ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra přírodovědných oborů TÝMOVÝ PROJEKT. 2011/2012 Monika Burdová

ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra přírodovědných oborů TÝMOVÝ PROJEKT 2011/2012 Monika Burdová

ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra přírodovědných oborů Použití metod světelné mikroskopie k detekci mikrobiálních kontaminací Týmový projekt Vedoucí projektu: Mgr. Veronika Vymětalová Student: Monika Burdová Rok: 2011/2012

Anotace Předmětem týmového projektu Použití metod světelné mikroskopie k detekci mikroorganizmů, konkrétně mé části Použití metod světelné mikroskopie k detekci mikrobiálních kontaminací je seznámit se s mikroorganismy, speciálně kvasinkami, popsat kvasné procesy, kterých se tyto organismy zúčastňují, zjistit uplatnění těchto procesů v potravinářském průmyslu a v neposlední řadě také popsat kontaminanty těchto procesů. V druhé části projektu jsem se zabývala vlastním experimentem, který spočíval v pozorování kvasinek pomocí světelné mikroskopie v roztoku destilované vody a v roztoku sacharózy. Annotation The goal of team thesis: Using of methods of light microscopy to detection of microorganisms, specifically my part Using of methods of light microscopy to detection of microbial contamination is to learn about microorganisms, especially with yeast, to describe the fermentation process, which these organisms take part in, to find their application in food industry and last but not least to describe contaminants of these process. In the second part of my work I dealt with experiment own, which concerned with observation of yeast in the solution of distilled water and solution of sucrose using the light microscopy.

Poděkování Ráda bych tímto poděkovala vedoucí týmového projektu Mgr. Veronice Vymětalové, za její pomoc při vypracovávání našeho projektu, především v experimentální části a dále svému otci Mgr. Pavlu Burdovi za veškeré korekturní práce. ii

Prohlášení Prohlašuji, že jsem týmový projekt s názvem..vypracoval(a) samostatně a použil(a) k tomu úplný výčet citací použitých pramenů, které uvádím v seznamu přiloženém k závěrečné zprávě. Nemám závažný důvod proti užití tohoto školního díla ve smyslu 60 Zákona č. 121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon). V. dne. podpis iii

OBSAH ÚVOD... 1 1 KVASINKY... 2 1.1 Zařazení do systému a základní charakteristika... 2 1.2 Historie pozorování kvasinek... 2 1.3 Morfologie... 2 1.4 Cytologie... 3 1.5 Kultury kvasinek... 5 1.6 Rozmnožování... 6 1.6.1 Vegetativní... 6 1.6.2 Pohlavní... 7 1.7 Taxonomie kvasinek a jejich zástupci... 7 1.7.1 Askosporogenní... 8 1.7.2 Bazidiodporogenní... 16 1.7.3 Rody, u nichž není známa tvorba pohlavních spor... 18 1.8 Průmyslové využití kvasinek... 23 1.8.1 Etanolové kvašení... 23 1.8.2 Výroba piva... 24 1.8.3 Pivovarské kvasinky... 25 1.8.4 Kontaminace piva... 26 1.8.5 Výroba vína... 26 1.8.6 Kontaminace vína... 27 1.8.7 Pekařské droždí... 28 1.8.8 Kontaminace droždí... 29 1.9 Patogenní kvasinky... 29 2 MIKROSKOPOVÁNÍ... 31 2.1 Základní světelná mikroskopie... 31 2.2 Fázový kontrast... 31 2.2.1 Princip... 32 3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... 34 3.1 Pozorování zástupců kvasinek v běžně dostupném zdroji... 34 ZÁVĚR... 37 Seznam použité literatury... 38 Seznam zdrojů obrázků... 40 iv

ÚVOD Kvasinky doprovázejí člověka již dlouhá staletí, možná tisíciletí, avšak jejich objev není tak starý. Tyto organismy nám pomáhají, ale i škodí. Setkáváme se s nimi prakticky v každodenním životě. Ať je to již při pití piva či vína nebo při konzumaci chleba, tak jsou obsaženy také v našem organismu. Jsou to jedny z nevíce používaných mikroorganismů na světe a díky nim jsme schopni vyrobit alkohol prakticky z jakéhokoli ovoce, může péct nadýchané pečivo, jsou to ale také organismy vhodné ke zkoumání na poli genetiky. Na druhou stranu mohou způsobit celou škálu onemocnění a chorob jak lidí a živočichů, tak rostlin. Pro všechny tyto vlastnosti a schopnosti je zajímavé a potřebné zkoumat a pozorovat je, stejně tak jako organismy a látky, které kvasným procesům škodí. Cílem této práce tedy je seznámit se s kvasinkami a jejich vlastnostmi, rozdělit je na základě těchto vlastností, obeznámit se také s kvasným procesem a jeho využitím v průmyslu, zjistit nejčastější kontaminanty kvašení, určit nejvhodnější techniku světelné mikroskopie pro pozorování těchto mikroorganismů a v experimentální části si ověřit vědomosti v praxi a zjistit možné způsoby detekce kontaminantů pomocí výše zmíněné světelné mikroskopie. 1

