MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2010 Jan Pazdera 1

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Metody studia vyjádření (exprese) genů Bakalářská práce Vedoucí práce: prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph. D. Vypracoval: Jan Pazdera Brno 2010 2

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma,,metody studia vyjádření (exprese) genů vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana AF MZLU v Brně. dne. podpis.... 3

PODĚKOVÁNÍ Tímto bych chtěl poděkovat panu prof. RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D. za cenné rady, trpělivost při konzultacích a odborné vedení při zpracovávání této bakalářské práce. 4

ABSTRAKT Cílem této práce je zpracovat a zhodnotit metody studia exprese genů. Metody vyjádření genetické informace se dělí dle úrovně studia, na úroveň mrna a proteinů. Z hlediska molekulární podstaty dělíme expresi genů na dvě fáze, a to transkripci a translaci. Chceme-li studovat první fázi exprese genu, měli bychom se zaměřit na RNA transkript. Metody, které se zaměřují na analýzu genové exprese na úrovni RNA, se zabývají také studiem transkripce a její regulace. Můžeme je rozdělit na metody, kterými se stanovuje transkripční aktivita daného genu a dále na metody, analyzující množství určitého transkriptu, který je přítomen ve vzorku v daném čase. Metody používané ke studiu exprese na úrovni proteinu slouží k získání, identifikaci a kvantifikaci byť jen malého počtu specifických proteinů. Mezi nejvýznamnější metody na úrovni mrna patří northernový přenos, DNA mikroarray, DD, RACE, FISH a mezi metody na úrovni proteinů SDS-PAGE, ELISA, 2-DE, IEF a MALDI-TOF a mnoho dalších metod. V práci jsou diskutovány a zhodnoceny nejvýznamnější vybrané metody, přičemž nejlepších výsledků dosáhneme při současném monitorování exprese genů na úrovni tvorby mrna a následně proteinu. Klíčová slova Exprese, transkripce, mrna, protein 5

ABSTRACT The goal of this thesis is to process and evaluate options of gene expression studies. Methods of genetic information expression can be categorised according to the level of study into mrna and protein levels. In term of molecular basis we recognise two stages of gene expression transcription and translation. If we want to study the first stage of gene expression, we should focus on the RNA transcript. The techniques that focus on the analysis of gene expression on the RNA level also deal with the study of transcription and its regulation. There are two kinds of methods: methods used to determine the transcription activity of the given gene and methods used to analyse the amount of a certain transcript presented in a sample at the given time. The techniques used to study expression on the protein level are used to determine, identify and quantify even a small amount of specific proteins. The most important techniques on the mrna level include northern blotting, DNA microarray, DD, RACE and FISH. The most important techniques on the protein level include SDS-PAGE, ELISA, 2-DE, IEF, MALDI-TOF and many more. The thesis discusses and evaluates the most important selected techniques. The best results shall be achieved by simultaneous monitoring of gene expression on the mrna and protein level. Key words Expression, transcription, mrna, protein 6

OBSAH 1. ÚVOD... 10 2. REGULACE GENOVÉ EXPRESE V JÁDŘE... 11 3. REGULACE GENOVÉ EXPRESE V CYTOPLAZMĚ... 14 4. VÝZNAM STUDIA EXPRESE GENŮ... 16 4. 1. Význam studia exprese genů... 16 4. 1. 1. Zkoumání transkriptů klonovaného genu... 16 4. 1. 2. Elektronová mikroskopie molekul nukleových kyselin... 16 4. 1. 3. Analýza transkriptu pomocí prodlouženého primeru... 17 4. 1. 4. Význam exprese genů... 18 4. 2. Význam studia funkční genomiky... 19 4. 2. 1. Identifikace genů v sekvenci genomu... 19 4. 2. 2. Hledání otevřených čtecích rámců (open reading frames)... 20 4. 2. 3. Studie transkriptomu a proteomu... 21 4. 2. 3. 1. Studium transkriptomu... 21 4. 2. 3. 2. Studium proteomu... 22 4. 2. 3. 3. Význam genomiky... 23 5. CÍL PRÁCE... 25 6. MOLEKULÁRNÍ PODSTATA EXPRESE GENŮ... 26 6. 1. Transkripce... 26 6. 1. 1. Iniciace... 26 6. 1. 2. Prodlužování (elongace) transkripce... 27 6. 1. 3. Ukončení (terminace) transkripce... 28 6. 1. 4. Posttranskripční úpravy... 28 6. 2. Translace... 29 6. 2. 1. Aktivace aminokyselin... 29 6. 2. 2. Iniciace translace... 30 6. 2. 3. Elongace (prodlužování) proteinu... 30 6. 2. 4. Ukončení translace... 31 7. SOUHRN METOD PRO STUDIUM EXPRESE GENETICKÉ INFORMACE NA ÚROVNI STUDIA mrna... 32 7. 1. Hybridizační metody... 32 7. 1. 1. Southernova hybridizace... 33 7. 1. 2. Northernová hybridizace... 34 7. 1. 3. Analýza transkriptu pomocí prodlouženého primeru... 35 7. 1. 4. Sekvenování RNA... 36 7

