Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici

Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici Množení modrých moštových odrůd révy vinné pro testaci viru svinutka-3 v podmínkách in vitro Bakalářská práce Vedoucí bakalářské práce Dr. Ing. Helena Fišerová Vypracoval Miroslav Spálovský Lednice 2010

Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Množení modrých moštových odrůd révy vinné pro testaci viru svinutka-3 v podmínkách in vitro vypracoval samostatně a použil pouze pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém přehledu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Zahradnické fakulty Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Lednici dne.. Podpis..

Poděkování Touto cestou bych chtěl poděkovat vedoucí mé bakalářské práce Dr. Ing. Heleně Fišerové za ochotu poskytnutí materiálů, praktických rad, připomínek a za celkovou podporu při tvorbě této práce. Dále patří můj dík panu Bc. Rostislavu Slavíkovi za spolupráci při výběru vhodného rostlinného materiálu z vinohradu Mendelea Zahradnické fakulty.

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK 2,4-D 2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina ABA kyselina abscisová BAP 6-benzylaminopurin ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay DKW Driver & Kuniyuki (1984) EPPO Evropská a středozemní organizace pro ochranu rostlin GA 3 kyselina giberelová A 3 IAA indolyl-3-octová kyselina IBA indolyl-3-máselná kyselina kinetin 6-furfurylaminopurin MS Murashige & Skoog (1962) NAA 1-naftyloctová kyselina pcpa p-fluorfenoxyoctová kyselina

OBSAH 1. ÚVOD... 8 2. CÍL PRÁCE... 9 3. LITERÁRNÍ PŘEHLED... 10 3.1. Charakteristika GLRaV-3... 10 3.2. Množení in vitro... 10 3.3. Meristémové kultury... 11 3.4. Kalusové kultury... 11 3.5. Složení MS a DKW média... 12 3.5.1. Destilovaná voda... 12 3.5.2. Makroelementy... 12 3.5.3. Mikroelementy... 13 3.5.4. Agar... 13 3.5.5. Vitaminy... 14 3.5.6. Sacharóza... 14 3.5.7. Aminokyseliny... 14 3.5.8. ph média... 15 3.5.9. Tabulka složení MS a DKW média... 15 3.6. Růstové regulátory... 17 3.6.1. Auxiny... 17 3.6.2. Cytokininy... 18 3.6.3. Gibereliny... 18 3.6.4. Kyselina abscisová... 18 3.6.5. Etylén... 19 3.7. Topofýza... 19 4. MATERIÁL... 20 4.1. Moštová odrůda Dačnyj... 20 4.1.1. Původ a rozšíření... 20 4.1.2. Morfologická charakteristika... 20 4.1.3. Rezistence... 20 4.2. Podnožová odrůda Crâciunel 2... 21 4.2.1. Původ a rozšíření... 21

4.2.2. Morfologická charakteristika... 21 4.2.3. Rezistence... 21 4.3. Podnožová odrůda Teleki 5C... 21 4.3.1. Původ a rozšíření... 21 4.3.2. Morfologická charakteristika... 22 4.3.3. Rezistence... 22 5. METODIKA... 23 5.1. Odběr a sterilizace materiálu... 23 5.2. Koncentrace fytohormonů v médiu... 23 6. VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUSE... 25 7. ZÁVĚR... 35 8. RESUMÉ A SOUHRN... 36 9. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 37

1. ÚVOD Česká republika je součástí European and Mediterranean Plant Protection Organizations. Tato mezivládní organizace je zodpovědná za evropskou spolupráci v oboru na ochranu rostlin v Evropské a středozemní oblasti. Byla založena v roce 1951 a v současnosti má padesát členských zemí. Jejím hlavním cílem je rozvíjet mezinárodní strategii proti zavlékání a šíření škodlivých organizmů, které poškozují zejména pěstované rostliny v zemědělských ekosystémech, nevyjímaje tak významnou plodinu jako je réva. Dle směrnic EU 2005/43/ES jsou členské země EU povinné testovat rostlinný materiál i na Grapevine leafroll associated virus 3, a tak zajistit co nejvyšší fytosanitární kvalitu jednotlivých odrůd. Zdravé sazenice révy vinné jsou nutným základem pro kvalitní produkci hroznů. Detekce virů révy je prováděna molekulárně-biologickými metodami a lze ji testovat i pomocí dřevitých indikátorů v podmínkách in vitro. Tuto metodiku zkoušeli Pathirana & Mackenzie (2005a) s rostlinami Cabernet franc a Cabernet sauvignon infikovanými GLRaV-3 pomocí DAS-ELISA testu a Janoušek (2010) s rostlinami Kober 125 BB, Cabernet Moravia a Cabernet Sauvignon. I když tato metoda doposud nebyla zařazena do certifikačních programů EPPO, nemůže být u řady chorob vynechána, neboť např. svinutka může být identifikována pouze na dřevitém indikátoru. Základem pro tuto diagnostiku a i eventuelní ozdravování v podmínkách in vitro jsou důležité metodiky pro odvození a multiplikaci vhodných odrůd révy vinné. 8

2. CÍL PRÁCE Metoda množení v podmínkách in vitro umožňuje v krátké době získat velké množství sazenic z diagnosticky zdravé révy či z ozdravených materiálů termoterapií. Zatím nejpřesnější diagnostickou metodou viróz je roubování či očkování citlivého materiálu k určitému viru. Cílem bakalářské práce bylo vytvořit pracovní protokol pro množení modrých moštových odrůd révy vinné in vitro vhodných pro testaci viru svinutky 3 (GLRaV 3 Grapevine leafroll associated virus) vyskytujícího se na révě. Z odebraných řízků modrých moštových odrůd révy vinné byla založena primární kultura in vitro. Dále byla dle literární rešerže vybrána multiplikační kultivační média, která byla testovaná růstovými reakcemi explantátů révy vinné - podnoží Teleki 5C a Crâciunel 2. Výsledky práce - založení primární kultury (sterilizace materiálu a složení primárního kultivačního média) a varianta s optimálním složením média pro multiplikaci révy bude základem pracovního protokolu množení modrých moštových odrůd révy vinné in vitro vhodných pro testaci viru svinutky 3. 9

3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1. Charakteristika GLRaV-3 Svinutka, mezinárodně označována jako GLRaV-3 (Grapevine Leafrollassociated 3), patří mezi celosvětově nejrozšířenější virózy révy vinné. V našich podmínkách patří vzhledem ke škodlivosti k nejvýznamnějším virózám révy vinné. Způsobuje omezení růstu a předčasné podzimní zbarvení listů, následkem čehož je snížení výkonu asimilace, oddalování zrání, nižší výtěžnost a kvalita moštu (Šafránková, 2007). Svinutka postihuje révu vinnou, její křížence i podnožové odrůdy. Svinutky se přenášejí při vegetativním množení, jako je očkování a řízkování nebo také larvami puklice Pseudoccocus longispinus. Mezi původce svinutky patří zástupci rodů closterovirů a ampelovirů. Z modrých moštových odrůd jsou náchylné například Rulandské modré nebo Chrupka červená. Tato viróza se projevuje od konce června svinováním okrajů listů směrem dolů. Nejprve dojde ke svinutí starších bazálních listů a poté i ostatních listů na letorostech. Napadené listy se u modrých odrůd zbarvují do červena (Kraus a kol., 2002). Dalším ukazatelem infekce GLRaV-3 může být také menší obsah aminokyselin a fenolických sloučenin (Lee a kol., 2009). Červená vína vyrobená z infikované révy mají výrazně menší intenzitu barvy a menší obsah antokyanů (Martinson a kol., 2008). Celkově lze říci, že ovoce infikované GLRaV-3 má nejen snížené množství antokyanů, ale také menší procento rozpustných pevných látek (Lee a Martin, 2009). 3.2. Množení in vitro Explantátové kultury in vitro znamenají izolované části rostlin pěstované v umělých podmínkách. Tato možnost vegetativního množení má tu výhodu, že rostlinné buňky jsou schopny dediferenciace a následně opětovného dělení, přičemž nedochází k degeneraci (Kováč, 1992). 10