1 KVASINKY Zařazení do systému a základní charakteristika Kvasinky patří mezi eukaryotní organismy, konkrétně mezi houby, oddělení vřeckovýtrusých a třídu hemiaskomycety, pravé vřeckovýtrusné či archiaskomycety, avšak jsou výjimky patřící do oddělení stopkovýtrusných. [1][2] Vzhledem k těmto rozdílným zařazením netvoří kvasinky taxonomickou skupinu a je obtížné je přesně definovat vzhledem k jejich rozdílnosti. Některé druhy žijí jako saprofyté, jiní jako parazité. Rozmnožují se převážně pučením, ale vyskytují se i výjimky, u kterých je možné přehrádečné dělení. U některých druhů bylo prokázáno pohlaví, u některých však stále je neurčeno. Kvasinky jsou organismy tvořící jak pravé mycelium (podhoubí), tak pseudomycelium (soubor nepravých hyf). [3] 1.1 Historie pozorování kvasinek Název kvasinek se vztahuje ke kvasným procesům, které mají velice dlouhou historii. Již ve starém Babylonu v dobách před naším letopočtem se vyráběl ze zkvašeného odvaru z naklíčeného obilí nápoj, který byl podobný dnešnímu pivu, jsou také známy doklady o pití vína a piva ve starém Egyptě. V takovéto formě lidé znali kvašení už od pradávna, avšak s kvasinkami, jako průvodci těchto dějů se seznámili až dlouho poté. [3] V sedmnáctém století pozoroval pravděpodobně jako první Angličan Antonie van Leeuwenhoek malé kuličky v pivě pomocí primitivního mikroskopu, avšak tehdy se kvasinky považovaly za jakýsi vedlejší produkt při čiření tekutiny. Následoval objev v roce 1837, kdy Theodore Swann popsal v kvasícím víně rozmnožující se kvasinky a označil je názvem cukerná houba. Rozhodujícím momentem pro přijmutí faktu o podílení se kvasinek na procesu kvašení byla studie Luise Pasteura z roku 1873, ve které dokládal účast mikroorganismů na kvasném procesu a také negativní vliv kyslíku na tento průběh. [3] 1.2 Morfologie Většina kvasinek se rozmnožuje pučením či dělením a s tím souvisí také tvar jejich buněk. Nejčastěji je vejčitý, kulovitý nebo elipsoidní, ale je také možné, aby buňky byly dlouze protáhlé, válcovité, trojúhelníkovité či citronkovité. Tvar závisí také na stáří buněk či kultivačním prostředí, takže většinou nebývá stálý, ale naopak kolísá. Velikost buněk je mezi 3 6 μm na šířku a 3 15 μm na délku. [4] 2

chitin. [4] Na povrchu buněčné stěny jsou jizvy po pučení a jejich počet se pohybuje mezi 9 43 U některých druhů dochází k pučení pouze na pólech a poté zůstávají buňky spojeny ve dlouhá zaškrcovaná vlákna, tzv. pseudomycelia, které obsahují místa se svazky kratších elipsoidních buněk blastospory. Jiné odrůdy se dělí příčně, čímž vzniká pravé mycelium, také s blastospory. Tvorba pseudomycelia či mycelia se vyskytuje většinou u rodů se zvýšeným aerobním metabolismem. [4] Pro některé rody je typické pučení na široké základně, což je přechod mezi pučením a dělením. Některé kvasinky mají tenké stopky (sterigmata), na kterých se tvoří exospory (balistospory), které jsou odmršťovány kapalinovým mechanismem. [4] Obr. č. 1: Růst kvasinek a) ve svazcích buněk, b) v pseudomyceliu, c) v pravém mycelium [1] 1.3 Cytologie Na okraji buněk kvasinek je buněčná stěna polysacharidové povahy (z 80%) doplněná bílkovinami (6 10%), lipidy a fosfolipidy (3-10%) a fosforečnany, vázanými esterovými vazbami na polysacharidy. Tyto fosfátové zbytky spolu s COOH skupinami bílkovin způsobují negativní náboj, který ovlivňuje adsorpci látek z živného prostředí. Stěna se skládá hlavně z glukanů, u některých druhů jsou zde přítomny ještě mannany či glukosamin a (nejčastěji 15 24). Jizvy po obarvení primulinem (látka podobná glykosidům) silně fluoreskují, je tedy možné je pozorovat pomocí fluorescenčního mikroskopování. Na jednom z pólů buňky je jizva po dřívějším spojení buňky s mateřskou. Nazývá se jizva zrodu a u některých rodů, kde buňky nepučí nikdy vícekrát na jednom místě, je možné pomocí těchto jizev určit stáří buňky či růstovou fázi. [4] 3

