadní střevo (viz obr. 2.2). Vznik jednotlivých částí řídí transkripční faktory. Hhex reguluje vznik předního střeva, Pdx1 středního střeva a Cdx zase zadního (ZORN, 2008). V 8. dni myšího vývoje v entodermu předního střeva probíhá exprese transkripčního faktoru Hhex, který je velmi důleţitý při raném vývoji jater (HUNTER et al., 2007). Překrývající se časové a prostorové působení růstových faktorů FGF (fibloblast growth factors), Wnt/β-katenin (β-katenin je realizátor působení růstového faktoru Wnt), BMP (bone morphogenetic protein) a kyseliny retinové, které jsou vylučovány z okolního mezodermu, určuje polohu entodermu. Jak přesně toto spojení funguje, se ještě přesně neví, ale nedávné studie prokázaly, ţe FGF4 a Wnt potlačují vývoj myšího předního střeva a podporují vývoj myšího zadního střeva. Signály FGF4 a Wnt musí být inhibovány, aby se mohlo vytvořit přední střevo. Z předního střeva jsou vylučovány antagonisté Wnt, např. Sfrp5, kteří zajistí blokaci růstového faktoru Wnt v předním střevě. Experimentální blokování této aktivity v myším vývoji jater bylo dostačující k nesprávné expresi transkripčního faktoru Hhex a 16

jaterní vychlípenina se zaloţila na nesprávném místě. Zajímavé je, ţe o pár hodin později mají Wnt i FGF opačný účinek a vývoj jater ovlivňují pozitivně (McLIN et al., 2007). Vytvoření předního střeva je velmi důleţitý krok ve vývoji jater, protoţe játra se mohou vyvíjet pouze z předního střeva. Tento původ určují transkripční faktory Foxa2, Gata4-6 a Hhex. Mají velice důleţitou roli při rané organogenezi. Vymizení faktorů Foxa1 a Foxa2 z předního střeva způsobí to, ţe se játra nemohou vyvíjet (ZORN, 2008). Obr. 2.2: Myší embrya v různých stádiích vývoje. Zdroj: (ZORN, 2008) Entoderm je označen žlutě, játra červeně a žlučník zeleně. (ps přední střevo, ss střední střevo, zz zadní střevo); 2.2.3 Úloha srdečního mezodermu v raném vývoji jater Studie prokázaly, ţe entoderm předního střeva je ve velmi blízkém kontaktu se srdečním mezodermem. Tento kontakt je velice důleţitý, protoţe některé faktory ovlivňující nástup hepatogeneze pochází právě ze srdečního mezodermu. Patřím sem faktory FGF. Jsou uvolňovány z vyvíjejícího se srdce a jejich činnost je omezena jejich vysokou afinitou k extracelulárnímu matrix (DUNCAN, 2002). Analýzy signálních drah růstového faktoru FGF naznačují, ţe enzym MAPK (mitogeny aktivována kinasa) reguluje expresi jaterních genů a PI3K (phosphoinositol-3 kinasa) podporuje růst jater (CALMONT et al., 2006). To, ţe růstové faktory FGF fungují jako signály pro hepatogenezi bylo dokázáno. Izoloval se přední entoderm z myších embryí ve stádiích od 2 do 6 prvosegmentů. Byl kultivován v přítomnosti nebo absenci faktorů FGF-1, FGF-2 a FGF8b. Zjistilo se, ţe oba faktory FGF-1 i FGF-2 plně nahrazují přítomnost srdečního mezodermu. I kdyţ FGF8b přímo neindukuje 17

