PATOFYZIOLOGIE GLIOVÝCH BUNĚK A NÁDORY MOZKU

PATOFYZIOLOGIE GLIOVÝCH BUNĚK A NÁDORY MOZKU Typy gliových buněk - funkce astrocytů, NG2 gliových buněk, oligodendrocytů a mikroglií v CNS, úloha gliových buněk v průběhu patologických stavů CNS: reaktivní glióza a změny morfologie a exprese genů u gliových buněk; typy gliomů a jejich původ, regulace genové exprese u gliomů, membránové vlastnosti nádorových buněk, úloha glutamátu.

PATOFYZIOLOGIE GLIOVÝCH BUNĚK A NÁDORY MOZKU Ing. Miroslava Anděrová, CSc

Gliové buňky (neuroglia) CNS PNS Ependymové buňky Astrocyty Oligodendrocyty Mikroglie = Hortegovy glie NG2-gliové buňky Schwannovy buňky Gangliové (satelitní) buňky = amficyty

Funkce gliových buněk Astrocyty fibrilární astrocyty v bílé hmotě 300 mm protoplazmatické astrocyty v šedé hmotě hvězdicovité buňky s dlouhými výběžky. výběžky naléhají na stěnu kapiláry a dotýkají se neuronů 100 mm

Alexandrova choroba jediná známá primární astrogliopatologie Heterozygotní mutace GFAP genu GFAP tvoří cytoplasmatické inkluze Asociace se stressovými proteiny (beta-krystalin, heat shock proteiny) Opožděný vývoj Zvětšení (progresivní) - ruce Záchvaty Křeče Zmatenost Kognitivní Poruchy Hsiao et al., Journal of Cell Science 118, 2057-2065 2005

Astrocyty Základní funkce astrocytů v CNS 1. vývoj -regulace neurogeneze a gliogeneze (NSCs) 2. strukturní -tvoří mikroarchitekturu nervového systému -tvoří syncytium 3. kontrolní -regulace extracelulárních koncentrací iontů -odstraňování neurotransmiterů z ECS - homeostáza vody v CNS -regulace ph 4. metabolická -energetické substráty pro neurony -odstraňování neuronálních metabolitů 5. signální -modulace synaptického přenosu -uvolňování neurotransmiterů -signalizace uvnitř syncytia 6. vaskulární - součást BBB -regulace mikrocirkulace v mozku

Cerebrální ischemia Globalní cerebrální ischemie: dochází k redukci průtoku krve v celém mozku, většinou způsobena zástavou srdeční činnosti Fokální ischemie: dochází k okluzi cévy krevní sraženinou (trombóza) redukce průtoku krve v určité oblasti mozku

Globální cerebrální ischemie Fokální ischemie-jádro Penumbra Rossi et al., Nat Neurosci 10 (11):1377-1386,2007

Astrocyty funkce v poškozené nervové tkáni Positivní funkce: vychytávání glutamátu vychytávání K + iontů a jejich redistribuce (K + -uptake, K + spatial buffering) energetická zásobárna pro neurony glykogen anaerobní metabolismus za hypoxických podmínek produkce laktátu, alaninu a a-ketoglutarátu odstraňování volných radikálů kyslíku -vysoké hladiny antioxidantů (askorbát, glutation) reaktivní astroglióza-chrání okolní tkáň Proliferace/neurogeneze sub-populace astrocytů-neurosféry Negativní funkce: zvětšování objemu astrocytů -cytotoxický + vasogenní edém uvolňování neurotransmiterů-glutamátu, ATP, taurinu.. Změny v extrasynaptickém přenosu v důsledku zmenšeného/zvětšeného ECS, morfologie astrocytů Spreading depression - šířící se deprese (opakující se depolarizační vlna doprovázená vysokými koncentrace K +, která se šíří od rozhraní nekrotické oblasti přes penumbru) Ca 2+ vlny propagace poraněné nervové tkáně reaktivní astroglióza brání migraci buněk do místa poškození, limituje prorůstání a regeneraci axonů v poškozeném CNS

Astrocyty -udržování fyziologických koncentrací glutamátu v extracelulárním prostoru odstraňování glutamátu transportéry EAAT1 (GLAST) a EAAT2 (GLT1) Na/K pumpa Na/Ca antiport glutamatový transportér 2-5 mm Na + 5 mm 20-30 mm 1-10 mm Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007 Benesova et al., J. Neurosci, 2008