Některé druhy mají na povrchu stěn buněk polysacharidové obaly ve formě pouzder. Stěna kvasinek je rozkládatelná při působení enzymů trávicího traktu hlemýždě Helix pomatia či enzymů některých bakterií. [4] U mladých buněk je cytoplazma průhledná, homogenní hmota, oproti tomu u starších se objevují zrníčka a vakuolizace. Cytoplazma obsahuje systém dvojitých membrán, endoplazmatické retikulum, které mají póry a na povrchu jsou zrníčka polyzomů, agregátů ribozomů, v nichž se vyrábějí bílkoviny. Endoplazmatické retikulum obsahuje také různé enzymy a rezervní látky. [4] Mezi další organely kvasinkových buněk patří mitochondrie, strukturované útvary různorodého tvaru. Jsou dlouhé až 3 μm a široké 0,3 až 1 μm. Každá mitochondrie má dvě membrány, vnější má bradavičnatý povrch a vnitřní tvoří vchlípeniny směrem dovnitř (kristy). Tyto organely jsou složeny především z bílkovin, lipidů a fosfolipidů. Obsahují také RNA (kyselina ribonukleová) a DNA (kyselina deoxyribonukleová). Jsou zde také dýchací enzymy a systém oxidační fosforylace, syntetizují se tu také některé bílkoviny. [4] Vakuola je jednomembránová organela, která se vyskytuje často u mladých buněk ve větším počtu, oproti tomu starší klidové buňky obsahují většinou pouze jednu velkou, která vyplňuje i téměř celý obsah buňky. Vakuola má při pozorování, kvůli roztoku propouštějící světlo, stejnou barvu jako zorné pole. Uvnitř vakuol se nacházejí hydrolytické enzymy (proteinázy, ribonukleáza, esteráza), polyfosfáty a draselné ionty, aminokyseliny a puriny. [4] Další membránový útvar je Golgiho aparát, který má tvar plochého měchýřku či několika těchto měchýřků nebo rovnoběžně uložených cisteren. Jeho pravděpodobnou funkcí je transport prekurzorů (stavební kameny) buněčné stěny z cytoplazmy přes cytoplazmatickou membránu. [4] Uvnitř kvasinkových buněk je také cytoskelet, což je vlastně síť proteinových vláken umožňující pohyb organel. Významné jsou zde mikrotubuly, vycházející z určitého centra, jež jsou nepříliš ohebné trubice z bílkoviny tubulinu a jejichž volné konce se podle potřeby mohou rozkládat a obnovovat. Molekula tubulinu obsahuje guanosintrifosfát, což je látka sloužící jako zdroj energie pro zapojení mikrotubulu. [4] V buňce kvasinek se nacházejí také zřetelná zrníčka rezervních látek, hlavně volutinu a glykogenu, u některých to může být tuk, který může tvořit až 60% sušiny buňky. [4] Jádro má dvojitou membránu, obsahující veliké póry. Leží přibližně ve středu buňky, a pokud ho chceme pozorovat, je nutné speciální barvení. Vzhledem k velmi obtížnému rozlišení chromozomů jsou jejich počty odvozeny z genetických studií. Jádro obsahuje také jadérko, které má srpkovitý tvar, leží těsně pod jadernou membránou a je možné ho také 4

