2
ABSTRAKT V poslední dob je celosv tov a rovn ž v R v nována zvýšená pozornost senzoricky aktivním látkám ovliv ujícím kvalitu piva. Mezi senzoricky aktivními látkami ovliv ujícími zásadn kvalitu piva hrají významnou úlohu heterocyklické a sirné slou eniny, z nichž které se vyzna ují vysokou senzorickou aktivitou i v extrémn nízkých koncentracích. Stopová množství t chto slou enin, která lze b žn nalézt v potravinách, se spolupodílejí na vytvá ení jejich aroma a tento vliv lze obecn hodnotit jako p íznivý. U sladu, resp. u piva však toto platí jen v omezené mí e a p ítomnost heterocyklických a sirných látek se hodnotí spíše nep ízniv. Cílem p edložené práce je poskytnout p ehled o problematice sirných slou enin v je meni, sladu a pivu, popsat metabolické dráhy vedoucí k jejich vzniku a experimentáln ov it možnosti jejich stanovení s využitím moderních analytických metod. Sirné aminokyseliny, které jsou p irozenou sou ástí je mene, sladu i piva jsou prekursory vzniku t kavých sirných látek. Pro analytická sledování byly vybrány nej ast ji se vyskytující sirné aminokyseliny metionin, cystein a homocystein. K jejich stanovení v je meni, sladu a pivu byla použita metoda plynové chromatografie. P ed vlastní analýzou byly sirné aminokyseliny derivatizovány za vzniku t kavých N(,S)-ethoxykarbonyl propyl ester, které byly následn identifikovány metodou plynové chromatografie ve spojení s hmotnostním detektorem (GC/MSD) a analyzovány metodou plynové chromatografie s plamenofotometrickým detektorem (GC/ FPD). ímá analýza sirných t kavých látek je možná jen z ídka, protože se nacházejí v analyzovaných matricích (slad, pivo) ve velmi nízkých koncentracích ( g/kg,l - ng/kg,l). ed vlastní analýzou je t eba analyty extrahovat z matrice a zakoncentrovat. K extrakci a následnému zakoncentrování sirných t kavých látek byly experimentáln porovnávány moderní analytické metody SPME (mikroextrakce na pevnou fázi), SPDE (dynamická mikroextrakce na pevnou fázi) a TDAS (automatizovaná termická desorpce). Pro vlastní analýzu sirných t kavých látek byla použita plynová chromatografie ve spojení s plamenofotometrickým detektorem. Byly sledovány tyto t kavé sirné látky: dimethylsulfid, dimethyldisulfid, dimethyltrisulfid, sirouhlík, ethylsulfid, diethyldisulfid, methionol, 3- methylthiofen, ethylthioacetát, 2-methyl-1-buthanthiol. V analyzovaných vzorcích je mene byl ve významném množství detekován pouze metionin. Sledován byl nejen obsah, ale i závislost na odr a lokalit. Byly také sledovány zm ny obsahu methioninu, cysteinu a PDMS v pr hu sladování. Výsledky prokázaly výrazný pokles obsahu t chto látek v závislosti na teplot hvozd ní. Pro analýzy vybraných sirných t kavých látek v pivu byly u metody SPME testovány i typy vláken. PEG vlákno se stacionární fází Carbowax, PDMS vlákno se stacionární fází polydimethylsiloxan a kombinované vlákno CAR/PDMS Carboxen a polydimethylsiloxan. Touto metodou byly detekovány sirouhlík, methionol, dimethylsulfid, 3- methylthiophen a diethyldisulfid. bsah ostatních analyzovaných sirných t kavých látek byl pod mezí detekce. Dále byla ov ována možnost použití metod SPDE a TDAS. Bylo zjišt no, že ob metody jsou vhodné pro stanovení sirných t kavých látek v pivu. KLÍ VÁ SLVA Sirné látky, methionin, pivo, pivovarské suroviny, GC/MS. 3
ABSTRACT Much attention has been recently devoted to sensorially active substances affecting beer quality in the Czech Republic and worldwide. Among them, the heterocyclic and sulphur containing compounds play an important role, some of them with high sensorial activity even in extremely low concentrations. Trace amounts of these compounds, which can be frequently found in foods, participate in formation of their aroma and this effect can be generally evaluated as favorable However, in malt or beer it is true only to a limited extent and the presence of heterocyclic and sulphur containing compounds are in this respect assessed rather unfavorably. The aim of the present study was to provide a survey about of problems in the field of sulphur containing compounds in barley, malt and beer, to describe metabolic paths leading to their formation and to verify experimentally possibilities of their determination using modern analytical methods. Sulphur-containing amino acids are a natural part of barley, malt and beer and are precursors of the origin of volatile sulphur substances. The most frequently occurring sulphur amino acids, metionine, cysteine and homocysteine, were selected for analytical monitoring. The method of gas chromatography was used to determine sulphur-containing amino acids in barley, malt and beer. Prior to the analysis, sulphur-containing amino acids were derived and volatile N(,S)-ethoxycarbonyl propyl esters were formed; they were subsequently analyzed using the gas chromatography with mass detector (GC/ MSD) and the gas chromatography with flame photo detector (GC/ FPD). Direct analysis of sulphur volatile substances is possible only rarely as they are found in the analyzed matrices (malt, beer) only in very low concentrations ( g/kg,l - ng/kg,l). Before the analysis, the analytes must be extracted from the matrix and concentrated. The modern analytical methods SPME (Solid Phase Micro Extraction), SPDE (Solid Phase Dynamic Extraction) and TDAS (Thermal Desorption Autosampler) were experimentally compared for the extraction and subsequent concentration of sulphur volatile substances. The method of gas chromatography with flame photo detector was used to determine sulphur volatile substances. Following volatile sulphur substances were monitored: dimethyl sulphide, dimethyl disulphide, dimethyl trisulphide, carbon disulphide, ethyl sulphide, diethyl disulphide, methionol, 3-methylthiophen, ethyl thioacetate, 2-methyl-1-buthanthiol. nly metionine was detected in significant amounts in the barley samples analyzed. Not only content but also dependence on a variety and locality were studied. Further, changes in methionine, cysteine and PDMS content during malting were followed. Results proved a significant decline in these substances content depending on the kilning temperature. Three types of fibers were tested for the analyses of the selected volatile sulphur substances in beer in the SPME method. PEG - a fiber with stationary phase Carbowax, PDMS - a fiber with stationary phase polydimethylsiloxan and a combined fiber CAR/PDMS - Carboxen and polydimethylsiloxan. Carbon disulphide, methionol, dimethyl sulphide, 3- methylthiophen and diethyl disulphide were detected with this method. Content of the other analyzed volatile sulphur substances was below the limit of detection. Further was tested usage the SPDE and TDAS methods. Both methods appear to be the suitable for the determination of volatile sulphur substances in beer. KEYWRDS sulphur compounds, methionine, beer, brewing materials, GC/MS 4