Obrázek č. 1: Metody mikropropagace rostlin (George a Sherrington, 1984) 3.3. Meristémové kultury Meristémové kultury jsou zakládány z vrcholových či axilárních meristémů a umožňují získání viruprostých rostlin. Ozdravování je tu založeno na poznatku, že viry nejsou ve všech částech rostliny založeny rovnoměrně, přičemž koncentrace virů bývá nejmenší právě v meristémových pletivech, která jsou nevhodným prostředím pro reprodukci virů. Ozdravování rostlin je možné provádět metodou meristémové kultury v kombinaci s aplikací vyšší teploty termoterapií. Další důležitou předností této metody mikromnožení je zachování genetické stability u získaného materiálu (Spěváčková, 1999). 3.4. Kalusové kultury Kalus je masa parenchymatických buněk tvořících se na poraněném povrchu orgánu rostliny. Na bazální části stonkových řízků předchází kalus u některých druhů tvorbu kořenů. Na vhodných živných půdách se tvoří kalus v kulturách in vitro (Psota, Šebánek, 1999). Kalus se užívá k následné produkci somatických embryí, anebo k získávání sekundárních metabolitů (Prknová, 2007). 11

3.5. Složení MS a DKW média 3.5.1. Destilovaná voda Destilováním pitné vody získáme vodu destilovanou, tedy zbavenou většiny iontů v ní obsažené. Tato čirá tekutina bez zápachu o neutrálním ph může být vyrobena i jiným způsobem než destilací, a to tzv. reverzní osmózou, která poskytuje vodu s daleko menším obsahem iontů než při destilačním procesu. 3.5.2. Makroelementy Makroelementy obsažené v kultivačních médiích představují šest nejdůležitějších minerálních prvků: dusík, fosfor, draslík, vápník, hořčík a síru. Optimální koncentrace každého z těchto prvků je závislá na rostlinném druhu i podmínkách explantace. Obecně by mělo kultivační médium obsahovat 25-60 mm anorganického dusíku (Hradilík, 2005). Rostlinný materiál roste nejlépe na médiích s dusíkem v nitrátové formě, vhodné je přidání i amonných solí. Vhodná koncentrace nitrátů se uvádí 25-40 mm, amonia 2-20 mm. Draslík se dodává v dusičnanové nebo chloridové formě v koncentraci 20-30 mm. Fosfor, hořčík, síra i vápník by měly být zastoupeny v koncentracích 1-3 mm (Adam, 2001). Fosfor je součástí mnoha významných sloučenin. Uplatňuje se především v systémech zabezpečujících přenos signálů na vnitrobuněčné i mezibuněčné úrovni (Procházka a kol., 1998). Obsah fosforu v rostlině je ve vegetativních orgánech ukazatelem celkového stavu výživy. Vysoké množství fosforu je nezbytné při intenzivním metabolismu a jeho dostupnost, vedle dusíku je rozhodující pro rašení a klíčení rostliny (Dvořák, 1976). Tabulka č. 1: Poruchy při příjmu fosforu (podle Pavlouška, 2010) Nedostatek fosforu Nadbytek fosforu - tmavozelené až načervenalé listy - zakrnělý růst - malé listy - častější výskyt chlorózy brzdí příjem železa. 12

Při výživě rostlin je dusík nejcitlivěji spjat se syntézou chlorofylu. Deficience dusíku se projevuje u rostlin nápadným symptomem, a to snížením obsahu chlorofylu nebo jeho úplnou ztrátou. Nejzřetelnější je to znát u starších listů, které uvolňují dusík pro transport vedoucí do nejmladších částí rostliny, k vegetačnímu vrcholu. Části rostlin u vrcholu rostliny zachovávají obsah chlorofylu nejdéle (Dvořák, 1976). Tabulka č. 2: Poruchy při příjmu dusíku (podle Pavlouška, 2010) Nedostatek dusíku Nadbytek dusíku - světlezelené listy - nadměrně bujný růst révy vinné - slabý růst rostliny - tenké výhony - malé listy Dalším důležitým prvkem je vápník. Většina vápníku je lokalizována v buněčných stěnách rostliny a podílí se na udržení integrity buněčných membrán. Významnou funkcí je také předávání signálů v rostlinách pomocí vápenatých iontů. Tabulka č. 3: Poruchy při příjmu vápníku (podle Pavlouška 2010) Nedostatek vápníku Nadbytek vápníku - žloutnutí listů mezi žilkami - chloróza díky blokování příjmu - svinování listové čepele dolů železa - předčasný opad listů - zhoršuje se příjem draslíku 3.5.3. Mikroelementy Mezi mikroelementy používané pro kultivaci rostlinných explantátů řadíme železo, které z fyziologického hlediska patří mezi makroelementy, dále pak mangan o koncentraci 20-90 µm, zinek 5-30 µm, bór 25-100 µm, měď 0,1 µm a molybden 1 µm (Adam, 2001; Hradilík, 2005). 3.5.4. Agar Tato bílá práškovitá látka se používá jako pevný substrát kultivačního média. Skládá se z lineárního polysacharidu agarózy a rozvětveného agaropektinu. Tyto přečištěné polysacharidy se extrahují z buněčných stěn červených řas rodů Gelidium a Gracilaria. Agaropektin má nižší schopnost tvořit gely, proto agar 13

pro výrobu média obsahuje ve větší míře agarózu. Tuhnutí agaru je závislé jak na teplotě (40 C), tak i na ph, které se pohybuje v rozmezí 4,7-5,8 (Makrořasy - Seaweeds). Obrázek č. 2: Chemická struktura agarózy (Makrořasy - Seaweeds) 3.5.5. Vitaminy Normální rostlina sama syntetizuje vitaminy nezbytné k jejímu růstu a vývoji, avšak v podmínkách explantace může být tato syntéza snížena nebo zastavena a může dojít k nedostatku vitaminů, což může být jeden z mnoha limitujících faktorů růstu rostliny. Mezi vitaminy nejčastěji používané v médiích patří thiamin, kyselina nikotinová, pyridoxin a myoinozitol (Hradilík, 2005; Kováč, 1992). 3.5.6. Sacharóza Jako nejčastější zdroj uhlíku a energie je používána sacharóza. Obvykle používaná koncentrace sacharózy je 2-3 %. Sacharóza představuje pro rostlinné explantáty substrát heterotrofní výživy, upravuje osmotickou hodnotu média a umožňuje v případě nedostatečné sterilace růst mikroorganizmů. Při sterilaci v autoklávu se sacharóza částečně rozkládá na glukózu a fruktózu (Hradilík, 2005; Kováč, 1992). 3.5.7. Aminokyseliny Aminokyseliny přidávané do živného média mohou stimulovat růst explantátů. Slouží buňkám jako bohatý zdroj dusíku, který je v organické formě velmi rychle využíván. Jako zdroj organického dusíku je přidáván například glycin aplikovaný při koncentraci nejvýše 100 mg.l -1 (Hradilík, 2005; Kováč, 1992). 14

