Doplňky stravy, Bifidobacterium, izolace DNA, imunomagnetická separace, magnetické částice, polymerázová řetězová reakce

ABSTRAKT Probiotické bakterie mléčného kvašení (BMK) jsou ve velké míře využívány v potravinářském průmyslu například při výrobě mléčných výrobků, sýrů a fermentovaných salámů, dále se využívají ke konzervaci zeleniny. V diplomové práci byly testovány synbiotické doplňky stravy od různých výrobců. Byla provedena izolace celkové DNA z hrubých lyzátů buněk pomocí magnetických nosičů P(HEMA-co-GMA) ze šesti doplňků stravy. Ze všech výrobků byla izolována DNA v kvalitě pro polymerázovozu řetězovou reakci (PCR). V souladu s údaji deklarovanými výrobcem byla pomocí PCR prokázána přítomnost bakterií rodu Bifidobacterium. Dále byla provedena imunomagnetická separace buněk rodu Bifidobacterium ze dvou výrobků a jejich identifikace pomocí PCR. U obou výrobků byla prokázána přítomnost bakterií rodu Bifidobacterium. ABSTRACT Probiotic lactic acid bacteria (LAB) are very often used in food procesing industry, such as milk products, cheese and fermentsd salami production in nova days. In diploma thesis were tested symbiotic food supplements from different producers. Bacterial DNA was isolated from crude cell lysates of six food suplements by magnetic particles P(HEMA-co-GMA). PCR-ready DNAs were isolated. from all products The detection of Bifidobacterium bacteria identified by PCR was in agreement with those declared by the manufacturers. Magnetic particles with immobilized antibodies against Bifidobacterium were used in the next part of thesis. These particles were used for the isolation of target cells from two products with cell identification by genus specific PCR. KLÍČOVÁ SLOVA Doplňky stravy, Bifidobacterium, izolace DNA, imunomagnetická separace, magnetické částice, polymerázová řetězová reakce KEYWORDS Food supplements, Bifidobacterium, DNA isolation, immunomagnetic separation, magnetic particles, polymerase chain reaction

MIZEROVSKÁ, L. Selektivní izolace bakterií rodu Bifidobacterium z potravin. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2012. 99 s. Vedoucí diplomové práce doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc..

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně a že všechny použité literární zdroje jsem správně a úplně citovala. Diplomová práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího práce a děkana FCH VUT. V Brně dne...... (podpis autora) PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych ráda poděkovala vedoucímu diplomové práce doc. Ing. Bohuslavu Rittichovi, CSc. za odborné vedení, množství cenných rad a připomínek. Dále bych chtěla poděkovat doc. RNDr. Aleně Španové, CSc. za cenné rady a odborný dohled. Velký dík patří také kolektivu z laboratoře toho času na doktorském studiu.

OBSAH 1 ÚVOD 1 2 TEORETICKÁ ČÁST 2 2.1 Probiotika... 2 2.1.1 Historie... 2 2.1.2 Charakteristika... 2 2.1.3 Mechanismy působení... 4 2.1.4 Bezpečnost... 4 2.2 Prebiotika... 5 2.2.1 Definice... 5 2.2.2 Charakteristika... 5 2.3 Synbiotika... 7 2.4 Doplňky stravy a funkční potraviny... 8 2.5 Probiotické kmeny rodu Bifidobacterium... 9 2.5.1 Taxonomické zařazení bakterií rodu Bifidobacterium... 9 2.5.2 Charakterisktika rodu Bifidobacterium... 10 2.6 Izolace bakteriální DNA... 12 2.6.1 Rozrušení buněčné stěny... 12 2.6.2 Extrakce nukleových kyselin a purifikace DNA... 13 2.6.3 Izolace DNA pomocí magnetických částic... 14 2.7 Polymerázová řetězová reakce... 15 2.7.1 Průběh polymerázové řetězové reakce... 15 3 CÍL PRÁCE 17 4 MATERIÁL 18 4.1 Analyzované potraviny - synbiotické doplňky stravy... 18 4.1.1 Synbiotické doplňky stravy ve formě tablet... 18 4.1.2 Synbiotické doplňky stravy ve formě tobolek... 18 4.2 Bakteriální kultury... 19 vii

4.3 Chemikálie a roztoky... 19 4.3.1 Imunomagnetické částice pro izolaci buněk rodu Bifidobacterium... 20 4.3.2 Magnetické částice pro izolaci DNA... 20 4.3.3 Roztoky pro přípravu hrubých lyzátů buněk... 20 4.3.4 Roztoky pro imuno-magnetickou izolaci buněk... 21 4.3.5 Roztoky pro izolaci DNA pomocí magnetických nosičů... 21 4.3.6 Roztoky pro agarózovou gelovou elektroforézu... 22 4.4 Přístroje a pomůcky... 22 5 METODY 23 5.1 Příprava vzorků pro imuno-magnetickou izolaci buněk... 23 5.2 Imuno-magnetická izolace buněk... 23 5.3 Kontrola imuno-magnetické separace pomocí PCR... 23 5.4 Příprava hrubých lyzátů buněk z doplňků stravy... 23 5.4.1 Lýze buněk z tablet synbiotických doplňků stravy... 23 5.4.2 Lýze buněk z tobolek synbiotických doplňků stravy... 24 5.5 Izolace DNA pomocí magnetických nosičů... 25 5.6 Spektrofotometrické stanovení koncentrace DNA... 25 5.7 Amplifikace DNA pomocí polymerázové řetězové reakce... 26 5.7.1 Komponenty pro směs PCR... 26 5.4.1.1. Primery pro PCR... 27 5.7.2 Složení PCR směsí pro stanovení citlivosti metody PCR... 28 5.7.3 PCR specifická pro doménu Bacteria... 29 5.7.4 PCR specifická pro rod Bifidobacterium... 29 5.7.5 PCR specifická pro druh Bifidobacterium animalis... 29 5.7.6 Programy pro PCR... 30 5.8 Detekce PCR produktů agarózovou gelovou elektroforézou... 31 5.8.1 Příprava 1,8 % agarózového gelu... 31 5.8.2 DNA standard (žebříček 100 bp)... 31 6 VÝSLEDKY 32 6.1 Příprava vzorků pro imuno-magnetickou izolaci buněk... 32 6.1.1 Stanovení počtu bakterií v tobolce... 32 viii

6.1.2 Identifikace buněk pomocí PCR z bakteriálních kolonií... 33 6.1.2.1 Aerobní kultivace... 33 6.1.2.2 Anaerobní kultivace... 39 6.2 Imuno-magnetická izolace buněk... 45 6.2.1 Identifikace buněk separovaných imuno-magnetickými nosiči pomocí PCR (IMS - PCR)... 45 6.2.2 Identifikace buněk separovaných imuno-magnetickými nosiči kultivační metodou (IMS KM)... 47 6.3 Izolace DNA z hrubých lyzátů buněk pomocí magnetických nosičů... 51 6.3.1 Spektrofotometrické stanovení koncentrace DNA izolované z tablet 51 6.3.2 Spektrofotometrické stanovení koncentrace DNA izolované z tobolek 53 6.3.3 Srovnání množství DNA izolované z výrobků... 54 6.3.4 Srovnání množství DNA izolované z tablet... 54 6.3.4.1 Porovnání průměrného množství DNA z 10 tablet výrobků Pangamin BIFI plus (2 různé šarže) a Pangamin BIFI... 55 6.3.5 Srovnání množství DNA izolované z tobolek... 56 6.3.5.1 Porovnání průměrných hodnot množství DNA z 5 tobolek výrobků Biopron, Linex forte a Multilac... 57 6.4 Stanovení citlivosti metod PCR s purifikovanou DNA... 58 6.4.1 Stanovení citlivosti PCR specifické pro rod Bifidobacterium... 58 6.4.2 Stanovení citlivosti PCR specifické pro druh Bifidobacterium animalis 60 6.5 PCR pro doménu Bacteria s DNA matricí izolovanou z doplňků stravy 61 6.5.1 PCR s DNA izolovanou z tablet... 61 6.5.2 PCR s DNA izolovanou z tobolek... 63 6.6 Rodově specifická PCR pro rod Bifidobacterium... 64 6.6.1 PCR s DNA matricí izolovanou z tablet... 64 6.6.2 PCR s DNA matricí izolovanou z tobolek... 70 6.7 PCR specifická pro druh Bifidobacterium animalis... 74 6.7.1 PCR s DNA matricí izolovanou z tablet... 75 6.7.2 PCR s DNA matricí izolovanou z tobolek... 79 6.8 Shrnutí výsledků průzkumu celkové DNA jednotlivých výrobků... 84 ix

