ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra biomedicínské techniky TÝMOVÝ PROJEKT

Transkript

1 ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra biomedicínské techniky TÝMOVÝ PROJEKT 2011/2012 Barbora Wallachová

2 ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE Fakulta biomedicínského inženýrství Katedra biomedicínské techniky KVASINKY V NÁPOJÍCH Týmový projekt Vedoucí projektu: Mgr. Veronika Vymětalová Student: Barbora Wallachová leden 2012

3 ANOTACE : Cílem této práce na týmový projekt bylo vypracovat souhrn informací o kvasinkách, které se vyskytují v nápojích a kolem nás. Snažila jsem se tedy o přehledné seřazení různých druhů kvasinek včetně jejich použití a negativních vlivů v průmyslu. ABSTRACT : The aim of this work on the project team was to develop a summary of the yeasts that occur in beverages and around us. So I tried to clear the sorting of different types of yeast, including their use and adverse effects in the industry.

4 Prohlášení Prohlašuji, že jsem týmový projekt s názvem kvasinky v nápojích vypracovala samostatně a použila k tomu úplný výčet citací použitých pramenù, které uvádím v seznamu přiloženém k závěrečné zprávě. Nemám závažný důvod proti užití tohoto školního díla ve smyslu 60 Zákona č.121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon). V. dne. podpis

5 OBSAH Seznam použitých obrázků 1. Úvod Rozdělení a Rozšíření kvasinek Hlavní rody kvasinek Rod Pichia Rod Zygosaccharomyces Rod Candida Rod Saccharomyces Rod Kluveromyces Rod Cryptococcus Rod Debaryomyces Rod Schizosaccharomyces Struktura kvasinkové buňky Buněčná stěna Cytoplazmatická membrána Cytoplazma Jádro Vznik a růst kvasinek Využití kvasinek v průmyslu Čajová houba Kombucha Použití kvasinek při výrobě vína Použití kvasinek při výrobě piva Experimentální část Materiál Pomůcky Přístrojové vybavení Pracovní postup Závěr Seznam literatury... 15

6 Seznam použitých obrázků Obr. 1 Schéma kvasinkové buňky ( ) Obr. 2 Pučení kvasinek ( ) Obr. 3 Protoplasty u Saccharomyces cerevisiae ( [8] ŠILHÁNKOVÁ LUDMILA, Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology Praha 2002, ISBN )

7 1. Úvod Kvasinky jsou v potravinářském průmyslu velmi významné, ale jsou to i průvodci kažení masa, drůbeže, ryb, mléčných výrobků atd. Jsou to mikroorganismy využívané v technologiích výroby fermentovaných produktů jako jsou např. pivo, víno nebo líh. 2. Rozdělení a rozšíření kvasinek Kvasinky jsou heterotrofní eukaryotické organismy v přírodě velmi rozšířené. Jejich název je odvozen od schopnosti zkvašovat monosacharidy. Mikroorganismy, které můžeme zařadit do skupiny kvasinek jsou většinou jednobuněčné organismy. Vyskytují se na ovoci, v potravinách, ve vzduch, v půdě, kůži lidí i zvířat. Je možné je rozdělit do mnoha druhů. Každý druh je vázán na určitou oblast a prostředí. Jelich rozlišení není tak snadné. Druhy byly rozděleny na základě dlouholetého studia kultur vypěstovaných v laboratořích, které byly získávány z laboratorních vzorků. Kvasinky se šíří vzduchem, větřem, vodou i hmyzem. Většina druhů kvasinek zkvašuje monosacharidy, disacharidy, případně trisacharidy na etanol a oxid uhličitý. Jsou schopny růstu v rozmezí teplot 0 48 C, v laboratorních podmínkách se běžně používají kultivační teploty C. Maximální teplota, při které ještě kvasinky přežívají je C. Dále rostou při nízkých hodnotách ph, koncentraci etanolu až 18% a sacharózy %[4]. Velikost buněk se pohybuje okolo 3 až 15 μm. Velikost kvasinkové buňky je větší než velikost buňky bakterií a je dána rodovou příslušností a kultivačními podmínkami. Podobně jako velikosti buněk kvasinek se i liší jednotlivé tvary. Základním tvarem je rotační elipsoid, ale během vlastního vývoje se tvar kvasinkové buňky může měnit. Různé tvary kvasinek lze pozorovat také v souvislosti s pohlavním rozmnožováním [2,4]. Největší význam mají kvasinky, které je možné upotřebit v kvasném průmyslu (lihovarství, drožďářství nebo pivovarství). Všechny průmyslové kvasinky řadíme mezi druh Saccharomyces cerevisiae Hansen. Tento druh je ještě rozdělen na různé typy, podle jednotlivých vlastností[1, 3]. 1