3.5.8. ph média Buňky vyžadují v pletivové kultuře kyselé ph, na počátku bývá optimum 5,5 až 5,8 ph. V suspenzní kultuře nárok na ph kolísá během buněčného růstového cyklu (zprvu pod 5 ph, pak vstup na 6 či výše) (Šebánek a Sladký, 1988). U médií MS a DKW se požaduje jako optimální ph 5,8. Při jiných hodnotách se upraví médium kyselinou trihydrogenfosforečnou či kyselinou chlorovodíkovou nebo hydroxidem draselným. 3.5.9. Tabulka složení MS a DKW média K pokusu byly použity dva typy médií - MS (Murashige, Skoog, 1962) a DKW 1. Médium DKW 1 bylo převzato podle návodu DKW (Driver, Kuniyuki, 1984) a upraveno pro vlastní pokus. Rozdíly ve složení lze porovnat v následující tabulce. 15

Tabulka č. 4: Složení MS a DKW média MS [mg.l -1 ] DKW [mg.l -1 ] DKW 1 [mg.l -1 ] Makroelementy NH 4 NO 3 1650 1417 1400 CaCl 2. 2 H 2 O 440 147 150 MgSO 4. 7 H 2 O 370 740 740 KNO 3 1900 - - Ca(NO 3 ) 2. 4H 2 O - 1960 1950 K 2 HPO 4 - - 1560 KH 2 PO 4 170 259 260 Mikroelementy Na 2 EDTA 37,3 44,7 45 FeSO4. 7 H 2 O 27,8 33,4 30 H 3 BO 3 6,2 4,8 5 MnSO 4. 4 H 2 O 22,3 44,6 33 ZnSO 4. 7 H 2 O 10,6 16,4 16 NaMoO 4. H 2 O 0,25 387,2 0,4 CuSO 4. H 2 O 0,025 0,25 0,25 KI 8,83 - - CoCl 2. 6H 2 O 0,025 - - Organické Myo-inositol 100 100 100 složky edamin 1000 - - thiamin-hcl 0,1 0,05 0,05 kys. nikotinová 0,5 0,025 0,025 pyridoxin-hcl 0,5 - - glycin 2 0,05 0,05 sacharóza 25000 30000 30000 agar 8000 6500 6500 Fytohormony BAP 0,75 0,8 0,8 a ph IBA 0,1 0,01 0,01 ph 5,8 6 6 16

Obsah dusíkatých látek je obdobný v obou typech médií, ale DKW 1 obsahuje více vápníku a fosforu než MS. 3.6. Růstové regulátory Regulátory růstu nejčastěji ovlivňují chování kultury ve vzájemných kombinacích. Jejich účinek závisí na druhu použité látky i na její koncentraci. Často se koncentrace i druh rostlinných hormonů v průběhu kultivace mění, například jiné je složení pro indukci kalusu, jiné pro jeho vlastní kultivaci. Problém ovšem představuje to, že často je těžké rozhodnout, zda určitý rostlinný hormon hraje roli v indukci morfogeneze nebo je jeho přítomnost nutná pro kontinuální růst buněk v kultuře in vitro (Procházka a kol., 1997). Nejvíce jsou v kultivačních médiích zastoupeny auxiny a cytokininy. Tyto dva druhy růstových regulátorů jsou aplikovány v množství okolo 10 µm. Pomáhají udržovat růst buněk, respektive podporují dělení buněk (Dixon a Gonzales, 1994). 3.6.1. Auxiny Auxin je produkován z větší části v apikální oblasti a transportován bazipetálně. Tento transport je důležitý pro udržení apikální dominance. Další z výrazných růstových účinků auxinů je stimulace tvorby kořenů. Jejich aplikace stimuluje tvorbu adventivních kořenů na segmentech stonků i u explantátů. Auxiny výrazně zvyšují tvorbu etylénu a některé z růstových účinků po jejich aplikaci mohou být zprostředkovány zvýšenou hladinou etylénu. Vyšší koncentrace auxinu v řadě případů růst inhibují (Procházka a kol., 1997). Syntéza IAA může být ovlivněna ostatními fytohormony na úrovni indolylacetaldehydoxidázy, jejíž aktivita je in vitro zvýšena kyselinou giberelovou a kinetinem a snížena kyselinou abscisovou (Kutáček, 1988). Pro indukci kalusu se aplikuje IAA v množství 10-30 M. Snížením na 1-10 M se může stimulovat organogeneze. Nízkou koncentrací IBA (1-50 M) se docílí zakořeňování, může se však aplikovat i koncentrace vyšší 100-250 M po dobu 2-10 dní a poté se explantát převede do média zcela bez hormonů. Nejčastěji používaný syntetický auxin pro indukci kalusu a suspenzi buněk v nediferenciovaném stavu je 2,4-D. Podobný 2,4-D, ale méně používaný pak je pcpa. NAA synteticky podobný IAA umožňuje v kombinaci s 2,4-D a koncentraci 2-20 M převážně indukci kalusu a růst buněk (Dixon a Gonzales, 1994). 17

3.6.2. Cytokininy Cytokininy jsou skupinou rostlinných hormonů vyznačující se schopností stimulovat v přítomnosti auxinu buněčné dělení některých rostlinných tkáňových kultur. Z praktických aplikací cytokininů je nejvýznamnější jejich využití v rostlinných biotechnologiích jako složek kultivačních médií při odvozování a udržování rostlinných tkáňových kultur a dále při regeneraci rostlin in vitro. Cytokininy jsou převážně syntetizovány v kořenových vrcholech (Procházka a kol., 1997). Kinetin je často součástí kultivačních médií pro indukci kalusu, růst buněčných suspenzí a projev morfogeneze, a to v koncentraci 1-20 M. Vyšší koncentrace může být důvodem rychlé multiplikace výhonků, pupenů nebo meristému. Dalším důležitým regulátorem pro buněčný růst a indukci morfogeneze je BAP, 0,5-10 M. Málokdy používaný zeatin, který je termolabilní a proto nevhodný pro autoklávování, ovlivňuje morfogenezi explantátu a to v koncentraci 0,05-10 M (Dixon a Gonzales, 1994). 3.6.3. Gibereliny Gibereliny vznikají pravděpodobně ve všech rostlinných orgánech. Nejvyšší hladiny giberelinů nacházíme v místech aktivního růstu a nově se tvořících orgánů. Podobně jako auxiny i gibereliny významně stimulují dlouživý růst. Na rozdíl od auxinů se tento účinek týká pouze nadzemních částí rostlin, růst kořenů není gibereliny obvykle ovlivněn. Zatímco auxiny stimulují pouze růst segmentů, které byly zbaveny přirozeného zdroje auxinu (vrcholové části), gibereliny aktivují dlouživý růst nadzemních částí intaktních rostlin (Procházka a kol., 1997). GA 3, méně často používaný v kultivačních médiích, může podpořit růst výhonků již o koncentraci 0,03-14 M. Tak jako zeatin je tato látka termolabilní a tudíž nevhodná pro autoklávování (Dixon a Gonzales, 1994). 3.6.4. Kyselina abscisová ABA je syntetizována především v dospělých listech (Hartmung a Davis, 1991). Obsah ABA v rostlinných pletivech je všeobecně velmi nízký, mění se v závislosti na faktorech vnějšího prostředí a v rámci rostliny kolísá v průběhu její ontogeneze. Základním faktorem ovlivňujícím hladinu ABA v jednotlivých rostlinných orgánech je vodní stres. Téměř univerzální reakcí rostlinných buněk na ABA je inhibice růstu (Procházka a kol., 1997). 18