7 DISKUZE 85 7.1 Stanovení počtu bakterií v tobolce... 85 7.2 Identifikace buněk pomocí PCR z bakteriálních kolonií... 85 7.2.1 Aerobní kultivace... 85 7.2.2 Anaerobní kultivace... 86 7.3 Imuno-magnetická izolace buněk... 86 7.3.1 Identifikace buněk separovaných imuno-magnetickými nosiči pomocí PCR (IMS-PCR)... 87 7.3.2 Identifikace buněk separovaných imuno-magnetickými nosiči kultivační metodou (IMS-KM)... 87 7.4 Izolace DNA z hrubých lyzátů buněk pomocí magnetických nosičů... 88 7.4.1 Spektrofotometrické stanovení koncentrace DNA izolované z tablet 88 7.4.2 Spektrofotometrické stanovení koncentrace DNA izolované z tobolek 88 7.4.3 Srovnání množství DNA izolované z tablet... 88 7.4.4 Srovnání množství DNA izolované z tobolek... 89 7.5 Stanovení citlivosti metod PCR s purifikovanou DNA... 89 7.6 PCR pro doménu Bacteria s DNA matricí izolovanou z doplňků stravy 89 7.7 Rodově specifická PCR pro rod Bifidobacterium... 89 7.8 PCR specifická pro druh B. animalis... 90 8 ZÁVĚR 91 SEZNAM ZKRATEK 96 PŘÍLOHY 98 x

1 ÚVOD V posledních letech je věnována velká pozornost probiotickým mikroorganismům, které mají vliv na zlepšení zdravotního stavu modulací střevní mikroflóry [47]. S konzumací probiotik je spojen význam prebiotik, které jsou substrátem probiotických bakterií. Konzumace prebiotik zvyšuje pravděpodobnost, že probiotické bakterie budou v převaze nad patogenními mikroorganismy, které jsou také běžnou součástí gastrointestinálního traktu (GIT) [47]. Jestliže jsou probiotické mikroorganismy konzumovány současně s prebiotiky, ať už v běžných potravinách nebo jako doplněk stravy, nazýváme takový výrobek synbiotikum. Dříve se zájem soustředil výhradně na identifikaci patogenních mikroorganismů GIT traktu, které jsou původci různých onemocnění. Poté, co bylo zjištěno, že probiotické bakterie inhibují jejich růst a navíc zlepšují zdravotní stav člověka, začal se výzkum soustředit na identifikaci probiotických bakterií [47]. Tato práce se zabývá izolací DNA a identifikací bifidobakterií v synbiotických doplňcích stravy (Bylo využito moderních metod izolace DNA a identifikace byla provedena pomocí molekulárně biologické metody polymerázové řetězové reakce (PCR). Zavádění nových metod izolace DNA má za úkol především zkrátit čas analýzy, zvýšit její specifitu a citlivost. Jednou z takových metod je i imuno-magnetická separace, která byla využita v experimentální části diplomové práce. Použití magnetických částic s navázanou protilátkou proti konkrétnímu druhu bakterií zajišťuje vysokou specifitu. Magnetická separace je mnohem rychlejší [48] než klasické postupy izolace, které jsou časově náročné a při analýze se používají chemikálie s nepříznivým vlivem na zdraví člověka (např. fenol). 1

2 TEORETICKÁ ČÁST 2.1 Probiotika 2.1.1 Historie V roce 1908 držitel Nobelovy ceny Ilja Mečnikov prohlásil, že dlouhý život bulharských rolníků je výsledkem jejich dlouhodobé konzumace mléčných kysaných výrobků. Usoudil, že konzumace těchto výrobků pozitivně ovlivňuje střevní mikroflóru, protože tyto mikroorganismy snižují patogenní bakteriální populaci střeva. [1,6] Termín probiotika byl poprvé použit v roce 1965. Tento termín popisoval látku, která je vylučovaná jedním organismem a stimuluje růst jiného organismu.[1] V roce 1974 použil R. B. Parker termín probiotika, tak jak ho vnímáme dnes. Definoval probiotika jako organismy a látky, které přispívají k mikrobiální rovnováze střeva.[4] Jedna z nejčastěji používaných definic byla ustanovena roku 2001 institucí Food and Agriculture Organization/ World Health Organization (FAO/WHO): Probiotika jsou živé mikroorganismy, které při konzumaci v dostatečném množství mají pozitivní vliv na zdraví hostitele. [2] 2.1.2 Charakteristika Probiotika jsou dobře známá pro svůj pozitivní vliv na stav střev. Bylo zjištěno, že probiotika přináší další zdravotní výhody, jako je zlepšení nesnášenlivosti laktózy, zvýšení humorální imunitní odpovědi, zlepšení post-menopauzálních symptomů biotransformací isoflavonu fytoestrogenu, biokonverze bioaktivních peptidů, které mají vliv na snížení krevního tlaku a snížení hladiny cholesterolu.[3] Efektivní probiotika mají příznivě působit na hostitelský organismus, obsahovat nepatogenní a netoxické mikroorganismy, mají obsahovat velké množství životaschopných buněk a měla by být schopna průchodu zažívacím traktem a metabolizovat ve střevě. [5] V průběhu let byly objeveny různé kmeny bakterií, které mají probiotické vlastnosti. Jsou to především bakterie produkující kyselinu mléčnou (laktobacily, streptokoky, enterokoky, laktokoky, bifidobakterie) a kvasinky Saccharomyces. Stručné shrnutí klíčových probiotik, které uvádí literatura a jejich příznivý vliv na zdraví, jsou uvedeny v Tabulce 1 [2,3] 2

Tabulka 1 Klíčové probiotické mikroorganismy a jejich účinek na zdraví člověka [6] KLÍČOVÉ PROBIOTICKÉ ORGANISMY Bakterie mléčného kvašení Bifidobakterie Mikroorganismus Lactobacillus rhamnosus GG Lactobacillus casei Lactobacillus casei Sirota Lactobacillus acidophilus Lactobacillus johnsonii Lactobacillus plantarum Bifidobacterium breve Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium Dopad na lidské zdraví Snižuje nežádoucí propustnost střeva způsobenou kravským mlékem nebo rotavirovou infekcí. Může zkrátit průběh průjmového onemocnění. Snižuje závažnost a dobu trvání průjmu, stimuluje imunitní systém střeva, zmírňuje příznaky Crohnovy nemoci a má silné antimikrobiální vlastnosti Působí jako prevence proti průjmu způsobeného viry nebo bakteriemi. Má nejsilnější účinky na lidské zdraví z hlediska nesnášenlivosti laktózy. Produkuje kyselinu mléčnou, která snižuje ph ve střevech a přispívá k potlačení růstu patogenních mikroorganismů, jako jsou Salmonella spp. nebo kmeny Escherichia coli. Snižuje hladinu cholesterolu. Může snížit počet buněk Helicobacter pylori a výskyt zánětu v žaludku Produkují mastné kyseliny, které inhibují tvorbu karcinogenních produktů. Aktivují humorální imunitní systém produkcí Ig A. Snižuje obsah patogenních mikroorganismů, snižuje výskyt průjmů, zvyšuje protilátkovou odpověď. Působí jako prevence proti 3