8 2.1 Hlavní rody kvasinek Rod PICHIA Rod Pichia je nejrozšířenějším rodem kvasinek. Množí se nepohlavně mnohostranným pučením a tvoří pseudomycelium. Tento rod kvasinek tvoří bělavý povlak např. na ovocných šťávách nebo fermentovaných nápojích. Podílí se na kvašení kyselých okurek či nakládaného zelí[2] Rod ZYGOSACCHAROMYCES Tento rod je nejvýznamějším zástupcem osmotolerantních kvasinek. Je schopnej se množit v prostředí s více než 50% glukózy a při velmi nízké vodní aktivitě prostředí. Tyto kvasinky způsobují kažení medu nebo sirupů[2] Rod CANDIDA Kvasinky tohoto rodu se množí pučením a tvoří pseudomycelium. Jedná se o kvasinky, které nejčastěji kontaminují potraviny. Podílí se na kažení masa a často se vyskytují v pivě a ovocných džusech, kde způsobují kvasinkový zákal. Tento rod zahrnuje spoustu druhů a některé z nich jsou významnými patogeny a způsobují onemocnění kůže, nehtů a sliznic[2] Rod SACCHAROMYCES Jedná se o kvasinky vyznačující se mnohostranným pučením, při kterém vytváří mycelium a pseudomycelium. Tento rod je technicky nejdůležitější rod při výrobě alkoholických nápojů jako je pivo a víno a pro průmyslovou výrobu lihu. V pekárenském průmyslu jsou využívány jako kvasnice. 2

9 Tyto kvasinky jsou rezistentní vůči kyselině benzoové a sorbové, které se uplatňují jako konzervační látky v potravinářské průmyslu. V anaerobních podmínkách zkvašují hexózy za vzniku etanolu a oxidu uhličitého[2]. Obr. 3 Protoplasty u Saccharomyces cerevisiae Rod KLUYVEROMYCES Kvasinky rodu Kluyveromyces se využívají pro průmyslovou výrobu laktózy a na fermentaci syrovátky za účelem produkce krmných kvasnic. Jsou schopny štěpit laktózu, proto jsou součástí kefírových kultur. Pohlavně se množí pomocí askopór nebo vegetativně mnohostranným pučením při vzniku pseudomycelia. Tyto kvasinky se také podílejí na kažení ovoce a sýrů[2] Rod CRYPTOCOCCUS Tyto kvasinky jsou nefermentující, rozmnožují se pučením a některé druhy jsou patogenní. Někdy mohou tvořit slizovité kolonie zbarvené červeně nebo oranžově. Kvasinky rodu cryptococcus způsobují kažení ovoce, ryb a nebo hovězího masa[2]. 3

10 2.1.7 Rod DEBARYOMYCES Jedná se o kvasinky množící se askapórami, které vytváří bílé povlaky na povrchu laků či sýrů. Také způsobují kažení mléčných výrobků nebo citrusových koncentrátů[2] Rod SCHIZOSACCHAROMYCES Kvasinky rodu Schizosaccharomyces se rozmnožují dělením a netvoří přitom mycelium. Buňky těchto kvasinek jsou obdélníkové a mají silnou fermentovací schopnost. Vyskytují se např. v melase, marmeládách nebo moštu. Do rodu Schizosaccharomyces můžeme zařadit např. kvasinky Schizosaccharomyces octosporus nebo Schizosaccharomyces pombe. Schizosaccharomyces pombe se využívá např. v Africe na přípravu alkoholického nápoje z prosa a nebo ve vinařství k odkyselování vín, jelikož tato kvasinka obsahuje kys.jablečnou. 4