Koncentrace tohoto fytohormonu se pohybuje okolo 0,04-10 M, zabraňuje předčasnému klíčení a podporuje normální vývoj somatických embryí (Dixon a Gonzales, 1994). 3.6.5. Etylén V důsledku působení velmi nízkých koncentrací etylénu (cca 0,1-1 ppm) je inhibován dlouživý růst, stimulován růst radiální a dochází ke ztrátě gravitropické reakce. Nejvýznamnějším účinkem etylénu je stimulace dozrávání některých plodů. Podobně jako zrání stimuluje etylén stárnutí a opad listů, květů a plodů (Procházka a kol., 1997). 3.7. Topofýza Topofýzou se rozumí rozdělení endogenních fytohormonů v prýtu rostliny. Obsah auxinu je zřetelný nejvíce na apexu rostliny a nejméně na její bázi. Jsou schopny aktivovat růstové geny rostliny, a tak zaručit její dlouživý růst. U giberelinů je tomu naopak, tedy jejich obsah od báze k apexu klesá. Největší množství cytokininů se vyskytuje ve středové části prýtu. Umožňují tak rostlině se větvit (Šebánek a sladký, 1988; Georgie a Hall, 2007). Obrázek č. 3: Schéma rozdělení fytohormonů v prýtu (Šebánek a Sladký, 1988) 19

4. MATERIÁL 4.1. Moštová odrůda Dačnyj 4.1.1. Původ a rozšíření Modrou stolovou odrůdu Dačnyj vyšlechtili v moldavském výzkumném ústavě vinohradnickém a vinařském Vierul v Kišiněvě. Vznikla křížením odrůd Guzaľ kara x S.V. 20473. Zatím je málo rozšířená, střetáváme se s ní jen ve sběratelských výsadbách (Pospíšilová a kol., 2005). 4.1.2. Morfologická charakteristika Vrchol letorostu je bělavý, vrchní lístky jsou hnědočervené až bronzové, lesklé. List je středně velký až velký, pětiúhelníkový, s výraznými vrchními lyrovitými výkrojky, světle zelený. Hrozen je velký, rozvětvený, volný. Bobule je velká, oválná, modré barvy, masité konzistence a jednoduché, neutrální, trochu tříslovité chuti. Slupka je pevná, hrubší. Jednoleté dřevo je světlohnědé, čárkované a tečkované, hrubé s dlouhými internodii. Růst větví je silný, vyzrávání letorostů je uspokojivé (Pospíšilová a kol., 2005). 4.1.3. Rezistence Peronospora tuto odrůdu prakticky nepoškozuje. Odolnost proti padlí je střední. Je velmi odolná proti plísni šedé, třapiny nepoškozují ani dlouhotrvající podzimní deště. Vyznačuje se vysokou odolností vůči zimním mrazům a ani jarní mrazy ji pro pozdější rašení nepoškozují. Při nepříznivém počasí v období kvetení mohou bobule částečně opadávat, proto vyžaduje přebírání plodů (Pospíšilová a kol., 2005). 4.1.4. Hospodářská využitelnost Dačnyj brzy raší, bobule měknou a dozrávají v pozdějším termínu. Tato velkoplodá stolní odrůda proto vyžaduje teplé oblasti a hluboké, výživné a teplé půdy. Vyhovuje ji vysoké vedení, které umožňuje co nejlepší přístup slunce k hroznům a rovnoměrné vybarvení bobulí. Plodnost je vysoká 12 14 t ha -1, zatěžujeme ji 5-6 plodonosnými očky na m 2 půdy. Uplatnění může najít jako zahrádkářská odrůda, přinejmenším na pergolách, případně jako solitér. Je ceněn především pěkný vzhled velkých modrých hroznů, které 20

snášejí přepravu a skladování. Při horším počasí v období kvetení může dojít k mírnému opadu třapin a hrozen vyžaduje úpravu (Pospíšilová a kol., 2005). 4.2. Podnožová odrůda Crâciunel 2 4.2.1. Původ a rozšíření Jedná se o rumunskou podnožovou odrůdu, vzniklou křížením rév Vitis berlandieri x Vitis riparia. Odrůda vznikla v pol. 20. století ve Výzkumné stanici vinohradnické v Crâciunel jako selekce podnože Kober 5BB. V České republice tvoří pouze 3% plochy podnožových vinic. Zapsaná do Státní odrůdové knihy byla roku 1983 (Ludvíková a kol., 2004). 4.2.2. Morfologická charakteristika List je středně velký se třemi až pěti laloky s mělkými výkroji. Bazální výkrojek je lyrovitý, otevřený. Vrcholek letorostu je ohnutý, slabě ochlupený, zelenohnědý s růžovými okraji. Růst je bujný a bujně rostou i na ní naštěpované odrůdy. Velmi dobře koření. Réví vyzrává lépe než u podnože Kober 5BB, ale v nepříznivých ročnících se tato vlastnost podstatně zhoršuje (Ludvíková a kol., 2004). 4.2.3. Rezistence Většinou dobrá odolnost vůči mrazu, suchu a k vápnu je vyšší než u podnože Kober 5BB. Rezistence proti révokazu je velmi dobrá, je rovněž odolná proti padlí révovému a plísni révové (Ludvíková a kol., 2004). 4.3. Podnožová odrůda Teleki 5C 4.3.1. Původ a rozšíření Jedná se o maďarskou podnožovou odrůdu, vzniklou křížením rév Vitis berlandieri x Vitis riparia. Podnož vyselektoval A. Teleki počátkem 20. století ze semen poslaných z Francie. Nejvíce je rozšířena v Maďarsku, na Slovensku, u nás a v Rakousku. Zaujímá téměř 23% plochy podnožových vinic a díky tomu se řadí k druhé nejrozšířenější podnoži v České republice. Do Státní odrůdové knihy byla zapsána roku 1983 (Ludvíková a kol., 2004). 21