Obrácené fungování glutamátového transportéru v ischemii: glutamát je uvolňován do extracelulárního prostoru Astrocyty přispívají k dalšímu poškození nervové tkáně -excitotoxicita -depolarizace buněčných membrán -aktivace Na + a Ca 2+ iontových kanálů -akumulace Ca 2+ v cytoplasmě a mitochondriích -inhibice ATP syntézy v mitochondriích buněčná smrt Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007

Astrocyty -udržování fyziologických koncentrací K + iontů v extracelulárním prostoru a K + redistribuce Kotransportéry- NKCC1, KCC1 Na + /K + pumpa Fyziologické podmínky 2.5mM K + Neuronální aktivita 4-4.2 mm Epilepsie 10-12 mm K + Ischemie/SD 60-70 mm K + Astrocytární Na + /K + pumpa Saturace 10-15 mm K + Na/K/Cl kotransport +H 2 O zvětšování objemu astrocytů

Astrocyty -udržování fyziologických koncentrací K + iontů v extracelulárním prostoru a K + redistribuce - K + iontové kanály Fyziologické podmínky 2-2,5mM K + Zvýšená neuronální aktivita ~4.5 mm K + Epilepsie max 20 mm K + Ischemie ~70 mm K + Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007

Astrocyty objemové změny astrocytů vyvolané patologický stavy CNS Cytotoxický edém Zvětšení objemu buněk Gliové a endotelové buňky, HEB neporušena zmenšení extracelulárního prostoru Vasogenní edém Porušení HEB -aktivita matrix metaloproteináz makromolekuly do ECP zvětšení ECP

Následky zvětšování objemu astrocytů -redukce extracelulárního prostoru -snížený extrasynaptický přenos -zvýšení extracelulárních koncentrací K + a glutamátu -depolarizace neuronů -buněčná smrt neuronů, oligodendrocytů -stlačení cév-redukce průtoku krve -aktivace iontových kanálů, které reagují na změnu objemu buňky -další uvolnění glutamátu, ATP Ischemie Trauma Selhání jater Hyponatremie

Hypotonický stres Extracelulární [K + ] Depolarizace, aktivace Cl-kanálů, K+ akumulace Glutamát Acidifikace Cl- 1. Aktivace antiportu Na + /H + Cl - /HCO 3 - kotransport Na + /HCO 3-2. Inhibice K + kanálů,akumulace K +, inhibice RVD Kimelberg, 2005, Glia

Astrocyty redistribuce vody a regulace ECP AQP4 a Kir4.1 kolokalizovány na membráně astrocytů Glu, K+, CO2 Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007

Astrocyty Transport relativně velkých molecul, až 1kDa uvolňování neurotransmiterů do extracelulárního prostoru - glutamát, aspartát, taurin, ATP -reverzně fungující transportéry (i u oligodendrocytů) v důsledku zvýšených intracelulárních koncentrací Na + a neurotransmiteru, + depolarizace (K + ) Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007 -aniontové kanály aktivované změnami objemu - Cl - Regulatory Volume -konexony hemichannels decrease -ionotropní purinergní receptory -P2X 7 -exocytóza v důsledku zvýšené koncentrace Ca 2+ odlišná schopnost astrocytů regulovat objem závisí i na intracelulární obsahu taurinu

Astrocyty -anaerobní metabolismus za hypoxických podmínek Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007

Astrocyty Ca 2+ vlny = propagace poraněné nervové tkáně Parpura a Haydon, Astrocytes in Pathophysiology of CNS, 2009 Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007

Astrocyty anisomorfní astroglióza hypertrofované astrocyty proliferace permanentní gliální jizva produkce chondoitinu a keratinu inhibice regenerace axonů astroglióza isomorfní astroglióza růstové faktory (NGF, FGF, cytokiny, Shh) -proteiny extracelulární matrix -adhézní molekuly -podpora neuron-astrocyt interakcí -podpora růstu axonů, synaptogeneze Anderova et al., 2004, Glia

Astrocyty Morfologie astrocytů a exprese GFAP zvýšená exprese GFAP

Hipokampus potkana - GCI

Hipokampus potkana - GCI

Astrocyty Reaktivní astrocyty vykazují charakteristiky NSC -exprimují markery radiálních glií-vimentin -v přítomnosti NGF a bfgf neurosféry -diferenciace v neurony a oligodendrocyty Anderova et al., Glia, 2009 Buffo et al., PNAS, 2007