Kvasinky infantis Bifidobacterium animalis Saccharomyces cerevisiae Boulardii průjmu a zácpě. Snižuje riziko akutního průjmu u dětí i dospělých. Působí jako prevence proti cestovatelskému průjmu a kolitidy patogenního původu. Snižuje riziko a dobu trvání průjmu spojeného s užíváním antibiotik. 2.1.3 Mechanismy působení Probiotika působí třemi mechanismy, kterými ovlivňují zdraví člověka. 1) Produkty anaerobní fermentace sacharidů jako jsou organické kyseliny mohou být absorbovány hostitelem. Tyto konečné produkty jsou schopné ovlivnit náladu člověka, energetickou hladinu a dokonce i kognitivní schopnosti.[18] 2) Úspěšně soutěží s patogeny 3) Stimulují imunitní odpověď hostitele produkcí specifických polysacharidů. Je důležité si uvědomit, že zdravotní výhody poskytované probiotiky jsou kmenově (ne druhově nebo rodově) specifické. Žádný probiotický kmen neposkytne všechny uvedené výhody. Klíčovým kritériem k posouzení mikroorganismu jako probiotika je jeho schopnost přežít transport horní částí gastrointestinálního traktu a kolonizovat střevo. [18] 2.1.4 Bezpečnost Probiotika jsou živé mikroorganismy a proto je možné, že mohou infikovat hostitele. Různé kmeny probiotik mají různé bezpečnostní profily. Ačkoliv probiotická terapie je ve své podstatě považována za bezpečnou, vzácně byla hlášena systémová infekce bifidobakteriemi a jsou známy případy sepse sekundárně spojené s mikroorganismy Lactobacillus rhamnosus GG a Lactobacillus casei. [1] Z různých studií vyplývá, že riziko infekce probiotiky obsahující laktobacily nebo bifidobakterie je stejné jako infekce komenzálními kmeny. Konzumace takovýchto produktů představuje nezanedbatelné riziko pro spotřebitele se sníženou imunitou. Proto byly zavedeny bezpečnostní pokyny pro probiotické organismy. FAO/WHO doporučuje, aby probiotické kmeny byly charakterizovány větším počtem testů jako rezistence vůči antibiotikům, metabolická aktivita, produkce toxinů, hemolytická aktivita, zvířecí modely pro studium možností infekce imunodeficientních hostitelů, vedlejší účinky u lidí a nežádoucí účinky na spotřebitele. [2, 7] 4

Možným zdrojem problémů je přítomnost genů pro rezistenci k antibiotikům u probiotických druhů (např. Enterococcus faecium). Rezistence k antibiotikům se horizontálním přenosem může přenést na autochtonní mikroflóru střev. Pro hodnocení antimikrobní rezistence se užívá metoda mikrodiluční test, ale zatím nebyla určena hraniční koncentrace. Kmeny nesoucí geny rezistence na plazmidu by neměly být použity jako probiotikum, a to ani jako probiotikum pro zvířata. [8, 9, 10] 2.2 Prebiotika 2.2.1 Definice Termín prebiotika byl zaveden Gibsonem a Roberfroidem (1995). Prebiotika jsou definována jako nestravitelná složka potravin, která má příznivý vliv na hostitele selektivní stimulací růstu a/nebo aktivity jednoho nebo limitovaného počtu probiotických bakterií ve střevě. Tato definice se více či méně překrývá s definicí vlákniny s výjimkou selektivity. Tato selektivita byla prokázana pro bifidobakterie, jejichž růst je podporován fermentací látek obsahující fruktooligosacharidy a inulin, transgalaktosylované oligosacharidy a sojové oligosacharidy. [4] 2.2.2 Charakteristika Aby složky potravin mohly být označeny jako prebiotika, musí splňovat některé předpoklady. Nesmí být hydrolyzovány ani absorbovány v horní části gastrointestinálního traktu, musí být selektivním substrátem pro jeden nebo limitovaný počet potencionálně prospěšných komenzálních bakterií ve střevě, stimulovat růst žádoucích bakterií nebo být metabolicky aktivní, anebo obojí. V důsledku těchto vlastností musí být potencionální prebiotika schopna ovlivňovat střevní mikroflóru tak, aby obsahovala více zdraví prospěšných mikroorganismů. [5] Většina prebiotik jsou cukry s krátkým řetězcem a stupněm polymerace dva a více, které jsou odolné k působení enzymů pankreatu. Jejich stručné shrnutí je uvedeno v Tabulce 2. Prebiotické oligosacharidy se vyrábí extrakcí rostlinných materiálů, mikrobiální nebo enzymatickou syntézou a enzymatickou hydrolýzou polysacharidů. V průmyslovém měřítku jsou produkované různé druhy prebiotik a jsou dostupné na trhu. Uvádí se, že výroba prebiotik je levná. Toto tvrzení vychází z předpokladu, že suroviny pro jejich výrobu jsou levné. To může být zavádějící, když uvážíme, že většina výrobních postupů zahrnuje enzymatické procesy, další syntézy a purifikaci. [6] 5

Tabulka 2 Hlavní představitelé prebiotik [6] HLAVNÍ PŘEDSTAVITELÉ PREBIOTIK Cukr Chemická struktura Způsob výroby Inulin Fructo - oligosacharidy Galakto- oligosacharidy Sojové oligosacharidy Xylo- oligosacharidy Isomaltooligosacharidy Pyrodextriny ß(2-1)-Fruktan ß(2-1)-Fruktan Oligomery galaktózy a jednotky glukózy/laktózy/galaktózy Extrakce z kořene čekanky a Agave tequilana Transfruktosylace sacharózy nebo hydrolýza inulinu čekanky Pomocí enzymu ß- galaktosidasy z laktózy Stupeň polymerizace 2-65 2-10 2-5 Směs rafinózy a stachyózy Extrakt sojových bobů 3-4 ß(1-4) - Xylóza α(1-4)-glukóza a větvená α(1-6)-glukóza Směs oligosacharidů obsahujících glukózu Enzymatická hydrolýza xylanu. Enzymatickým ošetřením nativních lignocelulózových materiálů. Hydrolytická degradace xylanu párou, vodou nebo zředěnými roztoky minerálních kyselin. Mikrobiální nebo enzymatická transgalaktosylace maltózy. Enzymatická syntéza ze sacharózy. Pyrolýza brambor nebo kukuřičného škrobu 2-4 2-8 Různé 6