4.3.2. Morfologická charakteristika List je velký, hladký, se třemi až pěti laloky. Bazální výkrojek je lyrovitý, otevřený, někdy lehce překrytý. Vrcholek letorostu je mírně ohnutý, jemně ochlupený, světlezelený. Růst je středně bujný, naštěpované odrůdy na ní rostou středně bujně až slabě. Bujné odrůdy tak oslabuje v růstu (Ludvíková a kol., 2004). 4.3.3. Rezistence Většinou dobrá odolnost vůči mrazu, vzdornost k suchu a k vápnu je vyšší než u podnože Kober 5BB. Rezistence k révokazu je velmi dobrá (Ludvíková a kol., 2004). 22

5. METODIKA 5.1. Odběr a sterilizace materiálu Ve spolupráci s panem Bc. Rostislavem Slavíkem bylo získáno réví Dačnyj z vinohradu Mendelea Zahradnické fakulty v Lednici. Následně byly letorosty nařízkovány na větší počet jednonodálních segmentů, které byly ponechány v nádobce s vodou pro další rašení. Nově narostlé výhony byly odebrány, omyty čistou vodou a sterilizovány pro kultivaci in vitro. Sterilizace probíhala pomocí 0,2% roztoku chloridu rtuťnatého po dobu dvanácti minut. Poté byla réva vyjmuta a opláchnuta sterilní redestilovanou vodou na dobu deseti minut, toto bylo opakováno celkem třikrát. Připravené segmenty byly následně pasážovány na médium DKW 1 (tabulka č. 6) a umístěny v kultivační místnosti. Pro další pokusy byly použity podnože Teleki 5C a Crâciunel 2, které byly získány z již odvozené kultury in vitro. Jednonodální segmenty byly pasážovány na média MS a DKW 1 s různými koncentracemi růstových regulátorů viz. tabulka č. 5. 5.2. Koncentrace fytohormonů v médiu V médiích MS a DKW 1 byly aplikovány fytohormony BAP a IBA v koncentracích, které jsou zobrazeny v následujících tabulkách: Tabulka č. 5: Koncentrace fytohormonů v médiích pro odrůdy Teleki 5C a Crâciunel 2 Médium Koncentrace BAP [mg.l -1 ] Koncentrace IBA [mg.l -1 ] 1. MS 0,3 0,1 2. MS 0,8 0,01 3. MS 2,0 0,1 4. DKW 1 0,3 0,1 5. DKW 1 0,8 0,01 6. DKW 1 2,0 0,1 23

Tabulka č. 6: Koncentrace fytohormonů v médiích pro odrůdu Dačnyj Médium Koncentrace BAP [mg.l -1 ] Koncentrace IBA [mg.l -1 ] 1. DKW 1 0,8 0,01 2. DKW 1 2,0 0,1 3. DKW 1 5,0 0,1 24

6. VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUSE Pro primární kultivaci v podmínkách in vitro byla vybráda odrůda Dačnyj (viz. kapitola 5.1.). V tabulce č. 8 je zpracován přehled množství jednonodálních segmentů, počet a procentuální zastoupení infekcí po sterilizaci. K tomuto pokusu bylo použito médium DKW 1 se třemi variantami koncentrací růstových regulátorů IBA 0,1 mg.l -1 a BAP 0,8 mg.l -1 ; 2,0 mg.l -1 a 5,0 mg.l -1 (tabulka č. 7). Tabulka č. 7: Přehled výsledků Dačnyj na médiu DKW 1 Médium DKW 1 DKW 1 DKW 1 Koncentrace mg.l -1 Množství segmentů [ks] Množství infekcí [ks] Množství nekróz [ks] Procentuální úspěšnost [rel. %] 0,1 mg.l -1 IBA 0,8 mg.l -1 BAP 15 9 1 33 0,1 mg.l -1 IBA 2,0 mg.l -1 BAP 14 10 0 29 0,1 mg.l -1 IBA 5,0 mg.l -1 BAP 15 7 2 40 Letorosty odebrané z vinohradu byly infikované peronosporou a i po důkladném omytí a sterilizaci 12 minut HgCl 2 (tabulka 8) je patrné, že ve větším případě se patogeny nepodařilo zcela inaktivovat. Delší sterilizace je již nežádoucí z hlediska nekrózy pasážovaných segmentů. Réva nejlépe rostla na médiu DKW 1 (0,1 mg.l -1 IBA a BAP 5,0 mg.l -1 ), jak je patrno z obr. č. 4-6. Tabulka č. 8 uvádí přehled sterilizačního pokusu. Byly sterilizovány jednonodální segmenty v 0,2% HgCl 2 po dobu 8, 12 a 14 minutách. Při krátké době sterilizace jevily segmenty infekci v následné kultivaci a při delší době segmenty nekrotizovaly v důsledku poškození pletiv. Jako nejvhodnější varianta byla vybrána doba 12 minut. 25

Tabulka č. 8: Sterilizační pokus Čas sterilizace [minuty] Množství segmentů [ks] Množství infekcí [ks] Množství nekróz [ks] Procentuální úspěšnost [rel. %] 8 15 11 0 27 12 15 2 0 87 14 15 0 7 53 Obrázek č. 4: Dačnyj - DKW 1 0,8 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA Obrázek č. 5: Dačnyj Obrázek č. 6: Dačnyj - DKW 1 2,0 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA - DKW 1 5,0 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA 26

V tabulce č. 9 je uveden přehled průměrných délek a průměrného počtu prýtů a počet vytvořených kalusů jednotlivých podnožových odrůd Teleki 5C a Crâciunel 2 sledovaných na různých médiích a daných koncentracích růstových regulátorů, především IBA a BAP. Byla vybrána dvě média MS a DKW 1, přičemž každé médium tvoří tři varianty koncentrací fytohormonů. IBA 0,01 a 0,1 mg.l -1 a BAP 0,3 mg.l -1 ; 0,8 mg.l -1 a 2,0 mg.l -1 viz. tabulka č. 5. Tabulka č. 9: Přehled průměrné délky a průměrného počtu prýtů jednotlivých podnoží Médium Podnož Průměrný počet prýtů [ks] Průměrná délka prýtů [mm] Počet explantátů tvořících kalus [ks] MS 0,3 BAP Teleki 5C 1,3056 18,7234 6 0,1 IBA Crâciunel 2 1,7333 25,6154 6 MS 0,8 BAP Teleki 5C 1,4688 7,7234 3 0,01 IBA Crâciunel 2 2,4667 12,2162 2 MS 2,0 BAP Teleki 5C 1,7353 14,3559 30 0,1 IBA Crâciunel 2 3,0833 18,7828 12 DKW 0,3 BAP Teleki 5C 1,2308 15,5000 11 0,1 IBA Crâciunel 2 1,2000 32,3333 15 DKW 0,8 BAP Teleki 5C 1,5652 21,6667 14 0,01 IBA Crâciunel 2 1,7143 24,1111 17 DKW 2,0 BAP Teleki 5C 1,2632 12,6667 11 0,1 IBA Crâciunel 2 2,1481 15,3103 24 Médium MS bylo vybráno jako nejvhodnější pro množení rezistentního kultivaru révy vinné Bianka Fišerovou (1996) z pěti testovaných druhů médií s 25 variantami změn růstových regulátorů. Na médiu DKW 1 s 0,8 BAP a 0,01 IBA prováděl své multiplikační pokusy Janoušek (2010), který toto médium používal i pro mikroroubování materiálů vhodných pro testaci viru svinutka 3. 27