Apoptóza

Apoptóza

Časově závislé změny v počtu buněk CA1 oblasti hipokampu po GCI

Proliferace-mikroglie, NG2 glie a astrocyty

Alzheimerova choroba Astrocyty detekují beta-amyloid uvolňovaný neurony, odtažení astrocytárních výběžků od neuronů Degenerace nervových zakončení v blízkosti atrofovaných astrocytů Astrocyty akumulují beta-amyloid Odumírání neuronů a astrocytů, Aktivace mikroglií, reaktivní astrocyty- plaky Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007

Epilepsie Vápníková vlna může vyvolat synchronizované uvolňování glutamátu Synchronizovaná depolarizace neuronů = epileptický záchvat

Funkce gliových buněk Mikroglie tvoří imunitní systém mozku 10% z gliových buněk monocytomakrofágového původu schopnost fagocytovat klidový stav aktivovaná-reaktivní

Mikroglie Klidová mikroglie = buňka neustále kontrolující ECS nahodilý pohyb výběžků (1.2-1.5mm/min), jejich prodlužováním a zkracováním kontroluje oblast CNS v průběhu několika hodin aktivace: Signál-ATP uvolněné z astrocytů -purinergní receptory na mikrogliích Up-regulace K + kanálů-kir, vně usměrněné Aktivace GLT-1 synaptic stripping selektivní odstranění glutamergních synapsí Produkce cytokinů a chemokinů- NGF, BDNF, NT-3, NT-4 Produkce imunokompetentních molekul- ILs, TNFa, TGFb (kontrola imunitní odpovědi) Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007 TGFb astroglióza

Aktivace mikroglií Astrocyty, neurony ATP, cytokiny klidová mikroglie Aktivovaná-reaktivní mikroglie proliferace, migrace, transformace ve fagocyty, buněčná smrt

Aktivace mikroglií-gci

Mikroglie Rozsah poranění určuje rozsah morfologických změn a produkce cytokinů Charakter poranění, intenzita a trvání stimulu ovlivňují produkci cytokinů

Funkce gliových buněk Oligodendrocyty obklopují výběžky neuronů vytvářejí myelinové pochvy axonů v PNS jsou obdobou Schwanovy buňky NG2 MBP O4

Oligodendrocyty Mechanismy vedoucí k poškození oligodendrocytů Corpus callosum Karadottir et al., 2005 Nature Frühbeis et al., Frontiers in Cell Neurosci (7), 182, 2013

Oligodendrocyty Wallerova regenerace: tělo buňky reaguje na oddělení axonu produkcí stavebních proteinů, nový axon roste rychlostí cca 1 mm/den a snaží se spojit s původními efektory nebo receptory, poté dochází k tvorbě myelinových pochev a funkční regeneraci-pns Myelinizovaný axon Transekce a degenerace axonu Schwanovy buňky dediferencují Fragmentace myelinu Makrofágy odstraňují poškozené buňky Bazální lamina Schwanových buněk intaktní Regenerace axon prorůstá do trubice bazální laminy Schwanovy buňky produkce faktorů Reinervace axon regeneruje a inervuje svaly Schwanovy buňky myelinizují axon Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007

Oligodendrocyty Wallerova degenerace- po přerušení axonu dochází k odloučení od buněčného těla a k degeneraci jeho distálního pahýlu CNS x PNS Myelinizovaný axon Dezintegrace a fragmentace myelinu Aktivace mikroglií, astrocytů a NG2 glií Makrofágy-odstranění buněč. debris Permanentní gliální jizva Verkhratsky a Butt, Glial Neurobiology, 2007

Demyelinizační onemocnění Vanishing white matter disease ve věku 2-6 let, ztráta myelinu, degenerace bílé hmoty mozkové, cystická BH, kolem cyst ztráta oligodendrocytů, abnormální morfologie oligodendrocytů Roztroušená skleróza autoimunitní zánětlivé demyelinizační onemocnění CNS -primárně progresivní-smrt oligodendrocytů, neurodegenerace, zanět, bez relapsů, bez remyelinizace OPC,

Polydendrocyty a jejich funkce v CNS CNS PNS Ependymové buňky Astrocyty Oligodendrocyty Mikroglie = Hortegovy glie NG2-gliové buňky Schwannovy buňky Gangliové (satelitní) buňky = amficyty