7. 1. 5. Test ochrany před účinkem RNázy (RPA)... 36 7. 1. 6. Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)... 37 7. 1. 7. Branched DNA assay... 38 7. 1. 8. DNA mikroarray... 39 7. 1. 9. Subtraktivní hybridizace... 41 7. 2. PCR metody... 41 7. 2. 1. Reverzní transkripce PCR (RT-PCR)... 42 7. 2. 2. Rychlá amplifikace cdna konců (RACE)... 43 7. 2. 3. Real-time PCR... 43 7. 2. 4. Diferenciální display (DD)... 45 7. 2. 5. PCR arrays... 46 7. 3. Ostatní metody... 47 7. 3. 1. Sériová analýza genové exprese (SAGE)... 47 7. 3. 2. Reportérské geny... 48 7. 3. 3. Test prodlužování primerů (PEA)... 49 7. 3. 4. Celogenomové sekvenování RNA... 50 8. SOUHRN METOD PRO STUDIUM EXPRESE GENETICKÉ INFORMACE NA ÚROVNI STUDIA VZNIKAJÍCÍCH PROTEINŮ...51Chyba! Záložka není definována. 8. 1. Gelová retardace komplexů DNA-protein... 51 8. 2. Footprinting pomocí DNázy I... 52 8. 3. Test modifikované interference... 52 8. 4. Identifikace kontrolní sekvence pomocí deleční analýzy... 53 8. 4. 1. Provedení deleční analýzy... 54 8. 5. Identifikace a studium translačního produktu klonovaného genu... 54 8. 5. 1. Metody HRT a HART (identifikace transl. produktu klon. genu)... 55 8. 5. 2. Analýza proteinů pomocí mutageneze in vitro... 56 8. 5. 3. Westernová hybridizace... 56 8. 5. 3. 1. Elektroforéza... 56 8. 5. 3. 2. Blotování... 57 8. 5. 3. 3. Reakce proteinů s protilátkou... 57 8. 5. 3. 4. Vyvolání blotu... 57 8. 5. 3. 5. Výsledek... 58 8. 5. 4. ELISA... 58 8. 5. 5. SDS-PAGE... 59 8. 5. 5. 1. SDS-elektroforéza... 59 8. 5. 5. 2. Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (PAGE)... 60 8. 5. 6. Izoelektrická fokusace (IEF)... 61 8. 5. 7. Dvojrozměrná elektroforéza (2-DE)... 62 8. 5. 8. Hmotnostní spektrometrie (MALDI-TOF)... 63 Odstraněno: 7. 1. 10. Celogenomové sekvenování RNA 41 Odstraněno: 7. 2. PCR metody 42 Odstraněno: 7. 2. 1. Reverzní transkripce PCR (RT- PCR) 43 Real- Odstraněno: 7. 2. 3. time PCR 44 Odstraněno: 7. 2. 4. Diferenciální display (DD) 46 Odstraněno: 7. 2. 5. arrays 47 Odstraněno: 7. 3. Ostatní metody 48 PCR Odstraněno: 7. 3. 1. Sériová analýza genové exprese (SAGE) 48 Odstraněno: 7. 3. 2. Reportérské geny 49 Odstraněno: 7. 3. 3. Test prodlužování primerů (PEA) 50 Odstraněno: 8. SOUHRN METOD PRO STUDIUM EXPRESE GENETICKÉ INFORMACE NA ÚROVNI STUDIA VZNIKAJÍCÍCH PROTEINŮ 52Chyba! Záložka není definována. Odstraněno: Odstraněno: 8. 1. Gelová retardace komplexů DNAprotein 52 Odstraněno: 8. 2. Odstraněno: 8. 3. Test Odstraněno: 8. 4. Identifikace... [3] Odstraněno: 8. 4. 1. Odstraněno: 8. 5. Identifikace... [5] a Odstraněno: 8. 5. 1. Odstraněno: 8. 5. 2. Odstraněno: 8. 5. 3. Odstraněno: 8. 5. 3. 1. Odstraněno: 8. 5. 3. 2. Odstraněno: 8. 5. 3. 3. Odstraněno: 8. 5. 3. 4. Odstraněno: 8. 5. 3. 5. Odstraněno: 8. 5. 4. Odstraněno: 8. 5. 5. Odstraněno: 8. 5. 5. 1. Odstraněno: 8. 5. 5. 2. Odstraněno: 8. 5. 6. Odstraněno: 8. 5. 7. Odstraněno: 8. 5. 8.... [1]... [2]... [4]... [6]... [7]... [8]... [9]... [10]... [11]... [12]... [13]... [14]... SDS- [15]... SDS- [16]... [17]... [18]... [19]... [20] 8

Odstraněno: 9. DISKUZE 66 9. DISKUZE... 65 9. 1. Studium exprese na úrovni mrna... 65 9. 2. Studium exprese na úrovni proteinu... 67 10. SEZNAM ZKRATEK POUŽITÝCH METOD... 69 11. POUŽITÁ LITERATURA... 70 Odstraněno: Odstraněno: 9. 1. Studium exprese na úrovni mrna 66 Odstraněno: 9. 2. Studium exprese na úrovni proteinu 68 Odstraněno: 10. SEZNAM ZKRATEK POUŽITÝCH METOD 70 Odstraněno: 11. POUŽITÁ LITERATURA 71 9

1. ÚVOD Exprese genů je v podstatě komplexní proces, jímž je genetická informace (GI) uložena ve formě deoxyribonukleové kyseliny (DNA) přeměněna v konkrétní buněčné struktury. Produkty exprese genů jsou molekuly proteinů, jsou jimi však i ribonukleové kyseliny (RNA). Exprese strukturních genů obecně sleduje schéma, kdy je určitý úsek DNA (gen) přepsán mediátorovou RNA (mrna) a ta slouží jako matrice pro syntézu bílkoviny. Syntézy bílkovin se také mimo rrna účastní ještě ribosomální (rrna) a transferová RNA (trna). V eukaryotických buňkách je ve skutečnosti vše daleko komplikovanější a zmíněná exprese genetické informace (GI) se děje v mnoha na sebe navazujících krocích. Produktem transkripce ještě není mrna, ale její prekurzor, primární transkript či heterogenní jaderná RNA (hnrna). hnrna jestě musí v jádře projít řadou úprav, než se z ní stane zralá mrna, jež pak může být translatována. Zralá mrna pak je pak transportována z jádra do cytoplazmy a tam za příznivých podmínek může dojít k translaci. Ještě je nutné zmínit, že molekula RNA se v buňce nikdy nevyskytuje nahá, ale vždy v asociaci s řadou RNA-vazebných a dalších bílkovin. RNA s bílkovinami pak tvoři ribonukleoproteinový komplex či částici, zkráceně RNP. Bílkovinná složka RNP komplexu se je zodpovědná jednak za ochranu reaktivní a méně stabilní RNA, dále plní i řadu úloh při dozrávání primárního transkriptu v jádře a konečně se podílí i na určování osudu RNA v cytoplazmě. RNP komplexy zralých mrna se nazývají mrnp částice, komplexy jejich nezralých forem pak hnrnp. Je zřejmé, že proces genové exprese musí být velice pečlivě regulován na všech zúčastněných úrovních. Této regulace se mimo bílkovin účastní i řada regulačních, nekódujících a většinou malých RNA, jež tak dotvářejí obrovskou variabilitu typů RNA vyskytujících se v eukaryotické buňce. Jedná se například o malé jaderné RNA (snrna, z angl. small nuclear RNA ) účastnící se sestřihu hnrna či editační grna (z angl. guide vést). Patří sem i stále se rozrůstající rodina protismyslných RNA, které se podílejí na umlčování genů.

2. REGULACE GENOVÉ EXPRESE V JÁDŘE Exprese genetické informace (GI) je u eukaryot poměrně komplikovaná a do značné míry neprobádaná. Základní kroky, do kterých ji můžeme rozdělit, jsou pak transkripce, zrání neboli posttranskripční modifikace hnrna, transport z jádra do cytoplazmy, translace a posttranslační úpravy nově syntetizovaných bílkovin. Přestože regulace na úrovni transkripce představuje hlavní kontrolní bod exprese většiny genů, každý z následných kroků představuje atraktivní hladinu, na které může být a velice často i je genová exprese také regulována. K tomu je nutné přiřadit i další aktivity v cytoplazmě, například regulaci stability mrna, přesnou lokalizaci v cytoplazmě, kontrolu translatovatelnosti jednotlivých transkriptů, eventuálně vytváření zásobních mrnp. Prvním krokem exprese strukturních genů je transkripce, jejímž produktem je molekula hnrna. Syntéza hnrna je katalyzována dle matrice DNA multienzymovým komplexem RNA polymerazy. V eukaryotických buňkách rozeznáváme tři evolučně spřízněné enzymy: RNA polymeráza I katalyzuje syntézu většiny rrna, RNA polymeráza II se uplatňuje při syntéze mrna (mediátorová RNA) a většiny malých jaderných RNA (snrna) a konečně RNA polymeráza III je rodpovědná za syntézu transferových RNA, 5S rrna a řady dalších malých a často regulačních molekul RNA. Protože aktivita RNA polymerazy II je nejprecizněji regulována a její produkty podstupují největší množství posttranskripčních modifikací, má tento enzymový komplex nejsložitější strukturu a sestává z nejvíce podjednotek. Z hlediska osudu primárního transkriptu je důležitou součástí C- terminální doména, tzv. CTD platforma. Tato doména lokalizovaná v místě, kde nově syntetizovaná RNA opouští komplex RNA polymerazy, slouží jako platforma pro formování hnrnp a dále pro asociaci bílkovinných komplexů zodpovědných za posttranskripční modifikace primárního transkriptu. Většina tzv. posttranskripčních modifikací vlastně vůbec neprobíhá po ukončení transkripce, ale ještě v jejím průběhu a přesnější označení pro tuto skupinu reakcí by mělo být kotranskripční modifikace (ROSYPAL, S. a kol., 1999). První postranskripční modifikací primárního transkriptu je přidání čepičky na jeho 5 -konec. K tomu dochází záhy po iniciaci transkripce prostřednictvím několika čepičkujících enzymů. Struktura čepičky (7-methylguanosin) a hlavně její 11

