ÚSTAV FYZIKÁLNÍ BIOLOGIE JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH ZPRÁVA O UKONČENÍ PROJEKTU Projekt Název projektu: Porovnání vlivu promývání a dezaktivace dekapsulovaných cyst Artemie na jejich líhnivost a růstové parametry odkrmovaných ráčat. Průběh řešení projektu: Dne 17. 5. 2011 byla od osmi samic raka signálního (délka hlavohrudi = 55,5±3,3 mm; postorbitální délka hlavohrudi = 42,8±2,4 mm; hmotnost = 52,4±9,1 g) odebrána ráčata ve druhém vývojovém stádiu. Iniciální délka hlavohrudi zástupného vzorku ráčat (n=20), která nebyla kvůli potencionálnímu poškození nasazena do následného experimentu byla 4,9±0,2 mm a hmotnost 24,2±2,6 mg. Experiment trval 28 dní s převážením po dvou týdnech. Ráčata byla náhodně rozsazena do akvárií umístěných v experimentálním recirkulačním systému (blíže popsán v Hamáčková a kol., 2009). Odchov probíhal v osmnácti akváriích (šest akvárií = šest opakování na ošetření viz níže) o jednotné ploše dna 0,18 m 2 a objemu 45 l. Do každého akvária byla umístěna perforovaná cihla (39 příčných děr 26krát 1 x 3 cm a 13krát 1 x 1 cm), která sloužila jako úkryt pro nasazená ráčata. Do jednotlivých akvárií bylo umístěno po 13 ráčatech (hustota nasazení 72 ráčat.m -2 ). Průtok vody byl nastaven na 0,5 l.min -1. Akvária byla odkalována třikrát týdně (Po, St, Pá). Světelný režim byl přirozený. Teplota vody v průběhu experimentu byla 20,6±0,7 C (registrace teploty byla pořízena s hodinovým intervalem pomocí teplotního čidla Minikin, Environmental Measuring Systems, Brno, Česká republika). Dvakrát denně měřený obsah ve vodě rozpuštěného kyslíku byl 8,9±0,4 mg.l -1 (Oxi 330i, WTW GmbH,Weilheim, Germany), hodnota ph vody byla 7,9±0,1 (ph/cond 340i, WTW GmbH). Obsah dusitanů (NO 2 test, Sera GmbH, Heinsberg, Německo) i amoniakálního dusíku (NH 3 NH 4 test, Sera GmbH, Heinsberg, Německo) byl pod hranicí detekce 0,5 mg.l -1. Ráčata byla krmena v nadbytku třemi druhy dekapsulovaných cyst, jejichž příprava vycházela z metodiky FAO - Organizace pro výživu a zemědělství (Van Stappen, 1996). Po procesu hydratace a dekapsulace byly cysty 1) dezaktivované v desetinásobku 0,1 N HCl a po dobu 1 min a obdobným způsobem propláchnuté destilovanou vodou ( D ), 2) dvakrát propláchnuté destilovanou vodou ( P ) a 3) nedezaktivované a nepropláchnuté cysty ( N ). Dekapsulované cysty byly připravované třikrát týdně a navážené krmné dávky byly skladovány v lednici (4 C). Po dvou týdnech odchovu bylo vyhodnoceno přežití a růst ráčat. S cílem zamezit možnému poškození odchovávaných živočichů při tomto převážení byla ráčata po osušení pouze individuálně zvážena na analytických vahách s přesností na 0,1 mg (Kern & Sohn GmbH, Balingen, Německo). Na konci experimentu byla pomocí digitálního
posuvného měřítka zjišťována i délka hlavohrudi s přesností na 0,01 mm (Proma CZ s.r.o., Mělčany, Česká republika). U různě dezaktivovaných resp. propláchnutých čerstvě dekapsulovaných cyst byl stanoven obsah aktivního chlóru a jejich líhnivost v časech 18, 21 a 24 h po jednodenním uskladnění v lednici při 4 C. Pro tento účel bylo použito standardizované metodiky FAO (Van Stappen, 1996) v. Stanovení obsahu aktivního chlóru bylo testováno v šesti opakováních, líhnivost byla testována ve třech opakováních (každé tvořeno šesti měřeními). Růstové ukazatele raků a obsah aktivního chlóru v cystách byly po ověření předpokladů (normality Kolmogorov-Smirnovovým a homoskedasticity Levenovým testem) analyzovány jednocestnou analýzou variance a Tukey-HSD testem pro post hoc porovnání. Procentní přežití ráčat a líhnivost cyst byla vyhodnocena obdobným způsobem po předchozí arcsinové transformaci. Nulová hypotéza byla