V současné době se výzkum prebiotik soustřeďuje především na podporu růstu bakterií mléčného kvašení. Příklad toho, že prebiotika mají příznivý vliv na zdraví, je studie, která prokazuje schopnost celobiózy zmírnit virulenci Listeria cytomonogenes. [5] Některé studie prokazují, že prebiotka stimulují absorpci vápníku a hořčíku. Katharina E. Schulz-Ahrens a kol. (2007) ve své studii uvádí, že denní příjem 40 g inulinu pozitivně ovlivňuje sorpci vápníku u mladých mužů. U adolescentů je to 15 g/den oligofruktózy a u dívek 8 g/den kombinace oligofruktózy a inulinu. U žen po menopause, které užívaly 10 g/den laktulózy nebo 20 g/den transgalaktooligosaccharidů byla sorpce vápníku také prokazatelně vyšší, než před testováním. [11] 2.3 Synbiotika Pojem synbiotika zahrnuje kombinaci probiotik a prebiotik. Příklady synbiotik uváděných v literatuře jsou uvedeny v Tabulce 3. Tato kombinace zlepšuje přežití probiotických mikroorganismů, protože použití specifického substrátu, který je snadno dostupný pro cílový mikroorganismus, zlepšuje fermentaci a tím přináší výhody pro hostitele. [4,5] Experimenty in vitro se zaměřují především na to, zda probiotika mohou metabolizovat prebiotické složky při navození žádoucích podmínek gastrointestinálního traktu, zda prebiotické složky mohou být metabolizovány patogenními mikroorganismy a zda jsou synbiotika schopné inhibovat nebo snížit počet patogenních bakterií ve srovnání s kontrolou bez synbiotik. [6] Tabulka 3 Příklady synbiotik [6] HLAVNÍ PŘEDSTAVITELÉ SYNBIOTIK Probiotikum Prebiotikum Typ experimentu Lactobacillus casei kmen Shirota Oligomat 55 TM in vitro Bifidobacterium longum Oligofruktóza in vivo (krysy) Bifidobacterium lactis Lafti TM B94 Bifidobacterium breve kmen Yakult Lactobacillus gasseri Lactobacillus acidophilus ATCC 4962 Rezistentí škrob Galakto-oligosacharidy Inulin a nespecifické oligosacharidy Manitol, fruktooligosacharidy a inulin in vitro in vivo (myši) in vivo (lidé) in vitro 7

Lactobacillus sakei JCM Lactobacillus plantarum a L. acidophilus Frukro-oligosacharidy a trehalóza Xylo- a fruktooligosacharidy in vitro in vitro 2.4 Doplňky stravy a funkční potraviny Podle Dietary Supplement Health and Education Act (DSHEA) z roku 1994 lze termín doplněk stravy definovat pomocí několika kritérií: a) Výrobek (kromě tabáku), který je určen jako doplněk stravy nese nebo obsahuje jednu nebo více z následujících složek potravy: vitaminy, minerály, byliny nebo jiné rostliny, aminokyseliny, výživové látky, které mají za úkol zvýšit výživovou hodnotu potraviny nebo koncentráty, metabolity, extrakty nebo kombinace těchto složek. b) Výrobek určený k požití je ve formě pilulky, tobolky, tablety nebo v kapalné formě. c) Výrobek se neužívá jako konvenční potravina nebo náhrada za běžnou stravu. d) Cokoliv označené jako doplněk stravy. [12,13] Podle DSHEA je výrobce odpovědný za to, že doplněk stravy uváděný na trh je bezpečný. Dále se výrobce zavazuje, že informace na obalu potravinového doplňku jsou pravdivé a nezavádějící. Řada evropských zemí přijala přísné normy uváděné v Codexu Alimentarius pro doplňky stravy. [14,15] Pojem funkční potravina sice česká ani evropská legislativa nedefinuje, ale tento pojem je běžně používán již řadu let. Funkční potraviny jsou vzhledově podobné konvenčním potravinám. Scientific Concepts of Functional Foods in Europe definoval funkční potraviny následovně: a) Funkční potravina je svým charakterem běžnou potravinou, není to tableta, kapsle ani jiná forma doplňku stravy. b) Průkaz příznivých účinků na lidské zdraví musí být založen na vědeckém základě. c) Funkční potravina kromě své výživové hodnoty má příznivé účinky na lidské zdraví a/nebo snižuje riziko lidského onemocnění (kardiovaskulární choroby, choroby zažívacího traktu). d) Funkční potraviny se konzumují jako součást běžné stravy. [23] 8

Vyvstává otázka, zda nutriety používané jako součást léčby definovaných onemocnění mohou být považovány za léčiva, když se ty samé nutriety používají k posílení zdraví (snižují riziko onemocnění) a měly by se tedy nazývat doplňky stravy. Tento příklad ukazuje propojení mezi léky a funkčními potravinami. [16] Stále více studií prokazuje, že funkční potraviny obsahující fyziologicky aktivní látky rostlinného nebo živočišného původu mohou posílit obranyschopnost člověka. Je zřejmé, že všechny potraviny jsou funkční, protože udávají chuť, aroma, nebo nutriční hodnotu. Je třeba zdůraznit, že doplňky stravy nejsou všelék na špatné stravovací návyky. Nejsou žádné dobré nebo špatné potraviny, jen dobře nebo špatně vyvážená strava.[16] 2.5 Probiotické kmeny rodu Bifidobacterium Nejvýznamnější druhy bifidobakterií, které se řadí mezi probiotika, jsou druhy B. longum a B. animalis. Rozlišit tyto dva druhy bylo dříve poměrně obtížné. Bonaparte a Reuter (1996) prokázali, že do té doby používaná biochemická metoda není ve všech případech spolehlivá. Proto se dnes využívá více metod současně (např. biochemické metody, molekulární fenotypická nebo genotypická metoda). [22] Do probiotických druhů Bifidobakterií patří kromě B. longum a B. animalis také druhy B. adolescentis, B. bifidum, B. breve, B. infantis a B. lactis. [18] 2.5.1 Taxonomické zařazení bakterií rodu Bifidobacterium Taxonomické zařazení bakterií rodu Bifidobacterium je následující [24]: Doména Bacteria Kmen Třída Řád Čeleď Rod Actinobacteria Actinobacteria Bifidobacteriales Bifidobacteriaceae Bifidobacterium Bifidobakterie jsou fylogeneticky seskupeny do třídy Actinomycet, která je charakterizována vysokým obsahem guaninu a cytosynu (G + C), který se pohybuje v rozmezí 55 67 mol%. Pro srovnání Lactobacillus, který patří do třídy klostridií, se pohybuje obsah G + C od 34 do 37 mol%. 9

2.5.2 Charakterisktika rodu Bifidobacterium Bifidobakterie jsou anaerobní, nepohyblivé, gram-pozitivní, bakterie ve tvaru tyčinek, které neprodukují plyny. Mohou mít různé tvary jako krátké nebo zakřivené tyčinky, rozdvojené do tvaru Y apod. jak je vidět na Obrázku 1. V současné době je do rodu Bifidobacterium zařazeno 30 druhů, 10 je lidského původu (ústní dutina, GIT, vagína), 17 živočišného původu (střeva, bachor); dva byly izolovány z odpadních vod a jeden z kysaného mléka. [17, 18] Obrázek 1 Bifidobacterium longum [38] Bifidobacterie jsou sacharolytické organismy, které produkují kyselinu octovou a mléčnou bez tvorby CO 2, výjimkou je degradace glukonátu (Obrázek 2). [17, 19] 10

Obrázek 2 Metabolické dráhy zpracování glukózy bifidobakteriemi. 1- Hexokináza a Fruktóza- 6-fosfát isomeráza, 2 - Fruktóza-6-fosfát fosfoketoláza, 3 - Transaldoláza, 4 - Transketoláza, 5 - Ribóza-5-fosfát isomeráza, 6 Ribulóza-5-fosát-3-epimeráza, 7 Xylulóza-5-fosfoketoláza, 8 Acetát kináza, 9 Enzymy homofermentativního kvašení [17] Bifidobakterie lidského původu mají optimální teplotní rozsah pro růst 36 38 C, naproti tomu druhy izolované z živočichů mají teplotní optimum vyšší (41 43 C). Nejvyšší růstovou teplotu má B. thermoacidophilum. Minimální růstová teplota neklesá pod 20 C, jedinou pozoruhodnou výjimkou je B. psychroaerophilum, u kterého je prokázaný růst při 8 C. [20, 21] 11