Z následujícího grafu (Graf č. 1) můžeme vyčíst, že vybraným odrůdám se ve větším případě dařilo na MS médiu, tvořily více prýtů, nejvíce podnož Crâciunel 2 při koncentraci 0,1 mg.l -1 IBA a 2,0 mg.l -1 BAP. Graf č. 1: Počet prýtů v závislosti na koncentraci fytohormonů Počet prýtů v závislosti na koncentraci fytohormonů Průměrné množství [ks] 3,5 4 2,5 3 2 1,5 0,5 1 0 Teleki 5C Crâciunel 2 Teleki 5C Crâciunel 2 Teleki 5C Crâciunel 2 MS médium DKW1 médium 0,1 IBA 0,1 IBA 0,01 IBA 0,01 IBA 0,1 IBA 0,1 IBA 0,3 BAP 0,3 BAP 0,8 BAP 0,8 BAP 2 BAP 2 BAP Podnož a koncentrace fytohormonů V následujícím grafu (graf č. 2) můžeme sledovat působení DKW 1 média na prodlužování prýtů s nejnižší hladinou BAP. Opět se ukazuje jako v předchozím grafu, že odrůda Crâciunel reagovala na koncentrace růstových regulátorů nejlépe. Zvyšující se hladina BAP podporuje vyšší tvorbu prýtů, které jsou ale kratší. Graf č. 2: Průměrná délka prýtů v závislosti na koncentraci fytohormonů Průměrná délka prýtů v závislosti na koncentraci fytohormonů Průměrná délka [mm] 35 30 25 20 15 10 5 0 Teleki 5C Crâciunel 2 Teleki 5C Crâciunel 2 Teleki 5C Crâciunel 2 MS médium DKW1 médium 0,1 IBA 0,1 IBA 0,01 IBA 0,01 IBA 0,1 IBA 0,1 IBA 0,3 BAP 0,3 BAP 0,8 BAP 0,8 BAP 2 BAP 2 BAP Podnož a koncentrace fytohormonů Na obrázcích č. 4-15 jsou uvedeny reprezentativní ukázky růstu jednotlivých odrůd révy vinné na sledovaných médiích po 8 týdnech kultivace v kultivační místnosti. 28

Obrázek č. 7: Teleki 5C Obrázek č. 8: Teleki 5C - DKW 1 0,3 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA - MS 0,3 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA Obrázek č. 9: Teleki 5C Obrázek č. 10: Teleki 5C - DKW 1 0,8 mg.l -1 BAP; 0,01 mg.l -1 IBA - MS 0,8 mg.l -1 BAP; 0,01 mg.l -1 IBA Obrázek č. 11: Teleki 5C Obrázek č. 12: Teleki 5C - DKW 1 2,0 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA - MS 2,0 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA 29

Obrázek č. 13: Crâciunel 2 Obrázek č. 14: Crâciunel 2 - DKW 1 0,3 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA - MS 0,3 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA Obrázek č. 15: Crâciunel 2 Obrázek č. 16: Crâciunel 2 - DKW 1 0,8 mg.l -1 BAP; 0,01 mg.l -1 IBA - MS 0,8 mg.l -1 BAP; 0,01 mg.l -1 IBA Obrázek č. 17: Crâciunel 2 Obrázek č. 18: Crâciunel 2 - DKW 1 2,0 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA - MS 2,0 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA 30

Podle výsledků zpracovaných v grafu č. 3 můžeme konstatovat, že největší tvorba kalusu je zřetelná u odrůdy Teleki 5C v médiu MS s koncentrací 2 mg.l -1 BAP a 0,1 mg.l -1 IBA. Celkově větší tvorbu kalusů však projevují obě odrůdy na DKW 1 médiu. Můžeme také soudit, že vyšší množství auxinu a cytokininu (IBA a BAP) působí ve vzájemné kombinaci příznivě na tvorbu kalusu. Graf č. 3: Počet kalusů v závislosti na médiu a koncentraci fytohormonů Průměrné množství [ks] 35 30 25 20 15 10 5 0 Počet kalusů v závislosti na médiu a koncentraci fytohormonů MS médium DKW1 médium Teleki 5C Crâciunel 2 Teleki 5C Crâciunel 2 Teleki 5C Crâciunel 2 0,1 IBA 0,1 IBA 0,1 IBA 0,1 IBA 0,1 IBA 0,1 IBA 0,3 BAP 0,3 BAP 0,8 BAP 0,8 BAP 2 BAP 2 BAP MS MS MS MS MS MS Podnož, koncentrace a médium Graf č. 4: Počet prýtů v závislosti na koncentraci fytohormonů - podnož Teleki 5C Počet prýtů v závislosti na koncentraci fytohormonů - podnož Teleki 5C Průměrné množství [ks] 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,1 IBA 0,01 IBA 0,1 IBA MS médium DKW1 médium 0,3 BAP 0,8 BAP 2 BAP Koncentrace fytohormonů V grafech č. 4 a 5 můžeme pozorovat se zvyšujícím se množstvím BAP, které je přímo úměrné počtu prýtů u MS média u obou odrůd podnoží. Ukazuje to, že čím je koncentrace cytokininů vyšší, tím dochází k vyššímu větvení prýtů. Naopak u DKW 1 média je optimální pro multiplikaci prýtů koncentrace 0,8 mg.l -1 BAP a 0,01 mg.l -1 IBA. Nižší a vyšší koncentrace nejsou tak účinné. 31

Graf č. 5: Počet prýtů v závislosti na koncentraci fytohormonů - podnož Craciunel 2 Počet prýtů v závislosti na koncentraci fytohormonů - podnož Crâciunel 2 Průměrné množství [ks] 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0,1 IBA 0,01 IBA 0,1 IBA MS médium DKW1 médium 0,3 BAP 0,8 BAP 2 BAP Koncentrace fztohormonů Graf č. 6: Průměrná délka prýtů v závislosti na koncentraci fytohormonů - podnož Teleki 5C Průměrná délka prýtů v závislosti na koncentraci fytohomonů - podnož Teleki 5C Průměrná délka [mm] 30 25 20 15 10 5 0 0,1 IBA 0,01 IBA 0,1 IBA MS médium DKW1 médium 0,3 BAP 0,8 BAP 2 BAP Koncentrace Graf č. 5 a 6 ukazuje, že DKW 1 médium s vyšším obsahem dusíku a fosforu, který podporuje funkci dusíku, způsobuje dlouživý růst prýtů u obou odrůd více než médium MS. 32