MIKULÍKVÁ, R.: Studium vybraných typ sirných látek v pivu a pivovarských surovinách. Brno: Vysoké u ení technické v Brn, Fakulta chemická, 2010. 111 s. Vedoucí diserta ní práce doc. RNDr. Ivana Márová, CSc. PRHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diserta ní práci vypracovala samostatn a že všechny použité literární zdroje jsem správn a úpln citovala. Diserta ní práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brn a m že být využita ke komer ním ú el m jen se souhlasem vedoucího diserta ní práce a d kana FCH VUT... podpis studenta Pod kování: Na tomto míst bych ráda pod kovala vedoucí diserta ní práce doc. RNDr. Ivan Márové, CSc. za odborné vedení, konzultace a cenné rady a všem svým koleg m za podporu p i realizaci této práce. 5
BSAH 1. ÚVD... 9 2. TERETICKÁ ÁST... 10 2.1. Sirné aminokyseliny... 10 2.1.1. Methionin... 10 2.1.2. Ethionin... 11 2.1.3. Cystein... 11 2.1.4. Homocystein... 12 2.1.5. S-methyl-L-methionin (SMM)... 13 2.2. Senzoricky aktivní sirné látky... 14 2.2.1. xid si itý... 14 2.2.2. Sulfan... 14 2.2.3. Sulfidy a polysulfidy... 14 2.2.3.1 Dimethylsulfid... 14 2.2.3.2 Dimethyldisulfid... 15 2.2.3.3 Diethyldisulfid... 15 2.2.3.4 Dimethyltrisulfid... 15 2.2.3.5 Dimethyltetrasulfid... 15 2.2.3.6 3,3-dimethylallyl-methylsulfid... 15 2.2.3.7 Methylethylsulfid, diethylsulfid a ethylpropylsulfid... 16 2.2.4. Thioalkoholy... 16 2.2.4.1 Methanthiol... 16 2.2.4.2 Ethanthiol... 16 2.2.4.3 3-methyl-2-buten-1-thiol... 16 2.2.4.4 4-merkaptopenthan-2-ol... 16 2.2.5. Thioestery... 16 2.2.5.1 S-methylthioacetát... 17 2.2.5.2 S-ethylthioacetát... 17 2.2.5.3 S-methylthiopropionát... 17 2.2.5.4 S-methylthiobutyrát, S-methyl-3-methylbutyrát, S-methylthiopentanát, S-methyl-2- methylthiopentanát, S-methylthiohexanát a S-methylthioheptanát... 17 2.2.5.5 S-methyl-2-methylthiopropionát, S-methyl-2-methylthiobutyrát, S-methyl-3- methylthiobutyrát... 17 2.3. Výskyt a význam sirných látek v je meni, sladu a pivu... 17 2.4. Metody stanovení aminokyselin v biologických matricích... 20 2.4.1. Kapilární elektromigra ní metody... 20 2.4.2. Chromatografické metody... 21 2.4.2.1 Vysokoú inná kapalinová chromatografie (HPLC)... 22 2.4.2.2 Automatický analyzátor aminokyselin... 24 2.4.2.3 Plynová chromatografie... 24 6
2.4.3. Možnosti provedení derivatizace v chromatografii... 26 2.4.3.1 Derivatizace p ed kolonou (p ed separací) - pre-column... 26 2.4.3.2 Derivatizace na kolon (b hem separace) - on-column... 26 2.4.3.3 Derivatizace za kolonou (po separaci) - post-column... 26 2.4.4. Derivatizace aminokyselin pro analýzu metodou GC... 26 2.4.4.1 Derivatizace aminokyselin alkyl-chlorformiáty... 27 2.5. Metody stanovení sirných senzoricky aktivních látek... 28 2.5.1. Extrakce sirných látek... 29 2.5.1.1 Destilace s vodní parou... 29 2.5.1.2 Headspace techniky... 29 2.5.1.3 Mikroextrakce tuhou fází (Solid Phase Microextraction SPME)... 30 2.5.1.4 Dynamická mikroextrakce tuhou fází (Solid Phase Dynamic Microextraction SPDE). 32 2.5.1.5 Single-drop mikroextrakce (Single Drop Microextraction SDME)... 33 2.5.1.6 ITEX In-Tube Exraction... 33 2.5.2. Chromatografické stanovení sirných t kavých látek v pivu a surovinách... 34 3. CÍL PRÁCE... 36 4. EXPERIMENTÁLNÍ ÁST... 37 4.1. Materiál a metodické postupy... 37 4.1.1. Vzorky je men a slad... 37 4.1.2. Vzorky piv... 37 4.1.3. Chemikálie, laboratorní vybavení a p ístroje... 39 4.2. Metody... 40 4.2.1. Technologie mikrosladování... 40 4.2.2. Stanovení methioninu, cysteinu a homocysteinu plynovou chromatografií v zrnu je mene, sladu a pivu... 41 4.2.2.1 Extrakce... 41 4.2.2.2 edkolonová derivatizace pro GC stanovení... 41 4.2.2.3 Instrumentace a chromatografické stanovení... 41 4.2.3. Stanovení methioninu kapalinovou chromatografií ve sladu... 42 4.2.3.1 Extrakce... 42 4.2.3.2 edkolonová derivatizace pro HPLC stanovení... 43 4.2.3.3 íprava mobilní fáze A... 43 4.2.3.4 Instrumentace a chromatografický systém:... 43 4.2.4. Stanovení prekursor dimethylsulfidu plynovou chromatografií ve sladu a pivu. 44 4.2.4.1 Instrumentace a chromatografické stanovení... 44 4.2.5. Stanovení sirných t kavých látek metodou HS-SPME/GC/FPD v pivu... 44 4.2.5.1 Extrakce... 44 4.2.5.2 Instrumentace a chromatografické stanovení... 45 4.2.6. Porovnání stanovení sirných t kavých látek metodou SPME, SPDE a TDAS... 45 4.2.6.1 Stanovení sirných t kavých látek automatizovanou metodou SPME, SPDE... 46 4.2.6.2 Stanovení sirných t kavých látek metodou TDAS... 46 7
4.2.6.3 Instrumentace a chromatografické stanovení... 47 4.2.7. Validace metody... 48 4.2.8. Statistické zpracování... 48 5. VÝSLEDKY... 49 5.1. Stanovení sirných aminokyselin plynovou chromatografií... 49 5.1.1. ptimalizace p ípravy vzorku... 49 5.1.2. Volba derivatiza ního inidla... 50 5.1.3. ptimalizace chromatografického systému... 51 5.1.4. Validace metody stanovení sirných aminokyselin v zrnu je mene, sladu a pivu.. 55 5.1.5. Výsledky analýz sirných aminokyselin v zrnu je mene, sladu a pivu... 55 5.1.6. Porovnání HPLC a GC metod pro stanovení sirných aminokyselin... 62 5.2. Stanovení prekursor dimethylsulfidu plynovou chromatografií... 63 5.2.1. Výsledky analýz prekursor dimethylsulfidu ve sladu a pivu... 64 5.3. Sledování obsahu methioninu, cysteinu a prekursor dimethyldsulfidu b hem hvozd ní (pražení) sladu... 69 5.4. Stanovení sirných t kavých látek v pivu... 70 5.4.1. ptimalizace SPME/GC/FPD... 70 5.4.2. Analýza vzork piv... 72 5.4.3. Porovnání automatizované HS-SPDE, HS-SPME a TDAS metody... 75 6. DISKUSE... 79 7. ZÁV RY... 84 8. SEZNAM PUŽITÝCH ZDRJ... 86 9. SEZNAM PUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBL... 92 10. SEZNAM P ÍLH... 93 8