Bifidobakterie jsou popsány jako striktně anaerobní bakterie, některé druhy ovšem mohou tolerovat kyslík (např. B. lactis, B. aerophilum, B. psychroaerophilum). Tolerance kyslíku může vést ke slabé katalázové aktivitě (která je jinak inaktivní) nebo může ovlivnit NADH oxidázu, která odstraní nebo zabrání tvorbě peroxidu vodíku. [18] 2.6 Izolace bakteriální DNA DNA se nachází v cytoplasmě bakteriálních buněk, jestliže má být DNA z buňky izolována, musí být nejdříve narušena její buněčná stěna. Izolace DNA se obvykle provádí ve třech krocích [29], a to: narušení buněčné stěny (lýze buňky) extrakce nukleových kyselin purifikace DNA. 2.6.1 Rozrušení buněčné stěny Izolace DNA z bakteriálních buněk obvykle zahrnuje jeden až všechny tři základní kroky: fyzické narušení, chemická lýze a enzymatická lýze. [30] Mezi techniky fyzikálního rozrušení buňky patří zmražení a následné roztátí, homogenizace kuličkovým mlýnkem, ultrazvukem a rozrušení kapalným dusíkem. Zmražení a následné zahřátí spolu s homogenizací kuličkovým mlýnkem patří mezi nejčastěji používané fyzikální metody disrupce buněk. [30] Metody chemické lýze buněk lze rozdělit na ty, které využívají detergenty (dodecyl sulfát sodný SDS, sarkosyl) směsi obsahující NaCl a směsi obsahující pufry (nejčastěji Tris nebo fosfát, ph 7-8). Modifikace této metody využívají lýzy za vysokých teplot (60 C), extrakční krok pomocí fenolu nebo chloroformu a použití chelatačních látek (EDTA) na potlačení nukleázové aktivity. [30] Enzymatická lýze buněk nejčastěji využívá enzym lysozym, který narušuje peptidoglykany v buněčné stěně. Lysozym se přirozeně nachází v slzách a vaječném bílku. [30] 12

Volba metody lýze buněk závisí na vlastnostech buněčné stěny, proto je důležité znát předem její složení. Například buněčná stěna Gram-pozitivních bakterií (Streptococcus pyogenes) obsahuje 40 80 % peptidoglykanu (tvrdý komplexní polymer). Struktura buněčné stěny je vidět na Obrázku 3. G+ bakterie jsou proto sensitivní na působení penicilinu (nebo jeho derivátů) a lysozymu, které hydrolyzují peptidické vazby. Naproti tomu Gram-negativní bakterie (např. Escherichia coli) mají buněčnou stěnu více vrstvenou (viz. Obrázek 3). Vnitřní část obsahuje vrstvu peptidoglykanu, vnější část obsahuje protein s lipidovou dvouvrstvou. Buněčná stěna G- bakterií obsahuje 15-20 % přerušovaně větveného peptidoglykenu. Větvení peptidoglykenu determinuje jeho tvrdost. Obecně lze říci, že G+ bakterie podléhají lýzi hůř než G- bakterie. Starší buňky lze lyzovat snadněji než mladé a větší buňky podléhají lýzi snáze než malé. [31] Obrázek 3 Složení buněčné stěny Gram-pozitivních a Gram-negativních bakterií [32] periplasmatický prostor 2.6.2 Extrakce nukleových kyselin a purifikace DNA Hrubý lyzát buněk je dále upravován pro extrakci. Použitím ribonukleázy se degraduje RNA a pomocí proteáz (např. proteináza K, pronáza E) se degradují proteiny. Běžné purifikační metody zahrnují extrakci rozpouštědlem, precipitaci (srážení), membránovou filtraci, chromatografii, afinitní purifikaci a elektroforézu. Většinou je nutné zařadit více purifikačních kroků, aby bylo docíleno požadované čistoty. Hlavní podstatou purifikace je odstranit kontaminanty, které mají podobné fyzikálně-chemické vlastnosti jako nukleové kyseliny. [31, 33] Ze získaného roztoku zbaveného proteinů lze DNA extrahovat pomocí organických sloučenin. Extrakce fenolem patří mezi nejstarší metodu. Komponenty, které neobsahují nukleové kyseliny, jsou extrahovány do organické vrstvy (fenol a chloroform), nukleové kyseliny zůstávají ve vodní fázi. Ta je přenesena do čisté zkumavky. 13

Do izolované vodné fáze se přidává isopropanol, který sráží vysokomolekulární nukleové kyseliny jako bílou hmotu. Vysrážená DNA při centrifugaci sedimentuje. Z precipitátu se zbytky solí odstraňují promytím 70 % ethanolem. DNA je poté rozpouštěna ve vhodných vodných roztocích. [31,33] 2.6.3 Izolace DNA pomocí magnetických částic Magnetické separační techniky představují jednu z nových metod používaných pro izolaci DNA. Oproti klasickým metodám je izolace magnetickými nosiči rychlá, jednoduchá a bezpečná. [34] Magnetické separační techniky využívají mikro- a nonočástice. Tyto částice mohou mít magnetické jádro s polymerním obalem, který může být dále funkcionalizován. [35]. Vnější vrstva polymeru chrání jádro před přímým kontaktem s analytem a usnadňuje funkcionalizaci částice. [36] Schematické znázornění magnetické částice je uvedeno na Obrázku 4. Obrázek 4 Schéma magnetického nosiče pro biotechnologické aplikace [35] Magnetické částice vykazují magnetické vlastnosti pouze v přítomnosti vnějšího magnetického pole, tj. jsou paramagnetické. Nevykazují reziduální magnetizmus, a pokud nejsou v bezprostřední blízkosti magnetického pole, vytvářejí homogenní suspenzi. [39] Pro magnetickou separaci DNA se osvědčily hydrofilní neporézní částice o průměru asi 1 µm. Tyto nosiče mají na svém povrchu karboxylové skupiny, pomocí nichž reverzibilně váží DNA. Reverzibilní adsorpce DNA probíhá v přítomnosti poly(etylenglykolu) (PEG 6000) a chloridu sodného. [39, 40] 14

2.7 Polymerázová řetězová reakce Objev amplifikace DNA in vitro spadá až do roku 1955, kdy držitel Nobelovy ceny Arthur Kornberg objevil enzym DNA polymerázu, která má velmi výhodné přirozené vlastnosti. Tento enzym je schopen opravovat a replikovat DNA. [25] V roce 1983 Kary Mullis (Nobelova cena za chemii) využil termostabilní DNA polymerázu a popsal polymerázovou řetězovou reakci. Tento proces zahrnuje oddělení vláken cílové nukleové kyseliny, molární nadbytek dvou oligonukleotidových primerů a jejich prodloužení za vzniku komplementárního produktu, který slouží jako templát pro syntézu nového vlákna. V současné době má tato metoda využití v mnoha oblastech, včetně potravinářství (např. diagnostika genetických onemocnění, detekce patogenních mikroorganismů, molekulární biotechnologie, atd.). [25, 27] 2.7.1 Průběh polymerázové řetězové reakce Podstata PCR spočívá ve schopnosti amplifikovat in vitro specifické sekvence DNA nebo cdna z komplexní směsi DNA. Amplifikovat specifické DNA/cDNA sekvence lze v mnoha milionech kopií. Z fragmentů DNA o velikosti 50 bp až 10 000 bp lze připravit více než milion kopií během několika hodin. Tato reakce probíhá automaticky v termocykleru v následujících krocích. Průběh reakce je vidět na Obrázku 5. [25] 1. Denaturace DNA - V tomto kroku dojde na zahřátí směsi na teplotu 94-98 C, vodíkové můstky dvou-šroubovice se rozpadnou a vlákna se od sebe oddělí. [25, 28] 2. Hybridizace (Annealing) Ochlazení na teplotu 37 65 C, dochází k hybridizaci primerů k oddělenému vláknu DNA [25, 28] 3. Elongace Enzymatická syntéza nového vlákna DNA pomocí termostabilní DNA polymerázy. Tato reakce probíhá při teplotě 72 C, která je teplotním optimem pro DNA polymerázu. [25, 28] Tento postup reprezentuje jeden cyklus. Při PCR se tento cyklus opakuje 30 40 x a výsledkem je velké množství cílové DNA/cDNA. Množství DNA roste s každým cyklem exponenciálně. [25] 15