11 3. Struktura kvasinkové buňky Kvasinková buňka funguje jako složitý systém složený z mnoha membrán, které od sebe oddelují jednotlivé kompartmenty buňky. Buňka kvasinek je tvořená silnou buněčnou stěnou, cytoplazmatickou membránou, cytoplazmou, jádrem a dalšími částmi na obr. Obr. 1 Schéma kvasinkové buňky 3.1 Buněčná stěna Buněčná stěna má pro buňku kvasinek velký význam. Chrání ji před mechanickými vlivy, osmotickým tlakem a dává tvar buňce. Póry na stěně buňky dovolují procházet všem sloučeninám kromě vysokomolekulárních sloučenin. Mezi základní stavební jednotky buněční stěny kvasinek patří polysacharidy a také lipidy, fosfolipidy a fosforečnany. Polysacharidy jsou tvořeny vlákny, která tvoří hustou pevnou síť. Tato síť je vyplněna bílkovinami. Hlavní složkou stěnových polysacharidů jsou glukany, které jsou tvořeny glukózou a jsou zodpovědný za udržení tvaru buňky. 5

12 Některé druhy kvasinek mají buněčnou stěnu obsahující manany nebo malé množství glukózaminu a chitinu. Chitin je polymer N-acetyl-D-glukózaminu a je v buněčné stěně hlavně v oblasti jizev a běhěm života života buňky ho stále přibývá. Buněčná stěna kvasinek rodu Saccharomyces cerevisiae je složena z glukanu a bílkovin, které jsou jsou mezi sebou vázány. Poté následuje glukomanan s bílkovinami a na povrchu jsou manany s bílkovinami a malým množstvím lipidů[4]. 3.2 Cytoplazmatická membrána Cytoplazmatická membrána kvasinek má podobnou funkci jako Cytoplazmatická membrána bakterií. Její funkce je oddělovat cytoplazmu od vnějšího prostředí. Je volně propustná pouze pro malé molekuly a tím tvoří osmotické rozhraní mezi buňkou a vnějším prostředím. Je složena z lipidů a proteinů a podobně jako u bakterií dovoluje transport látek z buňky do prostředí a teké příjem látek do buňky. Na rozdíl od bakterií neobsahuje dýchací enzymy[4]. 3.3 Cytoplazma Cytoplazma je charakteristická svým koloidním charakterem, který je dán přítomností různých bílkovin, glykogenu a dalších makromolekulárních a nízkomolekulárních látek. U mladých kvasinek můžeme vidět cytoplazmu v mikroskopu jako průhlednou homogenní hmotu. U starších kvasinek se objevujín zrníčka. U některých druhů kvasinek lze v cytoplazmě nalézt jemné fragmenty membrán nebo zrnka obsahující bílkoviny a lipidy[4]. 3.4 Jádro Jádro kvasinek je umístěno přibližně ve středu buňky a je odděleno od cytoplazmy jadernou membránou, která je dvojvrstvá s velkými póry, které slouží k transportu molekul. 6

13 Jádro je složeno z jadérka a karyoplazmy, kterou si můžeme představit jako heterogenní komplex s proměnlivou konzistencí. Jadérko je hustší než karyoplazma a soustřeďuje se v něm asi 1/5 RNA obsažené v jádře. Má srpkovitý tvar a je umístěno těsně pod jadernou membránou. Základem jaderné hmoty je chromatin, který je složen z DNA, histonů a proteinů. Základní jaderná hmota je organizovaná do chromozomů. Kvasinkové chromozomy jsou málo spiralizovány a proto lze jádro pozorovat pod mikroskopen pouze po speciálním obarvení. Počet chromozomů je různý pro různé druhy kvasinek. Např. u kvasinek druhu Saccharomyces cerevisiae je charakteristických 16 chromozomů[4]. 4. Vznik a růst kvasinek Kvasinky se rozmnožují vegetativně pučeník a nebo pohlavně za vzniku pohlavních spor. Při vegetativním rozmnožování dochází ke vzniku dceřiné buňky. Nejprve se na mateřské buňce vytvoří malý hrbol, který se postupně zvětšuje a dochází k fragmentaci buněčných organel. Podle místa, kde hrbol vzniká můžeme rozmnožování dělit na pučení monopolární, bipolární a multipolární. V případě monopolárního pučení vzniká hrbol vždy na jednom místě a vždy na stejném pólu buňky. U bipolárního pučení se hrbol tvoří střídavě na obouch pólech buňky. A u pučení kvasinek multipolárně může hrbol vznikat kdekoliv na povrchu buňky, ale nikdy se nevytváří ve stejném místě. Díky tomu je rozmnožování této buňky prostorově omezno. Poté dojde k oddělení mateřské a dceřiné buňky. Může ovšem dojít i k neoddělení dceřiné buňky a vzniká tak pseudomycelium. V místě, kde vznikl na mateřské buňce hrbol, se vytvoří výčnělek. Podle něco lze snadno zjistit, kolikrát buňka pučela. 7