zamítnuta na hladině významnosti. Všechna data jsou prezentována jako průměr ± SD. Dosažené výsledky: Po dvou týdnech odchovu ráčat raka signálního bylo dosaženo jejich přijatelného přežití, které bylo na úrovni 90 % (tabulka 1). Hmotnost ráčat odkrmovaných N cystami však již byla průkazně nižší v porovnání se skupinou odkrmovanou P cystami, jenž byla hmotnostně porovnatelná s experimentální skupinou D. Na konci pokusu bylo přežití P a D skupiny na úrovni 45-50 % avšak u ráčat odkrmovaných N cystami pouze necelých 27 %. Tato ráčata také byla průkazně menší než skupina P, která se nelišila od skupiny D, byla však v průměru menší. Obdobný trend byl patrný i při porovnání finálních délek hlavohrudi odchovaných ráčat. Ačkoliv bylo přežití v experimentálních skupinách na přijatelné úrovni po prvních 14 dnech odchovu, můžeme označit přežití po 28 dnech jako nízké a to i ve skupinách P a D. Tato skutečnost byla překvapivá při porovnání s výsledky z předešlé studie na půlročních ráčatech raka říčního (Astacus astacus) (Kouba a kol., 2011), kde bylo u čerstvě dekapsulovaných cyst dosaženo velmi vysokého přežití (okolo 90 %) po 75 dnech odchovu. Spíše nežli o mezidruhových rozdílech v potravních nárocích dotčených druhů raků však můžeme uvažovat o vyšších živinových nárocích nejmladších vývojových stádií v porovnání s většími raky, kteří si mohou (přinejmenším po určitou dobu) vykrývat případnou živinovou deficienci ze svých zásob v kombinaci s jejich více vyvinutou trávicí soustavou. Tabulka 1. Hmotnost, délka hlavohrudi a přežití ráčat raka signálního (Pacifactacus leniusculus) v průběhu odchovu při zkrmování dezaktivovaných, propláchnutých a nepropláchnutých cyst žábronožky rodu Artemia. Ošetření cyst Dní Hmotnost Délka hlavohrudi Přežití (mg) (mm) (%) Dezaktivované 43,6±12,7 b - 89,7±11,6 a Propláchnuté 14 43,4±8,8 ab - 89,7±7,9 a Nepropláchnuté 39,5±8,1 a - 91,0±12,3 a Dezaktivované 69,7±31,4 ab 7,2±0,7 ab 44,9±13,2 ab Propláchnuté 28 77,6±32,0 b 7,3±0,9 b 50,0±18,7 b Nepropláchnuté 52,1±17,6 a 6,6±0,7 a 26,9±8,1 a Hodnoty ve sloupcích s lišícími se písmeny u jednotlivých ošetření a období jsou statisticky rozdílné (P 0,05).
V případě P cyst nedošlo k úplnému vypláchnutí aktivního chlóru. Stejného efektu však bylo překvapivě dosaženo i při dezaktivaci dekapsulovaných cyst (skupina D). V obou případech však byl obsah aktivního chlóru velice nízký (0,5±0,0 mg.g -1 čerstvě dekapsulovaných cyst) a odpovídající množství uvolněného jódu zreagovalo s pouhou jedinou kapkou titračního činidla (0,01 N Na 2 S 2 O 3 ). Obsah aktivního chlóru v N cystách však byl více než 35krát vyšší (18,0±1,5 mg.g -1 čerstvě dekapsulovaných cyst). Nejlepších výsledků líhnivosti po jednodenním uskladnění testovaných cyst v lednici bylo dosaženo u P cyst a to ve všech odběrových časech (18, 21 a 24 h) (tabulka 2). Tato líhnivost byla poměrně vysoká a při jednotlivých odběrech vzrůstala z necelých 75 % do 83 %. Přibližně poloviční líhnivost byla pozorována u N cyst (47,6 % po 24 h). Tato skutečnost byla poměrně překvapivá, neboť jsme měli za to, že přítomnost aktivního chlóru významnějším způsobem poškodí takto ošetřené cysty a povede k výraznějšímu snížení jejich líhnivosti. Vliv dezaktivačního činidla však byl v tomto ohledu mnohem razantnější a neočekávaně vedl téměř k totální ztrátě líhnivosti (6,1 % po 24 h)! Lze uvažovat, že příčinou bylo velmi nízké ph tohoto činidla (ph cca 1,5-2). Ačkoliv byla námi použitá expozice dezaktivace na horní hranici doporučené doby, je nasnadě, že i tato je z pohledu případného líhnutí cyst příliš dlouhá. Z hlediska působení takto razantních hodnot ph se jeví užití mírně alkalicky reagujícího 