připojení k primárnímu transkriptu prostřednictvím atypické 5-5 trifosfátové vazby představují účinnou ochranu nově syntetizované RNA před aktivitou buněčných exonukleas. Čepička se dále účastní sestřihu pre-mrna a podílí se i na zprostředkování exportu zralé mrna do cytoplazmy a při vlastní translaci. Úpravou prochází i opačný konec molekuly hnrna. Touto úpravou je nejčastěji polyadenylace, tedy endonukleolytické rozštěpení primárního transkriptu v přesně definovaném místě a následné dosyntetizování poly(a) řetězce různé délky. Vyjímečné je, že tato syntéza probíhá bez templátu a za vydatné spoluúčasti bílkovin PABP. Bílkoviny PABP specificky rozpoznávají poly(a) řetězec, k němuž se váží a jehož délku ovlivňují.ribonukleoproteinová částice, na které k polyadenylaci dochází, se někdy nazývá poly(a)osom. Poly(A) řetězec, mimo stabilizace 3 -konce mrna, hraje spolu s čepičkou významnou roli při zprostředkování fyzického kontaktu obou konců mrna, které je důležité zejména při iniciaci translace a při recyklaci ribosomálních podjednotek a translačních faktorů po jejím ukončení. V mrna eukaryotických organismů jsou kódující oblasti (exony) většinou přerušovány nekódujícími intervenujícími sekvencemi (introny). Počet intronů v jednom genu může být značně variabilní a kolísá od žádného či jednoho až po mnoho desítek. Také jejich délka se pohybuje od několika desítek nukleotidů až po desetitisíce basí. Můžeme však říci, že průměrný eukaryotický gen obsahuje 3-10 intronů, každý o délce 100-200 nukleotidů (HONYS, D., 2009). Sestřihem nazýváme vyštěpení intronu v přesně definovaných pozicích (5 - a 3 -místo sestřihu) a následnou ligaci odpovídajících exonů. Je zřejmé, že precizní rozpoznání správných míst sestřihu je klíčovým předpokladem úspěšného vystřižení intronu. Reakčním mechanismem sestřihu je energeticky neutrální transesterifikace. To je jedna z reakcí, která může být katalyzována ribozymy. K sestřihu dochází na spliceosomech (z anglického splicing sestřih), což jsou ribonuleoproteinové částice, komplexy hnrna (ve formě hnrnp), malých jaderných RNA (snrna, ve formě snrnp) a dalších bílkovin. Spliceosom je během sestřihového cyklu postupně formován kolem hnrnp, a to postupnou asociací jednotlivých snrnp kolem obou míst sestřihu. Jedna ze snrna pak s největší pravděpodobností tvoří i katalytické místo spliceosomu. Ne všechny introny jsou vyštěpeny vždy důležitým a často využívaným regulačním mechanismem genové exprese eukaryot je fenomén alternativního sestřihu. Při něm dochází k vystřižení jen některých potenciálních 12

intronů či jejich kombinací a je tak umožněna syntéza několika různých bílkovin z jednoho primárního transkriptu. Zvláštní skupinu pak tvoří introny schopné samosestřihu. Tyto introny, vyskytující se převážně v semiautonomních organelách eukayrotických buněk, obsahují vše potřebné pro své úspěšné vystřižení a do určité míry ani nevyžadují asistenci bílkovin, jsou to typické ribozymy. Podle mechanismu sestřihu rozeznáváme dvě základní skupiny, z nichž jedna sdílí způsob svého vystřižení se spliceosomálními introny popsanými výše. Jsou to tzv. introny II. typu. Tyto introny jsou také považovány za evoluční předchůdce klasických intronů, o nichž se soudí, že spolu se spliceosomálními snrna vznikly rozpadem intronů II. typu. Poslední a také nejméně prozkoumanou skupinu posttranskripčních modifikací editaci zmíníme jen stručně. Jedná se o řadu úprav, jejichž společnou vlastností je místně specifická změna sekvence RNA odchylující jí od sekvence DNA (RNA) templátu, avšak s výjimkou dříve popsaných úprav sestřihu a polyadenylace. Konkrétně se zejména jedná o místně specifickou deleci či inserci nukleotidů, případně o jejich konverzi. V některých případech je nezralá RNA editována podle templátu, kterým je malá, nezávisle transkribovaná molekula grna (z anglického guide vést). Analogicky dalším typům modifikací, k alespoň některým typům editace dochází na RNP částicích nazvaných editosomy. Podobně jako sestřih, i editace umožňuje expresi různých variant RNA bez nutnosti změn v genomové DNA. Jednotlivé formy editace byly popsány ve všech typech RNA, a to ve všech říších v jaderném, mitochondriálním i plastidovém genomu. Typickým příkladem mimo mrna je obecně rozšířená editace prekurzorů trna, kde její působení vede ke konverzi běžných basí v base netypické, vyskytující se přednostně či výhradně v trna. Těchto netypických basí v trna bylo dosud popsáno téměř sto. Produktem posttranskripčních modifikací primárního transkriptu je zralá molekula mrna. Ta je ve formě mrnp exportována do cytoplasmy, kde již může být translatována (HONYS, D., 2009). 13

3. REGULACE GENOVÉ EXPRESE V CYTOPLAZMĚ Každá buňka klade rozdílné nároky na potřebu jednotlivých bílkovin jak z hlediska časování a místa syntézy tak z hlediska potřebného množství. Tyto faktory nejsou často zcela zohledněny na úrovni transkripce, ale jsou průběžně dolaďovány až na místě určení, v cytoplasmě, na úrovni translace. Buněčný aparát zde má možnost kontrolovat a měnit stabilitu jednotlivých mrna, jejich přesnou lokalizaci v cytoplasmě a účinnost, s jakou budou translatovány (translatovatelnost). Všechny tyto faktory určují, jaké množství konkrétní bílkoviny bude v buňce v daný moment syntetizováno. Proces translace, který probíhá ve třech fázích (iniciace, elongace a terminace), dokonce nemusí být regulován jen na logicky nejpochopitelnější úrovni iniciace, ale i v pozdějších obdobích, během probíhající elongační fáze. Všechny uvedené regulační úrovně spolu velice úzce souvisejí a žádná z nich nemůže být brána v potaz bez zohlednění úrovní ostatních. Například stabilita či translatovatelnost řady mrna kódujících často regulační bílkoviny se významně mění v závislosti na jejich lokalizaci či vývojovém stádiu příslušné buňky. Příkladem může být mrna kódující histony. Potřeba histonů výrazně fluktuuje během buněčného cyklu - počet všech typů histonů musí být koordinovaně zdvojnásoben během syntetické fáze (replikace DNA), jinak zůstává přibližně konstantní. S ohledem na množství histonů v jádře, které hmotnostně odpovídá množství přítomné DNA, je zřejmé, že náhlý extrémní nárůst syntézy histonů a zejména její stejně náhlý konec nemůže být regulován jen na transkripční úrovni. Podílí se na něm řada mechanismů, mimo transkripce i forma modifikace 3 -konce všech histonových mrna odlišná od polyadenylace. Ta pak souvisí se selektivní stabilizaci a destabilizací těchto molekul v závislosti na probíhající fázi buněčného cyklu. Specifická struktura na 3 -konci histonových mrna je zodpovědná za náhlou destabilizaci do té doby stabilních transkriptů v okamžiku, kdy již opadla potřeba dalších histonových bílkovin (HONYS, D., 2009). Stabilita, lokalizace i translatovatelnost mrna je určována přítomností specifickýchsekvenčních elementů nalézajících se většinou v nepřekládaných oblastech mrna a interagujících se specifickými regulačními bílkovinami či molekulami RNA. Zmíněné strukturní motivy se mohou nacházet i v kódující oblasti, 14