Graf č. 7: Průměrná délka prýtů v závislosti na koncentraci fytohormonů - podnož Craciunel 2 Průměrná délka prýtů v závislosti na koncentraci fytohormonů - podnož Crâciunel 2 Průměrná délka [mm] 35 30 25 20 15 10 5 0 0,1 IBA 0,01 IBA 0,1 IBA MS médium DKW1 médium 0,3 BAP 0,8 BAP 2 BAP Koncentrace Médium DKW 1 s 0,8 mg.l -1 BA a 0,01 mg.l -1 IBA používal Janoušek (2010) jako multiplikační médium pro odrůdy révy Kober 125 BB, Cabernet Moravia a Cabernet Sauvignon a na témže médiu bylo provedeno i mikroroubování. Z výsledků je patrné (graf č. 2), že podnož Craciunel 2 má vyšší aktivitu růstu než podnož Teleki 5C a vyhovuje jí lépe složení média MS (graf č. 1). Delší prýty byly produkovány na DKW 1 médiu (graf č. 2). Z grafů č. 4 a 5 lze potvrdit, že přídavek BAP do MS média statisticky průkazně zvyšuje počet prýtů oproti médiu DKW 1. Grafy č. 6 a 7 potvrzují lepší vhodnost DKW 1 média pro potřebu získání delších prýtů. Vzhledem k tomu, že cílem práce bylo najít vhodné médium s optimálním obsahem růstových regulátorů pro multiplikaci podnožového materiálu Craciunel 2 a Teleki 5C, který by dál mohl být použit pro testaci viru svinutka 3, lze doporučit pro přípravu materiálu k mikroroubování (Janoušek, 2010) médium MS s 2 mg.l -1 BA a 0,1 mg.l -1 IBA. Podle tabulky č. 3 obsahují obě média obdobné množství dusíku (podle tabulky č. 1 nadbytek dusíku způsobuje chlorózy a tento jev nebyl při naší testaci prokázán), a DKW 1 médium má více fosforu, který by podle Pavlouška (2010) mohl způsobit bujný růst (tento jev nebyl prokázán). Patrně vyšší obsah vápníku v DKW 1 médiu bude limitujícím faktorem menší vhodnosti tohoto média k multiplikaci sledovaných podnoží révy. Daleko výraznější vliv na aktivitu růstu je sledován při aplikaci cytokininu BAP. Nižší koncentrace prodlužují prýt (graf č. 6 a 7) a přídavek 2 mg.l -1 BAP sice o cca 0,5 cm v průměru prýt zkrátí, ale zase svým účinkem vyvolá vyšší četnost prýtů (graf č. 4 a 5). 33

Pracovní protokol pro založení a multiplikaci révy vinné 1. odběr réví po ukončení dormance (prosinec-únor) ve vinohradu, jeho segmentace a narašení v destilované vodě v laboratorních podmínkách. 2. sterilizace prýtů z narašených pupenů 0,2% HgCl 2 po dobu 12 minut a 3 x opláchnout ve sterilní destilované vodě. 3. kultivace na médiu DKW 1 5,0 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA 4. multiplikace na médiu MS 2 mg.l -1 BA a 0,1 mg.l -1 IBA po dobu 8 týdnů v kultivační místnosti při 21 C a světelné periodě 16 hod světla/8 hod tma. Po cca 8 týdnech je vhodné provést další pasáž na multiplikační médium či je materiál připraven pro další použití. 34

7. ZÁVĚR V moderním vinohradnictví je zcela nezastupitelná metoda množení in vitro, která umožňuje mimo jiné i ozdravování materiálu a testaci pomocí dřevitých indikátorů na virózy. V této práci je uveden způsob založení primární kultury in vitro odrůdy Dačnyj citlivé na virózy svinutky a padlí. Multiplikační fáze in vitro byla sledována u podnoží Crâciunel 2 a Teleki 5C na dvou základních médiích Murashige, Skoog (1962) a Driver, Kuniyuki (1984) s třemi variantami obsahu BAP a IBA. Nižší obsah BAP prodlužoval délku prýtu, zvýšený obsah 2 mg.l -1 BAP zvyšoval počet vytvářených prýtů. Vyhovující pro sledované odrůdy bylo médium MS než médium DKW 1, které bylo používáno jinými autory. Pro množení uvedených podnoží je vhodnější médium MS 2 mg.l -1 BA a 0,1 mg.l -1 IBA. 35

8. RESUMÉ A SOUHRN Práce je zaměřena na množení modrých moštových odrůd révy vinné (Vitis vinifera L.) vhodných pro testaci viru svinutka-3. Proto se tato práce zabývá jejich množením v podmínkách in vitro. Byla vybrána dvě média, Murashige & Skoog (1962) a Driver & Kuniyuki (1984). Rostlinný materiál byl odebrán z odrůdy Dačnyj z vinohradu Mendelea Zahradnické fakulty v Lednici na Moravě. Dále byly použity podnože Teleki 5C a Crâciunel 2 z již vytvořených kultivací. V použitých typech koncentrací bylo sledováno větvení prýtu, tvorba kalusu a celkový růst explantátů. Ze zjištěných údajů se jako nejvhodnější médium, které splňovalo požadavky pro následnou multiplikaci a testaci viru svinutka-3, ukázalo MS 2 mg.l -1 BA a 0,1 mg.l -1 IBA. Klíčová slova: in vitro, svinutka, multiplikace, médium Work is focused on the proliferation of blue-grape vine varieties (Vitis vinifera L.) suitable for testing of leafroll virus-3. Therefore, this essay focuses on the propagation in vitro. She was selected two media, Murashige & Skoog (1962) and Driver & Kuniyuki (1984). Plant material was collected from a variety Dačnyj Vineyard Mendelea of the Faculty of Horticulture in Lednice in Moravia. Were also used rootstocks 5C and telecommunications Crâciunel 2 of cultivation have already been created. In the types of concentrations were observed branching shoots, production and overall growth of calli explants. From the obtained data, the most appropriate medium to meet the requirements for the subsequent multiplication and testing of leafroll virus-3 showed ms 2 mg.l-1 BA and 0.1 mg.l-1 IBA. Key words: in vitro, leafroll, multiplication, medium 36

9. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY 1. ADAM, M.: Možnosti eliminace nežádoucího působení fenolických sloučenin na rostlinné explantáty. Diplomová práce. MZLU v Brně, 2001. 2. ANONYM: Makrořasy - Seaweeds [online]. [cit. 2010-07-02]. Dostupné z WWW: <botany.natur.cuni.cz/algo/soubory/biochemie/02_seaweed_industry.pdf>. 3. DIXON, R. A., GONZALES, R. A.: Plant cell culture : a practical approach. 2. vyd. Oxford: IRL Press, 1994. 230 s. The Practical approach series. ISBN 0-19-963402-5. 4. DRIVER, J.A., KUNIYUKI, A.H.: In vitro propagation of paradox walnut rootstock. Hort Science. 1984, 19: 507-509. 5. DVOŘÁK, M.: Fyziologie rostlin speciální. Metabolismus minerálních látek u rostlin. 1. vyd. Praha: Univerzita Karlova, 1976. 173 s. 6. FIŠEROVÁ, H.: Odvození explantátové kultury révy vinné. MendelNET 96, MZLU v Brně, 14-15, 1996. 7. GEORGE, E. F., HALL, M. A.: Plant propagation by tissue culture: The Background. Volume 1. 3. vyd. Dordrecht: Springer, 2007. 501 s. 8. GEORGE, E.F., SHERRINGTON, P.D.: Plant propagation by Tissue Culture. Hanbook and Directory of Commercial Laboratories. Eastern Press, Eversley, 1984. 709 s. 9. HOLLEINOVÁ, V., POKORNÝ, R.: Diagnostika virových patogenů révy a uplatnění ozdravovacích metod na vybraných odrůdách v udržovacím šlechtění révy v České republice. Disertační práce. MZLU v Brně, 2007. 125 s. 37