0,1% Na 2 S 2 O 3 jako vhodnější alternativa. Tabulka 2. Líhnivost (%) dezaktivovaných, propláchnutých a nepropláchnutých čerstvě dekapsulovaných cyst po jednodenním uskladnění v lednici. Ošetření cyst Líhnivost cyst v čase 18 h 21 h 24 h Dezaktivované 3,8±1,1 a 4,0±1,4 a 6,1±2,1 a Propláchnuté 74,8±5,6 c 80,6±1,2 c 82,7±3,3 c Nepropláchnuté 31,9±9,4 b 41,8±6,6 b 47,6±0,4 b Hodnoty ve sloupcích s lišícími se písmeny v jednotlivých časech jsou statisticky rozdílné (P 0,05). V souhrnu můžeme posoudit vliv různého ošetření dekapsulovaných cyst z hlediska obsahu aktivního chlóru, líhnivosti cyst a růstu i přežití odchovávaných ráčat následovně: Obsah aktivního chlóru o Obsah aktivního chlóru v D cystách je velice podobný v porovnání s obsahem v cystách propláchnutých pouze destilovanou vodou (ošetření P). Pouhé proplachování vodou se v tomto ohledu jeví jako dostačující. o N cysty mají podstatně zvýšený obsah (cca 35krát) aktivního chlóru. Líhnivost cyst o Nejlepších parametrů líhnivosti bylo dosaženo u P cyst. o Nepropláchnutí dekapsulačního činidla (N cysty) podstatnou měrou snížilo líhnivost cyst (cca o 50 %), nevedlo však k její úplné limitaci. o Pravděpodobně kombinace velmi nízkého ph a délky expozice dezaktivačního činidla (0,1 N HCl po dobu jedné minuty) vedla k podstatné redukci líhnivosti D cyst. o Jako vhodnější alternativa pro dezaktivaci, která však ještě musí být experimentálně ověřena, se jeví užití mírně alkalicky reagujícího 0,1% Na 2 S 2 O 3.
Růst a přežití ráčat o Nejlepší parametry růstu a přežití byly pozorovány při zkrmování P cyst. Celkově je však možno označit dosažený růst za pomalý a přežití za nízké. Spíše nežli o mezidruhových rozdílech mezi raky používanými v jednotlivých experimentech lze uvažovat o vyšších živinových nárocích nejmladších vývojových stádií v porovnání s většími raky, kteří si mohou (přinejmenším po určitou dobu) vykrývat případnou živinovou deficienci (obvykle je testována kombinace cyst Artemie a suchého krmiva pro ryby) ze svých zásob v kombinaci s jejich více vyvinutou trávicí soustavou. o Mírně horší výsledky ráčat odkrmovaných D cystami (avšak bez statistických rozdílů) s ošetřením P nebyly způsobeny přítomností volného chlóru. Určitou roli, jež se odrazila ve snížené líhnivosti těchto cyst, lze spatřovat ve sníženém množství trávicích enzymů exogenního původu, díky kterým pomáhá živá potrava nastartovat trávení samotných ráčat. Uvažovat lze i o částečné živinové degradaci těchto méně životaschopných cyst. o Raci jsou takzvaní slow feeders a předložené cysty často konzumují až po několika hodinách od nakrmení. I krátkodobé propláchnutí dekapsulovaných cyst vodou vede k podstatné redukci obsahu aktivního chlóru. Je tedy patrné, že přímý vliv chlóru na odkrmovaná ráčata skupiny N můžeme vyloučit. Uvažovat však lze o tom, že dochází k degradaci esenciálních živin, a jejich obsah není pro odkrmované živočichy dostatečný. Tato situace je zcela jistě komplexní, ale vcelku jednoduše si lze například představit oxidaci dvojných vazeb polynenasycených mastných kyselin, které jsou působením chlóru nevratně degradovány. Stav čerpání finančních prostředků: Pro úspěšnou realizaci studie byly vyčerpány všechny přidělené finanční prostředky a to v celkové výši 42 446 Kč bez DPH (49 977 Kč s DPH). Byly pořízeny chemikálie na dekapsulaci cyst Artemie, stanovení obsahu volného chloru a líhnutí nauplií v celkové ceně 3321 Kč bez DPH, spotřební laboratorní materiál (4679 Kč bez DPH) a pipeta eppendorf reference za 6141 Kč bez DPH. Za zbytek ceny (28 305 Kč bez DPH) bylo pořízeno laboratorní sklo (mimo jiné automatická byreta, krystalizační misky, kuželové