to je však jev méně častý. Příkladem regulační RNA uplatňující se mimo jiné v cytoplasmě je protismyslná RNA (angl. antisepse RNA), která se s postupujícím výzkumem ukazuje být jedním z čím dál důležitějších regulačních fenoménů. Popsaný přístup, využívající schopnost RNA tvořit dvouvláknové struktury, umožňuje cílené umlčování genů a stále častěji nalézá své uplatnění při výzkumu i v terapeutické praxi. Obecně můžeme říci, že sekvenční elementy ovlivňující stabilitu mrna se častěji nacházejí blíže 3 -konci molekuly, lokalizační elementy a motivy regulující translatovatelnost zase na opačné straně, existuje však řada výjimek. Jednotlivé strukturní elementy většinou nefungují samostatně, ale při jejich působení se uplatňuje aditivní efekt. V jednom transkriptu je často přítomno více aktivních motivů, jejichž počet a poloha spolu s přítomností vazebných bílkovin či regulačních RNA pak určuje konečný stav. Zmíněné strukturní elementy se také často překrývají, což dále zvyšuje možnosti kontroly. Je patrné, že u eukaryot je cesta od transkribovaného genu k syntéze odpovídající bílkoviny dlouhá a složitá a že se na ní nachází celá řada kontrolních bodů. Některé z popsaných či nepopsaných regulačních mechanismů jsou výjimečně zajímavé a komplikované a jejich vymyšlení by jistě vyžadovalo notnou dávku fantazie. Většina regulačních kroků se děje za spoluúčasti RNA a bílkovin. Prakticky neustále dochází k přeskupování dočasně formovaných specifických ribonukleoproteinových komplexů a jejich nahrazování jinými s jinou funkcí. To mimo jiné předpokládá existenci precizních mechanismů zajišťujících koordinovanou expresi regulovaných a regulačních molekul. Úzká spolupráce RNA a bílkovin také potvrzuje, že genová exprese eukaryot a zejména její regulace není neměnným lineárním sledem událostí, který je odstartován signálem pro transkripci určitých genů. Daleko spíše se jedná o řadu paralelních procesů a komplexní síť interakcí na mnoha vzájemně se prolínajících úrovních, které jsou postupně dolaďovány ještě v průběhu exprese konkrétního genu. To buňce umožňuje účinněji a operativněji reagovat na měnící se podněty okolí, ale také napravovat chyby nutně se vyskytující v tak komplikovaném systému. Jednotlivé kroky také proto nemohou probíhat nezávisle a odděleně od ostatních, existuje zde kontinuum světa RNA a bílkovin v eukaryotické buňce (HONYS, D., 2009). 15

4. VÝZNAM STUDIA EXPRESE GENŮ Geny mohou být funkční jen tehdy, pokud se exprimují. První fází exprese je transkripce genu do komplementárního vlákna RNA. U některých genů, např. u genů kódujících transferovou RNA (trna) a ribozomální RNA (rrna), je samotný transkript funkčně důležitou molekulou. 4. 1. RNA transkript Chceme-li se něco dozvědět o studiu exprese genu, měli bychom se zaměřit na RNA transkript. Molekulární biology bude především zajímat, zda je transkript věrnou kopií daného genu nebo jestli v něm některé genové segmenty chybí. Chybějící části se nazývají introny a jejich struktura a potenciální funkce je předmětem značné pozornosti. Vedle intronů jsou důležité také přesné pozice výchozích a koncových bodů transkripce. Transkripty nejsou většinou jen kopiemi samotného genu, ale také nukleotidových oblastí, které gen lemují. I když zatím nebyly signály určující začátek a konec transkripčního procesu uspokojivě vysvětleny, musíme je lokalizovat, abychom se mohli expresí genu dále zabývat. 4. 1. 1. Zkoumání transkriptu klonovaného genu Metody transkripční analýzy jsou nejčastěji založeny na hybridizaci mezi RNA transkriptem a fragmentem DNA obsahujícím příslušný gen. K hybridizaci nukleových kyselin dochází velmi snadno jak mezi komplementárními vlákny DNA a RNA, tak mezi jednovláknovými molekulami DNA. Výsledný DNA-RNA hybrid analyzujeme elektronovým mikroskopem či pomocí nukleáz specifických pro jedno vlákno (BROWN, T. A., 2006). 4. 1. 2. Elektronová mikroskopie molekul nukleových kyselin Molekuly nukleových kyselin můžeme pozorovat elektronovým mikroskopem, pokud jsme předtím polynukleotidy ošetřili chemickými látkami, které zvětšují jejich průměr (světlost). Neošetřené molekuly nemůžeme pozorovat, protože jsou příliš tenké. 16

K molekulám DNA se obvykle přidává protein, např. cytochrom c, jež se váže k polynukleotidovým řetězcům a potahuje vlákna tlustým pouzdrem. Viditelnost preparátu zvýšíme tak, že obalená vlákna obarvíme uranyl acetátem nebo jiným materiálem s velkým počtem elektronů. Získáme tak poměrně výrazný obraz molekul nukleové kyseliny. Elektronová mikroskopie dříve sloužila k analyzování hybridizace mezi různými molekulami DNA, postupně se však stále častěji uplatňovala také při studiu hybridů DNA-RNA. Používá se především ke zjištění přítomnosti intronů v genu. Představme si, že mezi vláknem DNA obsahujícím gen a jeho RNA transkriptem dojde k hybridizaci. Pokud gen obsahuje introny, nebudou tyto úseky DNA odpovídat RNA transkriptu a jejich base se nespárují. Stočí se do smyčky, což jim dává onen charakteristický vzhled pozorovatelný v elektronovém mikroskopu. Počet a poloha těchto smyček koresponduje s počtem a polohou intronů daného genu. Další informace získáme tak, že gen sekvenujeme a hledáme charakteristické znaky vyznačující hranice intronů. Máme-li k dispozici cdna klon, porovnáme jeho sekvenci přirozeně bez intronů se sekvencí daného genu a tak přesně zjistíme polohu intronů. 4. 1. 3. Analýza transkriptu pomocí prodlouženého primeru Analýza pomocí S1 nukleázy reprezentuje velmi výkonnou metodu umožňující identifikovat jednak 5 a 3 konce transkriptu a jednak hranice mezi exony a introny. Poslední metoda transkripční analýzy, o které bych se chtěl zmínit, prodloužení primeru (primer extension), není tak účinná, protože identifikuje pouze 5 konec RNA. Nicméně je také poměrně důležitá a často se jí používá k ověření výsledků analýzy s S1. Prodloužení primeru lze použít jen tehdy, když máme alespoň část sekvence transkriptu. Krátký oligonukleotidový primer se totiž musí k RNA připojit na známém místě, nejlépe do 100-200 nukleotidů od 5 konce transkriptu. Když se primer připojí, prodloužíme jej reverzní transkriptázou, která kopíruje vlákno RNA, dokud nenarazí na 5 konec transkriptu. 3 konec nově syntetizovaného řetězce DNA tedy odpovídá konci 5 konci transkriptu. Na sekvenci DNA tento konec lokalizujeme 17