1. ÚVD Pivo pat í již po staletí k tradi ním eským nápoj m. Vždy bylo považováno nejen za osv žující, ale také za velmi zdravý, výživný a chutný nápoj, který m že být dokonce lékem na adu nemocí. V poslední dob je celosv tov a rovn ž v eské republice v nována zvýšená pozornost senzoricky aktivním látkám ovliv ujícím kvalitu piva. Na senzorickém charakteru i analytickém složení piva se spolupodílí kvalita pivovarských surovin, technologie výroby sladiny a mladiny i technologie kvašení a zrání piva. V eské republice jsou kladeny zna né nároky zejména na použití vysoce kvalitních eských pivovarských surovin (je men, slad a chmel). eská republika je jedinou zemí ve sv, ve které pivovarští odborníci rozlišují u nových odr d je mene, zda je to odr da sladovnického je mene vhodná pro exportní slad, nebo pro zachování senzorického charakteru národního nápoje. Rovn ž eský chmel edstavuje špi ku mezi jemnými aromatickými chmely. Ke specifickým znak m eského piva pak pat í p edevším plnost chuti a zlatožlutá barva. Dalším d ležitým atributem je správná p nivost piva; smetanová hustá p na chrání pivo p ed oxidací. Mezi senzoricky aktivními látkami ovliv ujícími zásadn kvalitu piva hrají významnou úlohu heterocyklické a sirné slou eniny, z nichž n které se vyzna ují vysokou senzorickou aktivitou i v extrémn nízkých koncentracích. Stopová množství t chto slou enin, které lze b žn nalézt v potravinách, se spolupodílejí na vytvá ení jejich aroma a tento vliv lze obecn hodnotit jako p íznivý. U sladu, resp. u piva to však platí jen ve velmi omezené mí e a p ítomnost heterocyklických a sirných látek se v tomto sm ru hodnotí spíše nep ízniv. Sirné slou eniny se do piva dostávají bu s výchozími surovinami (slad, chmel), nebo vznikají v pr hu chemických i enzymatických reakcí b hem jednotlivých etap výroby (rmutování, va ení, fermentace, stárnutí). V je meni a chmelu m že obsah sirných slou enin záviset nejen na odr, ale i na p stebním míst, pr hu po así a použité technologii stování. U sladu pak závisí obsah sirných látek p edevším na technologii sladování a eventuální kontaminaci nežádoucími mikroorganizmy. P estože v tšina sirných slou enin obsažených v pivu jsou látky net kavé a tudíž nejsou p ímo odpov dné za sirné v a chuti piva, jsou tyto slou eniny d ležité jako prekursory, z nichž mohou za ur itých podmínek senzoricky aktivní slou eniny vznikat. Cílem p edložené práce je poskytnout p ehled o problematice sirných slou enin v je meni, sladu a pivu, popsat metabolické dráhy vedoucí k jejich vzniku a ov it možnosti jejich stanovení s využitím moderních analytických metod. Sou ástí práce je analýza vybraných typ sirných látek v pivu a pivovarských surovinách s využitím optimalizovaných extrak ních a analytických postup. 9
2. TERETICKÁ ÁST tšina sirných slou enin p ítomných v je meni, sladu a pivu jsou net kavé látky (aminokyseliny, bílkoviny, anorganické sírany). Tyto látky nejsou p ímo odpov dné za nep íznivé v a chuti piva, ale jsou d ležité jako prekursory, ze kterých za ur itých podmínek mohou vznikat senzoricky aktivní látky. Takto vzniklé slou eniny jsou ve v tšin ípad t kavé a jejich množství bývá nižší než 1 % z celkového množství látek, které mají ve své molekule síru a jsou obsaženy v pivu. Skute ná množství látek odpov dných za sirné jsou proto extrémn nízká. 2.1. Sirné aminokyseliny 2.1.1. Methionin Methionin je esenciální sirná aminokyselina. Je stavební jednotkou bílkovin a je donorem aktivních methylových skupin. Zahajuje biosynthesu bílkovin, ale v rámci posttransla ních modifikací bývá následn z N-konce peptidového et zce odšt pen [1,2]. Methionin se m že spojit s energeticky bohatým adenosintrifosfátem a vytvo it univerzální methyla ní koenzym S-adenosylmethionin. Tato pom rn nestálá slou enina poskytuje mnoha látkám methylovou skupinu jako stavební jednotku jejich molekul. Po každém p edání této skupiny z stane z jeho molekuly nestálý S-adenosylhomocystein, který se rozpadne na adenosin a homocystein [2]. S H 3 C - + NH 3 br. 1: Chemický vzorec methioninu 10
- NH 3 + N N NH 2 H 3 C S + N N P i + PP i H H R - S CH 3 NH 3 + ATP methionin THF Methionin Adenosyl Transferáza Methionin Syntáza S-adenosyl methionin homocystein Methyl Transferáza Hydroláza R-CH 3 S-adenosyl homocystein H 2 - + NH 3 S H N H N N N NH 2 N 5 -methyl tetrahydrofolát + H 3 N - adenosin SH br. 2: Cyklus vzniku S-adenosylmethioninu [2] 2.1.2. Ethionin Ethionin je S-ethyl analog aminokyseliny methioninu. V je meni, sladu ani pivu se ethionin nevyskytuje [3]. H 3 C S NH 3 + - br. 3: Chemický vzorec ethioninu 2.1.3. Cystein Cystein je aminokyselina, která ve své molekule obsahuje thiolovou skupinu -SH. Skupina -SH je pom rn reaktivní, podílí se významn na struktu e bílkovin (tvo í disulfidové stky). Cystein je sou ástí tripeptidu glutathionu, který se podílí na ad intracelulárních 11
oxida -reduk ních reakcí. Dekarboxylací cysteinu vzniká významný biogenní amin cysteamin. Cystein je také produktem transformace nadbyte ného homocysteinu. H S - + N H 3 br. 4: Chemický vzorec cysteinu 2.1.4. Homocystein Homocystein je jednoduchá aminokyselina obsahující síru, která hraje d ležitou úlohu v biochemických pochodech bu ky. Tyto pochody jsou geneticky naprogramovány a regulovány zp tnými vazbami a díky tomu se ve vnit ním prost edí živé bu ky udržuje rovnováha. d v tšiny aminokyselin se homocystein liší tím, že není sou ástí bílkovinných molekul. V bu kách vzniká z S-adenosylmethioninu a následn se využije bu k obnov methioninu, nebo k tvorb cysteinu. V reduk ním prost edí probíhá obnova methioninu. V oxida ním prost edí se homocystein nevratn m ní na cystein [2]. V bu ce se musí udržovat nízká koncentrace homocysteinu, protože molekula homocysteinu obsahuje velmi reaktivní volnou skupinu SH. P i poruše cyklu vzniku a em ny homocysteinu se jeho zvýšená koncentrace projeví poškozením enzym a oslabením nebo výpadkem jimi ízených biochemických proces [2]. HS H NH 2 br. 5: Chemický vzorec homocysteinu 12
- NH 3 + + - NH 3 + Cystathionin syntáza + H 3 N S - NH 3 + H H 2 HS homocystein serin cystathionin - NH 4 + + - + - NH 3 + Cystathionináza CH 3 a-ketobutyrát SH cystein H 2 br. 6: Cyklus p em ny homocysteinu na cystein [2] 2.1.5. S-methyl-L-methionin (SMM) S-methylmethionin vzniká metylací methioninu v cyklu sirných aminokyselin (obr. 8) a pat í mezi hlavní meziprodukty vzniku senzoricky aktivních látek b hem výroby piva [2,4]. Spolu s dimethylsulfoxidem vzniká p sobením enzym ve sladu b hem sladování ve vysokých koncentracích [5]. B hem hvozd ní sladu, když teplota p esáhne 60 C, je S- methylmethionin degradován na homoserin a dimethylsulfid. S-methylmethionin je hlavním prekursorem dimethylsulfidu. - N H 3 + H 3 C S + C H 3 br. 7: Chemický vzorec S-methyl-L-methioninu 13