baňky, odměrné válce a další). Využitelnost dosažených výsledků a navazující práce: Ani současné pokroky v intenzivní akvakultuře nedokáží plně pokrýt nutriční požadavky především nejmladších vývojových stádií odchovávaných živočichů a přídavek byť omezeného množství živého krmiva zůstává nezbytností. Nejčastějším druhem předkládaného živého krmiva byly a stále jsou různým způsobem upravené žábronožeky rodu Artemia. Jedním z progresivních trendů je zkrmování dekapsulovaných cyst žábronožek, a to hned z několika důvodů. Tyto cysty jsou totiž dezinfikované, snáze se líhnou, mohou být jednoduše skladované, a proces dekapsulace cyst je snadnější a levnější než-li líhnutí vlastních nauplií. Jako krmivo mohou být využity také méně kvalitní cysty a mají vyšší obsah energie a živin v porovnání s čerstvě vylíhlými nauplii. Takto upravené cysty již byly s úspěchem testovány na různých sumcích, kaprovitých a akvarijních rybách, jakožto náhrada vylíhlých nauplií žábronožek. Stejně tak jsou s pozitivními výsledky uplatňovány pro odchov mořských krevet rodu Penaeus a Metapenaeus, sladkovodních krevet, krabů a v neposlední řadě raků.
Využití dekapsulovaných cyst je tedy v experimentálních odchovech a další intenzifikaci akvakultury vysoce důležité. Pro dosažení požadovaných výsledků je ale nezbytné dokonalé zvládnutí postupu samotné dekapsulace, procesu, který se skládá ze čtyř kroků, kterými jsou hydratace, vlastní dekapsulace, proplachování a dezaktivace. V posledních dvou krocích dochází k dezaktivaci aktivního chlóru a propláchnutí použitých chemikálií (Kouba a kol., 2009). Z výše uvedeného souhrnu výsledků je patrné hned několik podstatných přínosů této studie, z nichž můžeme zdůraznit, že: Ani jedno ošetření dekapsulovaných cyst jakožto monodieta nebyla zcela uspokojivá pro růst a přežití ráčat. Pouhou vodou propláchnuté P cysty dosahovaly nízkého obsahu aktivního chlóru, vysoké líhnivosti a růst i přežití ráčat. D cysty měly srovnatelný obsah aktivního chlóru se skupinou P, vyznačovaly se však velmi nízkou líhnivostí a mírně sníženým růstem a přežitím ráčat. V tomto případě je podstatné zdůraznit pravděpodobně škodlivé účinky extrémně nízkých hodnot ph dezaktivačního činidla (0,1 N HCl). Vhodnější alternativou by v tomto ohledu mohl být mírně alkalicky reagující 0,1% Na 2 S 2 O 3. Tuto skutečnost je ale nezbytné experimentálně ověřit. N cysty mají přibližně 35tinásobný obsah aktivního chlóru. Ačkoliv jsou však nepropláchnuté, uchovávají si stále určitou úroveň líhnivosti. Z chovatelského hlediska se však jeví jako nevhodné. Spíše než o přímém negativním vlivu aktivního chlóru na odchovávané živočichy (kvůli jeho rychlému vymývání) lze v tomto případě uvažovat o degradaci esenciálních živin, jako jsou např. polynenasycené mastné kyseliny, na které jsou cysty žábronožek už tak poměrně chudé. Seznam citované literatury: Hamáčková, J., Prokeš, M., Kozák, P., Peňáz, M., Stanny, L.A., Policar, T., Baruš, V., 2009. Growth and development of vimba bream (Vimba vimba) larvae in relation to feeding duration with live and/or dry starter feed. Aquaculture 287, 158 162. Kouba, A., Hamáčková, J., Kozák, P., 2009, Dekapsulace, líhnutí a odkrm žábronožek rodu Artemia. Edice Metodik (technologická řada), VÚRH JU Vodňany, č. 94, 35 s. Kouba, A., Hamáčková, J., Buřič, M., Kozák, P., 2011. Use of three forms of decapsulated Artemia cysts as food for juvenile noble crayfish (Astacus astacus). Czech Journal of Animal Science 56, 114 118. Van Stappen, G., 1996. Use of cysts. In: Lavens P., Sorgeloos P. (eds): Manual on the production and use of live food for aquaculture. FAO Fisheries Technical Paper 361. FAO, Rome, 107 136.