barvit některými barvivy. Můžeme také pozorovat pólové tělísko vřeténka, jež má diskovitý tvar a vycházejí z něj mikrotubuly, jež hrají důležitou roli při dělení jádra v průběhu množení buněk. [4] Obr. č. 2: Schéma buňky kvasinek: 1 buněčná stěna, 2 jizva zrodu, 3 cytoplazmatická membrána, 4 jádro, 5 jaderná membrána, 6 vakuola, 7 endoplazmatické retikulum, 8 mitochondrie, 9 glykogen, 10 volutin, 11 lipidy, 12 Golgiho aparát [1] 1.4 Kultury kvasinek Pokud jsou kvasinky v kapalném prostředí, začínají se shlukovat a usazovat na dně ve formě sedimentu, což se projevuje jako zákal. Pokud potřebují větší množství kyslíku, po využití všech sacharidů vytvoří na povrchu kultivační tekutiny slizký povlak neboli mázdru. U některých druhů se vytvoří na povrchu média křís, což je křehká blanka. [3] Při použití pevného média vytvoří kvasinky kolonie. Ty jsou buď jednobuněčné či z jedné spory (unicelulární, monosporické) nebo z několika buněk. Abychom mohli posoudit velikost kolonie, sledujeme její povrch, který je buď hladký s vyvýšeným středem či prohlubní uprostřed, nebo drsný různého tvaru. Některé kolonie mohou být také slizovité, což svědčí o výskytu polysacharidových pouzder kolem buněk. [3] Některé rody či druhy lze určit podle tvaru, velikosti, vzhledu či rychlosti růstu kolonie. Tyto vlastnosti závisí na podmínkách kultivace, velikosti a tvaru samotných buněk či také na vzniku mutací, což zapříčiňuje různé rozdílnosti mezi koloniemi. [3] 5

1.5 Rozmnožování Kvasinky mají dva základní druhy rozmnožování. Vegetativní, což je pučení či přehrádečné dělení, a potom pohlavní, kde je to izogamní či heterogamní způsob. U každého druhu či rodu je životní cyklus či způsob rozmnožování rozdílný a závisí také na spoustě okolních faktorů. [3] 1.6.1 Vegetativní Největší část zástupců kvasinek se rozmnožuje pomocí pučení, při kterém se vytvoří na buňce postupně se zvětšující pupen až do stejné velikosti jako je buňka samotná. Během tohoto procesu se fragmentují vakuoly, v místě tvorby pupene se hromadí sekreční měchýřky, prodlužují se mitochondrie a jádro se přesune na hranici mezi mateřskou buňkou a pupenem. Poté se rozdělí a spolu s částí cytoplazmy a dalších organel přejde do pupenu, spojení mezi ním a mateřskou buňkou se postupně uzavře a nová buňka se definitivně oddělí. Na základě místa tvorby pupene, můžeme pučení rozdělit na monopolární, bipolární či multipolární. Je ale možné, že buňky zůstanou spojeny po vypučení na pólech ve vlákna, čímž vzniká pseudomycelium či pravé mycelium s příčnými přepážkami mezi jednotlivými buňkami. Toto se děj většinou u kvasinek s aerobním metabolismem. [3] Obr. č. 3: Průběh pučeni kvasinek: 1 jádro, 2 mitochondrie, 3 vakuola, 4 endoplazmatické retikulum, 5 pólové tělísko vřeténka, 6 mikrotubuly, 7 vřeténko [1] 6

Přehrádečné dělení je charakteristické například pro rod Schizosacchatomyces a je možné bez vzniku mycelia i s ním. [3] Na přechodu mezi přehrádečným dělením a pučením je rozmnožování se pomocí pučení na široké základně, kde mateřská buňka a dceřiná jsou spojeny širokým krčkem, který se postupně uzavírá přepážkou. [3] 1.6.2 Pohlavní Po několikerém buněčném dělení dojde u většiny druhů kvasinek ke spájení dvou haploidních buněk a také jejich jader, čímž vznikne diploidní buňka (zygota). Její jádro se může meioticky rozdělit a tím vzniknou 4 haploidní jádra, kolem kterých jsou ve vřecku umístěné spory. Pokud jsou původní buňky přibližně stejně veliké, nazývá se toto spájení izogamní, pokud je jejich velikost rozdílná, jde o spájení heterogamní. K druhému případu dochází pouze u homothalických kmenů kvasinek, což jsou kmeny s pohlavně nediferencovanými buňkami. Druhým případem jsou kmeny heterothalické, kde se vyskytují opačné párovací (kopulační) typy, které se spájejí díky zastavení buněčného cyklu a změnění složení stěn a tvaru jedné z buněk pomocí látek peptidového charakteru vylučovaných druhou buňkou. [3] 1.6 Taxonomie kvasinek a jejich zástupci Tříděním kvasinek (taxonomií) se u nás zabývá například Anna Kocková- Kratochvílová, která založila také jejich sbírku, další významná sbírka je v Delftu v Holandsku. V dnešní době je asi nejrozsáhlejší českou sbírkou Česká sbírka mikroorganismů (CCM) při Ústavu experimentální biologie PřF Masarykovy univerzity. [3][5] Každý zdroj a autor však rozdělují kvasinky jinak, což je to způsobeno nejednotností této skupiny. Nejvhodnější je třídit je podle způsobu rozmnožování. První skupinou jsou askosporogenní (telemorfní), které se vyznačují tvorbou vřecek s askosporami a jsou zařazené mezi Ascomycotina do třídy Hemiascomycetes a řádu Endomycetales. Tyto kvasinky se dělí přehrádkami a mají pravé mycelium či jsou jednobuněčné a pučí. Další skupinou jsou bazidiosporogenní (sporobocomycetaceae) z řádu Basidiomycetales, tvořící bazidiospory či sporidie. Poslední skupinou jsou imperfektní kvasinky (anamorfní), u kterých není známa tvorba pohlavních spor, jsou tedy považovány za asporogenní. Jsou zařazeny mezi Deuteromycotina a v dřívějších dobách byly označovány jako nepravé kvasinky či [3] [4] [7] kvasinkové mikroorganizmy. 7