2.2. Senzoricky aktivní sirné látky Sirné slou eniny, které mohou ovlivnit kvalitu sladu a piva, se d lí podle své chemické struktury zpravidla na následující látky a skupiny látek [4]. 2.2.1. xid si itý xid si itý je všeobecn znám jako látka s antioxida ními vlastnostmi a slouží k úprav potravin za ú elem zlepšení p edevším jejich trvanlivosti i vzhledu. Jeho význam spo ívá v tom, že participuje v redoxních systémech. Tvo í slou eniny s aldehydy a ketony a zárove inhibuje enzymy. xid si itý je p irozenou složkou sladu a údaje o jeho obsahu se pohybují v rozmezí 0 až 64 mg.kg 1. bsah oxidu si itého ve sladu je závislý na tom, zda byl slad sí en v pr hu hvozd ní a jaký druh paliva byl použit k vytáp ní hvozdu s p ímým otopem. V sou asnosti se oxid si itý považuje za jednu z nejd ležit jších látek, které mají vliv na senzorickou stabilitu v a chuti piva [6]. 2.2.2. Sulfan Jednou z nejb žn jších p in nep íjemných sirných chutí a v ní piva bývá sulfan. bsah v mladin se pohybuje v rozmezí 13 až 27 g.l 1 a je siln ovlivn n provzdušn ním horké mladiny a stupn m odstran ní kal. B žné pivo obsahuje pouze stopy sulfanu a v tší ást iont síry je vázána na t žké kovy 7,8,9. 2.2.3. Sulfidy a polysulfidy Sulfidy mají obecný vzorec R-S-R a polysulfidy R-(S)-R. Pat í mezi nejvíce aromatické sirné slou eniny. Jejich nejvýznamn jším zástupcem je dimethylsulfid. Koncentrace dalších sulfid v pivu je sice o jeden až dva ády nižší než je tomu u dimethylsulfidu, ale n které z nich jsou rovn ž velmi významné z hlediska jejich senzorických vlastností (tabulka 1) [4]. 2.2.3.1 Dimethylsulfid V sou asné dob se jedná o nejsledovan jší sirnou slou eninu, která výrazn ovliv uje senzorické vlastnosti piva. Jeho obsah se pohybuje v rozmezí jednotek až stovek g.l 1 v závislosti na typu piva, použité technologii a surovinách, p edevším sladu. Názory na prahovou koncentraci dimethylsulfidu se liší, ale v tšinou se považuje za hranici hodnota okolo 35 40 g.l 1 4,10,11. Protože v nižších koncentracích je považován za aromatickou složku ležáckých piv, je jeho ur itá koncentrace nezbytná, ba dokonce žádoucí 12,13. Charakteristická v dimethylsulfidu je udávána po va ené zelenin (kapust i zelí) 12,14. Dimethylsulfid v pivu pochází p evážn ze sladu. Dimethylsulfid v chmelu má zanedbatelný význam, nebo se z velké ásti odstraní chmelovarem 4. Hlavními prekursory dimethylsulfidu jsou S-methylmethionin a dimethylsulfoxid (DMS), které se vyskytují ve sladu b hem sladování ve vysokých koncentracích. 4,5. 14
2.2.3.2 Dimethyldisulfid Dimethydisulfid má typický sirný zápach, v nižších koncentracích páchne po va eném kv táku. Prahová hodnota se udává v rozmezí 3 až 7 g.l 1 14. 2.2.3.3 Diethyldisulfid 14. Diethyldisulfid páchne po spálené gum a jeho prahová hodnota není p esn stanovena 2.2.3.4 Dimethyltrisulfid Dimethyltrisulfid zapáchá po erstvé cibuli a jeho v je štiplavá 15. Jeho prahová hodnota je 0,4 g.l 1, což znamená, že se jedná o jednu z nejvíce senzoricky aktivních látek 7. P ítomnost tohoto polysulfidu byla detekována v ko aku, whisky, vín a piv 16. Koncentrace v pivu se pohybuje v rozmezí 0,01 až 0,7 g.l 1. Dimethyltrisulfid je rovn ž obsažen ve sladu a je také považován za jednu ze senzoricky nejaktivn jších složek chmelového olejí ku, který je hlavním zdrojem této látky [17,18]. Protože má vysoký bod varu, stoupá jeho koncentrace s prodlužující se délkou chmelovaru. V pr hu kvašení op t klesá, což se vysv tluje aktivitou kvasnic. Rovn ž piva vyrobená ze siln provzdušn ných mladin vykazují vyšší obsah této slou eniny. Vzhledem k jeho velmi nízké koncentraci je analytické stanovení zatím velmi obtížné. 4 2.2.3.5 Dimethyltetrasulfid Jeho zápach se udává jako po va ené zelenin, po cibuli, po gum. Prahová hodnota je ibližn 0,2 g.l 1 19. Tabulka 1: a práh vnímání alkylsulfid a alkylpolysulfid Slou enina Práh vnímání (ppm) Dimethylsulfid zkažená vejce, zelí 50 Diethylsulfid cibule, esnek 1,2 Diisopropylsulfid cibule, esnek, éter 20 Dimethyldisulfid va ené zelí, cibule, kau uk 3-50 Diethyldisulfid pálící se guma, po sí e, sladce 0,4-30 Dimethyltrisulfid cibule, po sí e, va ená zelenina 0,2 Dimethyltetrasulfid cibule, po sí e, va ená zelenina 0,2 2.2.3.6 3,3-dimethylallyl-methylsulfid 3,3-dimethylallyl-methylsulfid páchne po gum i cibuli. Jeho prahová hodnota je 0,2 g.l 1. Do piva se dostává z chmele, kde je sou ástí silic 19. 15
2.2.3.7 Methylethylsulfid, diethylsulfid a ethylpropylsulfid Tyto polysulfidy byly identifikovány v kvasných plynech, ale z pivovarského hlediska jsou považovány za mén významné 19. 2.2.4. Thioalkoholy Thioalkoholy, n kdy též je používán název merkaptany, mají obecný vzorec R - SH. Ve v tšin p ípad jsou odpov dné za mladý buket piva a n které se tvo í až po ozá ení UV paprsky. 2.2.4.1 Methanthiol Methanthiol je plyn s v ní po zkažených vejcích i shnilém kv táku. Prahová hodnota se udává v rozmezí 1,5 až 6 g.l 1. Skute né hodnoty se pohybují okolo 2 g.l 1. B hem kvašení se jeho koncentrace tém nem ní. Jeho obsah se mírn zvyšuje p i skladování piva v zelených lahvích vystavených slune nímu zá ení 20. 2.2.4.2 Ethanthiol Ethanthiol má charakteristickou v ni po shnilé cibuli i esneku. Jeho prahová hodnota se udává od 0,5 do 10 g.l 1. Skute né koncentrace v pivu se pohybují v pr ru okolo 0,3 g.l 1, tedy pod prahovou hodnotou. Vzniká p edevším v pr hu kvašení, kdy první t i dny jeho koncentrace stoupá, pak již z stává konstantní nebo mírn klesá 20. 2.2.4.3 3-methyl-2-buten-1-thiol Jeho v je ozna ována jako slune ní, liš í, letinková, po tcho ovi. Jeho prahová hodnota je 0,05 ug.l 1. Vzniká p sobení sv tla o vlnové délce 550 nm b hem fotochemické reakce alfa-iso-kyselin a sirnatých látek v pivu. 2.2.4.4 4-merkaptopenthan-2-ol Tento thioalkohol je pravd podobn odpov dný za takzvanou ko í v ni piva 20. 2.2.5. Thioestery Thioestery neboli estery thiokarboxylových kyselin mají obecný vzorec R-CS-R. Jejich v v tšinou p ipomíná va enou zeleninu nebo sýr. Jsou obsaženy p evážn v chmelu a do piva se dostávají p i použití hlávkového chmele. V tšina t chto látek, ale b hem chmelovaru vyt ká. 16