tak, že délku jednovláknové molekuly DNA porovnáme s místem připojení primeru (SMITH in BROWN, T. A., 2006). Odstraněno:, Odstraněno: C.P., 2001 4. 1. 4. Význam exprese genů Analýza exprese genů na úrovni RNA má velký význam v obecně biologicky orientovaném základním i aplikovaném výzkumu, zvláště lékařském a farmaceutickém. Určování přítomnosti RNA některých diferenciálně exprimovaných genů a patogenů má vysokou vypovídací hodnotu diagnostickou. V současné době jsou časově náročné tradiční metody identifikace přítomnosti studované mrna nahrazovány metodou RT-PCR, která spočívá v reverzní transkripci RNA na cdna, amplifikaci cdna fragmentu pomocí PCR a detekci amplifikovaného fragmentu. Pozdější výzkumy vedly k poznání, že RNA je schopna, ale v omezeném rozsahu, zastávat funkce DNA i bílkovin, a to zejména v základních procesech exprese genetické informace (GI) a její regulace. V tomto směru byl klíčový objev určitých katalytických schopností některých specializovaných molekul RNA, jež v polovině 80. let učinil Američan českého původu Thomas R. Cech. Nadšení z popsaných objevů dokonce vedlo ke zformulování konceptu světa RNA, jež měl v raných dobách počátků života přecházet dnešnímu komplexnímu světu DNA, RNA a bílkovin a ve kterém měla uchovávání i expresi genetické informace (GI) zajišťovat právě RNA (KMOCH, S., 2008). 18

4. 2. Význam studia funkční genomiky Na začátku 21. století se pozornost molekulární biologie přesunula od studia jednotlivého genu ke studiu celého genomu. Tuto změnu v 90. letech 20. století urychlil vývoj metod umožňujících sekvenování velkých genomů. V roce 2000 už bylo sekvenování bakteriálního genomu zcela běžné a projekty zacílené na eukaryotní genomy vypadají mnohem reálněji, než tomu bylo o několik let dříve. K tomu, abychom pochopili genom, je zapotřebí tří specifických typů analýz. 1) Genomika (genomics) je technika získávání dat o sekvencích genomů. Data mají zprvu podobu mnoha jednotlivých sekvencí o délce 500-800 bp, které musíme sestavit do jedné souvislé genomové sekvence. Musíme tedy navrhnout strategii, která povede ke správnému řazení sekvencí. 2) Postgenomika neboli funkční genomika je analýza genomových sekvencí zahrnující lokalizaci genů, řídicích sekvencí a dalších znaků, které jsou předmětem našeho zájmu. Po ní následují experimenty, jež mají za úkol zjistit funkci nalezených, dosud neznámých genů. 3) Bioinformatika je metodika práce s počítačovými systémy, které se uplatňují v genomickém a postgenomickém výzkumu. Bioinformatika zahrnuje počítačově zpracované skupiny sousedních bloků sekvencí DNA, zjišťování přítomnosti genů v sekvencích, předjímání funkce genů a uchovávání obrovského množství dat generovaných v průběhu genomického projektu (BROWN, T. A., 2006). 4. 2. 1. Identifikace genů v sekvenci genomu Lokalizovat gen je snadné, pokud známe aminokyselinovou sekvenci proteinu, jež umožňuje předpovědět nukleotidovou sekvenci genu, a nebo pokud byla už dříve sekvenována odpovídající cdna nebo EST. Většinou však žádné předchozí informace umožňující určit správnou DNA sekvenci nemáme. Za těchto okolností může být lokalizace genu obtížná, a to i přesto, že máme k dispozici mapu. Mapy jsou většinou pouze omezeně přesné a pozici genu vyznačí jen přibližně, takže k tomu, abychom jej nalezli, musíme často prohledat další desítky, či dokonce stovky kilobazí. Mapa řadu genů vůbec nezachycuje, protože se jejich existence neočekává. 19

Jak tedy tyto geny na sekvenci genomu lokalizujeme? 4. 2. 2. Hledání otevřených čtecích rámců (open reading frames) Sekvence DNA genu je otevřený čtecí rámec (open reading grame, ORF). Je to řada nukleotidových tripletů počínající iniciačním kodonem a končící terminačním kodonem (u většiny genomů TAA, TAG či TGA). Nalezení ORF v genomové sekvenci pouhým zrakem, ale častěji elektronicky, je prvním krokem v lokalizaci genu. Je důležité prohledat všech šest čtecích rámců (reading frames), protože geny mohou vést oběma směry podél dvoušroubovice DNA. U bakteriálního genomu je typickým výsledkem hledání identifikace dlouhých ORFs, jež jsou téměř jistě geny, a mnoha kratších ORF, které jsou částečně či úplně obsaženy uvnitř genů, ale leží v různých čtecích rámcích. Tyto krátké sekvence jsou kombinacemi nukleotidů, které náhodou tvoří ORF, ale nejsou geny. Pokud jeden z těchto krátkých ORF leží celý mezi dvěma geny, může být mylně považován za skutečný gen, ale u většiny bakteriálních genomů je mezi geny jen velice málo místa, takže tento problém nastává jen velmi zřídka. Lokalizace genu u eukaryot je mnohem složitější. Eukaryotické geny nejsou na sebe tak nahuštěny jako geny bakteriální a mezery mezi geny jsou mnohem větší. Znamená to tedy, že důkladným ohledáním sekvence zjistíme mnoho krátkých ORF, které nemůžeme brát na lehkou váhu jen proto, že se nepřekrývají se skutečnými geny. U člověka a jiných vyšších eukaryotů je hledání genů navíc komplikováno tím, že mnoho z nich je rozděleno na exony a introny. Určité nukleotidové sekvence se vyskytují vždy na hranicích exonu a intronu, ale vyskytují se také uvnitř exonů a uvnitř intronů. Zjistit, které z těchto sekvencí opravdu tvoří hranici exon-intron, může být velmi obtížné, a vývoj algoritmů, jež by toto přesně prováděly, je jedná z hlavních výzev bioinformatiky (BROWN, T. A., 2006). 20