1.7.1 Askosporogenní Vegetativní rozmnožování multilaterálním pučením: - r. Saccharomyces Tento rod je pravděpodobně nejdůležitějším a nejznámějším z kvasinek. Druhy patřící k Saccharomyces zkvašují většinou několik cukrů, avšak nevyužívají laktózu jako zdroj uhlíku ani NO3- jako zdroj dusíku. Jejich buňky jsou většinou elipsoidní, vejčité či protáhlé. Spájení u nich je izogamní a jejich askospory mají kulatý až elipsoidní tvar a vyskytují se v asku po 1 až 4. [4] S. cerevisiae je průmyslově a technologicky nejdůležitější kvasinka. Její buňky jsou kulovité až oválné, jejich velikost je 6 7 x 7,5 8,7 μm. Tyto kvasinky zkvašují glukózu, galaktózu, sacharózu, maltózu a rafinózu. Do tohoto rodu patří i vinařské kmeny, dříve označovány jako samostatná varieta S. cerevisiae var. Elipsoideus, jinak je to spíše pivní, vinná, lihovarnická a pekařská kvasinka. Pro jednotlivá odvětví se využívají speciální kmeny, které vyhovují příslušným podmínkám a mají požadované vlastnosti. Tato kvasinka je také modelovým organismem pro biochemické a genetické práce. [4] Kmeny pro výrobu droždí a pivovarské kmeny musejí mít stálý tvar, velikost buněk a stálé vlastnosti. Byly tedy vyselektovány polyploidní nebo aneuploidní buňky, které mají v důsledku nadbytečných chromozomů přerušený průběh meiózy. [4] Pekařské droždí se připravuje aerobní fermentací okyselených melasových zápar, které jsou přiživené amonnými solemi a fosfátem. Zápary se dále provzdušňují stlačením sterilním vzduchem, který je přiváděn ke dnu tanku, kde probíhá kvasný proces. Díky neustálému přívodu melasové zápary je dosaženo aerobního metabolismu a buňky se díky tomu rozmnožují za nízké koncentrace cukrů v prostředí a i při tomto procesu se produkuje určité množství etanolu. [4] Saccharomyces cerevisiae subsp. cerevisiae jsou především pivovarské kvasinky, které jsou velmi podobné pekařským. U svrchního typu kvašení probíhá tento proces při teplotě nad 15 C. Tyto kvasinky nemají enzym melibiozu, odštěpují fruktózu pomocí invertázy a disacharid melibiosu, který vzniká při tomto procesu, neumějí rozložit. Těchto kvasinek se využívá při výrobě piva anglického typu. [4] Kmen Saccharomyces cerevisiae subsp. uvarum je označován jako spodní pivovarská kvasinka, dříve jako S. Carlsbergensis. U tohoto kvašení je třeba nižší teplota (6 10 C) a také delší čas. Při pomnožování je třeba provádět provzdušňování a při kvašení a dokvašování je naopak potřeba vytvořit anaerobní podmínky. Po procesu prokvášení klesají kvasinky na 8

dno kvasících nádob. Takto vyrobená piva mají delší trvanlivost a patří mezi ně například česká. [4] S. exiguus: Tento druh fermentuje glukózu, sacharózu, galaktózu. Vyskytuje se především na ovocných výrobcích, ovoci samotném, v limonádách, fermentovaných nápojích atd. [4] Obr. č. 4: Saccharomyces cerevisiae - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm [2] Obr. č. 5: Saccharomyces cerevisiae - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25 C (tzv. obrovská kolonie)[2] - r. Zygosaccharomyces Kvasinky tohoto rodu jsou osmotolerantní a snesou i 50% glukózy v prostředí, ve kterém se nacházejí. Jejich buňky jsou schopné tvořit pseudomycelium. Je to rod, který se odštěpil od Saccharomyces. Kvasinky Zygosaccharomyces jsou častou příčinou kažení čokolád, medu a dalších cukrovinek. [4] Z. bailii se vyskytuje na některých potravinách s obsahem cukru nad 60%. Dobře snáší vysoké teploty, nízké ph či vysokou koncentraci etanolu a oxidu siřičitého. Způsobuje kontaminace vína tvorba křísu. Z. rouxii způsobuje kažení čokoládových bonbonů, Z. bisporus je schopná zkvašovat glukózu a také způsobuje kvašení medu či sirupu, kde při tomto procesu vzniká pěna. [3][4] 9