2.2.5.1 S-methylthioacetát S-methylthioacetát byl identifikován v pivu v koncentraci vyšší než 1 g.l 1. Jeho v je po va eném kv táku. Prahová hodnota je 300 g.l 1 a skute né hodnoty v pivu se pohybují v rozmezí 6 až 25 g.l 1 7,21,22,23. 2.2.5.2 S-ethylthioacetát Tento thioester byl rovn ž identifikován v pivu v koncentracích 5 40 g.l 1. Prahová hodnota jeho vnímání se udává 0,8 3,5 g.l 1 7,24. 2.2.5.3 S-methylthiopropionát Zapáchá po sýru nebo po va ené zelenin. Prahová hodnota není spolehliv stanovena 4. 2.2.5.4 S-methylthiobutyrát, S-methyl-3-methylbutyrát, S-methylthiopentanát, S-methyl-2- methylthiopentanát, S-methylthiohexanát a S-methylthioheptanát Uvedené thioestery byly identifikovány v esenciálním oleji chmele. Jejich obsah ve chmelu závisí spíše na p stitelské oblasti a podmínkách p stování než na odr chmele 25. 2.2.5.5 S-methyl-2-methylthiopropionát, S-methyl-2-methylthiobutyrát, S-methyl-3- methylthiobutyrát Tyto thioestery byly identifikovány v esenciálním oleji piva, zapáchají po va ené zelenin 25. 2.3. Výskyt a význam sirných látek v je meni, sladu a pivu Sirné aminokyseliny jsou p irozenou sou ástí je mene, sladu i piva, kde p sobí jako prekursory t kavých sirných látek. Tyto látky pak mají nezanedbatelnou roli v senzorické kvalit piva. T kavé sirné látky mohou nep ízniv ovlivnit chu piva i ve velmi nízkých koncentracích. Proto je nutné znát nejen obsah jejich prekursor, ale i možnosti jejich vzniku v pr hu technologie výroby piva. Vlastní síra se do výchozí suroviny, kterou je je men, dostává b hem vegetace ve form síran obsažených v ad minerálních hnojiv nebo po jejich p em i z organických hnojiv, ale také ve form plynné jako S 2 [26]. Prvním stupn m asimilace síry je aktivace síranového iontu pomocí ATP-sulfurylázy, což vede ke tvorb adenosin-5-fosfosulfátu (APS) a pyrofosfátu. Rozšt pením pyrofosfátu pyrofosfatázou a následnou sekundární fosforylací APS vzniká adenosin-3-fosfosulfát (PAPS). Aktivovaný sulfát z APS, stejn jako z PAPS je p enášen pomocí APS- nebo PAPSsulfotransferázy do thiolové skupiny p enaše e a vlastní redukce sulfátu na sulfit pak m že 17
probíhat vázanou nebo volnou cestou. Sulfity jsou dále redukovány na sulfidy sulfitreduktázou nebo thiosulfátreduktázou [26]. Redukovaná síra vstupuje do metabolismu výhradn ve form cysteinu a teprve následnou syntézou vzniká další esenciální aminokyselina methionin. Uvedené aminokyseliny jsou prekursory dalších sirných slou enin [26]. Mezi hlavní meziprodukty vzniku senzoricky aktivních sirných látek b hem výroby piva pat í S-methylmethionin, který vzniká metylací methioninu v cyklu sirných aminokyselin [2,5,26]. - S CH 3 methionin NH 3 + ATP PPi + Pi - H 3 C S + H NH 3 + N H S-adenosyl methionin N N N methionin NH 2 S-adenosyl homocystein H 3 C S + - CH 3 NH 3 + S-methyl methionin br. 8: Vznik S-methylmethioninu [17] B hem hvozd ní sladu, když teplota p esáhne 60 C, je S-methylmethionin degradován na homoserin a dimethylsulfid, takže nezanedbatelná ást m že být ztracena stržením do plynu. Degradace a syntéza S-methylmethioninu je závislá na vlhkosti a teplot zrna. xidací uvoln ného dimethysulfidu vzniká dimethylsulfoxid. Rychlost oxidace roste s teplotou hvozd ní. Rozsáhlejší oxidace dimethylsulfidu vede ke vzniku dimethylsulfonu, který není kvasinkami metabolizován [26]. H 3 C - S + CH 3 NH 3 + S-methylmethionin H - + NH 3 H 2 - H + homoserin + S oxidace S H 3 C CH 3 H 3 C CH 3 dimethylsulfid dimethylsulfoxid redukce br. 9: Vzájemná závislost cest vzniku dimethylsulfidu v pivu [20] Další cesta vzniku dimethylsulfidu zahrnuje rozklad methioninu vzájemnou reakcí s redukujícími cukry. Hlavním produktem této degradace je methional nebo od n j odvozený methionol. Dalšími dv ma produkty jsou dimethylsulfid a dimethylsulfoxid. Rozkladem 18
methionalu m že vznikat ehylmethylsulfid. Termickým rozkladem cysteinu a cystinu vzniká sulfan [20]. hem rmutování p echází S-methylmethionin, vzniklý p i sladování, do roztoku, kde probíhá jeho rozklad. Vznikající dimethylsulfid je strháván vroucími parami. Rychlost vypa ování dimethylsulfidu je v této fázi rychlejší než jeho syntéza [20]. Po va ení dochází v chladnoucí mladin stále k degradaci S-methylmethioninu, ale již nedochází k odpa ování dimethylsulfidu [20]. hem výroby piva mohu vznikat také r zné alkylpolysulfidy. Prekursory t chto alkylpolysulfid jsou trioly, S-alkylcystein sulfoxid, methional, thiosulfináty a methioninsulfoxid [20]. - NH 3 + C H 3 SH H 2 S DMDS, DMTS, DMQS S CH 3 glukóza, diacetyl, riboflavin, h riboflavin, 2 C H 3 S br. 10: Možný mechanismus syntézy polysulfid z methioninu b hem rmutování sladu [20] hem fermentace piva jsou pivní kvasinky Saccharomyces cerevisiae schopné metabolizovat sirné aminokyseliny na jednodušší slou eniny, mimo jiné i na t kavé sirné látky [27]. - NH 3 + H H S CH 3 S C H 3 S CH 3 S C H 3 methionin -keto- -methylthiobutyrát methional methionol (a) 19
- S H 3 C - C NH 3 + H 3 SH + + H 3 C NH 4 methionin methanthiol amonium -ketobutyrát (b) br. 11: Pravd podobná cesta degradace methioninu kvasinkami S. cerecisiae: (a) Ehrlichova dráha; (b) enzym C-S lasa [20] i kvašení mladiny jsou kvasinky schopné metabolizovat S-methylmethionin, ale nejsou schopny ho degradovat na dimethylsulfid. Pravd podobn ho p em ují na methionin inkem methyltransferázy [20]. B hem fermentace kvasinky produkují sulfan, a to p evážn z cysteinu, v menší mí e ze síran a zanedbateln z methioninu. Kvasinky jsou schopny b hem kvašení mladiny produkovat dimethylsulfid rovn ž enzymatickou redukcí dimethylsulfoxidu. Tato produkce dimethylsulfidu je nicmén kompenzována jeho ztrátou strháváním s C 2. Produkovány mohou být i polysulfidy, jako dimethyldisulfid a dimethyltrisulfid [20,28]. Kvasinky b hem života p ijímají organickou i anorganickou síru z prost edí, aby ji použily v metabolismu aminokyselin. Prekursory metabolizovanými kvasinkami jsou sírany, si itany, methionin, cystein, cystin, thiamin a glutathion [28]. V ležáckých pivech se nachází dimethyltrisulfid, který vzniká degradací methionalu a methionolu v erstvém pivu. Methional pochází p edevším ze Streckerovy eliminace methioninu p i sladování je mene [29,30] 2.4. Metody stanovení aminokyselin v biologických matricích Stanovení volných aminokyselin v etn sirných derivát hraje d ležitou roli p i posuzování nutri ní kvality potravin a nápoj. Specifické aminokyseliny mohou mimo jiné sloužit jako indikátory falšování a transformace b hem procesu výroby. Stanovení aminokyselin vyžaduje náro ný výb r vhodné metody d lení, která zaru uje dostate nou esnost a správnost. Analýza aminokyselin je navíc komplikována p ítomností dalších složek v potravinách, které dané stanovení mohou rušit, nebo mohou dávat pozitivní chyby. [31] 2.4.1. Kapilární elektromigra ní metody Elektromigra ní zp soby analýzy jsou založeny na rozdílné pohyblivosti nabitých ástic v stejnosm rném elektrickém poli. Pohyblivost nabitých ástic závisí na velikosti náboje, velikosti a tvaru molekul, podmínek prost edí a síly elektrického pole. Velikost náboje ovliv uje stupe ionizace, iontová síla a ph prost edí. [32] Moderní p ístroje pro kapilární elektromigra ní metody nabízejí velké možnosti pro stanovení aminokyselin ve velmi složitých matricích, jako jsou biologické tekutiny. P edností kapilárních elektromigra ních metod je p edevším vysoká separa ní ú innost, malý objem 20