4. 2. 3. Studie transkriptomu a proteinu Dosud jsme se zabývali aspekty postgenomického výzkumu, které se zaměřují na studium jednotlivých genů. Posun v zaměření výzkumu od genů ke genomu vedl ke vzniku nových typů analýz, které se snaží porozumět aktivitě genomu jako celku. 1) Transkriptom označuje veškerou mediátorovou RNA (mrna) v buňce. Tento pojem také vyjadřuje celkový obraz genové exprese v dané buňce. 2) Proteom označuje obsah proteinů v buňce a odráží např. její biochemický potenciál (BROWN, T. A., 2006). 4. 2. 3. 1. Studium transkriptomu Techniky pro studium transkriptomu byly poprvé vyvinuty jako součást kvasinkového post-genomického projektu. Ve své podstatě jsou tyto techniky založeny na složitém typu hybridizační analýzy. Každý z celkového počtu 6000 kvasinkových genů byl získán jako individuální klon a vzorky byla naneseny na mikroskopické sklíčko v řazení 80x80 bodů. Tomuto uspořádání se říká mikroerej (microarray). Aby bylo možné určit, které geny jsou v kvasinkových buňkách kultivovaných za určitých podmínek aktivní, byla z buněk izolována mrna, transformována na cdna, označena a hybridizována s klony na mikroarray. Bylo použito fluorescenčního značení a hybridizace byla detekována prohlížením mikroarray konfokálním mikroskopem. Body, které dávaly signál, indikovaly geny, jež byly za daných podmínek aktivní. V případě, že jsou kvasinky přeneseny do jiných růstových podmínek (např. nedostatek kyslíku), změny v expresi genů lze monitorovat opakováním experimentu s dalším preparátem cdna. Mikroarray se používá nyní k monitorování změn v transkriptomech mnoha organizmů. V některých případech je strategie stejná jako u kvasinek, tzn. že mikroarray reprezentuje všechny geny genomu. To je však možné provést pouze u těch organizmů, které mají relativně málo genů. Pro mikroarray všech genů člověka by stačilo 10 sklíček o rozměrech 18x18 mm, obrovskou práci by však znamenala příprava klonů každého z 30 000-40 000 lidských genů. To ale naštěstí není nutné. Například ke studiu změn v transkriptomu způsobených rakovinou by mikroarray byl připraven z cdna knihovny zdravé tkáně. Hybridizace s označenou cdna 21

z rakovinové tkáně by odhalila geny, jejichž regulace je zvýšena či snížena jako projev rakovinového stavu. Alternativou k mikroarray jsou DNA čipy (DNA chips), což jsou tenké silikonové membrány nesoucí mnoho různých oligonukleotidů. Tyto oligonukleotidy jsou syntetizovány přímo na povrchu čipu a lze jej připravit v hustotě 1 milion na cm 2, což je výrazně více než u klasických mikroarray. Hybridizace mezi oligonukleotidem a probou je detekována elektronicky. Protože jsou oligonukleotidy syntetizovány de novo pomocí speciálních automatických procedur, je relativně snadné připravit čip nesoucí oligonukleotidy, jejiž sekvence jsou specifické pro každý lidský gen (GRANJEAUD et al. in BROWN, T. A., 2006). Odstraněno:, Odstraněno: S. a kol.,1999 4. 2. 3. 2. Studium proteomu Proteom je soubor proteinů v buňce. Studium proteinu (= proteomika) poskytuje další informace, které bychom nezískali pouhým vyšetřením transkriptomu, protože jednotlivá mrna (a odtud gen) dává vznik více než jednomu proteinu, a to díky posttranslačním úpravám. K těm dochází u všech eukaryotů, kde je většina polypeptidů, jež jsou syntetizovány translací, dále upravována přidáním chemických skupin. Každé jednotlivé přidání určuje přesnou funkci proteinu. Například fosforylace je důležitou modifikací používanou k aktivaci některých proteinů. Naformátováno: Zarovnat do bloku Pro studium proteomu je celý proteinový obsah buňky či tkáně nejprve separován dvourozměrnou elektroforézou. Proteiny nadávkujeme do jamky na jedné straně čtvercového polyakrylamidového gelu a separujeme na základě molekulární hmotnosti. Čtverec pootočíme o 90 a provedeme další elektroforézu, při níž tentokrát separujeme proteiny vedle náboje. Výsledkem je dvourozměrný obraz bodů různých velikostí, tvarů a intenzit, přičemž každý bod reprezentuje odlišný protein či skupinu proteinů. Pokud srovnáme dva gely, jsou rozdíly mezi proteiny zřejmé z odlišného uspořádání bodů. Chceme-li identifikovat protein v určitém bodě, purifikujeme z gelu vzorek, který ošetříme proteinázou stříhající polypeptid ve specifické aminokyselinové sekvenci (podobným způsobem jako restrikční endonukleáza). Výsledné peptidy dále analyzujeme hmotnostní spektrometrií. Tato technika byla původně vyvinuta k identifikaci látek na základě poměrů hmoty k náboji ionizujících forem, jež jsou 22

produkovány v případě, když je látka vystavena vysokoenergetickému poli. Pro peptidy se používá specializovaná verze hmotnostní spektroskopie nazývaná matrixassisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF). Pro ionizaci je pro peptid v hmotnostním spektrofotometru stanoven poměr hmoty k náboji, a to na základě času letu (time-of-flight) v okamžiku, kdy projde od ionizačního zdroje k detektoru. Poměr hmoty k nábojí umožní stanovit molekulovou hmotnost, což na druhé straně dovolí určit aminokyselinové složení každého peptidu. Pokud je ve dvourozměrném gelu z jednoho proteinového spotu analyzován velký počet peptidů, pak výsledná informace o složení může být porovnána s genomovou sekvencí, a tak je možno identifikovat gen, jež specifikuje daný protein (MANN et al. in BROWN, T. A., 2006). Odstraněno:, Odstraněno: M. a kol., 2001 4. 2. 3. 3. Význam genomiky a) Projekt Lidský genom Nejdůležitějším projektem genomiky je ovšem projekt Lidský genom, jehož cílem je přečíst si naši vlastní genetickou informaci (GI).Lidský genom se skládá z molekul DNA o celkovém obsahu asi 3 miliard nukleotidů. Tyto molekuly DNA jsou uloženy v jádře lidské buňky ve 23 chromosomech. Vlastně párech chromosomů, protože každá tělní buňka obsahuje jeden chromosom původně pocházející od otce a k němu do páru chromosom od matky. Koncem roku 2003 byla publikována nukleotidová sekvence lidského chromosomu 22. Unikátní část tohoto chromosomu se skládá z 34,4 miliónů nukleotidů. Ty tvoří 545 genů. 97% DNA nenese žádnou smysluplnou zprávu. Jen přibližně 3% lidské DNA a DNA mnoha dalších vyšších organizmů kóduje vznik funkčních molekul, zejm. proteinů. Z genetických studií se ví, že nejméně 35 dědičných chorob je spojeno s poruchou genů lokalizovaných na chromosomu 22. Nyní nastává důležité období projektu Lidský genom, a sice podrobná analýza nukleotidových sekvencí nástroji bioinformatiky a funkční genomiky (na modelu tkáňových kultur). 23