- r. Kluyveromyces Tento rod byl oddělen od Saccharomyces z důvodu nepřítomnosti hexosové represe dýchání a vegetativní fázi, která je v převážné míře haploidní. Jedním z druhů je K. marxianus, který se vyskytuje ve dvou variantách - var. Marxianus (K. marxianus, K. fragilis) a var. Lactis (K. lactis). K. lactis je obsažena v kefírových zrnech, spolu s některými bakteriemi, z kterých se vyrábí kefír a zkvašuje laktózu. K. marxianus var. Lactis se používá také k výrobě krmných kvasnic. [3][4] Obr. č. 6: Klyveromyces lactis - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm [2] Obr. č. 7: Klyveromyces lactis - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25 C (tzv. obrovská kolonie)[2] - r. Pichia Tento rod se vyznačuje nízkou kvasnou schopností a vytvářením křísu na tekutých substrátech. Z cukrů vznikají organické kyseliny, které reagují s alkoholy na estery, jež způsobují pachuť či zápach kontaminovaného produktu. Na základě těchto vlastností jsou nežádoucím kontaminantem piva, ovocných šťáv, vína či kysaného zelí. [3][4][7] 10

Obr. č. 8: Pichia anomala - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm. [2] Obr. č. 9: Pichia anomala - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25 C (tzv. obrovská kolonie). [2] - r. Hansenula Rod Hansenula se odlišuje od rodu Pichia především schopností využívat dusičnany. Tento rod je také schopen zkvašovat cukry, tvoří kyseliny a estery, způsobují křís ve víně. Jsou velice rozšířené v přírodě a kontaminuji ostatní kvasné procesy v potravinářském průmyslu, kde například způsobují nežádoucí zákal piva či chuťové změny produktů. V některých zdrojích je rod Hansenula a Pichia považován za jeden a tentýž. [3][4][7] - r. Yarrowia Pučící buňky rody Yarrowia vytvářejí pseudohyfy i pravé hyfy. Y. lipolytica dříve nazývána Candida lipolytica nebo Saccharomyces lipolytica - není schopna zkvašování, avšak může štěpit tuky. Je využívána pro produkci biomasy růstem na n-alkanech ropy pro krmné účely a biotechnologické čištění ropy. [3][4] 11

Obr. č. 10: Yarrowia lipolytica - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm. [2] Obr. č. 11: Yarrowia lipolytica - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25 C (tzv. obrovská kolonie). [2] - r. Debaryomyces Kvasinku D. hansenii můžeme najít v mléčných výrobcích, v mase, tabáku a výrobcích studené kuchyně, ale také na pokožce lidí či zvířat. Speciální kmen je složkou tepelně neopracovaných masných výrobků především kvůli jeho výjimečným schopnostem snižovat redoxpotenciál, štěpit tuky či přispívat k tvoření aroma a stabilizaci zbarvení těchto výrobků. [3][4] Na povrchu kapalného média vytvářejí suchou blanku, některé zástupce můžeme najít v mořské vodě či solených potravinách, mají bradavčité spory a slabé kvasné schopnosti. [3][4] 12

Obr. č. 12: Debaryomyces hansenii - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm. [2] Obr. č. 13: Debaryomyces hansenii - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25 C (tzv. obrovská kolonie). [2] - r. Lipomyces Lipomyces mají pytlovitá vřecka s mnoha sporami, vytvářejí kolem sebe houbovitá pouzdra a nezkvašují cukry. U tohoto druhu se vyskytuje v asku 8 10 elipsoidních askospor a z jedné jediné jejich buňky může vzniknout až 6 asků. Obal buněk je obalen polysacharidem, který je možné barvit modře. [3][4] - r. Nematospora Vřecka těchto zástupců jsou větší než vegetativní buňky. N. coryli má 8 spor s přívěsky a parazituje na některých rostlinách, jako je například bavlník, kávovník a citrusové plody. V roce 200 byl N. coryli přejmenován na Eremothecium coryli. Tento rod je fytopatogenní (způsobující choroby rostlin) a v asku se u něj vyskytuje 8 vřetenovitých askospor s bičíky. [3][4] 13