Obrázek 5 Schematické znázornění průběhu polymerázové řetězové reakce. 1 Denaturace, 2 Hybridizace, 3 Elongace- syntéza nového vlákna DNA [46] Denaturace Hybridizace Elongace Exponenciální růst krátkých produktů 16

3 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce bylo prokázat bakterie rodu Bifidobacterium ve vybraných synbiotických doplňcích stravy pomocí metody PCR. Dalším cílem práce bylo využítí metody imunomagnetické separace pro izolaci bakterií rodu Bifidobacterium. Součástí diplomové práce bylo: Izolovat celkovou DNA z výrobků Stanovit koncentraci DNA spektrofotometricky Ověřit amplifikovatelnost DNA v doménově specifickéh PCR Provést imunomagnetickou separaci buněk z výrobku, kultivací buněk (IMS-KM) a PCR (IMS-PCR) 17

4 MATERIÁL 4.1 Analyzované potraviny - synbiotické doplňky stravy Pro experimentální část diplomové práce bylo použito 5 různých výrobků. Doplněk stravy Pangamin BIFI plus byl testován ve dvou šaržích. 4.1.1 Synbiotické doplňky stravy ve formě tablet Pro analýzu byly použity následující doplňky stravy ve formě tablet: Pangamin BIFI plus šarže 09072012, složení: probiotické bakterie rodu Bifidobacterium a Lactobacillus, pomocné látky: inulin, pupalkový olej, sušené odtučněné mléko. Počet bakterii v tabletě výrobce neuvádí Pangamin BIFI plus šarže 30092012, složení: probiotické bakterie rodu Bifidobacterium a Lactobacillus, pomocné látky: inulin, pupalkový olej, sušené odtučněné mléko. Počet bakterii v tabletě výrobce neuvádí Pangamin BIFI šarže 100114/L021, složení: probiotické bakterie rodu Bifidobacterium a Lactobacillus, pivovarské kvasnice, pomocné látky: inulin, pupalkový olej, sušené odtučněné mléko. Počet bakterii v tabletě výrobce neuvádí 4.1.2 Synbiotické doplňky stravy ve formě tobolek Pro analýzu byly použity následující doplňky stravy ve formě tobolek (kapslí): Biopron šarže 27978, složení: probiotické bakterie Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus lactis ssp. Lactis, Streptococcus thermophilus, pomocné látky: Fruktooligosacharidy, želatina, oxid titaničitý (barvivo). Počet bakterií v jedné kapsli je 4,5 10 9. Linex forte šarže BK 2735, složení: probiotické bakterie Lactobacillus acidophilus (LA-5), Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BB-12), pomocné látky: dextróza, mikrokrystalická celulóza (E460), bramborový škrob, stearan hořečnatý (E470b), inulin, oligosacharidy. Počet bakterií rodu Lactobacillus v jedné kapsli je 1 10 9 a počet bakterií rodu Bifidobacterium je 1 10 9. 18

Multilac šarže 8138107, složení: probiotické bakterie a jejich počet v jedné kapsli: Lactobacillus helveticus 9,00 10 8, Lactobacillus lactis 9,00 10 8, Bifidobacterium longum 6,75 10 8, Bifidobacterium breve 4,50 10 8, Lactobacillus rhamnosus 4,50 10 8, Streptococcus thermophilus 4,50 10 8, Bifidobacterium bifidum 2,25 10 8, Lactobacillus casei 2,25 10 8, Lactobacillus plantarum 2,25 10 8, pomocné látky: Oligofruktóza. 4.2 Bakteriální kultury Pro pozitivní kontrolu při PCR a pro stanovení citlivosti PCR byla použita bakteriální DNA (10 ng/µl) izolovaná z kmenů: Bifidobacterium animalis CCM 4988 T Bifidobacterium longum ATCC 15707 Které byly získány z České sbírky mikroorganismů (CCM Brno, Česká republika) 4.3 Chemikálie a roztoky Pro přípravu roztoků byly použity následující chemikálie: Agaróza pro elektroforézu DNA (Top-Bio, Praha, ČR) DNA standard (100 bp) (Malamité, Moravské Prusy, ČR) Destilovaná voda (FCH VUT Brno, ČR) Ethanol (Penta, Chrudim, ČR) Ethidium bromid (5 mg/ml) (EtBr) (Sigma, St. Louis, USA) Ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA) (Penta, Chrudim, ČR) Hydroxid sodný (Lachema, Brno, ČR) Chlorid sodný (Lachema, Brno, ČR) Chlorid draselný (Lachema, Brno, ČR) Chloroform (Penta, Chrudim, ČR) Isoamylalkohol (Lachema, Brno, ČR) Kyselina boritá (HBO 2 ) (Penta, Chrudim, ČR) Lysozym (Serva, Heidelberg, SRN) Nanášecí pufr (2,5 % Ficoll 400) (Top-Bio, Praha, ČR) Octan sodný (Lachema, Brno, ČR) PCR komponenty (Top-Bio, Praha, ČR) PEG 6000 (Sigma, St. Louis, USA) 19

Proteináza K (100 mg/ml) (Serva, Heidelberg, SRN) SDS (Sigma, St. Louis, USA) Tris-hydroxymethyl-aminomethan (Tris - base) (Serva, Heidelberg, SRN) Tris-hydroxymethyl-aminomethan (Tris-HCl) (Serva, Heidelberg, SRN) 4.3.1 Imunomagnetické částice pro izolaci buněk rodu Bifidobacterium Nosič pro imunomagnetickou separaci buněk (IMS) obsahoval magnetické jádro obalené perlovou celulózou. Pomocí biotin-streptavidinového komplexu byla na nosič navázána protilátka proti buňkám rodu Bifidobacterium. 4.3.2 Magnetické částice pro izolaci DNA Poly-(2-hydroxyethyl methakrylát-co-glycidyl methakrylát (P(HEMA-co- GMA)) (1:1) pokrytý karboxylovými skupinami. Průměru částic byl 2,2 µm s obsahem COOH skupin 2,67 mm/g a obsahem železa 6,5%. Byly syntetizovány ing. D. Horákem, CSc. z Makromolekulárního ústavu Akademie věd ČR, Praha. 4.3.3 Roztoky pro přípravu hrubých lyzátů buněk Pro přípravu hrubých lyzátů byly použity následující roztoky 0,5 M EDTA (ph 8,0) Za stálého míchání magnetickou míchačkou rozpustit 202,2 g EDTA v 800 ml destilované vody, ph upravit na hodnotu 8,0 pomocí NaOH v peletkách a doplnit destilovanou vodou do 1000 ml. Sterilizovat v autoklávu (121 C/15 minut). 1 M Tris-HCl (ph 7,8) 12,1 g Tris-base rozpustit v 80 ml destilované vody, ph upravit pomocí koncentrované HCl a doplnit destilovanou vodou do 100 ml. Sterilizovat v autoklávu (121 C/15 minut). Lyzační roztok A Sterilně smíchat 1 ml 1 M Tris-HCl (ph 7,8), 1 ml 0,5 M EDTA (ph 8,0) a 98 ml destilované vody. Lyzační roztok B Sterilně smíchat 1 ml 1 M Tris-HCl (ph 7,8), 1 ml 0,5 M EDTA (ph 8,0) a 98 ml destilované vody. Před použitím přidat lysozym (3 mg/ml). Roztok připravovat vždy čerstvý. 20