vzorku pot ebný k analýze, nízká spot eba mobilní fáze a vysoká rychlost analýzy. Komplikovaná je rovn ž detekce separovaných aminokyselin. Pouze aminokyseliny s aromatickou strukturou v postranním et zci absorbují v UV oblasti spektra, volné nativní aminokyseliny neobsahují fluorofory a elektrochemicky aktivních aminokyselin je pouze kolik. Tento problém elektromigra ní analýzy aminokyselin se obchází p evedením neaktivních aminokyselin na jejich aktivní deriváty, které poskytují odezvu p i použití íslušné detek ní techniky. Detekovat aminokyseliny v jejich volné form je možné pouze i použití fotometrické detekce, detekce vodivostní, pop. mén dostupných a velmi nákladných detek ních technik, jako je hmotnostní a NMR detekce [33]. Mezi nejpoužívan jší elektromigra ní metody pat í kapilární zónová elektroforéza a micelární elektrokinetická kapilární chromatografie. Kapilární zónová elektroforéza (Capillary Zone Electrophoresis CZE) neboli kapilární elektroforéza ve volném roztoku (Free Solution Capillary Electrophoresis FSCE) je separace založená na rozdílech v náboji analytu a provádí se jako volná elektroforéza bez nosi e v tenké kapilá e. Transport analyzovaných iont (analyt ) a jejich separace probíhá v kapilá e, která propojuje dv nádobky. Kapilára je v tšinou z taveného k emene, mívá vnit ní pr r ádov desítky i stovky mikrometr a délku mezi 10 cm až 1 m. Do roztoku základního elektrolytu jsou vno eny elektrody, jimiž se p ivádí elektrické nap tí obstarávající pohyb iont. Základní elektrolyt se plní do kapiláry p etlakem nad hladinou kapaliny v jedné nádobce. Potom se jeden konec kapiláry pono í do nádobky s analyzovaným vzorkem a malý sloupe ek vzorku vnikne na její za átek. Kapilára se vrátí do nádobky se základním elektrolytem a zapne se hnací nap tí. V elektrickém poli se n které analyzované látky pohybují rychleji, jiné pomaleji, což zp sobuje jejich separaci. Na druhém konci kapiláry je detektor zaznamenávající pr chod jednotlivých rozd lených látek. [34] Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography - MECC) se používá k separaci neutrálních slou enin a využívá povrchové aktivity micel. Do základního elektrolytu se p idá látka, která je schopna vytvá et micely kulovité vícemolekulární útvary s ur itou strukturou. Mezi takové látky pat í t eba mýdla nebo tenzidy. Micely jsou nabité a putují v kapilá e v elektrickém poli jako kterékoliv nabité ástice. Jestliže se do kapiláry nadávkuje neutrální vzorek, nem že sám putovat v elektrickém poli, ale m že interagovat s micelami, které putují kolem n j, p emž jednotlivé složky vzorku mohou interagovat r zn. Tím, že jsou unášeny micelami, získají vlastní pohyb, který umožní jejich separaci. [35] 2.4.2. Chromatografické metody Chromatografie je fyzikáln -chemická separa ní metoda, p i níž se využívá mnohokrát opakované ustanovení rovnováhy mezi dv ma nemísitelnými fázemi. Jedna fáze je p itom vždy pohyblivá a nazývá se mobilní. Druhá je nepohyblivá a ozna uje se jako stacionární. lení je založeno na rozdílné afinit analytu k mobilní a stacionární fázi [36]. Z hlediska charakteru mobilní fáze rozlišujeme plynovou a kapalinovou chromatografii, v obou ípadech stacionární fáze m že být tuhá nebo kapalná. V sou asné analytické praxi se p i všech chromatografických technikách pracuje elu ním zp sobem, kdy se do protékající mobilní fáze dávkuje velmi malé množství vzorku [37]. Chromatografické metody pat í k nejd ležit jším metodám, které umož ují analyzovat složité sm si biologických molekul. 21
2.4.2.1 Vysokoú inná kapalinová chromatografie (HPLC) V sou asné dob se k separaci a kvantifikaci aminokyselin používá hlavn kapalinová chromatografie. Nejstarší metodou použitou k separaci aminokyselin byla chromatografie na iontom ni ích [38], která se v r zných modifikacích se v automatických analyzátorech aminokyselin používá dodnes [39]. V sou asnosti se nejvíce využívá separace aminokyselin na reverzní fázi, kdy je stacionární fází zpravidla C18, s binární nebo ternární gradientovou elucí o r zném složení mobilních fází. Nejnov jší metodou je kapalinová chromatografie založená na hydrofilních interakcích mezi stacionární fází a separovanými látkami (HILIC: hydrophilic interaction liquid chromatography) [40]. Pomocí HILIC je možné separovat všechny proteinogenní aminokyseliny a mnohé z jejich derivát [41]. Stanovení stopových množství aminokyselin ve vzorcích pomocí HPLC je omezené, protože tyto látky nemají chromofory a mají tak velmi nízkou odezvu na b žn užívaných LC detektorech. Také složky matrice p ítomné ve vzorku mohou rušit stanovení. Tento problém se obchází p evedením neabsorbujících aminokyselin na jejich deriváty. Derivatizaci je možné provést p ed analýzou (nej ast jší ešení), v pr hu separace nebo až po separaci. V p ípad separace na iontom ni ích se používá jen derivatizace postkolonová. Detekce vzniklých derivát aminokyselin je nej ast ji UV nebo fluorescen ní. Jako derivatiza ní inidla se používají ninhydrin [42], fluorescamin [43], dansyl chloride [44] 4-fluoro-7-nitrobenzo-2, 1,3-oxadiazol [45], phenylisothiokyanát (PTIC) [46], 9-fluorenyl-methoxycarbonyl chlorid (FMC-Cl) [47], 6-aminoquinolyl-Nhydroxysuccinimidylcarbamát (AQC) [48], o-phthalaldehyd [46] a o-phthaldialdehyd (PA) [46]. -phthaldialdehyd (PA) je dosud nej ast ji používaným derivatiza ním inidlem pro edkolonovou i postkolonovou derivatizaci. Reakce je rychlá a probíhá za laboratorni teploty, ukázalo se však, že stabilita vzniklého 1-alkylthio-2-alkylisoindolového produktu není vždy dostate ná. Proto byla zkoušena další inidla, jejichž deriváty vykazovaly delší stabilitu - Naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde [49] a 2-Hydroxy-l-naphthaldehyde (HNA), který byl použit pro stanovení aminokyselin histidinu, methioninu a tryptofanu [50]. Porovnání n kterých derivatiza ních inidel je uvedeno v tabulce 2. i vlastní chromatografické analýze se také asto využívá vnit ní standard, který že kompenzovat nižší výt žnost derivatiza ní reakce, ztráty p i p íprav vzorku (rozklad aminokyselin, objemové korekce p i ed ní vzorku) nebo variabilní objem p i nást iku vzorku. Jako vnit ní standardy p i stanovení aminokyselin se používají nap. norleucin, norvalin, a-aminomáselná kyselina, b-aminomáselná kyselina, g-aminomáselná kyselina a homoserin, mohocystin, ethanolamin aj. Tabulka 2: Porovnání n kterých derivatiza ních inidel [51] Název PA FMC-Cl Ninhydrin DNS-Cl AQC PITC HNA Detekce FLD FLD UV UV (FLD) UV (FLD) UV FLD Citlivost fmol fmol mol pmol (nmol) fmol pmol mol Stabilita derivátu špatná dobrá X dobrá dobrá st ední dobrá 22