- r. Metschnikowia Některé druhy tohoto rodu se nacházejí jako parazité u obratlovců či se vyskytují na rostlinách a ovoci. Uvolňují do svého okolí barvivo pulcherimin, jsou schopny slabě zkvašovat a vyskytují se například na ovoci či v ovocných šťávách. Jeden ze zástupců - M. bicuspidata se vyskytuje v mořských vodách. [3][4] Vegetativní pučení na široké základně: - r. Saccharomycodes Rod Saccharomycodes má silné fermentační účinky, buňky jsou cintronkovitého tvaru a je možné, že některé askospory kopulují přímo v asku. Tento rod nemá vůbec haploidní vegetativní fázi. Vyskytuje se na ovoci, zúčastňuje se spontánního kvašení vína i po zasíření, čímž způsobuje nežádoucí kontaminace. [3][4] Obr. č. 14: Saccharomycodes ludwigii - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm. [2] Obr. č. 15: Saccharomycodes ludwigii - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25 C (tzv. obrovská kolonie). [2] 14

- r. Nadsonia Jediný zástupce rodu Nadsonia, Nadsonia fluorescens využívá ke svému rozmnožování heterogenní spájení.[7] - r. Wickerhamia W. fluorescens - zástupce kvasinek rodu Wickerhamia se množí v médiu s obsahem glukózy větším než 50%. Pokud se vyskytuje v tuhých živných půdách, může do nich vypouštět riboflavin (vitamin B2). [3][4] Vegetativní rozmnožování dělením - r. Schizosaccharomyces Tento rod se vyznačuje jako jediný tím, že se rozmnožuje pomocí dělení s tvorbou překážky, avšak nevzniká při tom mycelium. Má celkem dobré kvasné schopnosti a nevyskytuje se u něj hexosová represe dýchání. [4] Druh S. pombe je využíván například v Africe k výrobě nápoje z prosa jménem Pombe. Také se používá k odkyselování vín, kde využívá přítomnou kyselinu jablečnou. Je to jeden z modelových organismů v genetice. [4] Druhý z tohoto rodu je S. octosporus, který lze izolovat z ovoce a používá se také při biologickém odkyselování vín. [3][7] Obr. č. 16: Schizosaccharomyces pombe - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm. [2] 15

Obr. č. 17: Schizosaccharomyces pombe - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25 C (tzv. obrovská kolonie). [2] - r. Endomycopsis Tento rod spolu s Eremotheciumm a Ashbay je na pomezí mezi kvasinkami a plísněmi. Většina z nich má aerobní metabolismus a kvasí pouze slabě nebo vůbec. Rozmnožují se pomocí blastospor. [4] - r. Eremothecium Tento rod většinou parazituje na rostlinách a díky vysokému obsahu vitaminu B2 v některých kmenech, je možné je využít pro získávání tohoto vitaminu. [4] - r. Ashbya Stejně jako předcházející rod je Ashbya parazitem, ale lze jej využít pro výrobu vitaminu B2. [4] - r. Saccharomycopsis S. fibuligera produkuje škrob a amylasy. V myceliu tohoto rodu jsou přepážky, ve kterých se nacházejí plazmodezmata, což jsou vlastně úzké kanálky, které spojují protoplasty mezi buňkami. [4] 1.7.2 Bazidiodporogenní Mezi tuto skupinu patří kvasinky, které tvoří bazidiospory na protáhlých bazidiích, teliospory, z nichž pučí promycelium, které nese sporidie, ale také některé druhy bazidiomycet. Všechny se rozmnožují pučením a sexuální cyklus je zastoupen heterokaryotním myceliem s přezkami (vnější můstky mezi dvěma buňkami zajišťující rovnoměrné rozdělení jádra). [4] 16