Polydendrocyty 5-8 % gliových buněk NG2-gliové buňky Neuron-Glia Synantocyty-(kontakt) GluR gliové buňky Prekurzory oligodendrocytů Polydendrocyty NG2 = chondroitin sulfát proteoglykan 4 α receptor růstového faktoru produkt krevních destiček PDGF AA přežívání Proliferace migrace Komitova et al., 2009 J Comp Neurol

Polydendrocyty exprimují S100β, transcripční faktor Olig2 a APC Komitova et al., 2009 J Comp Neurol

Polydendrocyty-vývoj proliferující progenitorová buňka proliferující polydendrocyt Nishiyama et al., 2009, Nature Reviews/Neuroscience

Membránové vlastnosti polydendrocytů Vm ~ -85-90 mv IR ~ 200-300 Mohms +20mV -160mV oligodendrocyt -70mV astrocyt neuron NG2+ Olig2+ S100β- Exprese Na +, K +, Ca 2+ kanálů Glutamátové a GABA receptory Glutamátové transportéry GFAP 2 typy polydendrocytů NG2+ Olig2+ S100β+ Karadottir et al., Nature Neurosci, 2008

Polydendrocyty aktivně komunikují s neurony a gliovými buňkami Tvoří synapse s neuronypresynaptické zakončení, postsynaptické zakončení, NG2 glia a astrocyty Glutamát, ATP... Ranvierovy zářezy NG2 glie kontaktují Ranvierovy zářezy (propagace akčního potenciálu) -příma signalizace mezi neurony a NG2 gliovými buňkami -exocytóza- uvolnění glutamátu-aktivace AMPA R (depolarizace, Ca2+ increase) proliferace/diferenciace uvolnění růstových faktorů Nishiyama et al., 2009, Nature Reviews/Neuroscience

Polydendrocyty a jejich úloha v ischemickém poškození mozku 2 modely ischemického poškození mozku -globální cerebrální ischemie -fokální cerebrální ischemie Morfologické změny polydendrocytů Membránové vlastnosti polydendrocytů Proliferace polydendrocytů v ischemicky poškozené nervové tkáni Diferenciační potenciál polydendrocytů in vivo po ischemickém poškození mozku

Zvýšená proliferace gliových buněk po GCI Anderova et al., 2011, JCBFM

Proliferace-polydendrocyty a astrocyty Anderova et al., 2011, JCBFM

Proliferace a membránové vlastnosti polydendrocytů Vm, IR, proudova hustota KA current density (pa/pf) kontrola 6H 1D 3D

3D morfometrie - morfologické změny polydendrocytů A B C Alexa-Fluor-hydrazide 594- labeled astrocyte Confocal sectioning Confocal plane used for area calculation 0.12mm Benesova et al., J Neurosci Res, 2009

mm V (V, V ) 10 3 Změny morfologie NG2-glií po GCI processes soma 16 12 8 ** 4 ** ** V V s V p ** 0 V processes /V (V soma /V) % 80 60 40 20 0 (n=12) (n=14) (n=5) * V /V s V /V p control 3 days 1 month * Anderova et al., 2011, JCBFM

Globální cerebrální ischemie má za následek zvýšenou proliferaci polydendrocytů 3-7 den po GCI počet polydendrocytů ani oligodendrocytů v hipokampu po ischemickém poškození nestoupá počet astrocytů významně vzrůstá, i přestože proliferace astrocytů je nízká

Proliferace/diferenciace polydendrocytů in situ (P4) NG2 glie, oligodendrocyty Zhu et al., 2011, Development symetrické dělení -vznik 2 NG2 glií asymetrické dělení -vznik 1 NG2 gliea 1 oligodendrocytu symetrické dělení -vznik 2 oligodendrocytů

Zhu et al., 2011, Development Polydendrocyty dávají vznik subpopulaci astrocytů NG2creER :ZEG P14 Indukce Cre E16.5

Polydendrocyty heterogenní populace NG2 glia in GM NG2 glia in WM Astrocyty, Polydendrocyty, Neurony? Oligodendrocyty Polydendrocyty

Middle Cerebral Artery Occlusion triphenyltetrazolium chlorid

Vizualizace polydendrocytů: NG2CreBAC:ZEG Cre recombináza exprimovaná v polydendrocytech (NG2 gliích) indukuje permanentní expresi EGFP