vývoj jater, přispívá k růstu jaterní tkáně. Z předního entodermu se můţe vyvíjet i slinivka, ne pouze játra. Kdyţ je entoderm kultivován bez FGF nebo srdečního mezodermu, iniciuje se exprese pankreatických genů. A kdyţ FGF nebo srdeční mezoderm je přidán do kultury, indukuje se v entodermu exprese jaterních genů na úkor těch pankreatických (JUNG et al; 1999). Z toho vyplývá, ţe přední entoderm je původně předurčen k vývoji pankreatu. Faktory FGF, které jsou vylučovány ze srdečního mezodermu, potlačí expresi pankreatických genů a místo slinivky se začnou vyvíjet játra. Základ slinivky pochází tedy z entodermu, který není v blízkosti zárodku srdce, zatím co játra pochází z entodermu, který se srdcem sousedí (DUNCAN, 2002). 2.2.4 Úloha mezenchymu septum transversum v raném vývoji jater Septum transversum pochází z mezodermu a dává původ epikardu a bránici. Septum transversum hraje roli při diferenciaci hepatocytů a při růstu jaterní tkáně. Spolupracuje s vyvíjející se srdeční tkání na řízení hepatogeneze (DUNCAN, 2002). Při nástupu hepatogeneze se uplatňuje růstový faktor BMP4, který byl identifikován v mezenchymu septum transversum v myším embryu ve stádiu 8 prvosegmentů. Bylo to dokázáno tím, ţe vývoj jater selhal u embryí bez BMP4. Další členové BMP rodiny mohou nahradit nedostatek BMP4. BMP je rozhodující při růstu hepatoblastů (DUNCAN, 2002). FGF a BMP kooperují na indukci hepatogeneze v entodermu předního střeva a řídí nástup hepatogeneze (viz obr. 2.3). Spolupracují i při vývoji jiných orgánů, např. při kardiogenezi (BARRON et al., 2000). Se septum transversum úzce spolupracuje extracelulární matrix (ECM). Na ECM se váţí růstové faktory (Wnt, FGF) a následně pak aktivují receptory na přítomných buňkách. Dále je úloha ECM dána tím, ţe proteiny z kterých se skládá, jsou ligandy pro integriny, coţ jsou buněčné receptory. Integriny se skládají z různých kombinací podjednotek α a β. Myší embrya bez podjednotek β1 umírají ještě před nástupem hepatogeneze. Takţe nemohou být pouţita ve studiu vývoje jater. Nicméně se zjistilo, ţe podjednotky β1 jsou důleţité při vymezování a udrţování hepatocytů (FASSLER & MEYER, 1995). 18

Obr. 2.3: Indukce hepatogeneze růstovými faktory FGF a BMP. Zdroj: (DUNCAN, 2002); upraveno Kolem stádia 7 prvosegmentů (somitů) entoderm předního střeva (černá barva) leží vedle srdečního mezodermu (červená barva). Ve stádiu 14 prvosegmentů se začíná základ jater. Pro rozšíření základu jater je třeba faktoru BMP ze septum transversum (žlutá barva) a dalších faktorů (??) z endoteliálních buněk (modrá barva). 2.2.5 Morfogeneze základu jater Krátce po specifikaci jater (8. 9. den myšího vývoje) se začnou projevovat jaterní geny (Albumin, Afp, HNF4α hepatocyte nuclear factor). Buňky se přemění z jednoduchého kubického tvaru na víceřadý cylindrický epitel. Tak se formuje vychlípenina jater. Během devátého dne se rozpadá destičkovitá bazální vrstva, která obklopuje jaterní entoderm a hepatoblasty se oddělují a migrují do mezenchymu septum transversum (STM). Následně se játra mohou začít vytvářet (BORT et al., 2006). Pro tento proces je potřeba mnoha transkripčních faktorů, jako jsou např. Hhex, Gata4 a Gata 6, Prox1 a Onecut faktory. 2.2.5.1 Hhex V 8. dni myšího vývoje se zvětšuje koncentrace transkripčního faktoru Hhex v jaterním entodermu a přetrvává ve všech jaterních i ţlučových buňkách během vývoje. Studie naznačily, ţe transkripční faktor Hhex je potřebný v mnoha dalších stádiích vývoje. Řídí proliferaci entodermu předního střeva a také delaminaci a diferenciaci hepatoblastů. Také je nezbytný při morfogenezi ţlučových cest jak extrahepatálních tak i intrahepatálních (HUNTER et al; 2007). Embrya bez faktoru Hhex dočasně vyjadřují jaterní geny, ale epitel se zastaví v jednoduchém cylindrickém stádiu a hepatoblasty nedokáţí migrovat do mezenchymu septum transversum (BORT et al., 2006). 19