Rychlost derivatizace Sekundární aminokyseliny Interference reagentu Interference matrice rychlá rychlá malá malá rychlá st ední rychlá ne ano ano ano ano ano X ne ano ne ano ano ano ne malá st ední ne malá ne vysoká ne Derivatizace pomocí AQC 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamát (AQC) je jedno z nejnov jších derivatiza ních inidel. AQC reaguje jak s primárními, tak sekundárními aminokyselinami v prost edí 0,2 mol.l 1 borátového pufru ph 9,3 p i teplot 55 ºC po dobu 10 minut za vzniku derivát s excita ním maximem 245 nm a emisním maximem 395 nm (obr. 12) [51]. br. 12: Derivatizace aminokyselin inidlem AQC [51] Vzniklé deriváty jsou snadno separovány gradientovou elucí p i teplot 35 ºC na reverzní fázi (C18, 150 3,9 mm) (br. 12). P i separaci aminokyselin dochází k jejich separaci na základní linii, kritické píky pro separaci jsou následující: Arg/Thr, Cys/Tyr, Val/Met a Ile.leu. Reakce obvykle probíhá pro aminy a aminokyseliny za laboratorní teploty, tyrosin však poskytuje minoritní pobo né deriváty, které za laboratorní teploty pomalu esmykují na majoritní monoderivát. Nadbytek inidla se likviduje hydrolýzou samotného inidla za vzniku majoritního, málo interferujícího 6-aminochinolinu a N- hydroxysuccinimidu, který neinterferuje v bec. Samotné deriváty jsou stabilní asi týden p i laboratorní teplot. [48] 23
br. 13: Separace ACQ derivát aminokyselin[51] Chromatografické podmínky: Solvent A: pufr octan sodný-triethylamin-na 2 HP 4 ph 5,05; solvent B: 60 % acetonitril. Pr tok: 1,0 ml/min; program: 100-98 % A do 0,5 min, 93 % A do 15,0 min, 90 % A do 19 min, 68 % A do 32 min a trvá 1 minutu, 33-37 min 100 % B, ekvilibrace 25 minut solvent A. Kolona: NovaPak C18150x3,9 mm, 4 mm. AMQ hydrolyza ní produkt, AabA interní standard kyselina a-aminomáslená. 2.4.2.2 Automatický analyzátor aminokyselin Ke stanovení aminokyselin se m že použít automatický analyzátor, který pracuje na principu iontov vým nné chromatografie. Jeho nejd ležit jší sou ástí je chromatografická kolona napln ná katexem. Aminokyseliny jsou na kolonu zavád ny p i nízkém ph ve form kationt a jsou poutány na povrchu katexu. Potom jsou postupn uvol ovány z povrchu katexu p sobením vhodných elu ních roztok (pufr ). Po eluci z kolony aminokyseliny reagují s ninhydrinem za vzniku ervenofialového zbarvení, které je detekováno spektrofotometricky. Pro stanovení vázaných aminokyselin se používají katexy v Na + cyklu a sodnocitronanové pufry, pro stanovení volných aminokyselin se používají katexy v Li + cyklu a lithnocitronanové pufry [39]. 2.4.2.3 Plynová chromatografie Plynová chromatografie pat í mezi separa ní metody. Lze ji využít pro kvalitativní i kvantitativní analýzu [32]. V plynové chromatografii se vzorek dávkuje do proudu nosného plynu. Aby mohl být vzorek transportován, musí se ihned p em nit na plyn. V kolon se složky separují na základ zné schopnosti poutat se na stacionární fázi. Složky opoušt jící kolonu jsou zaznamenávány detektorem [32]. Stanovení sirných aminokyselin plynovou chromatografií je využíváno ím dál více, protože tato metoda je relativn jednoduchá, rychlá a p esná. 24
ed vlastní analýzou je t eba aminokyseliny derivatizovat. Derivatizace se provádí ke zvýšení t kavosti a zlepšení stability separovaných aminokyselin [52,53]. K detekci aminokyselin lze použít plameno-ioniza ní detektor FID (Flame ionization detection) i plameno fotometrický detektor FPD (Flame photometric detection) selektivní pro sirné látky). V sou asné dob se v plynové chromatografii používají hmotnostní detektory, protože umož ují potvrzení identifikace látek pomocí hmotnostních spekter [54]. Další možností pro stanovení sirných aminokyselin je spojení plynového chromatografu a hmotnostního spektrometru, který obsahuje nej ast ji analyzátory jako jednoduchý kvadrupol, iontovou past nebo v poslední dob stále ast ji využívaný pr letový analyzátor TF. [54,55,56] Pro analýzu sirných aminokyselin metodou GC - MS se používají kolony s mírn polární fází 5 % - phenyl-95 % - dimethylpolysiloxanu [54]. br. 14: aminokyselin [35] Ukázky hmotnostních spekter N(,S)-ethoxykarbonyl propyl ester sirných 25
2.4.3. Možnosti provedení derivatizace v chromatografii Derivatizací v chromatografických metodách se rozumí chemická p em na molekul separované látky provedená za ú elem umožn ní vlastní analýzy nebo zlepšení vlastností analyzovaných látek (t kavost, stabilita, separa ní proces, detekce). elem derivatizace v plynové chromatografii je obvykle odstran ní aktivních vodíkových atom (zlepšení vlastností analyt s ohledem na GC separa ní proces). Derivatizace v plynové chromatografii by obvykle m la vést ke zvýšení t kavosti a zlepšení stability separovaných látek. ptimální je odstranit všechny aktivní vodíky (-H, -NH 2 skupiny) v jednom reak ním kroku. N kdy bývá cílem derivatizace v GC zavedení funk ní skupiny využitelné pro selektivní detekci do struktury separovaného analytu.[52]. 2.4.3.1 Derivatizace p ed kolonou (p ed separací) - pre-column pre-column derivatizace obvykle nevyžaduje speciální p ístup k analýze, k dispozici zde bývá velký výb r derivatiza ních inidel i pracovních podmínek, nedostatkem derivatizace p ed kolonou je mnohdy pracná a asov náro ná edúprava vzorku a dlouhý reak ní as mezi složkami vzorku a derivatiza ním inidlem. 2.4.3.2 Derivatizace na kolon (b hem separace) - on-column v metod plynové chromatografie se obvykle jedná o okamžitou reakci v kapilární kolon probíhající v okamžiku nást iku, on-column derivatizace je velice rychlá a jednoduchá, lze ji však aplikovat pouze pro omezené množství analyt i derivatiza ních inidel. 2.4.3.3 Derivatizace za kolonou (po separaci) - post-column reak ní inidlo musí stanovovanou látku modifikovat co nejrychleji za ú elem provád ní derivatizace za kolonou je obvykle nutné p ídavné za ízení (nebezpe í rozmytí zón analyt ). [52] 2.4.4. Derivatizace aminokyselin pro analýzu metodou GC Derivatizace aminokyselin se provádí za ú elem jejich transformace na produkt se žádanými separa ními a detek ními vlastnostmi. P i GC analýze se musí zajistit úplné zablokování protických funk ních skupin (mají aktivní vodíky nap. -H, -SH, -NH 2 ) a zvýšení t kavosti aminokyselin [52]. K derivatizaci aminokyselin lze využít n kolik derivatiza ních metod [52]: Esterifikace karboxylu bezvodým alkoholem v HCl a následná acylace dalších protických funk ních skupin. 26