EGFP pozitivní polydendrocyty Honsa et al., 2012, PlosOne

Fokální cerebrální ischemie

Zvýšená proliferace polydendrocytů 3 dny po FCI

Zvýšená proliferace polydendrocytů po FCI

Polydendrocyty dávají vznik i astrocytům a neuronům 7-14 dní po FCI

Polydendrocyty dávají vznik i astrocytům a neuronům 7-14 dní po FCI

Membránové vlastnosti EGFP+ buněk v nepoškozené nervové tkáni

Membránové vlastnosti EGFP+ buněk po FCI

Gliomy - původ gliální progenitorové buňky neurální kmenové buňky ependymové buňky astrocyty, polydendrocyty (zvýšená proliferace po poranění)

Heterogeneita gliomů -OPC -heterogenní populace -nedávno objevená populace buněk NSC NPC Neuroblasty Přechodové stavy Různé subpopulace reaktivních astrocytů -distální, proximální -vlastnosti NSC -heterogeneita astrocytů obecně Oblast mozku, aktivované signalizační dráhy EGF, PDGFalpha, Wnt Siebzehnrubl et al., GLIA 59:1135 1147 (2011)

Klasifikace gliomů World Health Organization Z klinického hlediska - dle malignity, 4 stupně (I-IV) stupeň I - benigní tumory (pilocystický astrocytom) stupeň II-IV maligní tumory, které se liší svou agresivitou Louis et al., Am J Pathol. 2001 September; 159(3): 779 786. Z histopatologického hlediska astrocytomy, oligoastrocytomy, oligodendrogliomy, glioblastomy

Limitace pro růst gliomů -nedostatečný prostor -extracelulární prostor ~20% z celkového objemu nervové tkáně -pevné hranice pro růst - CNS je ohraničen pevnou schránkou (lebka, míšní kanál) -nemetastázující Maligní gliomy si kolem sebe aktivně vytvářejí prostor Migrují podél axonů a cév

Gliomové buňky uvolňují glutamát do ECP NMDA a Ca 2+ Mikrodialýza - Grade IV GBM indukovaná neuronální smrt v blízkosti tumoru 2 cm od tumoru prostor pro další růst gliomu Electroneutrální transportér aminokyselin GSH-tripeptid složený z aminokyselin kyseliny glutamové, cysteinu a glycinu ochrana před oxydačním stresem DeGroot and Sontheimer 2011, Glia 59(8):1181-9

Glutamát uvolněný nádorovou buňkou ovlivňuje nejen neurony, ale i funkci okolních gliových buněk Glutamin produkovaný astrocyty transportován do tumorových buněk, konverze na glutamát Glutamátové receptory u astrocytů a oligodendrocytů Na +, Ca 2+ apoptóza Jeffrey D. Rothstein & Henry Brem, Nature Medicine 7, 994-995 (2001)

Migrace gliomů Zvýšená exprese metaloproteináz MMP2, 9 štěpení molekul ECM, snazší migrace anti-mmp-2 sirna - apoptóza gliomových buněk inhibice MMP-2 - autofagocytóza gliomových buněk Zmenšení objemu gliomových buněk protáhlý tvar, snazší migrace v parenchymu McFerrin and Sontheimer, Neuron Glia Biol. 2006 Feb;2(1):39-49. Blokátory ClC3 zamezují expanzi gliomu ukončena 2. fáze klinického výzkumu, zahájen Trial III Zvýšené oscilace intracelulárního Ca 2+ v důsledku aktivace AMPAR Inhibice AMPAR omezuje šíření a růst nádoru

Významné membránové proteiny z hlediska nádorových onemocnění Arcangeli and Becchetti, Pharmaceuticals 2010, 3, 1202-1224; New Trends in Cancer Therapy: Targeting Ion Channels and Transporters

Nádorové buňky v mozku migrují podél cév a axonů odstraňují endfeet astrocytů RECA/GFAP/C6-GFP gliomové buňky C6 transplantované do striata neonatálních (2D) potkanů Farin et al., GLIA 53:799 808 (2006)

Mikroglie a glioblastomy nádorové buňky přetváří obranné systémy mozku expanze nádoru GBM GBM linie -až 30% nádoru tvoří mikroglie -produkce MT1-MMP nebo MMP14 -MT1-MMP max. aktivuje MMP2 gliomů usnadňují expanzi nádoru GMB produkuje CCL2 (Macrophage chemoattractant protein-2), CC Receptor na mikrogliích Tissue and Imaging Core Joanna Phillips, Tracy Richmond McKnight, Cynthia Cowdrey Zhang et al., Carcinogenesis vol.33 no.2 pp.312 319, 2012

Děkuji za pozornost