10. HRADILÍK, J.: Rostlinné explantáty. 1. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2005. 85 s. ISBN 80-7157-915-7. 11. JANOUŠEK, J.: Množení dřevinných indikátorů rodu Vitis a aplikace metody mikroroubování v podmínkách in vitro. Diplomová práce. MENDELU v Brně, 2010. 39 s. 12. LUDVÍKOVÁ, I., SEDLO, J., ŠEVČÍK, J.: Přehled odrůd révy 2004. Velké Bílovice: Svaz vinařů České republiky, 2004. 95 s. ISBN 80-903534-3-6. 13. KOVÁČ, J.: Explantátové kultury rostlin. 1. vyd. Ústí nad Labem: Univerzita J. E. Purkyně, 1992. 146 s. ISBN 80-7044-036-8. 14. KRAUS, V., HUBÁČEK, V. ACKERMANN, P.: Rukověť vinaře. 1. vyd. Praha: KVĚT, 2004. 267 s. ISBN 80-209-0327-5. 15. KUTÁČEK, M., BANDURSKI, R.R.: Physiology and Biochemistry of Auxins in Plants : Proceed. of the Symposium held at Liblice, Czechoslovakia, Sept. 28- Oct. 2, 1987. 1. vyd. Praha: Academia, 1988. 428 s. 16. LEE, J. et al.: Influence of grapevine leafroll associated viruses (GLRaV-2 and -3) on the fruit composition of Oregon Vitis vinifera L. cv. Pinot noir: Free amino acids, sugars, and organic acids. Food Chemistry [online]. 2009, 117, [cit. 2010-06-16]. Dostupný z WWW: <lib3.dss.go.th/fulltext/e_content/0308-8146/2009v.117n.1.pdf>. 17. LEE, J., MARTIN, R.R.: Influence of grapevine leafroll associated viruses (GLRaV-2 and -3) on the fruit composition of Oregon Vitis vinifera L. cv. Pinot noir: Phenolics. Elsevier : Food Chemistry [online]. 2009, 112, [cit. 2010-06- 26]. Dostupný z WWW: <lib3.dss.go.th/fulltext/e_content/0308-8146/2009v.112n.4.pdf>. 18. MARTINSON, T. et al: Grapevine Leafroll an Increasing Problem in the Finger Lakes, the US and the World.New York State Agricultural Experiment 38

Station Cornell University [online]. [cit. 2010-06-16]. Dostupný z WWW: <www.napagrowers.org/pdf/grapevineleafroll.pdf>. 19. MURASHIGE, T., SKOOG, F.: A resived medium for rapid growth and bioassay with Tobago tissue cultures. Physiol. Plant. 1962, 15: 473-479. 20. PAVLOUŠEK, P.: Management kvality ve vinohradnictví. (přednáška) Lednice: MENDELU v Brně, 5.5.2010 21. POSPÍŠILOVÁ, D., SEKERA, D., RUMAN, T.: Ampelografia Slovenska. Bratislava: Výskumná a šlachtitel'ská stanica vinárska a vinohradnícka Modra, 2005. 368 s. ISBN 80-96-9350-9-7. 22. PROCHÁZKA, S. a kol.: Fyziologie rostlin. 1. vyd. Praha: Academia, 1998. 484 s. ISBN 80-200-0586-2. 23. PSOTA, V., ŠEBÁNEK, J.: Za tajemstvím růstu rostlin : návody k experimentům. 1. vyd. Praha: Scientia, 1999. 187 s. ISBN 80-7183-093-3. 24. SPĚVÁČKOVÁ, K.: Rozmnožování podnožových odrůd révy vinné v podmínkách in vitro. Diplomová práce. MZLU v Brně, 1999. 25. ŠAFRÁNKOVÁ, I.: Poruchy, poškození a choroby révy vinné. 1. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2007. 77 s. ISBN 978-80- 7375-100-5. 26. ŠEBÁNEK, J., SLADKÝ, Z.: Biotechnologie rostlinných explantátů. 1. vyd. Brno: Vysoká škola zemědělská, 1988. 100 s. 39

SEZNAM OBRÁZKŮ, TABULEK A GRAFŮ Obrázek č. 1: Metody mikropropagace rostlin (George a Sherrington, 1984) Obrázek č. 2: Chemická struktura agarózy (Makrořasy - Seaweeds) Obrázek č. 3: Schéma rozdělení fytohormonů v prýtu Obrázek č. 4: Dačnyj - DKW 1 0,8 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA Obrázek č. 5: Dačnyj - DKW 1 2,0 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA Obrázek č. 6: Dačnyj - DKW 1 5,0 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA Obrázek č. 7: Teleki 5C - DKW 1 0,3 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA Obrázek č. 8: Teleki 5C - MS 0,3 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA Obrázek č. 9: Teleki 5C - DKW 1 0,8 mg.l -1 BAP; 0,01 mg.l -1 IBA Obrázek č. 10: Teleki 5C - MS 0,8 mg.l -1 BAP; 0,01 mg.l -1 IBA Obrázek č. 11: Teleki 5C - DKW 1 2,0 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA Obrázek č. 12: Teleki 5C - MS 2,0 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA Obrázek č. 13: Crâciunel 2 - DKW 1 0,3 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA Obrázek č. 14: Crâciunel 2 - MS 0,3 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA Obrázek č. 15: Crâciunel 2 - DKW 1 0,8 mg.l -1 BAP; 0,01 mg.l -1 IBA Obrázek č. 16: Crâciunel 2 - DKW 1 0,8 mg.l -1 BAP; 0,01 mg.l -1 IBA Obrázek č. 17: Crâciunel 2 - DKW 1 2,0 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA Obrázek č. 18: Crâciunel 2 - DKW 1 2,0 mg.l -1 BAP; 0,1 mg.l -1 IBA Tabulka č. 1: Poruchy při příjmu fosforu (podle Pavlouška, 2010) Tabulka č. 2: Poruchy při příjmu dusíku (podle Pavlouška, 2010) Tabulka č. 3: Poruchy při příjmu vápníku (podle Pavlouška 2010) Tabulka č. 4: Složení MS a DKW média Tabulka č. 5: Koncentrace fytohormonů v médiích pro odrůd Teleki 5C a Crâciunel 2 Tabulka č. 6: Koncentrace fytohormonů v médiích pro odrůdu Dačnyj Tabulka č. 7: Přehled výsledků Dačnyj na médiu DKW 1 Tabulka č. 8: Sterilizační pokus Tabulka č. 9: Přehled průměrné délky a průměrného počtu prýtů jednotlivých podnoží Graf č. 1: Počet prýtů v závislosti na koncentraci fytohormonů Graf č. 2: Průměrná délka prýtů v závislosti na koncentraci fytohormonů 40

Graf č. 3: Počet kalusů v závislosti na médiu a koncentraci fytohormonů Graf č. 4: Počet prýtů v závislosti na koncentraci fytohormonů - podnož Teleki 5C Graf č. 5: Počet prýtů v závislosti na koncentraci fytohormonů - podnož Craciunel 2 Graf č. 6: Průměrná délka prýtů v závislosti na koncentraci fytohormonů - podnož Teleki 5C Graf č. 7: Průměrná délka prýtů v závislosti na koncentraci fytohormonů - podnož Craciunel 2 41