14 Obr. 2 Pučení kvasinek Některé druhy kvasinek vytvářejí protáhlé buňky, které pučí pouze na pólech a po pučení zůstávají spojeny do dlouhých zaškrcených vláken, které se označují jako tzv. pseudomycelium. Vznik pseudomycelia bývá obvykle ovlivněno nedostatkem živin. Mezi kvasinky, které občas vytvářejí pseudomycelia patří např. kvasinky rodu Candida nebo Trichosporon. Při pohlavním rozmnožování kvasinky vytváří spory uvnitř sporotvorných buněk endospor. Tyto kvasinky řadíme mezi Ascomycotina. Kvasinky, které vytvářejí spory umístěné vně aporotvorných buněk označujeme jako Basidiomycotina. Rozmnožování se uskutečňuje hlavně v příznivém prostředí. Záleží na teplotě, zdroji výživy nebo vlhkosti. K růstu potřebují kvasinky nejrůznější látky ze skupiny aminokyselin a vitamínů. Tyto látky mají vliv na růst a rozmnožování kvasinek. Patří mezi ně biotin, inositol, kyselina pantotenová, pyridoxin, kyselina nikotinová, tiamin. Pro růst a množení kvasinek je nezbytná přítomnost kyslíku, živin a také vhodného prostředí, jelikož převážná část kvasinek patří mezi fakultativně anaerobní kvasinky[3,4]. 8

15 5. Využití kvasinek v průmyslu Kvasinky jsou většinou jednobuněčné organismy, které se využívají při kvasných výrobách. Saccharomyces cerevisiae patří mezi nejdůležitější z těchto organismů a označují se jako pravé kvasinky. Jsou to fakultativně anaerobní mikroorganismy, což znamená, že jejich primární činností je kvašení (fermentace). S. cerevisiae fermentují glukosu, manosu, fruktosu, galaktosu, maltosu, sacharosu a maltotriosu. Pro výrobu lihu se používají kvasinky s vysokou rychlostí tvorby ethanolu a nízkou produkcí vedlejších metabolitů. Ideální podmínky pro lihové kvašení je teplota mezi C a hodnota ph v rozmezí 4-6. Mezi nepravé kvasinky řadíme rody Hansenula, Pichia, Debaryomyces nebo i Geotrichum. Některé kvasinky mohou být i nežádoucími kontaminanty některých průmyslových výrob. Jedná se zejména o kvasinky, které velmi dobře rostou v prostředí se zvýšeným obsahem cukrů a solí např. zástupci rodu Zygosaccharomyces. Pokud není zajištěna potřebná kvalita suroviny, sterilita celého kvasného prostředí, zejména kvasírny a dostatečné množství zákvasu pravých kvasinek, mohou se při kvasném procesu uplatnit i jiné mikroorganismy, které snižují výtěžky ethanolu. Při výrobě alkoholu jde o etanolové kvašení. Etanolové kvašení je biochemický proces, při kterém mikroorganismy zkvašují sacharidy za vzniku alkoholu a dalších metabolitů. U kvasinek jsou přímo zkvasitelné jen monosacharidy hexosy (hlavně glukosa, fruktosa a mannosa) a disacharidy (sacharosa a maltosa). Složitější sacharidy jako škrob, dextriny nebo celulosa a musí být před zkvašením hydrolyzovány na jednoduché cukry a to buď působením vlastních hydrolytických enzymů mikroorganismů nebo častěji za použití enzymových preparátů či kyselin. Původci etanolového kvašení jsou zejména kvasinky Saccharomyces sp. nebo Kluyveromyces sp. Alkoholového kvašení lze popsat pomocí Guy Lussacova rovnice C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 cukr (glukóza) alkohol (ethanol) + oxid uhličitý 9