Silylace protických funk ních skupin za tepla v bezvodém prost edí pomocí trimethylsilyl- nebo terc-butyldimethylsilyl- derivát. Derivatizace alkyl-chlorformiáty. 2.4.4.1 Derivatizace aminokyselin alkyl-chlorformiáty Alkylchlorformáty jsou jednoduchá inidla schopná reagovat s protickými funk ními skupinami aminokyselin b hem n kolika sekund. Nejpoužívan jším alkylchlorformiátem je ethylchlorformiát [52,53,54]. Cl br. 15: Ethylchlorformiát C H 3 1) Reakce ethylchlorformiátu s aminoskupinou Primární nebo sekundární aminy reagují s ethylchlorformiátem ve vodném prost edí za vzniku ethylkarbamátu [52]. H R NH 2 + Cl CH 3 H 2 H R NH CH 3 br. 16: Chemická reakce ethylchlorformiátu s aminoskupinou [52] 2) Reakce ethylchlorformiátu s hydroxylovou skupinou Hydroxylová (fenolová nebo aktivovaná alifatická) skupina reaguje s ethylchlorformiátem ve vodném prost edí za vzniku ethylkarbonátu [52]. 27
H 3 C NH H + Cl H 2 H 3 C NH H CH 3 H H 3 C br. 17: Chemická reakce ethylchlorformiátu s hydroxylovou skupinou [52] 3) Reakce ethylchlorformiátu s thiolovou skupinou Thiolová skupina reaguje s ethylchlorformiátem ve vodném prost edí za vzniku ethyl thiokarbonátu [52]. H 3 C NH SH H + Cl CH 3 H 2 H 3 C NH S H H 3 C br. 18: Chemická reakce ethylchlorformiátu s thiolovou skupinou [52] 4) Reakce ethylchlorformiátu s karboxylovou skupinou Karboxylová skupina reaguje s ethylchlorformiátem a alkoholem ve vodném prost edí za vzniku alkyl esteru [52]. 2.5. Metody stanovení sirných senzoricky aktivních látek ímá analýza sirných senzoricky aktivních látek je možná jen z ídka, protože se nacházejí v analyzovaných matricích (slad, pivo) ve velmi nízkých koncentracích ( g.kg 1,l 1 ng.kg 1,l 1 ). P ed vlastní analýzou je t eba analyty extrahovat z matrice a zakoncentrovat. Výb r vhodné metody p ípravy vzorku pak výrazn ovliv uje rychlost, spolehlivost a esnost analýzy.[31] 28
2.5.1. Extrakce sirných látek Vzhledem k nízkým koncentracím analyt je nezbytné použít extrak ní techniku vhodnou pro izolaci a zvýšení koncentrace t chto látek. Pro zakoncentrování t kavých látek se používá destilace s vodní parou, headspace metody (extrakce plynem) a mikroextrakce tuhou fází (SPME) [57,58]. 2.5.1.1 Destilace s vodní parou Destilace je fyzikální separa ní metoda, která umož uje d lení složek kapalné sm si na základ jejich rozdílné t kavosti. Destilace s vodní parou umož uje získat ze vzorku kavé složky p i teplotách nižších než je jejich bod varu a zabránit tak ztrátám n kterých termolabilních látek [57]. 2.5.1.2 Headspace techniky kavé látky lze z kapalných i rozm ln ných pevných vzork izolovat šetrnou extrakcí plynem, tedy s využitím tzv. headspace techniky (HS). Podstatou t chto metod je analýza plynné fáze, která byla v kontaktu s extrahovaným materiálem, v ideálním p ípad až do ustavení rovnovážné distribuce t kavých látek mezi plynnou a kondenzovanou (kapalnou nebo pevnou) fází, která je popsána distribu ní konstantou jednotlivých složek v dané soustav. Rozlišují se dva zp soby uspo ádání headspace analýzy [58,59,60,61]: Statická headspace V tomto uspo ádání se analyzuje vzorek plynu odebraný z prostoru nad kondenzovanou fází ve statickém uzav eném systému. Dynamická headspace Kondenzovaná fáze se kontinuáln extrahuje proudem inertního plynu (tzv. stripování), z n hož jsou vynášené páry t kavých látek vhodným zp sobem zachycovány. Statická HS technika je v tšinou používaná pro stanovení t kavých látek ve vzorcích, které jsou obtížn analyzovatelné b žným chromatografickým postupem. V kombinaci s plynovou chromatografií (HS-GC) umožní nep ímo stanovit t kavé látky v kapalných nebo pevných matricích analýzou plynné fáze, která je v termodynamické rovnováze se vzorkem v uzav eném systému. Tato technika je v tšinou doporu ovaná pro kapalné vzorky, jejichž matrice m že p i p ímém nást iku poškodit chromatografickou kolonu nebo vyžaduje intenzivní išt ní vzorku p ed analýzou [58]. HS-GC byla aplikována zejména p i stanovení DMS ve sladu, mladin a pivu. bsahy volného DMS ve sladu se pohybují v rozmezí 1 20 mg.kg 1, hladiny volného DMS v pivu a mladin jsou ádov nižší, pohybují se v rozmezí 2 100 g.l 1 [12,62]. Dynamická HS našla široké uplatn ní p i izolaci a zakoncentrování t kavých látek z kapaných matric [58,59,60]. 29
V prvním kroku této metody jsou analyzované látky stripovány z kapalné fáze a mohou být zachyceny t emi zp soby: a) sorpcí na sorbent, b) vymražováním c) kryofokusací na za átku chromatografické kolony [58, 63]. Ze sloupce sorbentu jsou analyzované látky uvol ovány extrakcí organickým rozpoušt dlem nebo záh evem za pr chodu nosného plynu vedoucího p ímo do kolony plynového chromatografu (termická desorpce) [38,39]. Pro zakoncentrování sirných t kavých látek se používají r zné typy sorbent. Nap. pro zachycení thiol a disulfid z kapalných matric se používá Porapak Q a Tenax GC. Molekulární síto 5A a Tenax GC byly popsány pro záchyt dimethylsulfidu, dimethyldisulfidu, sirouhlíku, sulfanu [58]. 2.5.1.3 Mikroextrakce tuhou fází (Solid Phase Microextraction SPME) Mikroextrakce tuhou fází (SPME) je bezrozpoušt dlová metoda p ípravy vzorku. Tuto metodu vyvinul v polovin 90. let minulého století J. Pawliszyn na universit Waterloo ntario, Kanada. Metoda nevyžaduje složitou instrumentaci a je založena na sorpci analytu malým množstvím extrak ní fáze na povrchu k emenného vlákna. Analyty se sorbují do dosažení rovnovážného stavu. Množství extrahovaného analytu závisí na hodnot rozd lovacího koeficientu analyt vlákno [64,65]. br. 19: Za ízení pro SPME [66] emenné vlákno pokryté polymerem je spojeno s ocelovým pístem a umíst no v duté ocelové jehle. Vlákno je zataženo dovnit jehly, která propíchne septum v zátce vialky. br. 20: Schéma SPME vlákna[66] Vlákno se vysune p ímo do vzorku (DI-SPME) nebo do prostoru nad jeho hladinou (HS SPME). Analyt se sorbuje na povrch vlákna. Po dosažení rovnováhy (2-30 min) se vlákno zasune op t do jehly, která je pak zavedena do injektoru plynového chromatografu, 30