Roztok SDS (20 %) Rozpustit 20 g SDS v 80 ml sterilní destilované vody, v případě pomalého rozpouštění zahřát roztok na teplotu 68 C. Pomocí koncentrované HCl upravit ph na hodnotu 7,0 a doplnit destilovanou vodou do 100 ml. Bez sterilizace. Proteinázaa K (100 µg/ml) Rozpustit 100 µg proteinázy K v 1 ml destilované vody a rozplnit do alikvotů. Uchovávat při -20 C. 4.3.4 Roztoky pro imuno-magnetickou izolaci buněk Pro izolaci buněk pomocí imuno-magnetických částic byly použity následující roztoky: 10 x PBS pufr Rozpustit 80 g NaCl, 2 g KCl, 26,8 g Na 2 HPO 4 7H 2 O a 2,4 g KH 2 PO 4 v 800 ml destilované H 2 O. Před použitím se roztok naředí 10 x destilovanou vodou. MRS médium Rozpustit 5 g kvasinkového extraktu, 10 g Lab-lemco powder, 10 g peptonu, 20 g glukózy, 5 ml Tween 80, 2 g K 2 HPO 4, 5 g CH 3 CO 2 Na 3H 2 O, 2 g citrátu diamonného, 0,2 g MgSO 4 7H 2 O a 0,05 g MnSO 4 4H 2 O v 1000 ml destilované vody. Před sterilizací přidat 15 g agaru. Po vychladnutí vysterilizovaného média přidat 10 ml 5 % cysteinu. 4.3.5 Roztoky pro izolaci DNA pomocí magnetických nosičů Pro izolaci DNA pomocí magnetických nosičů byly použity následující roztoky: 0,5 M NaCl Rozpustit 58,4 g NaCl ve 150 ml destilované vody a doplnit destilovanou vodou do 200 ml. Sterilizovat v autoklávu (121 C/15 minut). 40 % PEG 6000 Rozpustit 40 g PEG 6000 v 60 ml destilované vody a doplnit destilovanou vodou do 100 ml. Uchovávat při 4 C. 70 % ethanol Smíchat 70 ml 96 % ethanolu s 26 ml destilované vody. 1 x TE pufr Smíchat 1 ml 1 M Tris-HCl (ph 7,8) a 200 µl 0,5 M EDTA (ph 8,0) a doplnit destilovanou vodou do 100 ml. 21

4.3.6 Roztoky pro agarózovou gelovou elektroforézu 5 x TBE pufr Rozpustit 54 g Tris-base a 27,5 g kyseliny borité v 600 ml destilované vody. Přidat 20 ml 0,5 M EDTA (ph 8,0) a ph upravit na 8,0 pomocí 1 N NaOH. Doplnit destilovanou vodou do 1000 ml. Před použitím se roztok naředí 10 x destilovanou vodou. Agarózový gel (1,8 %) Rozvařit 1,8 g agarózy ve 100 ml 0,5 x koncentrovaného TBE pufru. Ethidium bromid (0,5 µg/ml) 100 µl roztoku EtBr (2,5 mg/ml) rozředit v 500 ml sterilní destilované vody. 4.4 Přístroje a pomůcky Běžné laboratorní sklo a laboratorní pomůcky Centrifuga MINI Spin 13 400 min -1 (Eppendorf, Hamburg, Německo.) Digitální fotoaparát Canon Exikátor typ N 86 KN. 18 (KNF Neuberger Labport, Freiburg, SRN) Laboratorní váhy (Kern & Sohn, Německo) Magnetický separátor Invitrogen TM (Invitrogen Dyal AS, Oslo, Norsko) Mikropipety Bipette (Labnet international, Inc., USA) Mikropipety Discovery HTL (Discover HTL, Varšava, Polsko) Mikrovlnná trouba SMW 2320 (Sencor, ČR) Minicycler PTC-150 (MJ Research, Inc., Watertown, USA) NanoPhotometr TM (Implen, Německo) Termocycler PTC-200 (BIO-RAD, Lab., USA) Termostat- Mini incubator (Labnet international, Inc., USA) Transluminátor TVR 3121 (Spectroline, Paramount, USA) Zařízení pro elektroforézu Easy-cast, model B1 (Owl Scientific, USA) Zdroj elektrického napětí Enduro Power supplies, model E0303 (Labnet international, Inc., USA) 22

5 METODY Jednotlivé postupy jsou provedeny podle návodu k laboratorním cvičením Analýza vybraných druhů bakterií mléčného kvašení pomocí metod molekulární biologie [41]. 5.1 Příprava vzorků pro imuno-magnetickou izolaci buněk Obsah tobolek výrobku Biopron a Linex forte byly rozpuštěny v 1,5 ml PBS pufru. Obsah tobolek byl rozpouštěn asi 30 minut. Desítkovým ředěním byly připraveny roztoky 10-4, 10-5 a 10-6, tyto ředění byly vysety na MRS médium a byly 3dny aerobně i anaerobně kultivovány při 37 C. Narostlé kolonie byly spočítány a porovnány s údaji od výrobce. Dále byly 3 kolonie každého druhu odebrány a identifikovány pomocí PCR specifické pro doménu Bacteria a PCR specifické pro rod Bifidobacterium. 5.2 Imuno-magnetická izolace buněk Ze zkumavky s rozpuštěnými tobolkami výrobků (viz. 5.1) bylo odebráno po 100 µl roztoku do čisté mikrozkumavky. Dále bylo do mikrozkumavky přidáno 100 µl imuno-magnetických částic s navázanou protilátkou pro rod Bifidobacterium a směs byla ponechána inkubovat při laboratorní teplotě po dobu 1 hodiny. Poté byla směs vystavena magnetickému poli (15 minut), supernatant byl odpipetován a částice byly 4 x promyty PBS pufrem (1000 µl). Na MRS médium bylo vyseto 10 µl směsi částic s navázanými buňkami resuspendované v PBS pufru (50 µl) a proběhla anaerobní kultivace při 37 C 3dny. Suspenze imunomagnetických částic s izolovanými buňkami byly povařeny na termocykleru (program BOIL 99 C/30 min). Poté byla provedena PCR specifická pro doménu Bacteria a PCR specifická pro rod Bifidobacterium (viz. 5.7.3 a 5.7.4) 5.3 Kontrola imuno-magnetické separace pomocí PCR Z Petriho misek po kultivaci imuno-magnetických částic s navázanými buňkami byla odebrána kolonie pomocí sterilní kličky a ta byla resuspendována v 20 µl PBS pufru. Vzorky byly povařeny v termocykleru při 99 C po dobu 30 minut (program BOIL) a prudce zchlazeny ve směsi ledu a vody, aby buňky praskly a DNA byla přístupná. Z takto upravených vzorků DNA byla provedena nejprve PCR specifická pro doménu Bacteria a poté PCR specifická pro rod Bifidobacterium (postup viz. kapitola 5.7.3 a 5.7.4). 5.4 Příprava hrubých lyzátů buněk z doplňků stravy 5.4.1 Lýze buněk z tablet synbiotických doplňků stravy Tablety doplňků stravy značky Pangamin BIFI plus a Pangamin BIFI byly sterilně 23

odebrány z obalu a zváženy na analytických vahách. Pro analýzu bylo použito vždy 10 tablet. Hmotnosti tablet jsou uvedeny v Příloze 1. Tablety byly rozpuštěny v 2,25 ml lyzačního roztoku B do druhého dne. K suspenzi bylo druhý den přidáno 50 µl 20 % SDS a 5 µl proteinázy K (100 µg/ml). Suspenze byla důkladně promíchána a byla inkubována při 55 C jednu hodinu. Následně byla provedena izolace DNA pomocí magnetických částic. Hrubé lyzáty buněk byly uchovávány při -20 C, aby se předešlo možné degradaci DNA. 5.4.2 Lýze buněk z tobolek synbiotických doplňků stravy Tobolky doplňků stravy značky Biopron, Linex forte a Multilac byly sterilně odebrány z obalu, zváženy a vysypány do zkumavek. Následně byl zvážen samostatně obal a hodnoty byly odečteny. Hmotnosti obsahu tobolek jsou uvedeny v Příloze 2. Tobolky značky Biopron a Linex forte byly rozpuštěny v 1,5 ml lyzačního roztoku B, tobolky značky Multilac byly rozpuštěny v 2,5 ml lyzačního roztoku B. K suspenzi bylo druhý den přidáno 75 µl 10 % SDS a 3 µl proteinázy K (100 µg/ml) u výrobku Biopron a Linex forte, 125 µl 10 % SDS a 5 µl proteinázy K (100 µg/ml) u výrobku Multilac. Suspenze byla důkladně promíchána a byla inkubována při 55 C jednu hodinu. Následně byla provedena izolace DNA pomocí magnetických částic. Hrubé lyzáty buněk byly uchovávány při -20 C, aby se předešlo možné degradaci DNA. 24