16 Kromě ethanolu může vznikat také malé množství jiných produktů, například glycerol, acetaldehyd, vyšší alkoholy, kyselina octová a další. Produkce glycerolu není při výrobě čistého lihu žádoucí, naopak při výrobě vína nevadí. Při výrobě ovocných destilátů se naopak uplatňuje i jiné než ethanolové kvašení, neboť dochází k produkci cenných aromatických sloučenin, které dodávají destilátu charakteristickou chuť a vůni[2,4,7]. 5.1 Čajová houba Kombucha Kombucha je lehce fermentovaný čajový nápoj s kvasinkovými kulturami a bakteriemi kyseliny mléčné. Je to živý nápoj s přírodním zakalením, jehož barva a chuť se proto podrobují přírodnímu kolísání. Případné usazeniny jsou známkou živého nápoje a nejsou na závadu. Tato houba je tvořena symbiózní kulturou kvasinek a bakterií. V největší míře ji tvoří Schizosaccharomyces pombe (kvasinka) a Acetobacter xylinum (bakterie). Může se zde vyskytovat i malé nožství Bacterium xylonoides a Bacterium gluconicum. Každá houba má trochu jiné složení, které se mění s podmínkami. Tento nápoj se využívá k zvyšování odolnosti a celkovému posílení organismu. Doporučuje se u dětí s rakovinou, mnohočetnou sklerózou nebo jako prevence stárnutí. 5.2 Použití kvasinek při výrobě vína Víno se vyrábí etanolovým kvašením vinného moštu vylisovaného z hroznů. V průběhu kvašení dochází k rozkladu cukrů za vzniku etanolu a oxidu uhličitého působením kvasinek. Čerstvý mošt kvasí při nízkých teplotách za anaerobních podmínek buď spontánním kvašením nebo působením kulturních kvasinek. Nejdříve se začnou rozvíjet nekulturní kvasinky, které svou činností produkují alkohola oxit uhličitý, stoupající obsah těchto látek umožní rozvoj kulturních kvasinek Saccharomyces cerevisiae a Sac. oviformis. 10

17 K ošetření moštu se používá oxid siřičitý, který brání k rozvoji divokých kvasinek a plísní. Poté je mošt zaočkován čistou kulturou kvasinek Saccharomyces cerevisiae. Při kvašení se spotřebovává cukr a množství alkoholu se stále zvyšuje. Kvasinky začnou odumírat a postupně se usadí na dně. Následně je ještě víno přefiltrováno a uloženo do sudů, kde zraje[2]. 5.3 Použití kvasinek při výrobě piva K výrobě piva se používají kvasinky pivovarské, které můžeme zařadit jako ostatní kvasinky do skupiny jednobuněčných hub. Hlavním druhem pivovarských kvasinek, které se používají je druh Saccharomyces cerevisiae. Tento druh kvasinek se dobře adaptuje na hořké chmelové látky, které jsou v mladině. V průběhu výroby se rozdělil tento druh kvasinek na kvasinky svrchního a spodního kvašení. Původní kvasinky Saccharomyces cerevisiae se označují jako kvasinky svrchního kvašení. Do kvasinek svrchního kvašení se řadí i kvasinky lihovarské, drožďárenské i vinařské. Dnes se běžně používají jako pivovarské kvasinky kvasinky spodního kvašení, které se označují Saccharomyces carlsbergensis Hansen[5]. Při výrobě piva se využívají pivovarské kvasinky, které se přidají do mladiny a za anaerobních podmínek dochází k přeměně sacharidů na etanol a oxid uhličitý. Při výrobě českých piv se používá spodní kvašení, které probíhá 8 14 dní při teplotách 5 10 C. Po fázi bouřlivého kvašení, kdy je kvasinkami spotřebována většina cukrů a obsah alkoholu je vysoký, začínají kvasinky odumírat a klesat na dno. Poté je pivo ještě přefiltrováno od zbytků kvasinek[2]. 11