2.2.5.2 Gata Transkripční faktory Gata 4 a Gata 6 jsou vyjadřovány v různých tkáních včetně entodermu předního střeva, srdce a STM. Mutace obou transkripčních faktorů jak Gata 4 nebo Gata 6 vedou k brzkému úmrtí myšího embrya (DUNCAN; 2005). Gata 6 -/- embrya (embrya bez transkripčního faktoru Gata 6) umírají ještě před nástupem gastrulace. U Gata 4 -/- embryí se vady projevují uţ při morfogenezi předního střeva (KEIJZER et al., 2001). Nicméně u tetraploidních embryí, které měly ektoblast odvozený z kmenových buněk bez transkripčního faktoru Gata 4 nebo Gata 6, byl vývoj jater zastaven aţ v 9,5 dni myšího vývoje. U dalších podobných mutantů začala exprese jaterních genů, ale neudrţela se a hepatoblasty se nezačaly oddělovat. U kombinace Gata 4 -/- a Gata 6 -/- mutantů se objevily vady jiţ brzy při morfogenezi předního střeva a játra se nezačala vůbec vyvíjet (ZHAO et al., 2005). 2.2.5.3 Prox1, Onecut OC-1 (HNF6), OC-2 Transkripční faktory Prox1, Onecut-1 (OC-1, který je také znám jako HNF6) a Onecut-2 (OC-2) také regulují delaminaci hepatoblastů, ale působí o něco později neţ Hhex a Gata. Exprese transkripčního faktoru Prox1 začíná v jaterním epitelu v 8,5 dni myšího vývoje (BURKE & OLIVER., 2002).. Kdyţ chybí Prox1 i OC faktory rozklad bazální laminy obklopující základ jater se zpozdí, naruší se migrace hepatoblastů do STM, hepatoblasty se začnou shlukovat a exprese genů potřebných pro migraci je narušena. Tudíţ působení OC-1 a OC-2 transkripčních faktorů je nutné pro včasnou degradaci bazální laminy. Pozdní invaze hepatoblastů způsobí to, ţe se játra nedostatečně vyvinou. Kvůli pozdnímu působení těchto transkripčních faktorů se objeví vady i na ţlučníku i ţlučových cestách (MARGAGLIOTTI et al., 2007). Transkripční faktory Prox1 a Onecut1 a Onecut2 řídí migraci hepatoblastů tím, ţe regulují expresi proteinů odpovědných za přestavbu extracelulárního matrix. Přestavbu ECM zprostředkovávají enzymy jako např. matrix metaloproteinasa (MMP). MMP jsou enzymy, které jsou vylučovány buňkami a jejich funkce je narušení sítě proteinů v ECM, díky tomu mohou buňky migrovat do uvolněného prostoru. Klíčovou úlohu v migraci buněk má nejen narušení ECM, ale také přestavba cytoskeletu buňky. Přestavba cytoskeletu je regulována aktivitou malých GTPas. GTPasa je enzym, který štěpí molekulu GTP. Štěpením makroergní vazby v GTP se uvolní energie potřebná pro přenos signálu uvnitř buňky. Hepatoblasty nemigrují do STM v embryích, které mají mutace na genu Pccmt (prenylcysteine carboxylmethyltransferase). Pccmt je protein, který reguluje funkci GTPas, takţe jeho poškození vede k poruše přestavby cytoskeletu a moţnosti motility buněk. (ZORN, 2008). 20