5.5 Izolace DNA pomocí magnetických nosičů Z hrubých lyzátů buněk byla izolována DNA pomocí magnetických částic (P (HEMA co - GMA)). Postup byl totožný u tablet i u tobolek. Nejprve byla připravena separační směs smícháním komponent uvedených v Tabulce 4 v přesně daném pořadí. Tabulka 4 Komponenty pro přípravu směsi na izolaci DNA pomocí magnetických částic Pořadí Komponenta Objem [µl] 1 NaCl (5 M) 400 2 Matrice DNA 350 3 PEG 6000 (40 %) 200 4 Magnetické částice (2 mg/ml) 50 Výsledný objem 1000 Směs byla inkubována při laboratorní teplotě po dobu 15 minut. Poté byly částice s navázanou DNA separovány pomocí magnetu 15 minut při laboratorní teplotě. Supernatant byl opatrně odpipetován a částice byly promyty 500 µl 70 % ethanolu a poté 200 µl 70 % ethanolu. Částice byly separovány magnetem 2 minuty při laboratorní teplotě. Ethanol byl opatrně odpipetován a částice byly sušeny v termostatu při 55 C do úplného odpaření ethanolu. Poté byla DNA adsorbovaná na magnetických částicích rozpuštěna ve 100 µl TE pufru, DNA byla eluována 1 hodinu při laboratorní teplotě. Magnetické částice byly odseparovány pomocí magnetu a eluovaná DNA byla přenesena do čisté mikrozkumavky. Takto připravená DNA byla použita pro PCR. 5.6 Spektrofotometrické stanovení koncentrace DNA Stanovení koncentrace DNA vychází z Lambert-Beerova zákona: A = ɛ c l kde ɛ je extinkční koeficient, c je koncentrace DNA a l je délka optické dráhy. Tato koncentrace je přibližná a závisí na poměru nukleotidových bází AT a GC. Nukleové kyseliny mají absorpční maximum při 260 nm a minimum při 230 nm. Koncentrace DNA byla měřena spektrofotometricky pomocí přístroje Nanophotometr a speciálních kyvet Laber Gard. 25

Vzorky DNA byly vytemperovány na laboratorní teplotu a důkladně promíchány. Jako referenční vzorek byl použit TE pufr. Měřila se absorbance v rozmezí vlnových délek 220-320 nm. Odečtené byly hodnoty absorbancí při 230 (minimum), 260, 280 a 320 nm. Koncentrace DNA byla stanovena z hodnoty absorbance A 260nm. Do spektrofotometru byla ve směru procházející světla vložena speciální kyveta Laber Guard TM. Z již předvolených metod byla pro analýzu nukleových kyselin vybrána následující: Label Guard Applications Nucleic Acid ds DNA/ss DNA Pro měření bylo použito víčko lid 10, protože předpokládaná koncentrace byla v rozmezí 14-700 ng/µl. Pro víčko lid 10 platí následující parametry: optická dráha 1 nm objem vzorku 3 5 µl Měřitelný rozsah DNA 14-700 ng/µl Na kyvetu byl pipetován objem 3 µl vzorku DNA (TE pufr jako slepý vzorek). Všechny vzorky byly proměřeny a výsledky odečteny z displeje a zaznamenány. Víčko i kyveta byly po každém měření důkladně očištěny ethanolem. 5.7 Amplifikace DNA pomocí polymerázové řetězové reakce 5.7.1 Komponenty pro směs PCR Komponenty pro PCR byly uchovávány při -20 C. Před každou analýzou byly komponenty rozmraženy a krátce stočeny na centrifuze. Komponenty pro PCR byly následující: Voda pro PCR (Voda pro injekce ČSL 4, Biotika, Slovenská L upča, SR) Reakční pufr kompletní pro Taq DNA polymerázu 1.1 (10 x koncentrovaný); složení: 750 mm Tris HCl (ph 8,8), 200 mm (NH4)2SO4, 0,1 % TWEEN 20, 25 mm MgCl2 (Top-Bio, Praha, ČR) dntp směs (10 Mm ) ( Top - Bio, Praha, ČR) Oligonukleotidové primery (syntetizované Generi Biotech, Hradec Králové, ČR) Taq DNA polymeráza 1.1 (1 U / µl ) ( Top - Bio, Praha, ČR) DNA matrice Každá komponenta byla nejprve řádně promíchána, poté byl odebrán požadovaný objem a přidána do mikrozkumavky, kde byl objem znovu promíchán. Komponenty byly smíchány v přesně daném pořadí viz. výše. 26

5.4.1.1. Primery pro PCR Pro specifické PCR metody byly použity specifické PCR primery (viz. Tabulka 5-7). Tabulka 5 Primery pro PCR specifickou pro doménu Bacteria Primer Sekvence primeru (5-3 ) R_eub TCC TAC GGG AGG CAG CAG T F_eub GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC CTG TT Velikost PCR produktu Zdroj 470 bp [43] Tabulka 6 Primery pro PCR specifickou pro rod Bifidobacterium Primer Sekvence primeru (5-3 ) Pbi F1 CCG GAA TAG CTC C Pbi R2 GAC CAT GCA CCA CCT GTG AA Velikost PCR produktu Zdroj 914 [42] Tabulka 7 Primery pro PCR specifickou pro druh Bifidobacterium animalis Primer Sekvence primeru (5-3 ) Pbi R1 GCA CCA CCT GTG AAC CG Ban F2 AAC CTG CCC TGT G Velikost PCR produktu Zdroj 925 [42] 27

5.7.2 Složení PCR směsí pro stanovení citlivosti metody PCR PCR směsi pro stanovení citlivosti PCR byly připraveny podle Tabulky 8 a 9. Jako DNA matrice byla použita DNA ředěná na různé koncentrace (od 10 ng/µl po 100 fg/µl). Citlivost PCR byla sledována u rodově specifické PCR pro rod Bidobacterium a u druhově specifické PCR pro druh Bifidobacterium animalis. Použité primery jsou uvedeny v Tabulce 6 a 7. Tabulka 8 Složení směsi pro PCR při stanovení citlivosti rodově specifické PCR Komponenta Objem [µl] Voda pro PCR 18 10 x reakční pufr kompletní 2,5 dntp směs (10 mm) 0,5 Primer Pbi F1 (10 pmol/µl) 0,5 Primer Pbi R2 (10 pmol/µl) 0,5 Taq polymeráza (1 U/µl) 1 DNA matrice 2 Celkem 25 Tabulka 9 Složení PCR směsi pro stanovení druhově specifické PCR Komponenta Objem [µl] Voda pro PCR 14 10 x reakční pufr kompletní 2,5 dntp směs (10 mm) 0,5 Primer Pbi R1 (10 pmol/µl) 0,5 Primer Ban F2 (10 pmol/ µl) 0,5 Taq polymeráza (1 U/ µl) 2 DNA matrice 5 Celkem 25 28