Tak by se měla postupně objasnit funkce všech lidských genů, charakterizovat jejich případná poškození a studovat mechanismy regulace jejich zapínání a vypínání (tzv. exprese) (PAČES, V., 2008). b) Genomika v zemědělství V budoucnosti genomika umožní křížení dobytka a rostlin tak, aby se plně využily jejich přirozené genetické variace. Zřejmě se budou šlechtit živočichové a rostliny také dle specifických požadavků trhu. V živočišné produkci hovězího, vepřového a drůbežího masa genomika využije informací o funkcích genů při křížení. Pro zdraví zvířat je důležitá odolnost vůči onemocněním. Genomika znalostmi genomů zvířat přispěje k vyšlechtění odolných zvířat a k vývoji účinnějších veterinárních léčiv (nedávno byly objeveny geny zodpovědné za odolnost drůbeže vůči salmonelóze). Genomika bude schopna do genomů rostlin zavádět geny, jež ovlivňují výživnou hodnotu, chuť a další vlastnosti. Bude možno také odstranit geny, jež jsou odpovědné za určité alergeny či toxiny v rostlinách (BÍNA, J., 1976). Odstraněno: 2009 c) Genomika a životní prostředí Genomika může vyřešit některé zásadní a obtížné problémy životního prostředí a ekologie, jako jsou otázky jak ekosystémy fungují, co je biodiverzita a jak ji lze ovlivnit, jak se organizmy chovají ve svém přirozeném prostředí. Znalost mikroorganizmů získaná z genomiky může významně přispět k rozvoji biotechnologií šetrných k životnímu prostředí. Genomické projekty mikroorganizmů umožní určit, jak jsou skupiny mikroorganizmů v půdě a ve vodě ovlivňovány změnami klimatu či lidskou činností (umělé hnojení, znečištění atd.) d) Důsledky pro zdraví Genomický výzkum bude mít v budoucnosti zásadní dopad na naše znalosti lidských onemocnění. Studium lidského genomu umožní lépe porozumět, jak naše geny ovlivňují vnímavost našeho organizmu vůči určitým onemocněním (vč. infekčních). Další výzkum zřejmě povede ke zdokonalení diagnostiky, prevence a samotného léčení (BÍNA, J., 1976). Odstraněno: 2009 24

5. CÍL PRÁCE Cílem předložené bakalářské práce bylo zjistit význam studia exprese genů a funkční genomiky (postgenomiky). Dále bylo naším úkolem zhodnotit metody pro studium exprese genetické informace na úrovni studia mrna a na úrovni studia vznikajících proteinů. Samozřejmě nemůžeme opomenout zhodnocení jednotlivých metod, jejich klady, zápory a vhodnost pro využití v genetice hospodářských zvířat. 25

6. Molekulární podstata exprese genů Z hlediska molekulární podstaty můžeme expresi genů rozdělit do 2 fází: 1) Transkripce 2) Translace 6. 1. Transkripce Transkripce, neboli syntéza RNA dle předlohy DNA za pomoci RNA polymerázy. Stavebními kameny jsou ribonukleosid trifosfáty (ATP, GTP, UTP a CTP). Proces prodlužování řetězce a směr syntézy je stejný jako při replikaci DNA. Na rozdíl od replikace je přepis do RNA nesymetrický. V určitém segmentu DNA je přepisován jen jeden řetězec DNA (3 --- 5 ) označovaný jako negativní (antikódující, -DNA). Druhý nepřepisovaný řetězec (5 --- 3, pozitivní, kódující, +DNA) má stejnou sekvenci nukleotidů jako primární produkt transkripce (transkript) s tím, že thymin je nahrazen v RNA uracilem. Ten většinou podléhá posttranskripčním úpravám, aby vznikla zralá RNA (ROSYPAL, S., 2001). Podle typů primárních transkriptů se rozlišují tři typy transkripčních podjednotek, které jsou u prokaryot transkribovány jedním enzymem RNA polymerázou a u eukaryot jsou čtyři typy RNA polymerát závislých na DNA: transkripční jednotka strukturních genů, transkripční jednotka genů pro rrna (ribozomální RNA), transkripční jednotka genů pro trna (transferová RNA). Proces transkripce je možno rozdělit do čtyř fází: 6. 1. 1. Iniciace Transkripce začíná ve specifických sekvencích nukleotidů na úseku DNA, který se nazývá promotor. Přepisovaná část DNA řetězce se označuje jako skriptor. První přepisovaný nukleotid se čísluje +1, takže promotorové sekvence jsou proti směru transkripce. U bakterií i eukaryontů jsou v této oblasti promotoru dvě evolučně konzervované sekvence, bližší je označována zjednodušeně jako TATA box (syn. 26

Hognesův box, ve vzdálenosti -10 u bakterií a -30 u eukaryont). Vzdálenější sekvence eukaryontů je označena jako CAT box (cca -100). Tyto boxy regulují intenzitu transkripce (sílu promotoru).bakteriální RNA polymeráza se náhodně pohybuje po DNA, slabě navazuje a zase se uvolňuje, v případě, že narazí na odpovídající promotor, pevně se naváže a rozvine krátký segment dvoušroubovice a v místě nukleotidu +1 zahájí transkripci. RNA polymerázy zahájí syntézu bez oligonukleotidivého primeru, ale jen od ATP nebo GTP. Spouštění a zastavení transkripce a vyhledávání promotoru je regulováno jak funkcí a specifičností samé RNA polymerázy, tak vazbou různých proteinů (transkripčních faktorů) na promotory. U eukaryontů je celý proces zahájení transkripce složitější a komplikovaný tím, že DNA duplex je v chromozomech složitě svinut a seskládán do různých kliček a je vázán na komplexy proteinů. Transkribovaný úsek musí být přechodně rozvinut, zpřístupněn regulační, proteinům a DNA dvoušroubovice rozpletena pro činnost RNA polymeráz. 6. 1. 2. Prodlužování (elongace) transkripce RNA polymeráza syntetizuje RNA řetězec dle předlohy, přičemž kolem 12 nukleotidů nového vlákna zůstává ještě připojeno v místě transkripce. Za tímto segmentem se řetězec RNA odděluje od matrice a přepsaný úsek DNA se opět svinuje do dvoušroubovice. Natažení dvoušroubovice ruší enzym swiveláza. U prokaryontů volný transkribovaný začátek RNA zasahuje přímo do ribozomů, kde začne translace, přičemž transkripce z DNA nemusí být ukončena. Oba děje probíhají kontinuálně až do ukončení transkripce, tj. zastavení činnosti RNA polymerázy a uvolnění konce RNA. U prokaryontů je výsledným transkriptem polycistronová neboli mnohogenová mrna, která má informaci pro sled několika po sobě jdoucích genů, přičemž během translace existuje mechanizmus, který tandem těchto informací rozdělí. Výsledkem je řada jednotlivých a různých polypeptidů. U eukaryontů je transkripce většinou unicistronová (jednogenová), tzn. že pro každý strukturní gen existují jednotlivé mrna, které teprve po úpravě prochází z jádra do cytoplazmy na ribozomy. Pokud má některá mrna eukaryontů oligocistronovou strukturu, oddělení jednotlivých funkčních polypeptidů nastává až v posttranslačních úpravách (BEDNÁŘ, J. a kol., 2006). 27