Některé jsou červené kvasinkovité a za přístupu světla a kyslíku tvoří karotenoidy nerozpustné ve vodě, některé obsahují karotenoidní pigmenty a tvoří balistokonidie, které jsou na jednoduchých či větvených sterigmatech. [7] čeleď Filobasidiaceae: - r. Filobasidiella Tento rod patří mezi patogenní. Jeho zástupce je například F. neoformans, který má kulovité bazidiospory nebo F. bacillispora, u kterého jsou spory tyčinkovitého tvaru. Tyto kvasinky byly dříve označovány jako Cryptococcus neoformans, často napadají lidskou či zvířecí tkáň a způsobují smrtelná onemocnění. Přenáší se vdechováním ze vzduchu - například z holubího trusu. Mají řetízky bazidiospor na 4 místech basidia. [4] - r. Filobasidium Tento rod má 8 bazidiospor a je perfektním stádiem rodu Cryptococcus. [4] Rody tvořící sporidie: - r. Rhodosporidium Tyto kvasinky hromadí tuk a vytvářejí oranžové až růžové kolonie, což je způsobeno obsahem karotenoidních barviv v nich. Je to perfektní stádium rodu Rhodotorula, které má pouze aerobní metabolismus. [4] - r. Sporidiobolus Perfektní stadium rodu Sporobolomyces, jehož kolonie jsou žluté, oranžové či růžové barvy. Vytváří balistospory, které jsou odmršťovány pomocí speciálního kapalinového mechanismu. [4] Tento rod spolu s předcházejícím a jejich imperfektními rody se vyskytují ve vzduchu a zastupují také asi 50% kvasinkové populace ve sladké povrchové i slané mořské vodě na Zemi. [4] 17

Obr. č. 18: Sporidiobolus salmonicolor - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm.[2] Obr. č. 19: Sporidiobolus salmonicolor - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25 C (tzv. obrovská kolonie). [2] - r. Leucosporidium Rod Leucosporidium je bez červených pigmentů, je schopen růst při nízké teplotě, vyskytuje se tedy například v Arktidě či chladných oceánech. [4] Kvasinkovité stadia vyšších bazidiomycet - r. Tremellales Tremellales vytváří slizovité plodnice na kmenech a pařezech stromů či plodnicích jiných bazidiomycet. [4] 1.7.3 Rody, u nichž není známa tvorba pohlavních spor - r. Candida Rod Candida je nejrozsáhlejším z kvasinek, zahrnuje něco kolem 200 druhů. Mezi zástupci tohoto druhu jsou jedinci jak se silnými fermentačními účinky, tak i druhy nekvasící. Získávají uhlík a energii z metanolu a oxidací metanu ze zemního plynu nebo bioplynu Některé druhy, zejména C. utilis jsou vhodné k výrobě krmného droždí z melasy či jiných odpadních materiálů. C. kefyr, která se dříve označovala jako C. pseudotropicalis či C. 18

sphaerica, zkvašuje laktózu a je imperfektním druhem Kluyveromyces marxianus. K tomuto druhu patří i dříve samostatný Torulopsis, který se lišil pouze mutací rozhodující o tvorbě mycelia či pseudomycelia. [3][4] Dalším z tohoto rodu je C. albicans, který způsobuje kožní a nehtová onemocnění viz kapitola Patogenní kvasinky. C. utilis se používá k produkci biomasy. Dalšími zástupci jsou například C. ethanolica, C. ethanolitolerans, C. maltosa, C. shehatae, C. boidinii C. hydrofumarica, C. rugosa, C. atmospherica či C. diddensiae [3][4][7] Obr. č. 20: Candida tropicalis - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm. [2] Obr. č. 21: Candida tropicalis - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25 C (tzv. obrovská kolonie). [2] Obr. č. 22: Candida utilis - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm. [2] 19

Obr. č. 23: Candida utilis - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25 C (tzv. obrovská kolonie). [2] - r. Brettanomyces Kvasinky rodu Brettanomyces kontaminují kvašené nápoje, jako je pivo, víno a další. Při jejich fermentaci se uvolňuje vysoké množství kyseliny octové, čímž vzniká vysoké ph, které je pro ně smrtelné. Jsou také imperfektní formou rodu Dekkera. [3][4] - r. Kloeckera Příslušníci rodu Kloeckera snášejí velmi dobře kyselé prostředí, proto je můžeme nalézt na vinných hroznech či v půdě vinic, kde se uplatňují v první samovolné fázi. [3][4] - r. Malassezia Rod Malassezia (jiným názvem Pityrosporum) je velice podobný předešlému druhu. Je mimo jiné patogenní pro člověka i zvířata. U zdravých lidí je běžným kontaminantem na kůži a pro jeho růst jsou potřebné lipidy. Vyznačují se monopolárním pučením na velmi široké základně. [3][4] - r. Cryptococcus Toto imperfektní stadium rodu Filobasidium (kromě C. neoformans, což je imperfektní stadium rodu Filobasidiella) má buňky obalené slizovitým obalem a některé jeho kolonie jsou žluté barvy kvůli obsahu karotenoidních barviv. Jejich zdrojem uhlíku jsou pentózy a pentozany. Jediný patogen je C. neoformans. [3][4] - r. Rhodotorula Buňky kvasinek rodu Rhodotorula obsahující karotenoidní barviva nemají žádné fermentační účinky. Kolonie jsou tedy zbarveny oranžově až růžově, čímž se chrání před 20