18 6. Experimentální část V experimentální části práce jsem se zabývala kvasným nápojem Kombucha. Připravila jsem si mikroskopické preparáty, které jsem pozorovala pomocí mikroskopu Olympus s mikrofotografických zařízením. 6.1 Materiál kvašený nápoj kombucha. Tento nápoj obsahuje několik druhů kvasinek čeledi Schizosaccharomycetaceae (hlavně Schizosaccharomyces pombe), Saccharomycodaceae (Saccharomycodes ludwigii) a Saccharomycetaceae (např. Pichia fermentans a Saccharomyces cerevisiae) destilovaná voda 6.2 Pomůcky střička Petriho misky pipeta kádinky mikrocentrifuga Eppendorf 6.3 Přístrojové vybavení mikroskop Olympus s mikrofotografických zařízením 12

19 6.4 Pracovní postup Nejprve jsem odebrala vzorek z kvašeného nápoje kombucha. Poté jsem provedla centrifugaci vzorku v mikrocentrifuze Eppendorf. Centrifugaci jsem 5x opakovala z důvodu zajištění dostatečného množství mikroorganizmů. Vzorek jsem připravila přímo z násady, jejím vyředěním v kvašeném nápoji. Ze vzniklého roztoku jsem připravila mikroskopické preparáty. Nejprve jsem doprostřed očištěného podložního sklíčka pomocí pipety umístila kapku připraveného roztoku se získanou mikrobiální suspenzí. Poté jsem kapku opatrně přikryla krycím sklíčkem tak, aby se v preparátu nevytvořily vzduchové bubliny. Nakonec jsem provedla mikroskopování získaných preparátů a vytvořila mikrofotografii izolovaných kvasinek. Obr. 4 Mikrofotografie izolovaných kvasinek 13

20 7. Závěr V rámci týmového projektu jsem zpracovala teoretickou část práce cílenou na současný stav řešené problematiky v oblasti kvasinek a jejich použití. Zaměřila jsem se zejména na rody Saccharomyces, Schizosaccharomyces a Pichia. Zároveň jsem se také snažila o popis kvašených nápojů. V experimentální části jsem se pak seznámila s přípravou mikrobiologického mikroskopického preparátu z vybraného kvašeného nápoje kombucha. A s přípravou a archivací mikroskopické fotodokumentace. Výsledky získané řešením týmového projektu využiji při zpracování bakalářské práce. 14

21 8. Seznam literatury LITERÁRNÍ ZDROJE: [1] FRAGNER P. Určování kvasinek izolovaných z lidského organismu. Praha : Academia Praha ISBN [2] Doc. Ing. EVA VLKOVÁ, Ph.D., prof. Ing. VOJTĚCH RADA, CSc., Ing. JIŘÍ KILLER, Ph.D. Potravinářská mikrobiologie. Praha: Česká zemědělská univerzita v Praze. ISBN [3] Ing. VĚRA NOVÁKOVÁ, Ing. ANNA ROUSOVÁ. Mikrobiologie pro 2.ročník učebního oboru biochemik pro lihovarskou výrobu a výrobu vína. Praha ISBN [4] ČECHOVÁ LEONA, JANALÍKOVÁ MAGDA. Obecná mikrobiologie. Zlín: Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, ISBN [5] TVRDOŇ MILAN. Mikrobiologie pivovarská a sladařská pro SOU. Praha : Nakladatelství technické literatury, ISBN [6] NOVÁKOVÁ VĚRA, ROUSOVÁ ANNA. Mikrobiologie pro druhý ročník učebního oboru Biochemik se zaměřením na lihovarskou výrobu a výrobu vína. Praha : Středisko technických informací potravinářského průmyslu Výzkumného ústavu potravinářského průmyslu, ISBN [7] KADLEC PAVEL, et al. Technologie potravin II. Praha : VŠCHT, Lihovarnictví a výroba lihovin,s ISBN [8] ŠILHÁNKOVÁ LUDMILA, Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology Praha 2002, ISBN