6. 1. 3. Ukončení (terminace) transkripce Ukončení transkripce je dobře prostudováno u prokaryontů, kde RNA polymeráza postupuje až do místa zvaného terminátor. V tomto místě nastává nejčastěji situace, kdy jsou v DNA dva shodné, ale sekvenčně obrácené sledy nukleotidů bohaté na C a G, které jsou uprostřed přerušené jedinečnou sekvencí. Protože RNA transkript je volný jednořetězec, v místě jedinečné sekvence se ohne a na základě komplementarity vytvoří vlásenkovitý ohyb. Komplementarita G C končí smyčku a syntéza řetězce RNA pokračuje v úseku DNA bohatém na adenin (oligo-a), který je přepsán do oligo-u v RNA. Hybridní segment DNA-RNA (komplementární oligo-a s oligo-u) je labilnější než vlásenka se smyčkou bohatá na páry G C. Tím se transkript uvolní. Existují však i jiné nechanizmy ukončení. 6. 1. 4. Posttranskripční úpravy Přepisem sekvencí DNA strukturních genů eukaryont do mrna vzniká primární transkript neboli hnrna (heterogenní RNA), která podléhá nejméně třem posttranskripčním úpravám. Připojení čepičky jde o napojení metylguaninového nukleotidu na 5 konec. Čepička chrání 5 konec před naštěpením exonukleázami. Čepička po navázání specifické bílkoviny (CBP cap binding protein) funguje jako navádějící struktura pro vazbu ribozom. Sestřih hnrna většina strukturních genů nejsou souvislé kódující sekvence, ale jsou přerušovány segmenty, které nejsou součástí funkční mrna. Tyto úseky nazýváné introny jsou z hnrna vyštěpeny a zbývající kódující úseky zvané exony jsou propojovány, aby daly vznik funkční mrna. K vyštěpení dochází tvorbou lasovitých smyček na hnrna a to tak, že každý intron začíná dubletovou sekvencí GU a končí AG. 3 konec jednoho exonu se přiblíží k 5 konci následujícího exonu. Konce mohou být vzdáleny stovky nukleotidů, přičemž dojde ke spojení 28

s přesností na jeden nukleotid. Proces vystřižení (angl. splicing) umožňuje ribonukleotidový a enzymový komplex zvaný spliceosom (SESTŘIH, 2009). Polyadenylace u eukaryontů je většina mrna ukončena sekvencí kolem 250 adeninových nukleotidů tvořících ocas, který je připojený enzymem polya-polymerázou na konec transkriptu. Smysl této úpravy je, podobný jako tvorba čepičky, při ochraně mrna před rozštěpením exonukleázami. I primární transkripty ostatních ribonukleových kyselin (pre rrna a pre trna) podléhají obdobným posttranskripčním úpravám jako hnrna jejichž výsledkem jsou funkční ribonukleové kyseliny (rrna a trna) (BEDNÁŘ, J. a kol., 2006). 6. 2. Translace Proces překladu sekvence nukleotidů do pořadí aminokyselin v polypeptidovém řetězci neboli translace probíhá v buněčných organelách ribozomech. Oproti replikaci a transkripci je to proces daleko složitější. Do syntézy vchází upravené mrna molekuly, ribozomy, dvě desítky aminokyselin, řada transferových trna přenášejících aminokyseliny, desítka enzymů a regulačních proteinů, které zprostředkují jak tvorbu polypeptidu dle instrukce zakódované v mrna, tak i řadu dalších úprav primárního proteinu (ROSYPAL, S., 2001). Translaci je možné rozdělit podobně jako transkripci do čtyř fází: 6. 2. 1. Aktivace aminokyselin Tvorba peptidové vazby (-CO-NH-) začíná aktivací aminokyselin a to tak, že aminokyseliny navážou na 3 konec trna. Všechny trna jsou sestaveny z jednoduchého polynukleotidového řetězce, který je dlouhý cca 80 nukleotidů. Tento řetězec je svinut do konfirmace, která zjednodušeně může připomínat list jetele. 5 konec je fosforylován a na 3 konci je vždy sekvence ACC představující tzv. akceptorové rameno, na které se váže aminokyselina. Aktivace aminokyseliny, tzn. tvorba esteru aminoacyl-transferové RNA (aa~trna) katalyzována aminoacyl- 29

trna-syntetázami, které jsou substrátově striktně specifické. Při chybě kombinace trna s aminokyselinou by se do polypeptidového žetězce zařadila nesprávná aminokyselina. Kromě akceptorového ramene, trna má dvě boční ramena (dihydrouracilová klička a pseudouridylová klička) obsahující minoritní baze a má další, tzv. antikodonovou smyčku. Toto antikodonové rameno se páruje s příslušným kodonem na mrna. Tím je zabezpečen překlad genetické informace z mrna do proteinů. Enzym aminoacyl-trna syntetázy rozpoznávají příslušnou trna ne podle sekvence nukleotidů na antikodonu, ale podle konfirmace povrchové struktury: antikodonového, pseudouridylového a hydrouracilového ramena. 6. 2. 2. Iniciace translace Vlastní syntéza proteinů probíhá na buněčných organelách ribozomech. Tyto organely plní současně vazbové, katalytické a regulační funkce. Ribozomy jsou složeny ze dvou podjednotek ribozomové RNA (velkých a malých), které dále obsahují několik typů rrna lišících se hmotností, tvarem a funkcí. Kromě rrna obsahují přes 50 různých proteinů. Syntéza peptidového řetězce je zahajována tvorbou iniciačního komplexu. Jeho podstatou je vazba aktivované trna pro methionin na iniciační kodon AUG na mrna. Před tímto iniciačním kodonem je na mrna krátká sekvence, která je komplementární s částí ribozomové rrna, takže pomáhá ke správnému umístění na ribozomu. Při syntéze vchází do interakce několika dalších tzv. iniciačních proteinů (IF1, IF2, IF3), které umožňují vazbu na ribozom (BEDNÁŘ, J. a kol., 2006). 6. 2. 3. Elongace (prodlužování) proteinu Na aminoacylové místo ribozomu se navazuje další aa~trna, která je vybrána dle sekvence kodonu na mrna, která se v tomto místě nachází. Další aa~trna jsou na ribozom umisťovány tzv. elongační proteiny (EF-Tu, EF-Ts a EF- G), které kromě transportní funkce mají schopnost kontroly správnosti zařazených aa~trna. Vznik peptidové vazby je katalyzován enzymem peptidyltransferázou, která je součástí větší ribozomové podjednotky. V tomto kroku se NH 2 skupina připojované aminokyseliny (připojené na aa~trna) váže na uhlík karboxylové skupiny Met-tRNA za vzniku peptidové vazby, přičemž esterová vazba mezi 30

aminokyselinou a trna se rozštěpí. Vznikne peptidy trna, tzn. že peptidy je přenesen z předcházející trna na NH 2 skupinu následující aa~trna. Řetězec se prodlouží o jednu aminokyselinu ve směru od N-konce k C-konci. Transferová trna rozpojená od aminokyseliny se uvolní a mrna se posune o jeden kodon (tři nukleotidy). Na volné místo se naváže další aa~trna a cyklus se opakuje. mrna se posune po ribozomu a současně se z něj opačným směrem uvolňuje rostoucí proteinový řetězec. 6. 2. 4. Ukončení translace Překládaná mrna se postupně posunuje až do dosažení místa terminační sekvence (UAA, UAG a UGA). Tyto terminační sekvence na mrna jsou rozpoznány proteinovými terminačními faktory (RF1, RF2 a RF3) lokalizovanými na ribozomu a způsobení zastavení translace (hydrolytické uvolnění řetězce od trna). Syntéza proteinů je na ribozomech zefektivněna a urychlena tak, že na jednu molekulu mrna dosedá v určitém odstupu více ribozomů, na nichž probíhá zvlášť tvorba jednoho typu polypeptidu. Tento útvar je označován jako polyribozom. Jednotlivé složky translačního systému mohou vcházet do reakce opakovaně. Vzniklý a uvolněný proteinový řetězec podléhá posttranslačním modifikacím: úpravám štěpením, připojováním dalších chemických skupin nebo je spojován s dalšími proteiny a je transportován do místa svého funkčního určení (BEDNÁŘ, J. a kol., 2006). 31